KR101818811B1 - 신규한 캔디다 파라프실로시스 us01 미생물 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 캔디다 파라프실로시스 us01 미생물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

석유화학 공장의 폐수처리시설로부터 분리된 알케인, 지방산 및 지방산 유도체 등의 소모 속도가 빠르며, 알케인 등을 단일 탄소원으로 이용하여 빠른 세포 성장을 나타내는 특징을 가지는 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)균주를 이용하여, 알케인 등을 함유하는 산업폐수 및 유해환경물의 처리와 석유의 분해 등에 산업적으로 이용될 수 있다.

Description

신규한 캔디다 파라프실로시스 US01 미생물 및 이의 용도{NOVEL STRAIN CANDIDA PARAPSILOSIS US01 AND USES THEREOF}
본 발명은 알케인, 지방산 및 지방산 유도체 등의 소모 속도가 빠르며, 상기 탄소원을 단일 탄소원으로 하여 빠른 세포 성장을 나타내는 세포 특징을 가지는 신규한 캔디다 파라프실로시스 US01 미생물 및 이의 용도에 관한 것이다.
폐수처리는 크게 물리적, 화학적, 생물학적 처리로 나누어진다. 물리적 처리는 주로 고형물의 제거, 화학적 처리는 화학약품의 주입을 통한 pH 조정과 중금속의 제거, 그리고 생물학적 처리는 미생물에 의한 유기물의 제거를 일차적인 목적으로 한다. 폐수처리 공정은 보통 진행 단계에 따라 1차, 2차, 3차 처리로 구분하는데, 1차 처리는 현탁 고형물을 제거하기 위해 침전, 부상 등의 방법을 사용하는 물리적 처리 공정이고, 2차 처리는 미생물의 활성을 이용하여 생 분해성 용존 유기물을 제거하는 생물학적 처리 공정이며, 3차 처리는 1, 2차 처리에서 제거되지 않은 질소, 인, 잔류 유기물, 고형물, 염분 등을 제거하는 공정이다. 2차 처리 공정인 생물학적 처리는 폐수의 수질오염물질을 영양물질로 섭취분해, 안정화시킬 수 있는 미생물의 능력을 이용하는 방법이다.
폐수 처리 공정에서 있어서 근래의 세계적 추세는 처리 단가가 비교적 낮으며, 2차 오염물의 발생이 적은 생물학적 처리, 또는 생물학적 처리와 화학적 처리를 병행하는 경향이 있다. 특정 화합물, 난분해성 물질, 중금속 등에 대한 분해 미생물들의 연구는 국내외에서 활발히 진행되고 있는 실정이다.
석유 화학 공장의 폐수에는 고농도의 다양한 알케인이 포함되어 있으며, 종래의 석유화학 공장의 폐수처리시설에는 고농도의 다양한 알칸류를 처리하기 위해 오일 세퍼레이터(CPI, Coagulated plate interceptor)에서 일차로 폐수를 처리한 후, 폭기조, 침전조 등을 거쳐 폐수 처리를 진행한다.
석유화학 공장 폐수의 생물학적 분해를 위하여 상기와 같이 고농도의 다양한 알케인이 포함된 석유화학 공장의 폐수를 생물학적으로 분해·활용하기 위한 신규한 미생물이 필요하다.
본 발명에서는 상기와 종래 기술의 같은 문제점을 해결하기 위해, 폐수를 생물학적 공정으로 분해하는 신규한 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
신규한 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP) 균주를 제공한다.
본 발명의 신규한 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)균주는 알케인, 지방산 및 지방산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원을 이용하는 것 일 수 있다.
상기 탄소원은 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합 일 수 있다.
신규한 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)균주는 탄소 자화능에 있어서 하기 표와 같은 반응성을 나타내는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
[표]
Figure 112015080716259-pat00001
또한 본 발명은, 상기와 같은 균주를 사용하여 폐수를 처리하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기와 같은 균주를 사용하여 알케인, 지방산 및 지방산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원을 이용하여 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid; DDDA)을 생산하는 방법을 제공한다.
석유화학 공장의 폐수처리시설로부터 분리된 알케인, 지방산 및 지방산 유도체 등의 소모 속도가 빠르며, 상기 탄소원을 단일 탄소원으로 이용하여 빠른 세포 성장을 나타내는 특징을 가지는 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)균주를 이용하여, 알케인을 함유하는 산업폐수 및 유해환경물의 처리와 석유의 분해 등에 산업적으로 이용될 수 있다.
도 1은 경쟁유도 연속식 집적 배양장치를 간략하게 나타내는 도면이다.
도 2는 경쟁유도 연속식 집적 배양에서 미생물의 시간에 따른 OD값 및 희석률변화를 타나내는 그래프이다.
도 3은 분리균주(캔디다 파라프실로시스 US01)의 18s rRNA 염기서열을 나타낸다.
도 4은 분리균주(캔디다 파라프실로시스 US01)의 pH에 따른 성장률을 나타내는 그래프이다.
도 5는 캔디다 파라프실로시스 US01(KCTC 12819BP) 및 동종균주인 캔디다 파라프실로시스(KCTC 7214)의 시간에 따른 도데칸 소모 속도 및 생산되는 균체량을 나타내는 그래프이다.
도 6는 캔디다 파라프실로시스 US01(KCTC 12819BP) 및 표준균주인 캔디다 트로피칼리스(ATCC 20336)의 시간에 따른 도데칸 소모 속도 및 생산되는 균체량을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변화를 가할 수 있고, 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
'알케인'은 '알케인' 또는 '알칸'으로 표시 될 수 있으며, 탄소원자 및 수소 원자만으로 이루어지고, 배타적으로 탄일 결합을 포함하는 화학적 화합물인 포화 탄화수소를 말한다.
'지방산'은 사슬 모양의 포화 또는 불포화 모노카르복시산을 지칭한다.
'지방산 유도체'는 전술한 지방산의 에스테르를 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 신규한 균주는 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신규한 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP) 균주는 알케인, 지방산, 지방산 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원을 이용하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, '알케인'은 '알케인' 또는 '알칸'으로 표시 될 수 있으며, 탄소원자 및 수소 원자만으로 이루어지고, 배타적으로 단일 결합을 포함하는 화학적 화합물인 포화 탄화수소를 말한다.
바람직하게는 탄소수 6 내지 30, 더욱 바람직하게는 탄소수 8 내지 20의 알케인을 사용할 수 있다.
또한 지방산은 사슬 모양의 포화 또는 불포화 모노카르복시산을 지칭한다. 탄소수 6 내지 30의 지방산일 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 8 내지 20의 지방산일 수 있다. 탄소수 8 내지 20의 포화 지방산인 것이 보다 바람직하다.
지방산 유도체는 전술한 지방산의 에스테르를 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시예에 따르면, 상기 탄소원은 상기 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
바람직한 실시예에 따르면, 상기 탄소원은 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate) 및 라우르산(lauric acid) 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 신규한 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)균주는 탄소원 자화능에 있어서 하기 표와 같은 반응성을 나타내는 것 일 수 있다.
[표]
Figure 112015080716259-pat00002
본 발명의 신규한 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)균주는 pH 4 내지 pH 7의 산도에서 세포 성장을 나타내며, 더욱 바람직하게는 pH 7±0.5의 산도에서 최적의 세포 성장을 나타내는 것 일 수 있다.
또한 본 발명은, 상기와 같은 균주를 사용하여 폐수를 처리하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 상기와 같은 균주를 사용하여 알케인, 지방산 및 지방산 유도체로부터 선택되는 하나 이상을 탄소원으로 하여 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid; DDDA)을 생산하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 기술 사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허 청구범위에 속하는 것도 자명한 것이다.
< 실시예 1>균주의 분리
고농도의 다양한 탄소원이 포함된 석유화학 공장의 폐수를 처리 하기 위해 오일세퍼레이터(CPI, Coagulated Plate Interceptor)에서 일차적으로 처리를 진행한 후 균등조, 폭기조, 침전조 등을 거쳐가며 폐수 처리를 진행하는 석유화학 공정의 폐수처리시설의 오일세퍼레이터(CPI), 폭기조, 침전조에서 시료를 채취하였다.
상기 시료는 오일세퍼레이터의 유입수, 오일세퍼레이터의 방류수, 균등조 방류수, 폭기조 유입수, 폭기조 방류수, 침전조 유입수 및 침전조 방류수에서 폐수 샘플을 1L 멸균 수질 샘플 팩에 채취하여 준비하고, 채취한 시료는 아이스박스에 넣어 실험실로 이송하였다. 상기 채취한 샘플의 일부를 하기 표 1에 나타낸 1차 배양 배지의 조성으로 만들어진 고체 배지(agar plate)에 1차 평판도말(spreading)하고, 30℃ 항온 배양기에서 1주일간 배양하였다. 배양 후, 도데칸(Dodecane; C12 알케인)이 포함된 배양액에서 생장성이 빠른 균주를 선별하기 위해, 고체 배지에 생성된 군락(colony)들을 채취하여, 하기 표 1에 나타낸 2차 배양 배지의 조성으로 만들어진 도데칸(Dodecane; C12 알케인)을 유일한 탄소원으로 포함하는 경쟁 유도 연속식 집적배양 배지에 접종하여 30?, 1 v/v/m 통기량, 400 rpm 교반속도 및 pH 5.0 (controlled by 10N NaOH)의 조건의 경쟁 유도 연속식 집적배양장치(도 1)에서 배양 하였다. 상기 경쟁 유도 연속식 집적배양 시 초기 투입된 20g/L의 도데칸을 소진한 후, 추가로 40g/L의 도데칸이 포함된 하기 표 1의 추가 배지를 투입하여 희석률(dilution rate)을 0에서 0.4까지 상승 시켜, 최종적으로 생장성이 가장 우수한 균주 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)를 분리 하였다. 상기 실험에서 일부 미생물의 성장을 억제하기 위하여 항생제 카나마이신 25m g/L를 사용하였다. 상기 실험 결과를 도 2 에 나타내었다.
배지 조성 1차 배양 배지
(고체 배지)		 경쟁 유도 연속식 집적배양 배지
2차 배양 배지 추가 배지
YNB
(Yeast nitrogen base without amino acid)		 6.7 g/L 20 g/L 20 g/L
도데칸(Dodecane) 10 g/L 20 g/L 40 g/L
계면활성제 Gum Arabic 0.5 % Tween 80 3 mL/L Tween 80 3 mL/L
< 실험예 1> 분리균주의 18s rRNA 유전학적 분석
상기 실시예 1에서 분리한 분리균주에 대해서 18s rRNA 염기서열분석법으로 분석하였다. Yeast gDNA prep kit(PureHelixTM, NANOHELIX)를 이용하여 상기 실시예 1의 분리균주의 genomic DNA를 추출하고, 상기 추출한 genomic DNA를 주형으로 하기 표 2의 18s ITS 1/4 primer를 이용한 PCR 반응으로 증폭 시킨 후, TA 벡터 클로닝 시킨 후, DNA 시퀀싱 반응을 통하여 18s rRNA 염기서열을 얻었으며, 상기 염기서열은 도 3 및 서열번호 1에 나타내었다.
염기서열(5' → 3') 서열번호
정방향 프라이머 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 서열번호 2
역방향 프라이머 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 서열번호 3
서열번호 1에 나타낸 상기 분리 균주의 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment search tool)을 사용하여 균주의 상동성을 조사하였다. 상기 조사결과는 하기 표 3에 나타내었다.
분리 균주 서열의 길이 근연종 상동성
Candida parapsilosis US01 523bp Candida parapsilosis isolate ZA039(FJ662416) 100%
상기 표 3에 나타낸 바와 같이 상기 분리균주는 캔디다 파라프실로시스 ZA039와 높은 상동성을 가지는 근연종인 것을 확인 할 수 있었다.
< 실험예 2> 캔디다 파라프실로시스 US01 ( Candida parapsilosis US01 )( KCTC 12819BP)의 탄소원 자화능 ( 資化能 ) 분석
상기 균주(캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP))의 탄소원 자화능을 알아보기 위하여 API 20c AUX Biomerieux 社)를 사용하여 분석하였다. API 20c AUX (Biomerieux 社)를 이용하여 분석한 실험 결과는 동종의 캔디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis; API kit 참고자료) 및 표준 균주 캔디다 파라프실로시스 PYCC 2545 (Candida parapsilosis PYCC 2545)와 비교분석 하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
탄소원 실시예 1
(Candida parapsilosis US01; KCTC 12819BP)		 비교예 1
(Candida parapsilosis; API kit reference )		 비교예 2
(Candida parapsilosis PYCC 2545)
글루코오스(Glucose) + + +
글리세롤(Glycerol) - + +
2-케토-D-글루콘산
(2-keto-D-gluconate)		 + + .
L-아라비노오스(L-Arabinose) + + +
D-자일로스(D-Xylose) + + +
아도니톨(Adonitol) - + +
자일리톨(Xylitol) - - .
D-갈락토스(D-galactose) + + +
이노시톨(Inositol) - - -
D-솔비톨(D-Sorbitol) + + +
A-메틸-D-글루코시드
(A-Methyl-D-glucoside)		 - + +
N-아세틸-D-글루코사민
(N-Acetyl-D-glucosamine)		 + + +
D-세롤비오스(D-Cellobiose) - - -
D-젖당(D-Lactose) - - -
D-맥아당(D-Maltose) + + +
D-자당(D-Saccharose (Sucrose)) + + +
D-트레할로오스(D-Trehalose) - + +
D-멜레치토오스(D-Melezitose) + + +
D-라피노오스(D-Raffinose) - - -
상기 표 4에 나타낸 바와 같이 비교예 1(Candida parapsilosis; API kit reference) 및 비교예 2(Candida parapsilosis PYCC 2545)와 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(실시예 1)을 비교하였을 때, 비교예 1 및 비교예 2는 탄소원으로 글리세롤, 아도니톨, A-메틸-D-그루코시드 및 D-트레할로오스를 이용 가능한 반면, 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(실시예 1)은 탄소원으로 글리세롤, 아도니톨, A-메틸-D-그루코시드 및 D-트레할로오스를 이용하지 못함을 알 수 있었다. 상기 실험 결과와 같이 본 발명의 신규한 캔디다 파라프실로시스 US01(KCTC 12819BP)은 기존의 균주들과 비교하여 탄소 자화능에서 큰 차이를 보이는 것을 확인 할 수 있었다.
< 실험예 3> 캔디다 파라프실로시스 US01 ( Candida parapsilosis US01 )( KCTC 12819BP)의 최적 성장 pH
캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)의 최적 성장 pH를 알아보기 위하여, 상기 균주를 아미노산이 포함되지 않은 YNB(Yeast Nitrogen base (without amino acid)) 배지의 초기 pH를 4 내지 7로 다양하게 설정하고 배양하였다. 상기 실험 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)의 최적 성장 pH는 pH 7인 것을 확인 할 수 있었다.
< 실험예 4> 캔디다 파라프실로시스 US01 ( Candida parapsilosis US01 )( KCTC 12819BP))의 알케인 ( C 12 ) 기질 섭취 속도 비교
캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)의 알케인(C12) 기질 배양에서의 알케인(C12) 소모 속도 및 생산되는 균체량에 대하여 알아보기 위하여, 20 g/L의 알케인(C12)을 탄소원으로 첨가한 아미노산이 포함되지 않은 YNB(Yeast Nitrogen base (without amino acid)) 배지에 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP) (실시예 1) 및 비교 균주로서 동종의 캔디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis; KCTC 7214)(비교예 3) 및 표준균주 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis; ATCC 20336)(비교예 4)를 배양하였다. 상기 실험 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP)의 알케인(C12) 소모 속도는 일(24시간)당 5.9 g/L로 비교균주인 동종의 캔디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis; KCTC 7214)(비교예 3)의 알케인(C12) 소모 속도인 일당 4.4 g/L에 비해 약 35% 빠른 속도로 알케인(C12)을 소모하였고, 균체 생산량 또한 비교 균주(비교예 3)에 비해 약 13% 가량 높은 것을 확인 할 수 있었다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 표준 균주 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis; ATCC 20336)(비교예 4)의 알케인(C12) 소모 속도인 일당 3.10 g/L와 비교하여 약 1.9배 빠른 속도로 알케인(C12)을 소모하였고, 균체 생산량 또한 표준 균주(비교예 4)에 비해 약 31% 가량 높은 것을 확인 할 수 있었다.
<110> LOTTE CHEMICAL CORPORATION <120> NOVEL STRAIN CANDIDA PARAPSILOSIS US01 AND USES THEREOF <130> DPA-0685 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 523 <212> DNA <213> Candida parapsilosis US01 <400> 1 cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttacagaatg aaaagtgctt aactgcattt 60 tttcttacac atgtgttttt ctttttttga aaactttgct ttggtaggcc ttctatatgg 120 ggcctgccag agattaaact caaccaaatt ttatttaatg tcaaccgatt atttaatagt 180 caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tcgcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240 ataagtaata tgaattgcag atattcgtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc 300 ctttggtatt ccaaagggca tgcctgtttg agcgtcattt ctccctcaaa ccctcgggtt 360 tggtgttgag cgatacgctg ggtttgcttg aaagaaaggc ggagtataaa ctaatggata 420 ggttttttcc actcattggt acaaactcca aaacttcttc caaattcgac ctcaaatcag 480 gtaggactac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga gga 523 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s ITS quarter forward primer <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s ITS quarter reverse primer <400> 3 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (7)

  1. 탄소원 자화능에 있어서 하기 표와 같은 반응성을 나타내는 것을 특징으로 하는 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP) 균주.
    [표]
    Figure 112017016266058-pat00010
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 균주는 알케인, 지방산 및 지방산 유도체로부터 선택되는 하나 이상을 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP) 균주.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 탄소원은 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP) 균주.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 균주는 pH 4 내지 pH 7의 산도에서 세포 성장을 나타내는 것을 특징으로 하는 캔디다 파라프실로시스 US01(Candida parapsilosis US01)(KCTC 12819BP) 균주.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 균주를 사용하여 폐수를 처리하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 5 항 중 어느 한 항의 균주를 사용하여 알케인, 포화지방산 및 포화지방산 에스테르로부터 선택되는 하나 이상의 탄소원을 이용하여 도데칸디오익산(dodecanedioic acid; DDDA)을 생산하는 방법.
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