CN111655838B - 产油酵母菌的变体及其用于脂质生产的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及油脂丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)物种的产油酵母菌的变体，其特征在于相对于相同物种的野生型菌株改变其形态的影响细胞壁合成的突变。特别地，受益于所述突变，形成了细胞聚集体，其相对于相同物种的野生型菌株而言，降低了培养液的粘度，更易于从中被分离出来，从而使其易于回收。所述的油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌的变体的特征还在于较相同物种的野生型菌株具有相似或甚至更高的油质细胞生物质产量和细胞内脂质积累。此外，本发明涉及通过油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌的所述变体生产脂质的方法。由此获得的脂质可以有利地用作合成中间体，特别是在所谓的“绿色化学”领域中，或在生物燃料的生产中，例如可以用作“生物柴油”或“绿色柴油”，其可以以本身使用或与其他燃料混合运输。

Description

产油酵母菌的变体及其用于脂质生产的用途

技术领域

本发明涉及油脂丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)物种的产油酵母菌的变体。

更具体地，本发明涉及油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌的变体，其特征在于相对于相同物种的野生型菌株改变其形态的影响细胞壁合成的突变。特别地，受益于所述突变，形成了细胞聚集体，其相对于相同物种的野生型菌株而言，降低了培养液的粘度，更易于从中被分离出来，从而使其易于回收。

所述的油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌的变体的特征还在于较相同物种的野生型菌株具有相似或甚至更高的油质细胞生物质产量和细胞内脂质积累。

此外，本发明涉及通过油脂丝孢酵母物种的产油酵母菌的所述变体生产脂质的方法。

由此获得的脂质可以有利地用作合成中间体，特别是在所谓的“绿色化学”领域中，或在生物燃料的生产中，例如可以用作“生物柴油”或“绿色柴油”，其可以以本身使用或与其他燃料混合运输。

背景技术

通过微生物学方法生产脂质被认为是目前从可再生资源生产脂质的有利替代方案。相对于从植物中提取脂质，微生物学方法更具成本效益，因为它们更易于扩展，需要的劳力较少，并且利用微生物的特性以低成本基质(例如来自木质纤维素材料水解的衍生物)的代价进行快速繁殖。此外，它们不受气候因素的影响并且不与农业上用于食物用途开发的土壤竞争。

为此目的特别有希望的是产油酵母菌，即可以在特定的培养条件下以其干重的25％以上积累脂质(尤其是甘油三酸酯)的酵母。例如在Meng X.et al,“RenewableEnergy”(2009),Vol.34,pag.1-5；Galafassi S.等人，“Bioresource Technology”(2012),Vol.111,pag.398-403中描述的，使用产油酵母菌生产脂质是现有技术的一部分。

通常，所述脂质通过在生物反应器中在有氧条件下培养产油酵母菌而获得。使用糖溶液培养产油酵母菌，所述糖溶液可以从含淀粉植物或含糖水果中获得并被定义为“第一代糖”，或者优选从处理和糖化不可食用的木质纤维素生物质而获得，并因此被定义为“第二代糖”。木质纤维素生物质可以是，例如，农业残留物(如麦秸或玉米秸秆)，或不能用于食品领域的植物(如普通芦苇、纤维高粱、芒属植物)或非食用植物(如银胶菊、桉树、白杨等)的加工残留物，或来自造纸工业的森林残留物或加工残留物。被称为水解产物的第二代糖的此类混合物包含具有5(C5)和6(C6)个碳原子的糖。产油酵母菌天然地能够在C5糖(如木糖)和C6糖(如葡萄糖)上生长，产生细胞生物质，并且在特定的生长条件下，以相对于干细胞重量的高百分比积累脂质。

通过在生物反应器中培养所述产油酵母菌，获得了包含要回收的油质细胞生物质的培养液。随后，必须将细胞中积累的脂质提取并与仍然存在的培养液和由适当的裂解或破裂技术产生的细胞碎片分离。

关于通过微生物学方法生产脂质的主要关键因素之一涉及以下事实：容积生产率(即每单位体积的培养液获得的脂质量)受到限制，并且通常小于100g/L。因此，这些生产方法的工业应用设想使用大量的所述微生物的培养液。当然，这大量的培养液必须在大型工厂中以较高的设备及加工成本进行处理，以回收形成的油质细胞生物质，并进行脂质的提取。

为了保证脂质生产方法的成本效益，产油酵母菌的培养物必须达到高细胞密度，从而允许提高所述方法的生产率以使培养液的体积和使用的生物反应器的数量最小化。在生长结束时，必须浓缩获得的油质细胞生物质，以减少所得产品(例如微生物油、脂质)的后续提取步骤中待处理材料的体积，并优化回收所需的设备尺寸和反应物的体积。

当前用于在上述产油酵母菌生长结束时从培养液中回收油质细胞生物质的技术方案主要是物理或化学性质的。

用于脂质工业生产的产油酵母菌，尤其是在它们达到高细胞密度的情况下，可导致高粘度的培养液，其中所得油质细胞生物质因其形态特征和具有表面活性剂性质的物质的合成而难于从水相分离。此外，由于培养基的混合和氧合效率较低，因此培养液的粘度使产油酵母菌在生物反应器中的培养更加困难和昂贵。在使用高产脂产油酵母(例如属于丝孢酵母属的那些)进行脂质生产的过程中，所述关键性尤为明显。

通常，为了从培养液中分离出脂质生产过程结束时获得的油质细胞生物质，所使用的技术利用了培养液两相(即水相和油质细胞生物质)之间存在的密度差异，例如离心、自发沉淀、水力旋流器、过滤、压滤、微滤、超滤，有时连续地与进行所述过程的生物反应器耦合。然而，在使用丝孢酵母属的产油酵母的情况下，所述技术的效率非常低，因为获得的油质细胞生物质的密度与水相的密度非常相似。

为了提高效率，可以将絮凝剂添加到培养液中以产生细胞聚集体，所述细胞聚集体因其尺寸而相对于单个细胞更容易沉淀。然而，以现有技术规定的比例添加絮凝剂并没有导致油质细胞生物质与水相分离的改善。此外，由于所述絮凝剂与用于提取的溶剂的高亲和力，絮凝剂的添加可能与随后的脂质提取工艺不相容。在实践中，所述絮凝剂可以与细胞内脂质一起被提取，因此其代表在使用脂质本身之前要除去的杂质。

用于浓缩油质细胞生物质的其他方法是基于过滤技术的。然而，通常由产油酵母菌产生的具有表面活性剂性质的物质阻碍了水相穿过用于过滤的膜的渗透，使该方法效率低下。

还已知设想蒸发过量水(例如加热以引起蒸发)的方法，或使用诸如喷雾干燥或冷冻干燥的技术干燥细胞生物质；然而，虽然所述方法在细胞生物质的浓缩中是有效的，但需要高能量消耗，并且对于随后生产合成中间体的工业过程在经济上是不可行的，特别是在所谓的“绿色化学”领域或在生物燃料的生产中。

还已知的方法是设想在中性或酸性pH下的热处理，其通常在所述过程结束时在将培养液从脂质生产过程使用的生物反应器中排出后进行，以使其适于离心/过滤并促进所获得的油质细胞生物质的回收。然而，所述方法还需要进一步的能量消耗，并且当在酸性pH下操作时需要中和被酸化的废物。

此外，上述某些方法可能导致包括要获得的最终产物的特征的细胞结构的降解。最后，在所使用的生物反应器内，上述方法不能解决培养液的粘度问题以及由于需要保持良好的搅拌和良好的氧合所导致的所需能源增加的问题。

为了克服上述缺点已经进行了研究。

例如，国际专利申请WO 2013/155050描述了一种用于从可再生资源生产材料的产油微生物，其中所述微生物包含未修饰的微生物中不存在的基因修饰，并且其中所述微生物相较于未修饰微生物产生具有较低粘度的发酵液。据说上述产油微生物减少了胞外多糖的合成，并且能够以高产量生产脂质。

由于从可再生资源生产材料，特别是脂质，仍然受到很大的关注，其可有利地用于所谓的“绿色化学”领域中的中间体合成的生产或生物燃料的生产，能够以高产量生产脂质并且更容易从培养液中回收的新的产油酵母的研究也受到很大的关注。

因此，申请人着手解决鉴定能够以高产量生产脂质并且更容易从培养液中回收的产油酵母的问题。

申请人现已鉴定出一种产油酵母变体，其能够以高产量生产脂质并且更容易从培养液中回收。

特别地，本发明涉及根据布达佩斯条约于2017年5月10日在莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物菌种保藏中心-Inhoffenstraβe 7B 38124Braunschweig(德国)提交的油脂丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)物种的产油酵母变体，保藏号为DSM 32508，其特征在于相对于相同物种的野生型菌株改变其形态的影响细胞壁合成的突变。特别地，由于所述突变，形成了细胞聚集体，其相对于相同物种的野生型菌株而言，降低了培养液的粘度，更易于从中被分离出来，从而使其易于回收。此外，所述产油酵母菌的变体的特征在于油质细胞生物量的产量和脂质在细胞内的积累与野生型菌株的相似或甚至更高。

本发明的另一个方面涉及通过培养所述物种油脂丝孢酵母DSM 32508的产油酵母菌的变体来生产脂质的方法。

出于本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，否则数值范围的定义总是包括限值。

出于本说明书和所附权利要求的目的，术语“包括”还包括术语“基本上由...组成”或“由...组成”。

出于本说明书和所附权利要求的目的，术语“生物柴油”是指用于柴油发动机的燃料，其包含衍生自生物来源的长链脂肪酸的烷基酯(例如，甲基、丙基或乙基)。

出于本说明书和所附权利要求书的目的，术语“绿色柴油”是指用于柴油发动机的燃料，其包含在氢和至少一种催化剂存在下衍生自生物来源的脂质的氢化或脱氧产物。

出于本说明书和所附权利要求的目的，表述“培养(cultivation)”和“培养(culture)”表示在人类控制的条件下微生物细胞生长和繁殖的过程。通过以上表达定义的过程包括在本发明的一些实施方案中实现的油质酵母的“培养”。

出于本说明书和所附权利要求书的目的，表述“培养基”是指提供以支持微生物(例如产油酵母细胞)生长的液体或凝胶。培养基可以具有确定的组成(例如“YEPD”培养基、“B”培养基等)，或者可以源自非选定来源的处理，例如废水、市场垃圾或水解木质纤维素材料。

出于本说明书和所附权利要求的目的，表述“碳源”、“氮源”、“硫源”和“磷源”是指有机或无机物质，或分别基于碳、氮、硫(例如硫酸盐)和磷(例如磷酸盐)的所述物质的组合物，其包含于培养基中并且可以被微生物代谢以产生能量。

出于本说明书和所附权利要求的目的，术语“生物质”是指在根据本发明的脂质生产过程中或在其他培养方法中产生的细胞的集合。

通过以下详细描述，本发明的其他特征和优点将变得清楚。

发明内容

因此，本发明的主题由根据布达佩斯条约于2017年5月10日在莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物菌种保藏中心-Inhoffenstraβe 7B 38124Braunschweig(德国)提交的油脂丝孢酵母物种的产油酵母变体(保藏号为DSM 32508)构成。

如下述实施例4中所述，油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的基因型通过将其基因组DNA序列与产油酵母油脂丝孢酵母ATCC 20509野生型菌株的基因组DNA序列比较来表征。

油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母野生型菌株的基因组大小为19601063个碱基对(bps)并且包含8283个基因。其中，已鉴定出3621个具有已知功能的基因并注释了4419个基因。通过与油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的基因组比较，共发现了647个突变，其中228个为纯合子的突变，420个为杂合子的突变。

下文描述了影响编码区的突变，其直接或间接地导致每个突变所在的基因编码的蛋白质的氨基酸序列的改变。特别地，分析了参与细胞壁合成过程的蛋白质，其改变可影响细胞形态、培养液的粘度特性以及存在于所述培养液中的酵母细胞的沉降难易性。更特别地，共有131个导致相应蛋白质氨基酸序列的改变的编码区突变。在后者中，22个突变是由于缺失，13个突变是由于插入，89个突变是由于单核苷酸变异(SNV)，3个突变是由于多核苷酸变异(MNV)。鉴定出30个纯合突变(发现于单个拷贝的基因中)。在这些突变中，特别是缺失突变产生其蛋白与细胞壁组分(特别是几丁质)相关的基因，不希望比照任何理论地，可能与油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变异体的不同形态的表型相关，并确定其更大的沉降便利性(可离心性)。实际上，缺失突变导致具有几丁质合成酶活性(通过同源性标注为酿酒酵母的几丁质合成酶4)的蛋白质的合成的缺乏，从而阻止了形成完整细胞壁所必需的几丁质的正确生产。实际上，在几丁质合成中存在突变的酿酒酵母的变体在子细胞与母细胞的分离中显示出缺陷，因此产生了未分离细胞群。此外，与例如在以下文献中报道的野生型菌株相比，这些细胞显示出不同的形状和尺寸：Bulawa C.E.，“Annual Review ofMicrobiology”(1993)，Vol.47,pag.505-534；Cabib E.等人，“Nature ReviewsMicrobiology”(2013)，Vol.11,pag.648-655。

在蛋白质的编码区中鉴定出269个杂合突变(存在于多于一个拷贝的基因中)，其中的92个在功能已知的蛋白质的编码基因中。这其中，三个突变影响了细胞壁或细胞膜组分相关蛋白的编码基因，因此可能涉及其形态和功能特征的改变。特别地，缺失突变涉及编码假定的膜脂蛋白的基因。第二个突变通过产生蛋白质中单个氨基酸变化的单核苷酸变异(SNV)，影响编码参与N-乙酰氨基葡萄糖基磷脂酰肌醇(GlcNAc-PI)生物合成的酶的基因，GlcNAc-PI是“GPI锚”(即将蛋白质锚固到细胞壁所需的糖脂)的“通路”中的第一个中间体。第三个突变也是通过单核苷酸变异(SNV)，涉及编码具有几丁质合成酶活性的蛋白质的基因，因此参与了几丁质的合成(通过同源性标注为酿酒酵母的几丁质合成酶1)。同样在这种情况下，不希望比照任何理论地，所有所述突变(甚至是杂合的，但与影响几丁质合成的纯合突变关联)都可能与油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的不同形态的表型相关，并决定细胞壁结构的重大变化，产生更易于与培养液水相分离的细胞聚集体。

下表1和表2显示了相对于野生型菌株(野生型)，在油脂丝孢酵母物种DSM 32508(突变体)的产油酵母变体的基因组DNA中检测到的导致蛋白质序列改变的突变。对于每个突变，指示了在所谓的“骨架(scaffold)”上的位置，即在基因组DNA的连续区域之一上，所述基因组DNA基于其核苷酸序列组装，允许基因组的重建。表1和表2还表明：突变类型：SNV“单核苷酸变异”，即单核苷酸突变；MNV：“多个核苷酸变异”，即序列中多个核苷酸的突变；一个或多个核苷酸的插入；一个或多个核苷酸的缺失；涉及的核苷酸数，即分别在野生型菌株的基因组和产油酵母DSM 32508变异体的基因组中发生变化(通过突变、插入或缺失)的一个或多个核苷酸。纯合突变是在基因组中以单拷贝形式存在的基因中发现的突变(表1)；杂合突变是在基因组中以多拷贝形式存在的基因中发现的突变(表2)。

与野生型菌株相比，油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞形态的改变在多种实验中得到了验证，其中一些在下面提供的实施例中进行了描述，其中所述改变在光学显微镜下以及通过流式细胞荧光法均可检测到。此外，确定了在根据本发明的脂质生产过程中生物质的产生和脂质的积累量。最后，确定了在接种后的不同时间从所述方法获得的培养液的粘度和可离心性(centrifugability)(即，浓缩系数)。

本发明目的的油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体是通过诱变方法获得的，该诱变方法是通过将油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞暴露于230nm至260nm的波长范围的紫外线(UV)辐射而进行的。暴露于UV辐射下的诱变可以根据例如在Winston F.等人，“Current Protocols in Molecular Biology”(2008),DOI:10.1002/0471142727.mb1302s82,John Wiley&Sons中描述的现有技术进行。例如，所述诱变可以通过将置于培养皿中以琼脂固化的培养基上的油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞暴露于UV辐射源(由至少一盏功率在8瓦至15瓦，波长在230nm至260nm范围内的灯代表)来进行，所述紫外线辐射源放置在距培养皿10cm到50cm的距离内，持续5秒到5分钟的时间。

如上所述，本发明还涉及通过培养油脂丝孢酵母物种的产油酵母的所述变体来生产脂质的方法。

因此，本发明的另一主题是生产脂质的方法，其包括：

-制备接种物，其包含至少一种油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体；

-将所述接种物加入到培养装置中以获得培养液；

-分离所述培养液以获得包含脂质和水相的浓缩油质细胞生物质的水悬浮液；

-提取酵母细胞内积累的细胞内脂质。

为了实现本发明方法的目的，所述培养装置可以是例如生物反应器，并且所述分离可以例如通过离心进行。

根据本发明的优选实施方案，所述方法可以在10℃至40℃，优选20℃至35℃的温度范围内进行。

根据本发明的优选实施方案，所述方法可以进行40小时至200小时，优选80小时至150小时的时间。

根据本发明的优选实施方案，所述方法可以在有氧条件下进行。

所述有氧条件可以例如通过将无菌空气吹入培养装置并通过可变的搅拌来促成，所述搅拌取决于所使用的培养装置的类型。

根据本发明的优选实施方案，所述方法可以在4.5至7.0，优选5.0至6.5的pH下进行。为了将pH保持在期望的范围内，可以向培养基中添加能获得所需的pH值的量的至少一种无机碱的水溶液，例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化钙[Ca(OH)₂]、氢氧化镁[Mg(OH)₂]或其混合物，优选氢氧化钾(KOH)，或至少一种无机酸的水溶液，例如磷酸(H₃PO₄)、硫酸(H₂SO₄)、盐酸(HCl)或其混合物，优选硫酸(H₂SO₄)。

根据本发明的优选实施方案，所述方法可以从培养基总体积的1％至5％(体积/体积)的量的接种物开始进行，所述接种物是从所述的油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的先前培养物获得的，所述方法在同一培养基中进行6小时至24小时的时间。

所述先前的培养物又可以通过在前的培养物进行接种，或者可以从所述油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的样品开始接种，所述样品在-80℃保持在含有15％(vol/vol)甘油的悬浮液中。

根据本发明的优选实施方案，所述方法可以在包含葡萄糖作为碳源和硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]作为氮源的培养基中进行。

根据本发明的优选实施方案，所述方法可以以分批补料的方式进行。

根据本发明的优选实施方案，在接种后15小时至25小时的时间之后，所述方法可以添加另外的氮源(例如玉米浆、酵母提取物、硫酸铵、尿素)使添加至培养液中的氮的总量在0.5g/L至5g/L的范围内以进一步以分批补料的方式进行，优选进行25小时至175小时，更优选65小时至125小时的时间。

根据本发明的优选实施方案，在接种后15小时至25小时的时间之后，所述方法可以添加葡萄糖水溶液使培养液中葡萄糖的浓度恒定在25g/L至50g/L的范围内进一步以分批补料的方式进行，优选进行25小时至175小时，更优选65小时至125小时的时间。

培养过程中的细胞生长可以通过分光光度法测定以确定培养液样品在660nm(OD₆₆₀)下的浊度或光密度(OD)。

在上述方法结束时，可以通过现有技术中已知的方法，例如过滤、压滤、微滤或超滤、离心，优选通过离心，将所用的油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞与培养液分离。优选地，所述离心可以在3000rpm至9000rpm，优选4000rpm至8000rpm的转速下进行5分钟至30分钟，优选15分钟至25分钟。应当指出，指示的离心操作条件涉及以实验室规模进行的方法：在工业方法的情况下，其中通常使用连续的离心机，本领域技术人员将能够适应所述运行条件。

获得的油质细胞生物质的浓度可以以克/升培养液测量，以确定在预定时间间隔和所述方法结束时所取的已知体积的培养液样品中的产油酵母细胞的干重。特别地，油质细胞生物质的“干重”是指在已知体积的培养液中包含的细胞的重量，其通过在105℃通风炉中热处理除去所有水分至恒重(约24小时)后称重上述细胞来确定。

为了回收脂质，可以根据现有技术中已知的，例如在国际专利申请WO 2014/102254中描述的方法，对获得的油质细胞生物质进行细胞裂解，所述方法包括例如在加压反应器中进行热处理、用均质器(homogenizor)进行机械处理或微波处理。

在所述细胞裂解结束时，可以根据现有技术中已知的，例如在国际专利申请WO2014/102254中描述的方法，从获得的悬浮液中通过用极性或非极性有机溶剂提取回收脂质。

本发明的主题的方法结束时由产油酵母生产的脂质可以直接在酵母细胞悬浮液的样品中通过现有技术中已知的比色方法测量，所述方法例如使用硫代磷酸香兰素(sulpho-phospho vanilline)，其使用“总脂质–硫代磷酸香兰素(sulpho-phosphovanilline)”试剂盒(Spinreact S.A.U.,Ctra.Santa Coloma,7E-17176St.Esteve d’enBas(GI),西班牙出售)。

此外，可以用重量分析法对用有机溶剂混合物从冷冻干燥的生物质样品中提取的部分测定产生的脂质的量，所述有机溶剂混合物例如，氯仿：甲醇2：1(体积/体积)，如FolchJ.等人，“The Journal of Biological Chemistry”(1957),vol.226,pag.497-509所述；或正己烷：异丙醇3：2(体积/体积)，如Hara A.等人,“Analytical Biochemistry”(1978),Vol.90,pag.420-426所述。

因此，为了评估在本发明的主题的方法中，油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体相较于野生型菌株的有关脂质积累的性能，在以下实施例中，在所述方法结束时，用上述列举的方法确定生物质的干重(以g/L表示)和脂质的量(以g/L表示)，并计算这两个参数之间的百分比。

要注意的是，根据本发明的主题的方法操作，油脂丝孢酵母物种DSM 32508变体相较于相同物种的野生型菌株可以使生产率提高多达50％以及使脂质效价(titer)提高多达70％。

还应注意，根据本发明的主题的方法的操作，所述方法结束时获得的培养液粘度(在具有相同浓度的产油酵母细胞和脂质含量的情况下，在相同操作条件下进行)，油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体比油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株低2至10倍。

通过色谱技术对脂质部分进行分析，例如通过现有技术中已知的气相色谱法或高效液相色谱法(HPLC)。

通过所述分析方法发现无论在变种还是野生型菌株的产油酵母细胞中积累的脂质，90％均是甘油三酸酯，优选甘油与具有8至24个碳原子的脂肪酸(例如棕榈酸、硬脂酸、油酸和α-亚油酸)的酯。

可以存在的其他脂质是：磷脂、甘油单酸酯、甘油二酸酯、游离脂肪酸或其混合物。

根据本发明的主题的方法获得的脂质可以有利地用作合成中间体，特别是在所谓的“绿色化学”领域。此外，它们可以在至少一种具有1-4个碳原子的醇，优选甲醇或乙醇，和至少一种酸性或碱性催化剂的存在下进行酯交换反应，以产生甘油和烷基酯，特别是甲基酯或乙基酯(“生物柴油”)。

或者，可以在氢和至少一种催化剂存在的情况下使所述脂质进行氢化/脱氧，以产生“绿色柴油”。氢化/脱氧方法在现有技术中是已知的，并且在例如欧洲专利申请EP 1,728,844中进行了描述。

为了实施本发明并更清楚地说明本发明，以下是一些非限制性实施例。

实施例1(获得油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体)

下面提供了获得油脂丝孢酵母物种ATCC 20509野生型菌株的变体的方法的应用的实施例，其导致获得了在莱布尼兹研究所DSMZ备案的保藏号为DSM32508的油脂丝孢酵母物种的产油酵母变体。在此实施例中，通过UV辐射获得了偶然诱变。

为此目的，将油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞样品接种在含有“YEPD”培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L)的烧瓶中：将烧瓶在30℃下在搅拌培养箱中放置一晚。随后，通过在4000rpm离心5分钟收集细胞，在无菌水中洗涤，然后在无菌水中以1:10稀释，并铺板在含有固体脂肪生成“B”培养基(琼脂20g/L、葡萄糖50g/L、硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]1g/L、酵母提取物1g/L、磷酸二氢钾[KH₂PO₄]1g/L、七水硫酸镁[MgSO₄·7H₂O]0.05g/L、氯化钠[NaCl]0.01g/L、二水氯化钙[CaCl₂·2H₂O]0.01g/L)的培养皿中，以使每板约有100个菌落。

将板暴露于UV辐射源(15瓦的UV灯(波长254nm)，放置在10cm的距离处)40秒，以获得10％的剩余存活率(residual vitality rate)。随后，将板在30℃下孵育4天，直到菌落达到足以计数的尺寸。诱变后，选择具有不规则和锯齿状边缘的菌落，其对应于油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体，将其再次铺板在含有上述固体脂肪生成“B”培养基的培养皿中。

出于比较目的，一些培养皿未被暴露以进行诱变。

图1显示：

(A)：未被暴露以进行诱变的培养皿的照片，其中可以看出，油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的菌落的外观呈圆形且有光泽和粘液；

(B)培养皿的照片，其中可以看出，油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的菌落具有不规则和锯齿状边缘和不光滑的外观。

实施例2(油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞形态的改变：在光学 显微镜下观察)

使用光学显微镜评估油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞与油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母的变种的细胞之间的形态学差异。

为此目的，在两个不同烧瓶的“YEPD”培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L)中接种了油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞样品和油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变种的细胞样品，将烧瓶在30℃下在搅拌培养箱中放置一晚。随后，从每个烧瓶中取出培养液的等分试样，置于在载玻片上，并在光学显微镜下以400X的放大倍数观察(图2)。

从图2可以看出：

(A)：油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞呈椭圆形或略微拉长，所述细胞处于活跃繁殖期并且芽体在出芽过程结束时正确分离；

(B)：油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞非常细长，不能正确地结束出芽过程并趋于形成聚集体。

随后，将来自每个先前培养的细胞的等分试样转移到两个不同的烧瓶中的液体脂肪生成“B”培养基(葡萄糖50g/L、硫酸铵[(NH₄)₂SO₄]1g/L、酵母提取物1g/L、磷酸二氢钾[KH₂PO₄]1g/L、七水硫酸镁[MgSO₄·7H₂O]0.05g/L、氯化钠[NaCl]0.01g/L、二水氯化钙[CaCl₂·2H₂O]0.01g/L)中，以获得0.1OD₆₆₀/mL的细胞密度：将烧瓶在30℃下在搅拌培养箱中放置96小时。随后，从每个烧瓶中取出等份的培养液，置于载玻片上，并在光学显微镜下以400X的放大倍数观察(图3)。

从图3可以看出：

(A)：油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞呈圆形，并显示为单个细胞；

(B)：油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞更细长，并倾向于形成双联体和聚集体。

实施例3(油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞形态的改变：通过流 式细胞荧光法研究)

通过流式细胞荧光法在单个细胞水平上定性和定量分析了油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母野生型菌株的细胞与油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母的变种的细胞之间的形态学差异。所述分析如下所述进行：Gunasekera T.S.等，“InternationalJournal of Food Microbiology”(2003),Vol.85,Issue 3,pag.269-279；Cronin U.P.等，“Journal of Applied Microbiology”(2010),Vol.108,Issue 1,pag.1-16。所使用的流式细胞荧光仪(BD Accuri C6 plus)配备有在488nm发射的氩离子激光。对总共20000次事项进行了测量，样品的采集流量等于35μl/min。

为此目的，在两个不同烧瓶的“YEPD”培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L)中接种了油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞样品和油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母的变种的细胞样品，并在到达指数生长期(10OD₆₆₀)后收集。在获取下述参数之前，将细胞在过滤水中以10⁶个细胞/mL的浓度稀释：分析如此稀释的样品。

为此目的考虑的参数是“前向散射”(FSC)和“侧向散射”(SSC)。FSC参数可根据单个细胞的大小和聚集状态来表征种群，而SSC参数则表示其细胞内粒度/密度：后一个参数受细胞质水平上颗粒的存在和细胞膜的大小的影响。

通过分析图4中提供的散点图，油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株(A.)和油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体(C.)的种群分布差异均可以在FSC值和SSC值方面观察到。详细地，直方图突出显示了油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株(B.)的种群分布在尺寸上更均一，而油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的种群分布在尺寸上更不均一(D.)。比较B.和D.中提供的图，也可以在种群的FSC值中注意到向右的“偏移”，这表明油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体相较于油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株不仅具有更大的细胞尺寸，而且具有细胞聚集体。这些聚集体的存在也可以通过在显微镜下收集的图像来确认【图2(B.)】。

参数FSC和SSC的平均值示于表3中，并以任意单位(a.u.)表示。比较FSC参数的值，可以推断出，与油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株相比，油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体具有更大的尺寸。还观察到了由参数SSC指示的细胞内粒度/密度的增大。对应于FSC和SSC的值，还提供了方差系数(CV)(在括号中)：此参数指示群体中的值的离散度，因此指示其均匀程度。

表3

	ATCC 20509	DSM 32508
			FSC(a.u.)	1257(49％)	6380(76％)
SSC(a.u.)	105(80％)	876(132％)

总之，通过流式细胞荧光法进行的分析表明，油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的形态和细胞内结构与派生它的油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株有很大不同。

实施例4(油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的基因型表征)

在本实施例中，描述了油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的表征方法，通过基因组DNA测序和生物信息学分析其相对于派生它的油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株存在的突变。

为此，从在“YEPD”培养基(酵母抽提物10g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L)中培养一晚的两种菌株(油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体和油脂丝孢酵母物种ATCC20509产油酵母的野生型菌株)的培养物中提取基因组DNA，并按照制造商提供的说明书使用Quiagen的商业试剂盒DNeasy Blood&Tissue试剂盒(cat.Num 69504)进行纯化。

用于测序的平台是Illumina HiSeq2500系统。FASTQ序列是用Illumina Casava系统(1.8.3版本)生成的。先使用Illumina Chastity，随后使用FASTQC(0.10.0版本)检查测序质量。使用“Trim sequences”(8.5.1版本)改善了测序质量。将由此产生的片段用CLSGenomics Workbench程序(8.5.1版本)中的“De novo assembly”选项组装在连续区域(“contig”)中，并使用Walker B.J.等人在“Pilon:an integrated tool forcomprehensive microbial variant detection and genome assembly improvement”,“PLoS One”(2014),Nov.19,9(11),e112963；DOI:10.1371/journal.pone.0112963中描述的Pilon(1.8版本)复查。

使用Boetzer M.等人在“Scaffolding pre-assembled contigs using SSPACE”,“Bioinformatics”(2011),Feb.15,27(4):578-9,doi:10.1093/bioinformatics/btq683,Epub 2010Dec.12.中描述的SSPACE Premium scaffolder(2.3版本)将“contigs”组装在“supercontigs”中。

“gaps”使用Boetzer M.等人在“Toward almost closed genomes withGapFiller”,“Genome Biology”(2012),Jun.25,13(6):R56,DOI:10.1186/gb-2012-13-6-r56.中描述的GapFiller(1.10版本)进行封闭。

基因组的注释是通过数据库Prokka Genome System(http://vicbioinformatics.com/)和数据库AUGUSTUS v3.0.1完成的。

序列分析鉴定了大小在119195和301个碱基对(bps)之间的2177个连续区域(“contig”)，共19,601,063个碱基对(bps)。该值与在系统上类似于丝孢酵母属的酵母的基因组DNA的大小一致，因此认为获得的文库代表了油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体和相应的派生它的油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的完整基因组。使用CLCbio的“Map Reads to Reference”和“Quality-based Variant Detection”软件，将两种基因组DNA的序列相互比较。

通过检查两个测序方向的存在并通过“phred”值确定准确性来确认鉴定出的突变。

总的来说，在油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的基因组DNA中，突出显示了647个突变(包括核苷酸的取代、缺失和插入)：131个突变导致相应蛋白质的序列改变并将它们显示在表1和表2中。

实施例5(油脂丝孢酵母物种DSM 32508的产油酵母变体对抗生素卡泊芬净 (caspofungin)的敏感性)

在该实施例中，评估了油脂丝孢酵母物种DSM 32508的产油酵母变体对抗生素卡泊芬净的敏感性。实际上，如Garcia L.等人，“BMC Genomics”(2015)，DOI：10.1186/s12864-015-1879-4中所述，缺陷真菌突变体在几丁质合成中对抗生素卡泊芬净显示了更高的敏感性。根据油脂丝孢酵母物种DSM 32508的产油酵母变体的基因组分析结果，该结果突出显示了影响编码具有几丁质合酶活性的蛋白质的基因的突变的存在，因此评估了对该抗生素的敏感性。

为此目的，将油脂丝孢酵母物种ATCC 20509的产油酵母的野生型菌株的细胞样品和油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞样品分别接种在两个不同烧瓶的“YEPD”培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L)中：将烧瓶在30℃下在搅拌培养箱中放置一晚。随后，通过在1500g离心5分钟收集细胞，在无菌水中洗涤，然后重悬于1ml无菌水中，获得悬浮液，将其在含有固体“YEPD”培养基(琼脂20g/L、酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L)的培养皿上铺板，所述固体“YEPD”培养基含有不同浓度的卡泊芬净：30ng/mL、60ng/mL、90ng/mL、120ng/mL。在所述板上，将10μL所述悬浮液的斑点铺板，所述悬浮液在无菌水中被稀释以包含约10⁵、10⁴、10³、10²和10个细胞。将平板在30℃下孵育3天以使细胞生长。

不同灵敏度的结果在具有120ng/mL卡泊芬净的“YEPD”培养基中更为明显(图5)。如在几丁质合成中缺陷真菌菌株所发生的，油脂丝孢酵母物种DSM32508产油酵母变体比油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株更敏感，在卡泊芬净存在下表现出较低的生长能力，因此证实了其在几丁质合成中的缺陷。

实施例6(在生物反应器中用于生产脂质的培养)

在该实施例中，评估了油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞和油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞的生长和脂质的积累。

为此目的，在两个不同的500mL烧瓶的100毫升“YEPD”培养基(酵母提取物10g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L)中接种了油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞样品和油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞样品：将所述烧瓶在30℃下在搅拌培养箱中放置一晚。

所获得的细胞悬浮液用于分别接种含有6L液体脂肪生成培养基(葡萄糖100g/L、玉米浆50g/L、酵母提取物2g/L、磷酸二氢钾[KH₂PO₄]6g/L、七水硫酸镁[MgSO₄·7H₂O]0.3g/L、氯化钠[NaCl]0.06g/L、二水氯化钙[CaCl₂·2H₂O]0.06g/L)的20升生物反应器。

每种菌株的接种物体积是获得约6L具有0.5OD₆₆₀的细胞悬浮液所必需的体积。

生长是在有氧条件下进行的，其通过吹入空气和600rpm至900rpm的可变搅动进行气流调节以保持溶解氧(DO2)的浓度等于饱和度值的30％，并且通过必要时加入几滴5M的KOH溶液或10％(体积/体积)的H₂SO₄溶液来维持pH值约5.0。

该过程在最初的20小时内以批次模式进行。随后供给氮养料，即玉米浆(1.25g/L)和硫酸铵(5.5g/L)，并直至24小时，。从24小时到该过程结束，加入600g/L的葡萄糖溶液，以便在整个过程中将葡萄糖的浓度保持恒定在约30g/L(总共90小时)。

生长90小时后，从两个生物反应器中取出培养液样品，并按照上述操作确定以下值：

-油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株的细胞浓度达到89g/L(即生物质的量，以每升培养液中以g为单位的细胞干重表示)，其含有47重量％的脂质(即累积的脂质的量，以脂质重量与总干重之间的百分比表示)，总计为42g/L(即累积的脂质的量，以g/L为单位的脂质浓度表示)；最大产量为0.52g/L/h的脂质，其中总产量为每消耗1g葡萄糖可获得0.17g脂质；

-油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体的细胞浓度达到111g/L(即生物质的量，以每升培养液中以g为单位的细胞干重表示)，其含有60重量％的脂质(即累积的脂质的量，以脂质重量与总干重之间的百分比表示)，总计为67g/L(即累积的脂质的量，以g/L为单位的脂质浓度表示)；最大产量为0.77g/L/h的脂质，其中总产量为每消耗1g葡萄糖可获得0.20g脂质。

实施例7(培养液的粘度和离心能力的测量)

在如上文实施例6中所述获得的培养物上，测量了在不同的接种时间的粘度和密度(通过Stabinger SVR 3000Anton Paar显微粘度计，剪切速率1/1000，在30℃)以及离心能力(通过使用带有固定角度转子AC 100.10A的Thermo Scientific IEC CL31R多速离心机进行旋转测试)。

特别地，通过将10mL等量的培养液等分试样在5000rpm下离心10分钟并测量其相对于培养液本身的浓缩系数来进行旋转测试。

所得结果列于表4和表5中。

表4

油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株

表5

油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体

从表4和表5中报告的数据可以推论，从油脂丝孢酵母物种DSM 32508产油酵母变体获得的培养液比从油脂丝孢酵母物种ATCC 20509产油酵母的野生型菌株获得的培养液具有更低的粘度和更大的离心能力。

Claims (11)

1.一种油脂丝孢酵母(Trichosporon oleaginosus)物种的产油酵母，其根据布达佩斯条约于2017年5月10日在莱布尼兹研究所DSMZ提交，保藏号为DSM32508。

2.一种用于生产脂质的方法，其包括：

-制备接种物，所述接种物包含保藏号为DSM 32508的产油酵母；

-将所述接种物加入到培养装置中获得培养液；

-分离所述培养液以获得包含脂质和水相的浓缩油质细胞生物质的水悬浮液；

-提取酵母细胞内积累的细胞内脂质。

3.根据权利要求2所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法：

-在10℃至40℃的温度范围内进行；和/或

-进行40小时至200小时的时间；和/或

-在有氧条件下进行；和/或

-在4.5至7.0的pH范围内进行。

4.根据权利要求3所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法：

-在20℃至35℃的温度范围内进行；和/或

-进行80小时至150小时的时间；和/或

-在有氧条件下进行；和/或

-在5.0至6.5的pH范围内进行。

5.根据权利要求2或3所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法从培养基总体积的1％至5％(体积/体积)的量的接种物开始进行，所述接种物是从保藏号为DSM 32508的产油酵母的先前培养物获得的，所述方法在同一培养基中进行6小时至24小时的时间。

6.根据权利要求2所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法在包含葡萄糖作为碳源和硫酸铵作为氮源的培养基中进行。

7.根据权利要求2所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法以分批补料的方式进行。

8.根据权利要求2所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法在接种后15小时至25小时的时间之后，向培养液中添加至少一种另外的氮源使添加的氮的量在0.5g/L至5g/L的范围内，以进一步以分批补料的方式进行，进行25小时至175小时的时间，所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、硫酸铵、尿素。

9.根据权利要求8所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法在接种后15小时至25小时的时间之后，向培养液中添加至少一种另外的氮源使添加的氮的量在0.5g/L至5g/L的范围内，以进一步以分批补料的方式进行，进行65小时至125小时的时间。

10.根据权利要求2所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法在接种后15小时至25小时的时间之后，向培养液中添加葡萄糖水溶液使培养液中葡萄糖的浓度恒定在25g/L至50g/L的范围内，以进一步以分批补料的方式进行，进行25小时至175小时。

11.根据权利要求10所述的用于生产脂质的方法，其中，所述方法在接种后15小时至25小时的时间之后，向培养液中添加葡萄糖水溶液使培养液中葡萄糖的浓度恒定在25g/L至50g/L的范围内，以进一步以分批补料的方式进行，进行65小时至125小时。

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