JP2013545491A - バイオマス加水分解物培地中でのキシロース資化性ザイモモナス・モビリスによるエタノール産生の向上 - Google Patents

Abstract

バイオマス加水分解物を含む培地中での性能が改善されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）キシロース資化性エタノール産生株を、適応工程を使用して単離した。別々に単離された株は、同じコード領域において独立した変異を有することが見出された。このコード内の変異は、改善された表現型が与えられるようにエンジニアリングすることが可能である。

Description

米国政府の権利についての記述
本発明は、米国エネルギー省によって授与された契約番号第ＤＥ−ＦＣ３６−０７ＧＯ１７０５６の下に、米国政府の支援を得て為されたものである。米国政府は、本発明において所定の権利を有する。

本発明は、微生物学および発酵の分野に関する。より具体的には、バイオマス加水分解物培地中での生育およびエタノール産生が改良された変異体ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を単離し、特徴付けた。

微生物によるエタノール産生は、化石燃料に代わるエネルギー源となっているため、現在の研究領域として重要性が大きい。エタノールだけでなく他の有用な生成物も産生する微生物は、ヒトによる食糧供給に影響しない培地（例えばトウモロコシ穀粒から生成される糖類の利用が回避されるような培地）中で生育しかつエタノールを産生する能力を有することが望ましい。セルロースバイオマス加工が進展した結果、グルコース、キシロースおよび他の糖は、バイオマス加水分解物における発酵用に高濃度で放出し得る。このように、バイオマスからエタノールに変換し、再生可能な非食糧リソースを使用して化石燃料の代替を提供すれば、環境への影響を改善できる可能性が高い。

天然ではキシロースを資化しないザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）および他の細菌のエタノロジェンに対しては、バイオマス加水分解物中の糖の利用率を高めてキシロース資化による生育およびエタノール産生を改善するための遺伝子操作が為されてきた。しかし、培地を含むバイオマス加水分解物中には、微生物に対して抑制的なアセテートおよび他の化合物が存在するため、生育およびエタノール産生は一般的に最適ではない。共通の所有者を有する同時係属中の米国特許出願公開第２０１１００１４６７０Ａ１号明細書には、培地中のアセテートおよびエタノールに対する耐性に優れる改良型のキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を生成するための方法、ならびに本方法で単離される株が開示されている。

前処理されたバイオマスの加水分解物中によく見出される単一化合物の毒性による影響は、Ｄｅｌｅｇｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（（１９９６）Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：２２０−２２４）に記述されている。キシロース発酵性付与ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）を調整済みユリノキ（ｙｅｌｌｏｗ−ｐｏｐｌａｒ）ヘミセルロースの希酸加水分解物に適応させる方法は、Ｌａｗｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（（１９９９），Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７７：１９１−２０４）に記述されている。

バイオマス加水分解物培地での発酵中にエタノール産生を改善する単離型のキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）のエタノロジェン株に対するニーズが存続しているだけでなく、改良型株が生成されるように遺伝子操作する方法も依然として求められている。

本発明は、バイオマス加水分解物培地中での生育およびエタノール産生が改善された組換えキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を提供する。加えて、本発明は、加水分解物培地中で使用される改良型ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の製造方法、および前記株を使用したエタノール製造方法を提供する。

したがって、本発明は、ｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレーム中に少なくとも１つの遺伝的改変を有するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属の、キシロース資化性エタノール産生性組換え微生物を提供する。

一態様において本発明は、配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、およびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。

別の態様において本発明は、
ａ） ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属のキシロース資化性エタノール産生微生物を提供する工程と、
ｂ） 配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する工程と、
ｃ） 内在性ｚｍｏ１４３２コード領域が中断されるように、ｂ）のポリヌクレオチドをａ）の微生物内に導入する工程と、
を含む、組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の作製方法を提供する。

代替の態様において本発明は、
ａ） 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレームを含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属のキシロース資化性エタノール産生微生物を提供する工程と、
ｂ） ａ）のｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレームに変異を導入し、変異したオープンリーディングフレームの発現によって配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させる工程と、
を含む、組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の作製方法を提供する。

別の態様において本発明は、
ａ） 本発明の組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を提供する工程と、
ｂ） キシロース含有のバイオマス加水分解物培地を提供する工程と、
ｃ） エタノールを産生するｂ）のバイオマス加水分解物培地中でａ）のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を生育する工程と、
を含むエタノールの生産方法を提供する。

図面、生物学的寄託、および配列の簡単な説明
出願人らは、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に基づいて、以下の生物学的寄託を行った。
寄託された株の情報

ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株およびＡｄａｐｔｅｄ７−３１におけるグルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生を比較して示した、トウモロコシ穂軸の加水分解物の経時的発酵のグラフである。 ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株ＺＷ７０５、Ａｄａｐｔｅｄ７−３１、およびＡｄａｐｔｅｄ５−６におけるグルコースおよびキシロース資化、ならびにエタノール産生を比較して示した、トウモロコシ穂軸の加水分解物の経時的発酵のグラフである。 バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のｚｍｏ１４３２でコードされたタンパク質とＢｃｅｍｎ０３＿１４２６タンパク質とのアラインメントを示した図である。 ｚｍｏ１４３２でコードされたタンパク質とＥ．ｃｏｌｉのＡａｅＢタンパク質とのアラインメントを示した図である。

以下の配列は、連邦規則集第３７巻：特許法施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）の１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ））に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに用いられている記号および形式は、連邦規則集第３７巻：特許法施行規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．）の１．８２２に規定された一連の規則に準拠したものである。

配列番号１は、公開されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノム配列（ＮＣＢＩリファレンス：ＮＣ＿００６５２６．２）中の、ｚｍｏ１４３２と呼ばれるコーディング領域のヌクレオチド配列である。

配列番号２は、公開されたザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノム配列（ＮＣＢＩリファレンス：ＮＣ＿００６５２６．２）中の、ｚｍｏ１４３２と呼ばれるコーディング領域内でコードされたアミノ酸配列である。

配列番号３は、位置番号３６６のアミノ酸がアルギニンに変わることを除き、配列番号２のアミノ酸配列と同じである。

配列番号４は、位置番号１１７におけるアミノ酸がフェニルアラニンに変わることを除き、配列番号２のアミノ酸配列と同じである。

配列番号５は、ｆｕｓＣ（受託番号Ｐ２４１２８）にコードされたバークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号６は、クレブシエラ・オキシトーカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）のフザリン酸解毒タンパク質（受託番号Ｑ４８４０３）のアミノ酸配列である。

配列番号７は、Ｂｃｅｎｍｃ０３＿１４２６にコードされたバークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号８は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質ＡａｅＢのアミノ酸配列である。

配列番号９は、位置１〜１６に対応する予測されたシグナル配列を含む、未成熟Ｘｙｎ３のアミノ酸配列である。

配列番号１０は、位置１〜２３に対応する予測されたシグナル配列を含む、未成熟Ｆｖ３Ａのアミノ酸配列である。

配列番号１１は、位置１〜２０に対応する予測されたシグナル配列を含む、未成熟Ｆｖ４３Ｄのアミノ酸配列である。

配列番号１２は、位置１〜１９に対応する予測されたシグナル配列を含む、未成熟Ｆｖ５１Ａのアミノ酸配列である。

本発明は、バイオマス加水分解物培地中のキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）菌体の生育およびエタノール産生を改善するように適応させることについて記述している。適応株における変異の特徴付けによって、改善のための変異特性が同定された。この変異特性は、非適応のキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株においてエンジニアリングすることが可能である。これらの株を使用することによって、エタノール産生の効率を高め、化石燃料の代替となるエタノールを生成できる。

明細書および特許請求の範囲を解釈するにあたって、下掲の略語および定義を使用する。

本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「具備する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「具備してなる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有してなる（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」もしくは「含有してなる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、他の何らかの変形態様は、非排除的な包含を規定することを意図したものである。例えば、要素のリストを含む組成物、混合物、工程、方法、物品または装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されるわけでなく、明示的に記載されていない他の要素、またはそのような組成物、混合物、工程、方法、物品もしくは装置に固有の他の要素も包含し得る。更に、そうでない旨を明示的に記述しない限り、「または（ｏｒ）」は、排他的論理和（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｏｒ）でなく包含的論理和（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ｏｒ）を指す。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる：条件ＡまたはＢは、「Ａが真で（または存在し）かつＢが偽である（または存在しない）」、「Ａが偽で（または存在せず）かつＢが真である（または存在する）」、ならびに「ＡおよびＢが共に真である（または存在する）」。

また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「或る（ａ）」、および「或る（ａｎ）」は、要素または成分の実例（即ち、実現値）の数に関して非制限的であることを意図している。ゆえに、「或る（ａ）」または「或る（ａｎ）」は１つまたは少なくとも１つを含むと読むべきであり、数が単一である旨が明らかに意味されていない限り、要素または成分の単数形の単語も複数を包含する。

本明細書において「キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）菌体」は、キシロースを発酵用の炭水化物源として利用する能力を付与する酵素を発現するように遺伝子操作される株の菌体を指す。

「適応株」という用語は、特定の条件下で生育して生成物を産生する能力を向上させるために、そうした条件で生育するように選択された微生物を指す。

本明細書において「対応する非適応株」とは、本明細書に開示されているバイオマス加水分解物適応工程を使用して改良型株を生成する元となるキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）原株を指す。

本明細書において「補給用の成長培地」とは、連続培養容器に添加される培地を指す。

「リグノセルロースバイオマス」あるいは「バイオマス」という用語は、任意のリグノセルロース材料を指し、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖類および／または単糖類を含む材料を包含する。バイオマスはまた、タンパク質および／または脂質等の付加的な成分を含んでいてもよい。バイオマスは、単一の源に由来してもよく、またはバイオマスは、１つ以上の源に由来する混合物を含むことも可能である。例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸およびコーンストーバの混合物、または草および葉の混合物を含んでいてもよい。リグノセルロースバイオマスは、バイオ燃料用作物、農業残渣、都市ごみ、産業廃棄物、製紙スラッジ、庭ごみ、木材および林業廃物を含むが、これらに限定されない。バイオマスの例としては、限定はされないが、トウモロコシ穂軸、作物残渣（トウモロコシ外皮、コーンストーバ、草、小麦藁、大麦藁、干し草、稲藁、スイッチグラス、廃紙、砂糖黍バガス、モロコシ植物材料、大豆植物材料等）、穀粒、樹木、枝、根茎、葉、木片、鋸屑、潅木および低木の粉砕により得られる成分、野菜、果物および花が挙げられる。

本明細書で用いられている「バイオマス加水分解物」および「セルロース加水分解物」は、バイオマスから生成された生成物、一般的に前処理および糖化工程を経たセルロース材料を指す。加水分解物および他の生成物中には、発酵性糖が存在する。

本明細書において「バイオマス加水分解物培地」とは、セルロースバイオマスおよび／またはリグノセルロースバイオマスから調製された加水分解物を少なくとも約５０％含有する培地を指す。加水分解物はバイオマスの糖化によって調製され、事前に前処理が行われるのが一般的である。培地は、加水分解物に加えて、生触媒の生育および生産用に定められた成分を含んでいてもよい。

「Ｘｙｎ３」は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のＧＨ１０ファミリーのキシラナーゼである。Ｘｙｎ３（配列番号９）は、エンドキシラナーゼ活性を間接的に有する。このことは、前処理されたバイオマスまたは単離されたヘミセルロースに対して酵素が作用したときに、キシロシダーゼ（ｘｙｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ）の存在下にてＸｙｎ３がキシロースモノマー産生の増大を触媒する能力を有することを観測することによって立証された。

「Ｆｖ３Ａ」は、フザリウム・ベルチシルリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）由来のＧＨ３ファミリーの酵素である。Ｆｖ３Ａ（配列番号１０）は、例えばｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、混合直鎖状キシロ−オリゴマー、ヘミセルロース由来の分枝アラビノキシランオリゴマー、または希釈アンモニアで前処理した穂軸を基質として用いた酵素アッセイにて、β−キシロシダーゼ活性を有することが立証された。

「Ｆｖ４３Ｄ」は、フザリウム・ベルチシルリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）由来のＧＨ４３ファミリーの酵素である。Ｆｖ４３Ｄ（配列番号１１）は、例えばｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、および／または混合直鎖状キシロ−オリゴマーを基質として用いた酵素アッセイにて、β−キシロシダーゼ活性を有することが立証された。

「Ｆｖ５１Ａ」は、フザリウム・ベルチシルリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）由来のＧＨ５１ファミリーの酵素である。Ｆｖ５１Ａ（配列番号１２）は、例えば４−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを基質として用いた酵素アッセイにて、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが立証された。

「遺伝子」とは、特異的タンパク質または機能ＲＮＡ分子を発現させる核酸フラグメントを指し、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）およびコード配列に続く調節配列（３’非コード配列）が含まれていてもよい。「生来の遺伝子」あるいは「野生型遺伝子」とは、自然界に見出される固有の調節配列を有する遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見出されない調節配列およびコーディング配列を含んでなる、生来の遺伝子でない任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、種々の源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来する調整配列およびコード配列を含み得るが、自然界に見出されるものとは異なる仕方で配列される。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノムにおける自然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子とは、通常は宿主生物内に見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物内に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、天然でない生物に挿入される生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子で構成し得る。

「遺伝子構築物」という用語は、１つ以上の特異的タンパク質または機能ＲＮＡ分子の発現をコードする核酸フラグメントを指す。遺伝子構築物において、遺伝子は、生来、キメラ、または自然界にはない外来性のものであり得る。遺伝子構築物は典型的に「コード配列」を含む。「コード配列」とは、特異的アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。

「プロモータ」あるいは「開始制御領域」とは、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御する能力を持つＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列はプロモータ配列の３’側に局在する。プロモータは、完全に生来の遺伝子から誘導することも、自然界に見出される種々のプロモータに由来する種々の要素から構成することも可能であり、更には合成ＤＮＡセグメントを含むことさえ可能である。種々のプロモータは、種々の発達段階で、または種々の環境状態に応答して、種々の組織内または種々の菌体タイプの遺伝子の発現を指図し得る。このことは、当業者によって理解されるであろう。ほとんど菌体タイプにおいてほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモータは、一般に「構成的プロモータ」と呼ばれる。

本明細書で用いられている「発現」という用語は、遺伝子に由来するコーディングＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または機能ＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することを指す場合もある。「過剰発現」は、トランスジェニック生物において遺伝子産物の産生が、通常の生物（即ち、形質転換されていない生物）における産生のレベルを超えることを指す。

本明細書で以降用いられる「形質転換」という用語は、宿主生物に核酸フラグメントを導入した結果として遺伝的に安定した遺伝形質が生じることを指す。形質転換された核酸は、宿主細胞内で維持されるプラスミドの形態、または宿主細胞のゲノム内に組み込むことの可能な何らかの変形された核酸の形態を取り得る。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」生物または「組み換え」生物または「形質転換」生物と呼ばれる。

本明細書で用いられている「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多い余分の染色体要素を指し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態を取る。そのような要素は、任意の源に由来する自律複製配列（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ゲノム組み込み配列、ファージ配列またはヌクレオチド配列、線状または環状の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、それらの要素においては、幾つかのヌクレオチド配列が固有の構成体に結合されるかまたは再結合されており、この構成体は、選択された遺伝子産物のプロモータフラグメントおよびＤＮＡ配列を、適切な３’未翻訳配列と一緒に細胞内に導入できる。

「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を指す。例えば、或るコード配列の発現に対する影響力を持つプロモータは、コード配列と作動可能に連結されている（即ち、コード配列が、そのプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向に向かって調節配列に作動可能に連結され得る。

「選択マーカー」という用語は、関心対象の核酸の遺伝を追跡するために、かつ／または関心対象の核酸を受け継いでいる細胞もしくは生物を同定するために用いられるマーカー遺伝子の効果（即ち、抗生物質に対する耐性）に基づいて選択され得る、同定因子（通常、抗生物質または化学物質耐性遺伝子）を意味する。

当該技術分野において公知の「同一性パーセント」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列、または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係であり、配列同士を比較することによって定量される。当該技術分野において「同一性」とは、その状況により、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度も意味し、そのような配列のストリング間の一致率によって定量される。「同一性」および「類似性」を容易に計算するための方法としては、限定はされないが、１．） Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；２．） Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；３．） Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；４．） Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；および５．） Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に記載されている既知の方法を挙げることができる。

同一性の定量方法は、試験された配列間で最高の一致率が得られるように設計されたものであることが好ましい。同一性および類似性の定量方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで分類される。配列アラインメントおよび同一性パーセントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて計算できる。多重配列アラインメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を用いて実施される。この方法は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖとラベルされるアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９−１９１（１９９２）に記載）に対応する「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖアラインメント法」を含めた幾つかの種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見出される。多重アラインメント（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の場合、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズアラインメントおよびタンパク質配列の同一性パーセント計算用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータはＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを用いて配列のアラインメントを終えた後は、同じプログラム中の「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見て「同一性パーセント」を得ることができる。加えて、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法」が入手可能であり、これはＣｌｕｓｔａｌ Ｗと名付けられたアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１（１９９２）に記載）に対応しており、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）において見出される。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０，ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２，Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０，ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ，ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いて配列のアラインメントを終えた後は、同じプログラムの「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見て「同一性パーセント」を求めることができる。

加水分解物培地での発酵が改善されたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の作製
本発明は、ｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレーム中に遺伝的改変を少なくとも１つ有する、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属の、キシロース資化性、エタノール産生性組換え微生物を提供する。この変異による影響は、加水分解物培地中での株の作用を改善するポリペプチドを発現させ、加水分解物中で様々な成長阻害物質に対する株の耐性を増強し、エタノールの収率を増大することである。発酵作用の改善は、本明細書で配列番号１として定義されているザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）ゲノム（ＮＣＢＩリファレンス：ＮＣ＿００６５２６．２）において、配列番号２のポリペプチドをコードするｚｍｏ１４３２領域内での変異と関連していた。

したがって、加水分解物培地中で、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株の発酵を改善できることが、本明細書に記載されている。このザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、キシロースを炭素供給源として資化する能力を有し、かつ改変前に配列番号２に対し少なくとも約９５％アミノ酸同一性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中に、少なくとも１つの遺伝的改変を導入することによってエタノールを生成するものである。このタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも約９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有し得る。前記タンパク質においては、加水分解物培地の存在下にて前記変異体タンパク質を保菌する株によって何らかの遺伝的改変が為され、エタノール産生を増大し得る。エタノール産生の増大は、同じ発酵条件下にて、遺伝的改変の無いザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株による産生と比較することによって定量される。前記ＯＲＦにおいて遺伝的改変を施された株は、当業者がバイオマス加水分解物の存在下にて本明細書中の実施例３に記載されているような方法で容易にアッセイし、エタノール産生を評価できる。前記改良型の株はバイオマス加水分解物に対する耐性に優れ、バイオマス加水分解物に対する耐性に優れ、バイオマス加水分解物には阻害物質が存在する。ここで、耐性とは、加水分解物の含量が少ないかまたは全く含まない培地と比較した所定レベル（耐性レベル）の加水分解物を有する培地におけるのと同じように、株が生育しエタノールを生成できる能力を指す。耐性が向上したことは、遺伝的改変の無いザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株との比較によって定量される。

一実施形態においては、遺伝的改変が起きると、配列番号２のアミノ酸配列の位置３６６が変わり、スレオニンがアルギニンで置換される。別の実施形態においては、遺伝的改変が起きると、配列番号２のアミノ酸配列の位置１１７が変わり、セリンがフェニルアラニンで置換される。ヌクレオチド配列に何らかの変更が為され、その結果、コドン３６６がアルギニンをコードするか、またはコドン１１７がフェニルアラニンをコードする場合があり得る。アルギニンをコードするコドンはＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧである。フェニルアラニンをコードするコドンはＴＴＴおよびＴＴＣである。

一実施形態においては、遺伝的改変は、公開済みザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノム配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６５２６．２）内のｚｍｏ１４３２と呼ばれるＯＲＦに対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号１が付いたヌクレオチド１４４６６０３〜１４４８６３３の相補鎖のコーディング配列内に存在する。配列番号１のＯＲＦは代替名で呼ばれる場合もあるが、いずれにせよ配列番号１の配列との比較でｚｍｏ１４３２として同定され得る。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種または株間でｚｍｏ１４３２として同定されたコード領域の配列には、幾つかのバリエーションが存在し得る。ゆえに、ｚｍｏ１４３２として同定されるコード領域は、配列番号１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。また、遺伝的改変が為されたコード領域は、遺伝的改変に先立って配列番号１に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有し得る。このコード領域は、遺伝的改変の、改変に先立つ標的となる。

記載されている遺伝的改変の少なくとも１つは、キシロースを炭素供給源として資化する能力を有し、かつ当業者に公知の何らかの方法でエタノールを産生するザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株において為され得る。そのような方法としては、本明細書中の実施例１および２で後述するような、適応、化学変異誘発およびスクリーニング、ならびに遺伝子操作による方法が挙げられる。

遺伝的改変を標的コード領域に導入するための遺伝子操作は、ダブルクロスオーバーの相同性組み換えを使用して内在性標的コード領域を上述のような変異を持つ同じコード領域で置換する方法を介したものであってよい。相同組み換えでは、標的組み込み部位の側面に位置するＤＮＡ配列が、スペクチノマイシン耐性遺伝子または他の選択可能マーカー、および置換変異体配列を取り囲むように配置され、結果として、選択可能マーカーおよびその置換変異体配列が標的ゲノム部位に挿入される。選択可能マーカーはコード領域の外側にあり、それにより、その生成物においてコード領域が発現されるようになっている。加えて、選択可能マーカーが部位特異的組み換え部位で取り囲まれ、対応する部位特異的リコンビナーゼが発現した後に耐性遺伝子がゲノムから摘出できるようにもなっている。置換変異体配を組み込むには、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）のＥＺ：：Ｔｎインビトロ転置方式（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を使用した転置が特に好適である。この方式は、米国特許第２００９−０２４６８４６Ａ１号明細書の実施例１および６で使用されている。

代替方法として、標的内在性コード領域が発現したとしても、挿入、変異または削除などの操作によって、菌体内で中断されることもあれば、上に記載したように、変異を持ったコード領域を発現する遺伝子が、菌体中に導入されることもあり得る。コード領域を不活性化する際に用いられるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）におけるダブルクロスオーバーの相同組み換えの例は、米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されている。導入された遺伝子は、そのネイティブなプロモータを含む内因性遺伝子である（変異体コード領域を有する）場合もあれば、作動可能に連結したプロモータと、中断されたコード領域に対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するコード領域と、を含んでなるキメラ遺伝子である場合もあり得る。キメラ遺伝子には典型的に３’末端領域が含まれる。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）において使用され得るプロモータとしては、ＺｍＰｇａｐおよびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）エノラーゼ遺伝子のプロモータが挙げられる。

導入された遺伝子は、プラスミド上に維持される場合もあれば、例えば、相同組み換え、部位特異的組み込みまたはランダム組み込みを使用してゲノムに組み込まれる場合もあり得る。導入される遺伝子は、典型的には、ベクター内で構成されるか、更なる操作のためにベクターに転送される。ベクターは、当該技術分野において周知である。ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）における特に有用な発現は、米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されているｐＺＢ１８８などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の両方において複製能を持つベクターである。ベクターとしては、菌体内での自律複製のためのプラスミド、および細菌ゲノム中に組み込まれる構造を担持するためのプラスミドを挙げることができる。ＤＮＡ組み込みのためのプラスミドとしては、トランスポゾン（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）、標的細菌ゲノムに対して相同性を持つ核酸配列の領域、または組み込みをサポートする他の配列を挙げることができる。更に別のタイプのベクターとしては、例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されているシステムを使用して生成されるトランスポソーム（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ）も挙げることができる。所望の標的宿主および所望の機能に適切なベクターを選択する方法は、周知である。

宿主株
いずれのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株も、キシロースを炭素供給源として資化する能力を有しかつエタノールを産生するものである限り、本発明の開始株となり得る。そのような株は、加水分解物培地での適応、化学変異誘発、およびスクリーニングの目的に使用されるか、または本明細書に開示されている改良型の株を生成するために遺伝子操作される。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）などのように、キシロース−エタノール発酵経路を発現するようにエンジニアリングされたザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の株は、特に有用である。内因性遺伝子は、代謝経路の一部を提供する場合もあれば、またはキシロース代謝に役立つ酵素活性を有するタンパク質を提供するように、何らかの公知の遺伝子操作技術によって変更可能な場合もある。例えば、内在性トランスケトラーゼは、キシロース資化経路の作製時に、導入された他の酵素活性を補足し得る。参照によって本明細書に援用されている米国特許第５，５１４，５８３号明細書に記載されているように、キシロースの代謝に関与する４つの酵素を発現させる場合、典型的には４つの遺伝子がＺ．モビリス（Ｚ ｍｏｂｉｌｉｓ）などのザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株に導入され得る。これらには、キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子も包含されている。このキシロースイソメラーゼによってキシロースからキシルロースおよびキシルロキナーゼへの転換が触媒され、キシルロキナーゼによってキシルロースがリン酸化されて、キシルロース５‐リン酸が形成される。加えて、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ（ペントースリン酸経路の二酵素）は、キシルロース５‐リン酸を中間体に転換し、ペントース代謝を解糖Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ経路に連結して、キシロースからエタノールへの代謝を可能にする。これらの酵素をコードするＤＮＡ配列は、キシロース代謝能を有する多数の微生物（腸溶細菌、ならびに一部の酵母および真菌など）のいずれかから採取できる。コード領域の供給源としては、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）、およびザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコード領域は、特に有用である。

コーディングＤＮＡ配列は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）菌体内で発現されるプロモータ（Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のプロモータ、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰプロモータ）、およびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）エノラーゼ（ＥＮＯプロモータ）など）に作動可能に連結される。プロモータから別々にコード領域が発現する場合もあれば、２つ以上のコード領域が同じプロモータから発現してオペロンにおいて結合される場合もある。結果として生じたキメラ遺伝子は、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）に導入されてからプラスミド上に維持される場合もあれば、例えば、相同組み換え、部位特異的組み込みまたはランダム組み込みを使用してゲノムに組み込まれる場合もあり得る。特定の用途に用いられているキシロース資化性株としては、ＺＭ４（ｐＺＢ５）（米国特許第５，５１４，５８３号明細書、米国特許第６，５６６，１０７、および米国特許第５，５７１，２１３３号明細書に記載され、参照によって本明細書に援用されている）、８ｂ（米国特許出願公開第２００３／０１６２２７１号明細書；Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２５；３２１−３２５）のほか、ＺＷ６５８（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−７８５８）、ＺＷ８００、ＺＷ８０１−４、ＺＷ８０１−５、およびＺＷ８０１−６（参照によって本明細書に援用されている共通の所有者を有する同時係属中の米国特許出願公開第２００８−０２８６８７０Ａ１号明細書に記載）が挙げられる。

天然基質でない他の糖類を資化するように加えてエンジニアリングされるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株もまた、本工程において使用してもよい。参照によって本明細書に援用されている米国特許第５，８４３，７６０号明細書に記載されているように、一例は、アラビノース資化能を有するようにエンジニアリングされたＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の株である。

適応
適応のために、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）（上述の開始株）のキシロース資化性株は、バイオマス加水分解物を含有する培地中で連続的に生育される。バイオマス加水分解物は、バイオマスの糖化によって生成される。典型的には、バイオマスは糖化に先立って前処理される。バイオマスは、当業者に公知の何らかの方法で処理することにより、加水分解物中に発酵性糖を生成できる。バイオマスは典型的には、物理的および／または化学的処理によって前処理され、酵素処理で糖化される。物理的および化学的処理としては、研磨、粉砕、切断、アンモニアまたはＮａＯＨによる塩基処理、および酸処理を挙げることができる。特に有用なのは、低濃度アンモニアによる前処理である。この前処理では、バイオマスをアンモニア含有の水溶液と接触させ、バイオマス−アンモニア水混合物のアルカリ性ｐＨを維持するのに充分なアンモニア濃度（ただし、バイオマスの乾燥重量を基準として約１２重量％未満）のバイオマス−アンモニア水混合物を形成する。ここで、バイオマスの乾燥重量は、バイオマス−アンモニア水混合物の重量を基準として少なくとも約１５重量％（固形）である。これは、参照によって本明細書に援用されている共通の所有者を有する同時係属中の米国特許出願公開第２００７００３１９１８Ａ１号明細書中に開示されている。

酵素糖化では典型的に、酵素組成物または配合物を利用してセルロースおよび／またはヘミセルロースを分解し、例えばグルコース、キシロース、およびアラビノースなどの糖類含有の加水分解物を生成する。糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６６：５０６−５７７，２００２）に概説されている。少なくとも１種の酵素が使用され、典型的には、１種以上のグリコシダーゼを含む糖化酵素配合物が使用される。二糖類、オリゴ糖類および多糖類のエーテル結合を加水分解するグリコシダーゼ類は、一般グループ「ヒドロラーゼ」（ＥＣ３）の酵素分類ＥＣ３．２．１．ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ｗｉｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １（１９９３），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２（１９９４），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３（１９９５，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４（１９９７）ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５ ［ｉｎ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２３：１−５，１９９４；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３２：１−６，１９９５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３７：１−５，１９９６；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５０：１−６，１９９７；ａｎｄ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６４：６１０−６５０ １９９９，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ］）に記載されている。本方法において有用なグリコシダーゼ類は、加水分解されるバイオマス成分によって分類できる。本方法に係る有用なグリコシダーゼ類としては、セルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）、ヘミセルロース加水分解グリコシダーゼ（例えば、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ）、およびデンプン加水分解グリコシダーゼ（例えば、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グリコシダーゼ、イソアミラーゼ）が挙げられる。加えて、ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．ｘ．ｙ）、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．ｘ、および３．１．４．ｘ）、リグニナーゼ（ＥＣ１．１１．１．ｘ）もしくはフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）などの糖化酵素集合体に他の活性を加えて、バイオマスの他の成分からの多糖類の放出を促すことも、有用であり得る。多糖類加水分解酵素を生成する微生物が多くの場合、異なる基質特異性を有する幾つかの酵素または酵素のグループによって触媒されるセルロース分解能などの活性を呈することは、当該技術分野において公知である。ゆえに、微生物由来の「セルラーゼ」は、セルロース分解活性に関与し得る酵素のグループ、１種以上の酵素、またはそれらすべてを含み得る。商業的な酵素製剤または非商業的な酵素製剤（セルラーゼなど）は、酵素の採取に利用される精製方式に応じて多数の酵素で構成され得る。

糖化酵素は、市販のものを入手できる。そのような酵素としては、例えば、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ｘｙｌａｎａｓｅ、Ａｃｃｅｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、およびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＤＵＥＴ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）が挙げられる。加えて、糖化酵素には、未精製の状態で、かつ菌体抽出物または完全な菌体製剤（ｃｅｌｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）として提供されているものもある。１種以上の糖化酵素を発現するようにエンジニアリングされた組換え微生物を使用すれば、酵素を生成できる。

糖化酵素としては、ほかにも、例えば、ファミリーＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ４３、ＧＨ５５、ＧＨ１０、およびＧＨ１１のメンバーなどのグリコシルヒドロラーゼが挙げられる。ＧＨは、２つ以上の炭水化物間、または炭水化物と非炭水化物の残基間でグリコシド結合を加水分解する酵素のグループである。ＧＨのファミリーは、配列類似性に基づいて分類され、分類は炭水化物−活性物質酵素（ＣＡＺｙ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３３−２３８）利用できる。これらの酵素の幾つかは、様々な基質に作用する能力を有し、糖化酵素としての効力を実証した。グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）酵素は、幾つかの既知の活性を有する。例えば、β−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２１））活性；β−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性；Ｎ−アセチルβ−グルコサミニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５２）活性；グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．５８）活性；セロデキストリナーゼ（ＥＣ：３．２．１．７４）活性；エキソ−１，３−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ：３．２．１）活性；および／またはβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）活性が挙げられる。グリコシドヒドロラーゼファミリー３９（「ＧＨ３９」）酵素もまた、幾つかの既知の活性を有する。例えば、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＥＣ：３．２．１．７６）および／またはβ−キシロシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．３７）活性が挙げられる。グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）酵素は、幾つかの既知の活性を有する。例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）；β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）；エンドアラビナーゼ（ＥＣ３．２．１．９９）；および／またはガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４５）活性が挙げられる。グリコシドヒドロラーゼファミリー５１（「ＧＨ５１」）酵素もまた、幾つかの既知の活性を有する。例えば、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）活性および／またはエンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）活性が挙げられる。グリコシドヒドロラーゼのファミリー１０（「ＧＨ１０」）はＳｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：２４０３−２４１２ ａｎｄ Ｌｏ Ｌｅｇｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５０９：３０３−３０８）に記載され、グリコシドヒドロラーゼのファミリー１１（「ＧＨ１１」）は、Ｈａｋｏｕｖａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：９６１７−２４に記載されている。

本明細書中の実施例１および２に記載されているように、本適応工程において、キシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）は、漸次増分されるバイオマス加水分解物の存在下にて成長培地中で継続的に生育される。定期的な間隔で標本を採取し、加水分解物培地におけるキシロースおよびグルコース資化、ならびにエタノール産生などの性能をアッセイする。比例的に増分されるバイオマス加水分解物のほか、アセテートおよびエタノールといった他のストレス成分を含む培地に、複数回にわたって適応させることによって、上記のような性能が向上した株を生成できる。

改良型キシロース資化性株の発酵
本明細書に記載されている遺伝的改変を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされた、キシロース資化性かつエタノール産生ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株は、エタノール生成の目的で発酵に使用できる。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、グルコースおよびキシロース含有の糖類を含むバイオマス加水分解物を含んでなる培地に接触させる。少なくとも一部の糖類は、前処理済みの糖化セルロースバイオマスまたはリグノセルロースバイオマスから誘導される。更に他の糖類および／または他の培地成分を培地に含めてもよい。

共通の所有者を有する米国特許第７，６２９，１５６号明細書に開示されているように、糖類濃度が生育を阻害する程度に高いときは、その培地にソルビトール、マンニトールまたはこれらの混合物が含まれている。ガラクチトールまたはリビトールは、ソルビトールまたはマンニトールで置き換えてもよいし、ソルビトールまたはマンニトールと組み合わせて用いてもよい。Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、発酵が起こりかつエタノールが産生される培地中で生育する。発酵は、空気、酸素または他の気体を補給せずに行われる（嫌気性、微好気性、または微好気性発酵などの条件を伴う場合もある）。発酵時間は少なくとも約２４時間であるが、３０時間以上継続させてもよい。エタノール産生が最大に達するまでのタイミングは、発酵条件に応じて変動することがある。発酵は温度約３０℃〜約３７℃かつｐＨ約４．５〜約７．５にて行うことができる。

本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）は、実験室規模の発酵槽中のキシロース含有混和糖を含む培地において、商業的な量のエタノールを産生するスケールアップ式の発酵で生育できる。エタノールの商業生産が望ましい状況では、それに適用できる培養法は多岐にわたる。例えば、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、バッチ培養法および連続培養法のどちらを使用しても大量生産できる。古典的なバッチ培養法は、培地の組成物が培養開始時に設定される閉じた系であるため、培養工程中に人為的な変更を被らない。ゆえに、培養工程の開始時に、培地に所望の生物が接種され、系に何も添加しなくても生育または代謝活性が生じ得る。ただし、「バッチ」培養は典型的には炭素供給源の添加に関する処理単位であり、多くの場合、ｐＨおよび酸素濃度などの制御因子にて試行が為される。バッチ系では、培養が終了する時点まで、系の代謝産物およびバイオマス組成物が絶えず変更される。バッチ培養において菌体の生育速度は、静的誘導期から高対数増殖期までを通じて緩和され、最後に、定常期に移ると、生育速度が減速または停止する。定常期において菌体は、無処置のままだと最終的に死滅する。多くの場合は、対数増殖期にある菌体が、エタノールの大量産生を担う。

標準バッチ系のバリエーションには、流加（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）系がある。流加（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）培養プロセスはまた、本Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株の生育にも好適であり、培養の進行につれて基質を増分的に添加することを除き、典型的なバッチ系で構成されている。流加（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）系で実の際の基質濃度の測定は困難であるため、ｐＨ、および廃物気体（ＣＯ₂など）のガス分圧といった測定可能因子の変更に基づいて推定される。バッチおよび流加（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ）培養法は一般的であり当該技術分野において周知であり、それらの例は、参照によって本明細書に援用されているＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，Ｃｒｕｅｇｅｒ，ａｎｄ Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，ｏｒ Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）に見出すことができる。

エタノールの商業生産もまた、連続培養によって達成し得る。連続培養は開放系であり、培地がバイオリアクターに連続的に添加されると同時に等量の調整培地を除去し、処理を可能にしている。連続培養では一般に、菌体は主として対数増殖期にある。この対数増殖期においては恒常的な高液相密度で菌体が維持される。連続培養を実施する場合の代替方法として、固定化菌体が用いられる場合もある。炭素および栄養分が継続的に添加され、有用な生成物、副産物、または廃物が菌塊から継続的に除去される。当業者に公知のように、菌体の固定化には天然材料および／または合成材料で構成される固体支持体を使用可能であり、これらの固体支持体には多種多様なものがある。

エタノール産生には特に好適な発酵方法は、下掲のとおりである。本発明に係る望ましいＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株は、振盪フラスコ内で半複合培地にて約３０℃〜約３７℃で生育され、オービタルシェーカー内で約１５０ｒｐｍにて振盪された後、同様な培地を含む１０Ｌのシード発酵槽に移される。シード培養物はシード発酵槽内で嫌気的に生育し、ＯＤ₆₀₀が３〜１０に達すると、発酵パラメータがエタノール産生用に最適化されている産生用発酵槽に移される。シードタンクから生産タンクに移された典型的な接種菌体積は、約２％〜約２０％ｖ／ｖの範囲に及ぶ。当業者に知られているように、本株の発酵培地は少なくとも約５０％のバイオマス加水分解物を含有しており、他の栄養分を補給してもよい。培地中には、終濃度が約５ｍＭのソルビトールまたはマンニトールが存在する。

発酵はｐＨ５．０〜６．０にて制御される。その際、苛性アルカリ溶液（水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウム等）と、硫酸またはリン酸のどちらか一方とを使用する。発酵槽の温度は、３０℃〜３５℃で制御される。発泡を最小限に抑えるために、必要に応じて消泡剤（シリコーン系、有機系など、任意の種類のもの）を容器に添加する。カナマイシンなどの抗生物質は、その抗生物質に対して抗菌性の耐性マーカーが株内に存在する場合、またはその抗生物質に対して株が耐性を有する場合に、汚染を最小限に抑える目的で任意選択的に使用してもよい。

上記の一連の条件および当該技術分野において周知であるこれらの条件のバリエーションは、キシロース資化性組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を用いたエタノール産生にとって好適な条件である。

（発明の好ましい態様）
バイオマス加水分解物培地中での適応およびスクリーニング工程によって、バイオマス加水分解物の存在下にてグルコースおよびキシロースの資化性ならびにエタノール産生に優れるキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株を得ることが可能であることが、本明細書に開示されている。グルコースおよびキシロース資化性ならびにエタノール産生の増大は、対応するキシロース資化性の非適応株を用いた場合のグルコースおよびキシロース資化性と比較することによって測定される。対応する非適応株は、加水分解物の適応工程用の開始株として使用される株である。

本明細書中の実施例１および２に記載されているように、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株を、加水分解物の適応実験から単離した。２つの単離株をＡｄａｐｔｅｄ５−６（またはＡＲ２ ５−６）およびＡｄａｐｔｅｄ７−３１（またはＡＲ３ ７−３１）と命名し、更に特徴付けた。本明細書中の実施例３に記載されているように、これらの株はトウモロコシ穂軸の加水分解物中で生育された場合、対応する非適応株ＺＷ７０５に比べてグルコースおよびキシロースの資化速度が迅速であった。発酵を実施してから２１時間経った時点で、グルコースが資化率が約２０％増加した。加えて、２１時間経った時点で、エタノールが産生率が約２２％増加した。５２時間経った時点では、キシロース資化率が約２１％増加し、エタノール産生率が５％増加した。一般的に、後述するＡｄａｐｔｅｄ５−６株またはＡｄａｐｔｅｄ７−３１株の新たな遺伝的変更を有する株においては、グルコース資化、キシロース資化、およびエタノール産生の正確なパーセントの増加は、多くの因子に依存する。これらの因子としては、発酵条件のほか、本明細書に開示されている新たな遺伝的変更が加えられた株の遺伝的特性も挙げられる。

Ａｄａｐｔｅｄ５−６およびＡｄａｐｔｅｄ７−３１株のゲノムに何らかの変更が生じたかどうかを同定するために、ゲノムの配列決定を行った。これらのゲノム配列を、対応する開始株、ＺＷ７０５（米国特許出願公開第２０１１００１４６７０Ａ１号明細書に記載）、野生型株ＺＷ１（ＡＴＣＣ ３１８２１）、および株ＡＴＣＣ ３１８２１（Ｓｅｏ ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：６３−８ ２００５；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６５２６．２）の公開済みザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）配列のゲノム配列と比較して、両方の株が同じコード領域内で単一の新たな変異を持つことを確認した。このコード領域は、公開済みザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノム配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６５２６．２）内のｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として同定されており、配列番号１が付いたヌクレオチド１４４６６０３〜１４４８６３３を補足している。

Ａｄａｐｔｅｄ５−６においては、変異（ＣからＧへの変更）が配列番号１の位置番号１０９７に保持されている。これにより、ｚｍｏ１４３２でコードされたタンパク質（配列番号２））中のコドン３６６が、スレオニンをコードするＡＣＡからアルギニンをコードするＡＧＡに変わり、結果として配列番号３のタンパク質においてスレオニンＮｏ．３６６がアルギニンで置換される。Ａｄａｐｔｅｄ７−３１においては、変異（ＣからＴへの変更）が配列番号１の位置番号３５０に保持されている。これにより、ｚｍｏ１４３２でコードされたタンパク質（配列番号２））中のコドン１１７が、セリンをコードするＴＣＴからフェニルアラニンコードするＴＴＴに変わり、結果として配列番号４のタンパク質においてセリンＮｏ．１１７がフェニルアラニンで置換される。

仮説的（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）コード領域ｚｍｏ１４３２（即ち、ＯＲＦ）は、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の完全なゲノム配列（ＮＣＢＩリファレンス：ＮＣ＿００６５２６．２）中で「フザリン酸耐性タンパク質」をコードするものとして注釈付けされている。それには、フザリン酸耐性タンパク質保存領域、即ち、タンパク質モチーフ：ＰＦＡＭ：ＰＦＯ４６３２（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を有するものとして注釈付けされている。このモチーフは、フザリン酸耐性に関連しているバークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：：Ｐ２４１２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）；Ｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：１９１３−１９１８；この生物は旧称シュードモナス‐セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）から改名済み）由来およびクレブシエラ・オキシトーカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：：Ｑ４８４０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）；Ｔｏｙｏｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１３３：１６５−２７７）由来のタンパク質中に見つかる。これらのタンパク質は、多くの場合、膜輸送タンパク質である。

バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）染色体１の完全な配列のＢｃｅｎｍ０３＿１４２６と名付けられた領域は、推定のフザリン酸耐性輸送体タンパク質をコードするものとして注釈付けされている（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＹＰ＿００１７６４７２３；Ｃｏｐｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ２／２７／２００８）。本明細書中の実施例４に記載されているように、このタンパク質（配列番号７）は、ｚｍｏ１４３２でコードされたタンパク質に対して類似性を有する。加えて、本明細書中の実施例４に記載されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）タンパク質ＡａｅＢ（配列番号８）は、芳香族カルボン酸流出ポンプの成分であり（ＶａｎＤｙｋ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔ．１８６：７１９６−７２０４（２００４））、ｚｍｏ１４３２でコードされたタンパク質に対して類似性を有する。ゆえに、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の輸送タンパク質は、加水分解物培地で生育されたキシロース資化性ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）株のグルコースおよびキシロース資化性、ならびにエタノール産生を改善する、変異の標的となり得る。

以下の実施例では、本発明について更に明確に述べる。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的にのみ挙げられていることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に種々の変更および改良を施して本発明の様々な利用および条件に適合させ得る。

略語の意味は、以下のとおりである。即ち、「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｎｔ」はヌクレオチドを意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「μＬ」または「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｐｍｏｌ」ピコモルを意味し、「ＯＤ６００」は６００ナノメートルにおける光学密度を意味する。

一般的方法
タービドスタット
適応はタービドスタット（米国特許第６，６８６，１９４号明細書；Ｈｅｕｒｉｓｋｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）という連続流動培養装置で為された。この装置において、培養物への培地の流れを制御することによって培養物中の菌体濃度が一定に維持され、結果として、培養物の混濁度が所定の狭い範囲内に維持された。連続培養物装置での増殖培養に利用できた培地は、レスティング培地（培地Ａ）およびチャレンジ培地（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｅｄｉｕｍ）（培地Ｂ）の２つである。グロースチャンバにて静止培地中で培養物を混濁度設定点まで生育し、次いで、その菌体密度を維持するように設定された希釈率で希釈した。規定した容量の培地を１０分ごとに１回添加して、希釈を行った。タービドスタットが培地チャレンジモードに入ってから、前回の培地添加後の設定点への復帰率に基づいて、チャレンジ培地（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｅｄｉｕｍ）またはレスティング培地のどちらを添加するかを選択した。グロースチャンバ内の培地の定常状態濃度は、培地Ａおよび培地Ｂの混合物に、設定済み菌体密度を設定済み希釈率に維持できるときの各培地からの回収率に依存する、２つの培地の比率を用いて求められる。グロースチャンバ内の母集団を代表する菌体標本を、１週間間隔でタービドスタット（トラップチャンバ内）の流出物から回収した。菌体標本をいったんＭＲＭ３Ｇ６培地中で生育してから、−８０℃にてグリセロール株として貯蔵した。

酵素
Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ−１００，Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ＣＸ１２Ｌ、およびＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００はＤａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）製であった。

Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８はＮｏｖｏｚｙｍｅｓ（２８８０Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）製であった。

本明細書中の糖化工程で用いられた酵素には、ほかにもグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１ＡおよびＦｖ４３Ｄがあった。Ｘｙｎ３（配列番号９）はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のＧＨ１０ファミリーのキシラナーゼであり、Ｆｖ３Ａ（配列番号１０）はフザリウム・ベルチシルリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）由来のＧＨ３ファミリーの酵素であり、Ｆｖ４３Ｄ（配列番号１１）はフザリウム・ベルチシルリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）由来のＧＨ４３ファミリーの酵素であり、およびＦｖ５１Ａ（配列番号１２）はフザリウム・ベルチシルリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）由来のＧＨ５１ファミリーの酵素である。

培地
まず、挽いたトウモロコシ穂軸を希釈アンモニアで前処理して、適応に使用されるトウモロコシ穂軸の加水分解物を調製した。容器の本体周囲および側面の１つに蒸気を渡すためのジャケットを備えた横置きＬｉｔｔｌｅｆｏｒｄ Ｄａｙ１３０Ｌ反応器ベッセル（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ，ＫＹ）に、粉砕成型された穂軸を入れた。容器に減圧を適用して０．１ａｔｍに到達させてから、２９ｗｔ％の水酸化アンモニウム溶液および水を容器の最上部近くに導入し、乾燥重量バイオマスを基準として６ｗｔ％のＮＨ３を生成した。容器の最上部近くに蒸気を導入し、内部の容器温度を１４５℃まで上げた。この温度を２０分間保持した。前処理が終わった時点で、反応器が減圧され、大気圧に到達する。以後、減圧を（約１ａｔｍ未満になるまで）適用して、温度を６０℃未満に下げた。

その後、前処理した穂軸を酵素集合体で処理し、Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰ−１００（前処理済み穂軸のグルカン１ｇあたりタンパク質３４ｍｇ）；Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ ＣＸ１２Ｌ（前処理済み穂軸のキシラン１ｇあたりタンパク質１２．５ｍｇ）；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ１８８（前処理済み穂軸のグルカン１ｇあたりタンパク質６．６ｍｇ）を含有する酵素混合物を使用してセルロースポリマーおよびヘミセルロースポリマーを酵素加水分解できた。加水分解反応を２５％（重量／体積）で行い、穂軸乾燥物をｐＨ５．３かつ４７℃で前処理した。反応を連続撹拌により７２時間継続した。

初期連続遠心分離を用い、加水分解物から固体を除去して、混合物を部分的に清澄化する。部分的に清澄化された混合物を１８，０００×Ｇで２０分間再び遠心分離し、先に０．４５マイクロメートルのフィルターに通してから０．２２マイクロメートルのフィルターに通して、清澄化されたフィルター滅菌加水分解物を生成する。

グルコース、キシロースおよびアセテート濃度のそれぞれをＨＰＬＣ分析で定量した。清澄化された加水分解物は、グルコース濃度が６８ｇ／Ｌ、キシロース濃度が４６ｇ／Ｌ、およびアセテート濃度が５ｇ／Ｌであった。清澄化された加水分解物に６．２ｇ／Ｌの酢酸アンモニウムを補給して、濃度が１１〜１２ｇ／Ｌの範囲に収まるように酢酸アンモニウムの総濃度を上げた。記載がある場合、更なる栄養分を提供するために０．５％の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）を添加した。この培地をＨＹＡｃ／ＹＥとラベル付けした。ＨＹＡｃ／ＹＥ培地のｐＨを５．８に調整して、培地をフィルター滅菌した。

加水分解物中に使用される酵素組成物を、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）１５００、Ｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１ＡおよびＦｖ４３Ｄ含有の酵素配合物に変更し、グルカン＋キシラン１ｇあたり２１．３ｍｇのタンパク質で加水分解反応物に添加したことを除き、上記の方法を使用して、１Ｌの発酵試験のための加水分解物培地を調整した。加水分解物を清澄化せずに、１Ｌスケールの発酵物中に使用した。

更なる培地
ＭＲＭ３は１リットルあたり以下を含有する。酵母抽出物（１０ｇ）、ＫＨ₂ＰＯ₄（２ｇ）およびＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（１ｇ）
ＭＲＭ３Ｇ６．５Ｘ４．５ＮＨ₄Ａｃ１２．３は、６５ｇ／Ｌのグルコース、４５ｇ／Ｌのキシロース、１２．３ｇ／Ｌの酢酸アンモニウムを含有するＭＲＭ３である。
Ｇ５またはＭＲＭ３Ｇ５は、５０ｇ／Ｌのグルコースを含有するＭＲＭ３である。
Ｇ１０またはＭＲＭ３Ｇ１０は、１００ｇ／Ｌのグルコースを含有するＭＲＭ３である。
ＭＲＭ３Ｇ２は、２０ｇ／Ｌのグルコースを含有するＭＲＭ３である。
ＭＲＭ３Ｘ２は、２０ｇ／Ｌのキシロースを含有するＭＲＭ３である。
ｈａｌｆＹＥＭａｘＳＭ：１０ｇ／ＬのＤｉｆｏ酵母抽出物、２ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、５ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１０ｍＭのソルビトール、１５０ｇ／Ｌのグルコース。

図２に示す平板培養に関する研究では、ＭＲＭ３Ｇ２（２０ｇ／Ｌのグルコース）およびＭＲＭ３Ｘ２（２０ｇ／Ｌのキシロース）に１．５％の寒天を補給し、寒天が溶けるまで加熱し、４５℃まで冷却してペトリ皿に注入した。

冷凍貯蔵培養物の調製
株ＺＷ７０５、週次のタービドスタット標本母集団培養物、および単離された変異体クローンで凍結貯蔵培養物を調製した。Ｇ５またはＧ１０培地で最初の凍結株を生育し、生成されたバイオマスを使用して新しい凍結株を調製することによって、凍結株をほかにも調製した。

シード培養物、バッチ適応培養物、およびタービドスタット培養物の接種
凍結株を使用して、オーバーナイトＧ５またはＧ１０のシード培養物を接種した。そのシード培養物を使用して、シード培地を遠心分離して新鮮な適応培地中で菌体ペレットを希釈することによって、バッチ適応培養物を接種した。タービドスタット接種では、１０〜１５ｍｌのタービドスタットレスティング培地中に全シードペレットを再懸濁してタービドスタット反応器への接種に使用するか、または５ｍｌのオーバーナイトシードを１０％接種菌として使用した。

培養物のＯＤ６００の測定
培養物のＯＤを測定するにあたって、標本を１００ｇ／Ｌキシロース（希釈液、およびブランク）で希釈した。希釈された培養物を１５分間静置させてから、ＯＤの測定を行った。すべてのＯＤ測定を６００ｎｍで行った。

ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ分析をＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステムで行った。使用されたカラムは、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ−Ｇｕａｒｄ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃａｔｉｏｎ−Ｈ（＃１２５−０１２９，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）搭載のＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ ＩＯＮ−３００カラム（＃ＩＣＥ−９９−９８５０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ）であった。０．０１ＮのＨ₂ＳＯ₄を溶媒として使用して、７５℃かつ０．４ｍＬ／分の流量にてカラムを作動させた。外部標準較正曲線を使用して、示差屈折率検出器で、開始糖類および生成物の濃度を定量した。

株ＺＷ７０５の説明
ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ７０５を株ＺＷ８０４−１から生成した。ＺＷ８０１−４は、共通の所有者を有する米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載のＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の組換えキシロース資化性株である。この特許文献は、本明細書において参照により援用されている。株ＺＷ８０１−４は、株ＺＷ６５８に起源を持つ株ＺＷ８００から派生した。これらはすべて米国特許第７，７４１，１１９号明細書に記載されている。ＺＷ６５８は、４つのキシロース資化性遺伝子（キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼ、およびトランスケトラーゼをコードする）を含む２つのオペロン（Ｐ_gapｘｙｌＡＢおよびＰ_gapｔａｌｔｋｔ）を、逐次転位事象（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ）を介してＺＷ１（ＡＴＣＣ３１８２１）のゲノムに組み込むことによって構成され、その後、キシロース含有の選択培地上で適応された（米国特許第７，６２９，１５６号明細書）。ＺＷ６５８はＡＴＣＣ ＰＴＡ−７８５８として寄託された。ＺＷ６５８において、宿主媒介のダブルクロスオーバーの相同組み換えおよびスペクチノマイシン耐性を使用して、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を選択可能マーカーとして挿入的に不活性化して、ＺＷ８００を作製した（米国特許第７，７４１，１１９号明細書）。ｌｏｘＰ部位に囲まれているスペクチノマイシン耐性マーカーを部位特異的組み換えによって除去し、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用してＺＷ８０１―４を作製した。

酢酸アンモニウム含有の培地のストレス条件下で、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）株ＺＷ８０１−４の培養物を生育に適応させ、共通の所有者を有する米国特許出願公開第２０１１００１４６７０Ａ１号明細書に記載のＺＷ７０５を生成した。この特許文献は、本明細書において参照により援用されている。ＺＷ８０１−４の連続培養は、２５０ｍｌ撹拌型の、ｐＨおよび温度調節式発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ；Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。発酵用の基礎培地は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１５ｍＭのリン酸アンモニウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１０ｍＭのソルビトール、５０ｇ／Ｌのキシロースおよび５０ｇ／Ｌのグルコースであった。特定の希釈率で測定された確立済み生育速度を９７日間にわたって維持しながら、酢酸アンモニウムの濃度を徐々に上げ、上述の連続培地に添加して、高濃度のアセテートおよびアンモニアの存在下での生育に適応させた。酢酸アンモニウムの濃度を１６０ｍＭまで上げた。リン酸アンモニウムを添加してアンモニウムイオン濃度を更に上昇させ、１３９日間の連続培養の終了時までに最終的な総アンモニウムイオン濃度２１０ｍＭにした。単一コロニーに平板培養し、その選択された単一コロニーを増殖して、適応された母集団から株ＺＷ７０５を単離した。

実施例１
自動菌体密度調整連続培養器を使用したトウモロコシ穂軸加水分解物への適応
「一般的方法」に記載のタービドスタットを使用して、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）の培養物をトウモロコシ穂軸の加水分解物培地中での生育に適応させた。「一般的方法」に記載されているタービドスタットにて、恣意的な濁度設定点に達するまで、株ＺＷ７０５の培養物を生長させた。この濁度設定点は、規定の希釈率における設定点菌体密度を達成できるよう、搬入される培地中に存在する全グルコースと約半分のキシロースとを培養物に利用させるように指示するものである。使用したレスティング培地は、ＨＹＡｃ／ＹＥが５０％、ＭＲＭ３Ｇ６．５Ｘ４．５ＮＨ₄Ａｃ１２．３が５０％であった。「一般的方法」に記載されているように、チャレンジ培地（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｅｄｉｕｍ）ＨＹＡｃ／ＹＥとして使用してタービドスタットを作動させた。６週間にわたって週次に、トラップチャンバから菌体標本を採取した。

６週間にわたって連続培養した後、週次に貯蔵された菌体株からの標本をＭＲＭ３Ｇ６中で復活させ、１０ｍｌの静置培養物中で３３℃にてＯＤ６００が約１になるまで生育した。これらを使用して、ＯＤ６００ｎｍが約０．４になるまで１２ｍｌのＨＹＡｃ／ＹＥ培地の培養物を接種し、３０℃で培養物を生育した。表１に記載されているような様々な時点で標本を採取し、ＯＤ６００、糖消費、およびエタノール産生についてアッセイした。結果は表１に示すとおりである。

表１．１２ｍｌのＨＹＡｃ／ＹＥ発酵物中で生育されたタービドスタット標本の週次分析

すべての培養物が、キシロースを資化する能力を保持したが、３週目の適応後にキシロースの利用率が低下したようであった。３週目の終わりに標本採取された菌体培養物から、単一コロニーを単離した。コロニーは、ＭＲＭ３Ｇ５中で保持されたグリセリン株を生育してＭＲＭ３Ｘ２プレート上で平板培養することによって、単離された。単一コロニーはＭＲＭ３Ｘ２およびＭＲＭ３Ｇ２プレートにレプリカパッチされた。両方の炭素供給源上の大きい高密度パッチを株として選択し、冷凍グリセロール株として維持した。上述の冷凍株母集団試験について記述したように、選択した株を１２ｍｌの試験培養物中で生育させた。６つの株およびＺＷ７０５の結果は、表２に示すとおりである。

表２．１２ｍｌのＨＹＡｃ／ＹＥ発酵物中で生育されたＺＷ７０５（タービドスタットでの適応３週目）から単離された純粋培養の分析

１２ｍｌの試験において、選択されたいずれの株も、適応を施した株（ＺＷ７０５）と比較対照してエタノール産生を増した。それらの株は、親株に比べてキシロース使用量が若干多かった。更に適応を反復させる株１２−１８Ｘ−２−３６を選択した。

実施例２
自動菌体密度調整連続培養器を使用しての、エタノールを添加したトウモロコシ穂軸加水分解物への適応
レスティング培地をＨＹＡｃ／ＹＥとし、チャレンジ培地（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｍｅｄｉｕｍ）をＨＹＡｃ／ＹＥ＋９重量％のエタノールとしたことを除いて、「一般的方法」にて株ＺＷ７０５に関して上述したのと同様に、株１２−１８Ｘ−２−３６の培養物（実施例１に記載）をタービドスタットで生育させた。４週間にわたってタービドスタットを作動させ、チャンバ流出物を週次に標本採取した。流出物の標本から冷凍菌株を作製した。開始密度をＯＤ６００＝約０．５としたことを除き、最初のタービドスタットの作動について記述した条件と同じ条件で、１２ｍｌの加水分解物発酵試験においてＭＲＭ３Ｇ６の冷凍細胞株を復活させた。１つの発酵を同じＨＹＡｃ／ＹＥ培地にて行い、もう１つの発酵を培地１Ｌあたり３０ｇのエタノールを添加したＨＹＡｃ／ＹＥ培地にて行った。両方の発酵の結果は、表３に示すとおりである。

表３．１２ｍｌのＨＹＡｃ／ＹＥまたはＨＹＡｃ／ＹＥ＋３０ｇ／Ｌエタノール発酵物中で生育されたタービドスタット標本の週次分析

ＨＹＡｃ／ＹＥ培地にエタノールを添加しない試験発酵では、すべての培養物がＺＷ７０５対照と類似していた。ＨＹＡｃ／ＹＥ培地に３０ｇ／Ｌのエタノールを添加した発酵では、１週間後および２週間後に採取された培養物は、ＺＷ７０５ならびに第３週および第４週の標本に比べて、グルコース資化性およびエタノール産生がはるかに良好であった。エタノールを添加して開始された試験において、最終のエタノール滴定値が最も高かったのは、２週間後に貯蔵された培養物であり、この培養物は単細胞由来の株から単離される対象として選択された。株１２−１８Ｘ−２−３６を誘導するスクリーニングについて記述した株単離手順を２回行った。その両方のスクリーニングの結果は、表４および表５に示すとおりである。エタノールを添加しないＨＹＡｃ／ＹＥ培地または４０ｇ／Ｌのエタノールを添加したＨＹＡｃ／ＹＥ培地にてスクリーニングを開始した。

表４．１２ｍｌのＨＹＡｃ／ＹＥまたはＨＹＡｃ／ＹＥ＋エタノール発酵物中で生育された１２−１８Ｘ−２−３６（タービドスタットでの適応２週目）から単離された純粋培養の分析（１回目）

エタノールを添加せずに開始したときに、ほとんどの株は加水分解物培地中のグルコースをすべて使用したが、キシロースを一部しか使用しなかった。そのため、エタノールの総産生量はキシロース資化性の程度に依存した。非適応親株ＺＷ７０５に比べてキシロース利用率およびエタノール産生に優れる株も、幾つかあった。４０ｇ／Ｌのエタノールを開始培地に添加したときの生育および糖資化性は、すべての株のなかでもかなり低かった。本試験では、ほとんどの場合に、キシロース利用率がきわめて低かったか、キシロースが全く消費されなかった。３つの株のグルコース利用率およびエタノール産生は、ＺＷ７０５よりも有意に高かった。それらのなかでも最高だったのは、表４に示す株Ａｄａｐｔｅｄ５−６である。

表５．１２ｍｌのＨＹＡｃ／ＹＥまたはＨＹＡｃ／ＹＥ＋エタノール発酵物中で生育された１２−１８Ｘ−２−３６（タービドスタットでの適応２週目）から単離された純粋培養の分析（２回目）

結果は、２回目の株単離実験のときと同様であった。エタノールを添加しない試験においてＺＷ７０５に比べてキシロース利用率が多かった優れる株もあれば、エタノールを添加した試験においてグルコース利用率が多かった株もある。多くの株は、最初の２４時間の生育中にグルコース利用率が増加し、かつ最初の２４時間で菌塊収率量（ＯＤ６００ｎｍにて測定）も増加した。これらの株のなかから株Ａｄａｐｔｅｄ７−３１を更なる試験対象として選択した。

実施例３
加水分解物適応株の性能試験
シード発酵
１Ｌの発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ ＢＩＯＳＴＡＴ）でシード発酵を行った。滅菌された空の発酵槽を、フィルター滅菌されたｈａｌｆＹＥＭａｘＳＭで充満した。濾過されてない４規定のＮＨ₄ＯＨをｐＨ５．５に調整するための塩基として使用して、シード発酵を３３℃かつｐＨ５．５で実施した。シード発酵物に、ｈａｌｆＹＥＭａｘＳＭ中でＯＤ６００が約２．５になるまで約７．５時間生育させた充分な量の冷凍株細胞を接種した。菌体を１Ｌの発酵槽で希釈し、開始時のＯＤ６００ｎｍを約０．０２５とした。概して、〜１２０ｇ／Ｌのグルコースが消費されてから、かつ／またはＯＤ６００が約１０に達してから、シード発酵物を回収した。シード発酵物を周期的に標本採取して生育をモニターしてから、約１８．５時間で回収した。

加水分解物の発酵
加水分解物の発酵を１Ｌの発酵槽（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ ＢＩＯＳＴＡＴ）で実施した。滅菌された空の発酵槽を、「一般的方法」に記載されている方法で調整されたトウモロコシ穂軸加水分解物４５０ｍｌで充填した。４規定のＮａＯＨをｐＨ調整のための塩基として使用して、加水分解物の発酵をｐＨ５．８で実施した。加水分解物の発酵を３３℃で開始した。加水分解物の発酵物に、シード発酵物（上記を参照）からのシードを１０体積％（５０ｍｌ）接種して、初期ＯＤを約１．０にした。加水分解物の発酵を周期的に標本採取し、反応の進行をモニターした。「一般的方法」に記載されているように、グルコース、キシロース、およびエタノールについて標本をアッセイした。

２つの加水分解物の発酵を１週間の間隔で行った。各発酵には、対照株ＺＷ７０５、および適応を経た株のなかから選択されたＡｄａｐｔｅｄ７−３１（実施例２）を用いた。発酵時間の経過は図１に示すとおりである。Ａｄａｐｔｅｄ７−３１は、発酵過程においてグルコース利用速度がＺＷ７０５よりも速くなり、キシロース総使用量が増加し、エタノール滴定値が増加した。

上に記載したように加水分解物の発酵を行い、アッセイして、対照株ＺＷ７０５、株Ａｄａｐｔｅｄ７−３１、および株Ａｄａｐｔｅｄ５−６（実施例２を参照）を比較対照した。結果は図２に示すとおりである。株Ａｄａｐｔｅｄ５−６の性能は、株Ａｄａｐｔｅｄ７−３１の性能と同等であった。これらの適応株は両方とも、発酵開始時点でグルコース利用速度が迅速化し、発酵終了時までにキシロース利用率が増大したため、エタノール滴定終値が高まった。

実施例４
適応株の比較対照用ＤＮＡ配列決定
野生型ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ＺＭ４）の全ゲノム配列が記述されている（Ｊｅｏｎｇ−Ｓｕｎ Ｓｅｏ ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２３，２００５）。野生型開始株（ＺＷ１；ＡＴＣＣ３１８２１）、中間株（ＺＷ６５８；ＡＴＣＣ ＰＴＡ−７８５８）およびＺＷ７０５については、高スループット４５４技術（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ａｎｄ Ｊｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：１１３５（２００８））を使用して配列決定を行い、公開済み野生型配列と比較した。株Ａｄａｐｔｅｄ５−６およびＡｄａｐｔｅｄ７−３１については、Ｉｌｕｍｉｎａ技術（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ａｎｄ Ｊｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２６：１１３５（２００８））を使用して配列決定を行った。野生型配列、ＺＷ６５８の配列、および別々に判別された挿入部位（その部位への意図的な配列変更が、２つのキシロース資化オペロンの挿入とＧＦＯＲ遺伝子のノックアウトとに起因するもの）（「一般的方法」に記載）を基に、適応株由来の配列と比較対照し得るコンセンサス配列が作製された。配列決定およびゲノムアセンブリについては、以下に説明する。

配列決定
株の配列決定には、配列決定技術Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａおよびＲｏｃｈｅ４５４を使用した。これらの大規模並列処理の配列決定方法を用いると、ショートリード（ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ）のきわめて高いスループットが実現される。Ｉｌｌｕｍｉｎａの場合、リード数は２億（１００塩基対の長さ）を超える。Ｒｏｃｈｅ４５４による出力の場合、リード数は１００万（５００塩基対の長さ）である。どちらの方法を使用した場合にも、ゲノムＤＮＡ断片の両端からの配列決定が可能になり、ペアードエンドリード（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ ｒｅａｄｓ）が起こる。

Ａｄａｔｐｅｄ５−６およびＡｄａｐｔｅｄ７−３１株からの何億ものショートリード（ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓ）が、野生型、ＺＷ６５８、およびＺＷ７０５配列から調製されたリファレンスゲノム配列にアラインされた。結果として得られたアラインメントを分析することによって、カバレージおよびバリエーションの情報が収集された。多くのリードを特定の領域に対してアラインできるため、アラインメントはリファレンスに対するリードの累積（ｐｉｌｅ ｕｐ）となり、所定の位置の深度カバレージはその位置をカバーするリードの数となる。或る位置においてコンセンサス塩基がリファレンス塩基とは異なる場合、その位置は一塩基多型（ＳＮＰ）バリエーションを有すると言える。

Ａｄａｐｔｅｄ５−６およびＡｄａｐｔｅｄ７−３１配列を適応ＺＷ７０５配列の開始株と比較する際に、一塩基の変更またはＳＮＰを、適応株ごとに同定した。Ａｄａｐｔｅｄ５−６のＳＮＰは、ｚｍｏ１３３０と呼ばれる遺伝子のオープンリーディングフレーム内の位置１４５３１１６に存在した。同じオープンリーディングフレーム内にはＡｄａｐｔｅｄ７−３１のＳＮＰが存在していたが、その変更は別の位置（１４５３８６３）に保持されていた。Ａｄａｐｔｅｄ５−６における変更は、コード領域（配列番号１）の位置１０９７に保持されている、その位置におけるＣからＧへの変更である。この変異が起こると、アミノ酸３６６のコドンがＡＣＡからＡＧＡに変更され、結果として、コードされたタンパク質中のアミノ酸３６６がスレオニンからアルギニンに変更される。Ａｄａｐｔｅｄ７−３１における変更は、コード領域（配列番号１）の位置３５０に保持されている、その位置におけるＣからＧへの変更である。この変異が起こると、アミノ酸１１７のコドンがＴＣＴからＴＴＴに変更され、結果として、アミノ酸１１７がセリンからフェニルアラニンに変更される。

ｚｍｏ１３３０でコードされたタンパク質を、輸送体分類データベースのＢＬＡＳＴ（Ｓａｉｅｒ Ｌａｂ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ；Ｓａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：Ｄ２７４−８）で使用して、そのタンパク質がａａｅＢファミリーに属していることを同定した。このタンパク質ファミリーは、５〜６の膜交差部、かなり長い低疎水性の中間セクション、そしてＣ末端における同様な５〜６の膜交差部を予測する、疎水性Ｎ末端を有することにより特徴付けられる。この結果は、ｚｍｏ１３３０でコードされたタンパク質が膜輸送タンパク質であることを示唆している。

公開済みＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のゲノム配列（Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：ＮＣ＿００６５２６．２）においてｚｍｏ１３３０は、「フザリン酸耐性タンパク質」をコードするものとして注釈付けされているｚｍｏ１４３２に対応している。シュードモナス‐セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）においてフザリン酸に対する耐性を有するうえで必要とされる一連のタンパク質は、Ｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：１９１９−１９１８（１９９１））によって同定された。フザリン酸耐性を付与する１つのオペロン様のものにおける一連のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうちの１つは、Ｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．（前掲書）がｆｕｓＢと命名したものである。ｆｕｓＢでコードされるタンパク質の配列は、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）由来のＢｃｅｎｍ０３＿１４２６（配列番号７）と同一物であり、ｚｍｏ１４３２でコードされるタンパク質とアラインされた。図３に示すとおり、２つのタンパク質配列が３つの小ギャップとアラインされ、２２％の同一性および６３％の類似性（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント）を有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のオペロン内でコードされる２つのタンパク質はｐ−アミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）に対する耐性を持つうえで必要であることが立証されており（ＶａｎＤｙｋ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔ．１８６：７１９６−７２０４（２００４））、その２つのタンパク質のうちの大きい方が、ＡａｅＢの配列（配列番号８）である。このＡａｅＢの配列に対して、Ｂｃｅｎｍ０３＿１４２６の配列はほぼ同じ同一性および類似性を有する。Ｚｍｏ１４３２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＡａｅＢに対して１７％の同一性、および５５％の類似性を有する。ｚｍｏ１４３２でコードされるタンパク質とａａｅＢに属するタンパク質とのアラインメントは、図４に示すとおりである。

Claims (8)

1. ｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレーム中に少なくとも１つの遺伝的改変を有する、キシロース資化性エタノール産生性の、組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物。
2. 少なくとも１つの遺伝的改変を有する前記ｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレームが、配列番号２に示す前記アミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の相同性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、
   前記変異体タンパク質を存在させることによって、前記同じ条件下にて前記遺伝的改変の無いザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）による産生と比較して、バイオマス加水分解物培地での発酵中に前記ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）によるエタノール産生を増強する、請求項１に記載の組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）。
3. 遺伝的改変が、
   １） 配列番号２の位置３６６におけるスレオニンからアルギニンへの置換、および、
   ２） 配列番号２の位置１１７におけるセリンからフェニルアラニンへの置換、
   からなる群から選択されるアミノ酸置換を生じさせるｚｍｏ１４３２コード領域における変異である、請求項２に記載の組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）。
4. ｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレーム中の少なくとも１つの遺伝的改変の無いザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）と比較してバイオマス加水分解物に対する耐性に優れる、請求項１に記載の組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）。
5. 配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
6. 配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
7. ａ） 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレームを含む、キシロース資化性エタノール産生性のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物を提供する工程と、
   ｂ） ａ）のｚｍｏ１４３２オープンリーディングフレームに変異を導入する工程であって、前記変異したオープンリーディングフレームの発現によって配列番号３および配列番号４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが発現する、前記工程と、
   を含む組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の生産方法。
8. ａ） 請求項１に記載の組換えザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を提供する工程と、
   ｂ） キシロース含有バイオマス加水分解物培地を提供する工程と、
   ｃ） ｂ）のバイオマス加水分解物培地中でａ）のザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）を生育させ、エタノールが産生される工程と、
   を含むエタノールの生産方法。

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