CN104046571B - 一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突变株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突变株。本发明利用菌体通过尼罗红染色后与产油指示菌对比荧光强弱的方法进行产油菌株的筛选，对获得的产油菌株进行碳代谢分析，获得可利用廉价碳源糖蜜的产油酵母菌株。本发明还利用制备原生质体后紫外诱变的技术选育出产量提高的突变株。本发明为发酵生产微生物油脂提供了新的菌种来源，且其突变菌株可用于工业生产。

Description

一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突 变株

技术领域

本发明属于生物能源技术领域，特别涉及一种可利用廉价碳源糖蜜的产油酵母菌株及其高产油突变株。

背景技术

某些微生物在一定条件下能将碳水化合物、碳氢化合物以及普通油脂等作为碳源转化为菌体内大量储存油脂，且储存的量超过生物量的20％，便可称为产油微生物(Oleaginous microorganisms)。产油微生物主要有酵母、霉菌、丝状真菌、藻类和细菌等，其中真核的酵母、霉菌和藻类合成的甘油三酯与植物油脂组成相似，而原核的细菌则合成特殊脂类，因此己报道的产油微生物以酵母菌和霉菌类真菌居多。

油脂既是维持和构成生命的基本物质之一，也是重要的工业原料，其应用价值非常广泛。传统的油脂资源主要来源于动植物，能源油主要来源于矿物资源。随着人口的增长、社会的进步，油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益尖锐，特别是随着日益严重的环境污染与全球性能源短缺，被迫寻求开发新型油脂资源及可再生清洁能源。随着生物科技的快速发展，人们对微生物油脂的研究也在逐步深入，利用微生物发酵法生产油脂为油脂资源的开发提供了一条新途径。

微生物油脂在脂肪酸组成上与许多植物油脂的成分相似，富含不饱和的长链脂肪酸，是生产生物柴油的潜在原料。产油脂微生物可以利用食品工业生产的废弃物生产油脂以及农副产品等可再生资源，不仅降低了生产成本，而且提高了原料及废弃物附加值，实现了废弃物的资源化。

因此开展微生物油脂的研究对解决人类面临的人口增长、人类健康、资源短缺、环境恶化等现实问题具有重要的意义。本发明正是从解决现实的问题出发，获得了可利用廉价碳源糖蜜高产油菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可利用廉价碳源废糖蜜的产油酵母菌株，该产油酵母菌株的产油率达百分之四十以上。

本发明的另一目的在于提供一种产油酵母菌株的突变株，其产油率比原始菌株提高20％。

本发明的再一目的在于提供所述产油酵母菌株的筛选方法及制备所述产油酵母菌株的突变株的制备方法；所述突变株的制备方法工艺简单，易于工业化。

本发明的产油酵母菌,分类命名为近平滑假丝酵母2A00015Candidaparapsilosis2A00015，2013年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2013354。

本发明的产油酵母菌从海洋来源的真菌中筛选得到，其来源于东太平洋鲀鱼腮中。其筛选方法具体为：将从太平洋来源的酵母在添加尼罗红的培养基中培养后，通过与指示菌对比荧光强弱的方法筛选出产油酵母菌2A00015。通过26S rDNA D1/D2序列扩增技术对产油酵母菌2A00015进行鉴定，确定为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，其为一株新高产油酵母菌，命名为近平滑假丝酵母2A00015(Candida parapsilosis)。

本发明利用尼罗红与胞内油脂成分结合后在紫外光照射下发出荧光且荧光强弱与油脂含量相关的原理。通过在添加尼罗红的培养基中培养酵母，并观察菌落荧光强弱的方法对深海酵母进行产油脂菌株筛选。本发明的筛选方法简单易于操作。

通过碳代谢分析，发现本发明的近平滑假丝酵母2A00015可利用廉价碳源废糖蜜产油脂。以廉价糖蜜作为底物，对本发明的近平滑假丝酵母2A00015进行发酵培养，尼罗红染色后用快速荧光定量检测油脂含量，计算获得产油率达到44.18％。

通过对近平滑假丝酵母2A00015制备原生质体后紫外诱变，获得了提高产油量的突变菌株。该突变菌株分类命名为近平滑假丝酵母2A00015/25Candidaparapsilosis2A00015/25，2013年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2013271。本发明的近平滑假丝酵母2A00015/25的产油率为64.06％，比原始菌株提高了20％。

本发明近平滑假丝酵母2A00015/25通过如下方法制备得到：首先利用近平滑假丝酵母2A00015菌体酶解制备获得原生质体，然后将制备好的原生质体在黑暗条件下在紫外光照射下进行诱变，诱变后恒温培养4-5天，筛选获得近平滑假丝酵母2A00015/25。所述诱变方法工艺简单，易于工业化。

本发明获得以下有益的效果：

1、本发明利用菌体通过尼罗红染色后与产油指示菌对比荧光强弱的方法进行产油菌株的筛选，对获得的产油菌株进行碳代谢分析，获得可利用廉价碳源糖蜜的高产油菌株近平滑假丝酵母2A00015。产油率高达44.18％。

2、本发明通过制备近平滑假丝酵母2A00015原生质体后紫外诱变的方法，获得高产油菌株的突变株，其产油率比原始菌株提高了20％，并且诱变方法简单，具有明显的工业应用价值。

附图说明

图1近平滑假丝酵母2A00015突变株生长及产油情况。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选近平滑假丝酵母2A00015

PYG培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母膏5.0g、琼脂粉15g，人工海水1000ml，pH自然。

筛选的酵母分离自太平洋航行中所采集的海水、生物及沉积物样品；其中2A00015酵母分离自东太平洋鲀鱼腮。

PYG培养基灭菌后冷却至60℃左右后添加尼罗红贮存液1.0mg/mL(Nile/DMSO)，使其最终浓度达到0.5μg/mL，倒入一次性平板，待平板完全冷却凝固后将所要筛选的酵母接种到平板，并在各平板上接入指示菌-皮状丝孢酵母(Trichosporn cutaneum)2.571(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。避光室温培养3-4天后置于波长为280-300nm紫外灯下观察，若有橙色荧光出现则为产油脂菌株，对比指示菌的荧光强度可粗略获知油脂含量高低。

通过上述筛选方初步获知编号2A00015酵母为高产油脂菌株，应用26SrDNA D1/D2序列扩增技术对2A00015进行菌种鉴定，2A00015为近平滑假丝酵母Candidaparapsilosis，为一株新高产油酵母菌，命名为近平滑假丝酵母2A00015(Candidaparapsilosis)。2013年7月21日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M2013354。

酵母2A00015的具体鉴定方法如下：

采用改进的CTAB法抽提酵母2A00015的染色体DNA，体提取方法如下：

1)接种已纯化的酵母2A00015至5mLPYG液体培养基中，经摇床过夜培养后，取1mL培养物经8000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水洗涤3次；

2)吸取400μL CTAB抽提液，加入β-巯基乙醇8μL(终浓度为2％)，预热至65℃；

3)收集的菌体经-70℃冷冻30min后，迅速加入预热的抽提液，65℃保温45-60min；

4)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀，13000r/min离心20min，将上层水相移入新管；此步骤重复两次；

5)加入0.6倍体积异丙醇,于4℃中沉淀20min；10000r/min，离心10min,去除上清，沉淀用70％乙醇洗涤2次，吹干；

6)以25μL无菌DDW溶解沉淀，-20℃保存备用。

提取结果显示染色体DNA大小在22kb左右，DNA条带清晰，纯度和浓度较高可直接用于PCR反应。以提取的染色体DNA为模板，选用酵母通用引物NL1及NL4，对26S rDNA D1/D2区的一段核糖体DNA进行PCR扩增。其反应体系及条件如下：

PCR反应条件：

PCR反应后，取5μL产物琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示电泳条带清晰，片段大小约为500-600bp，无明显非特异性扩增现象。

利用26S rDNA D1/D2区的序列分析方法对酵母2A00015菌株进行鉴定，通过与GenBank网络数据库比对，按照酵母2A00015与相应参照菌株同源性在99％-100％的标准(符合Kurtzman&Robnett所定的同种内不同菌株间差异一般不超过1％的标准)进行鉴定。

近平滑假丝酵母2A00015(Candida parapsilosis)的16sRNA如下：

1aaaccaacag ggattgcctt agtagcggcg agtgaagcgg caaaagctca aatttgaaat

61ctggcacttt cagtgtccga gttgtaattt gaagaaggta tctttgggtc tggctcttgt

121ctatgtttct tggaacagaa cgtcacagag ggtgagaatc ccgtgcgatg agatgaccca

181gacctatgta aagttccttc gaagagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg

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301gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgt tgaaagggaa

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481gtagtgtgtt atagtctttg tcgatactgc cagcctagac tgaggactgc ggcttcggcc

541taggatgttg gcataatgat cttaagtcgc

实施例2近平滑假丝酵母2A00015的碳代谢分析

将近平滑假丝酵母2A00015进行碳代谢分析，结果见表1，发现54种碳源中(Biolog微生物鉴定酵母板)有17种可以被近平滑假丝酵母2A00015利用，表明该酵母菌株能够利用的碳源相对较广。在可利用的16种碳源中包括了蔗糖，证实了该菌株可以利用廉价碳源糖蜜生产油脂。

表1 2A00015酵母菌株碳源利用情况

实施例3检测近平滑假丝酵母2A00015油脂含量

种子培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10、酵母膏5g、人工海水1000ml，pH自然。

分别将近平滑假丝酵母2A00015及实施例1中筛选得到的其他产油酵母接种到PYG培养基(与实施例1相同)上培养3天，用接种环取活化好的菌体于种子培养基中，28℃、160r/min摇床培养24h；取种子液以10％的接种量(v/v)接种于基础产脂培养基中(廉价糖蜜70g/L，硫酸铵1g/L，酵母粉0.25g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁2.0g/L。)，摇瓶装液量100mL/500mL，27℃，150r/min发酵120h。准确量取10mL发酵液，5000g离心5min，弃上清液，加入等量的无菌水清洗菌体，再次以5000g离心5min，重复两次，保存菌悬液以备待用。

将菌悬液用无菌水稀释至合适浓度，并控制菌悬液光密度值OD600在1.20以内，添加尼罗红贮存液(浓度0.5μg/mL Nile red/DMSO)，快速混匀，染色5min。用移液枪吸取200μL准确加入到黑色96微孔板中，每个样品做三个平行。选用SpectraMax M5多功能酶标仪(Molecular Devices公司)荧光检测功能，对96微孔板中的样品进行荧光特性测定。计算相同细胞密度下激发波长488nm、发射波长570nm处的相对荧光强度与油脂含量之间的相关性，Y＝0.1381X-9.1239(R²＝0.9639)。注：相对荧光强度为添加尼罗红样品的荧光强度减去未添加尼罗红样品荧光强度。Y代表油脂含量，X代表相对荧光强度。计算得出近平滑假丝酵母2A00015油脂含量达到44.18％。

近平滑假丝酵母2A00015/25发酵生产获得的油脂经甲酯化后，采用GC-MS法测定其脂肪酸组成。通过质谱谱图分析和计算机标准谱库检索，共鉴定出8种化合物，用峰面积归一化法分别测定了其相对含量，结果见表2。

气相色谱-质谱联用(GC-MS)条件

色谱柱：DBP5-MS，毛细管石英柱(50m×0.25mm,0.25μm)；载气:He；进样口温度：280℃；界面温度：250℃；柱子程序升温：120℃停2min，升温速率20℃/min升至250℃，保持15min；分流比：5:1；柱流量：1mL/min；扫描质量范围：33-400amu；检测电压：1.36kv。

表2近平滑假丝酵母2A00015/25发酵生产获得的油脂成分及含量

实施例4近平滑假丝酵母2A00015突变株的制备

1、近平滑假丝酵母2A00015原生质体的制备

将近平滑假丝酵母2A00015菌液倒入离心管中，离心(3000r/min，5min)，PC液洗两次，收集菌体。收集的菌体中加入预处理剂，用吸管混合均匀，置于30℃下恒温处理30min，离心(3000r/min，5min)，弃上清，无菌水洗涤2次。按1:30(菌体干重g:酶液总体积mL)的比例加入酶液(采用PC配制的酶液，含有蜗牛酶1.5％、纤维素酶1.0％、KCl0.8mol/L，配置后用0.22μm的过滤除菌膜过滤)酶解，用吸管混合均匀，30℃，110r/min，每隔15min用吸管吹吸几次，使形成的原生质体从菌丝上脱落下来，每隔30min取样镜检酶解程度，约处理1～2h即可停止酶解处理(即停止30℃水浴振荡)，离心(3000r/min，5min)，弃酶液，收集原生质体及未酶解细胞，用高渗溶液PCS洗涤，用4层擦镜纸过滤于一新无菌含有原生质体保存液离心管中(以滤去未被酶解的菌丝片段)，冷冻保存。

2、原生质体紫外诱变

将制备好的原生质体用高渗溶液PCS稀释至5×10³个/mL，取1个已灭菌的5cm培养皿，培养皿装有新制备的原生质体悬液5mL。先打开紫外线光管(30W)预热20min，使光波稳定诱变过程应在黑暗条件下进行，照明采用红色灯泡预热完成后，对着培养皿使用15W紫外灯在30cm处照射4min，然后取1mL适当稀释后涂布于再生培养基上。平板用黑布包裹后置于黑暗闭光的28℃恒温箱培养4～5d。

优先选取生长速度快、直径最大、生长最旺盛的菌落，接入斜面培养基，准备进行进一步筛选。斜面培养基(PDA培养基)：去皮马铃薯200g，切成小块，加人工海水1000ml，煮沸1h，双层纱布过滤成清液后添加10g葡萄糖，加人工海水补足至1000ml，琼脂粉2％，pH自然。

按照实施例三的方法进行发酵和测定菌体的生物量、相对荧光值两项数据(结果如图1)，从图1可以确定高突变产油菌株Number25(N.25)，其产油率为64.06％，比原始菌株提高了20％。

采用实施例1所述的CTAB法抽提法获得高突变产油菌株N.25的16SrDNA基因片段，提交EzTaxon数据库进行比较，其与已知近平滑假丝酵母Candida parapsilosis(U45754)的相似性为99.6％，确定菌株为近平滑假丝酵母Candida parapsilosis，命名为近平滑假丝酵母2A00015/25Candida parapsilosis。2013年6月20日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC M2013271。

近平滑假丝酵母2A00015/25Candida parapsilosis的16sRNA如下：

1aaaccaacag ggattgcctt agtagcggcg agtgaagcgg caaaagctca aatttgaaat

61ctggcacttt cagtgtccga gttgtaattt gaagaaggta tctttgggtc tggctcttgt

121ctatgtttct tggaacagaa cgtcacagag ggtgagaatc ccgtgcgatg agatgaccca

181gacctatgta aagttccttc gaagagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg

241gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg

301gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgt tgaaagggaa

361gggcttgaga tcagacttgg tattttgtat gttactcttt cgggggtggc ctctacagtt

421taccgggcca gcatcagttt gggcggtagg agaattgcaa agaaatgtgg cactgcttcg

481gtagtgtgtt atagtctttg tcgatactgc cagcctagac tgaggactgc ggcttcggcc

541taggatgttg gcataatgat cttaagtcgc

上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (4)

1.一种产油酵母菌株，其特征在于：所述菌株为近平滑假丝酵母2A00015(Candidaparapsilosis)，其微生物菌种保藏号为CCTCC M 2013354。

2.一种产油酵母菌株的突变株，其特征在于：所述突变株为如权利要求1所述的近平滑假丝酵母2A00015的紫外诱变突变株，所述突变株为近平滑假丝酵母2A00015/25(Candidaparapsilosis)，其微生物菌种保藏号为CCTCC M 2013271。

3.如权利要求1所述的产油酵母菌株的应用，其用于产油脂。

4.如权利要求2所述的产油酵母菌株的突变株的应用，其用于产油脂。