BR112013014912B1 - Micro-organismo recombinante, polinucleotídeo, polipeptídeo, método para a produção de um zymomonas recombinante etanologênico e método para a produção de etanol - Google Patents

Abstract

micro-organismo recombinante, polinucleotídeo, polipeptídeo, método para a produção de um zymomonas recombinante etanologênico e método para a produção de etanol linhagens de zymomonas mobilis produtoras de etanol e que utilizam xilose, com desempenho aprimorado no meio compreendendo hidrolisado de biomassa, foram isoladas utilizando um processo de adaptação. verificou-se que linhagens independentemente isoladas possuem mutações independentes na mesma região codificante. mutação em tal região codificante pode ser modificada para conferir o fenótipo aprimorado.

Description

DECLARAÇÃO DE DIREITOS GOVERNAMENTAIS

[001] Esta invenção foi realizada com apoio do governo dos Estados Unidos da América sob o registro No. DE-FC36-07GO17056 registrado pelo departamento de energia. O governo dos Estados Unidos da América possui certos direitos sob a presente invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere ao campo da microbiologia e fermentação. Mais especificamente, foram isoladas e caracterizadas linhagens de Zymomonas mutantes com crescimento e produção de etanol aumentados no meio hidrolisado de biomassa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A produção de etanol por microrganismos fornece uma fonte de energia alternativa para combustíveis fósseis e, é portanto, uma importante área de pesquisa atual. É desejável que os microrganismos que produzem etanol, bem como outros produtos úteis, sejam capazes de crescer e produzir etanol em um meio que não impacte o fornecimento de alimentos a humanos, evitando desta forma, o uso de açúcares produzidos a partir de grãos de milho. Como resultado dos desenvolvimentos no processamento da biomassa celulósica, glicose, xilose, e outros açúcares podem ser liberados em altas concentrações em um hidrolisado de biomassa para uso em fermentação. Assim, a conversão de biomassa em etanol possui grandes possibilidades de aprimoramento dos impactos ambientais através do uso de fontes não alimentícias renováveis para fornecer uma alternativa à combustíveis fósseis.

[004] Zymomonas mobilis e outros organismos bacterianos etanologênicos, que não utilizam xilose naturalmente, foram modificadas geneticamente para a utilização de xilose, para melhorar o crescimento e a produção de etanol, pelo uso de mais açúcares do que os contidos no hidrolisado de biomassa. Entretanto, o crescimento e a produção de etanol no meio contendo hidrolisado de biomassa é tipicamente não ótimo devido à presença de acetato e outros compostos que são inibitórios à microrganismos. É descrito no pedido de patente pendente US20110014670A1, de mesma titularidade e relacionado à presente invenção, um método para a produção de uma linhagem aprimorada de Zymomonas que utiliza xilose que é mais tolerante a acetato e etanol no meio, bem como linhagens isoladas por dito método.

[005] O efeito tóxico de compostos isolados que pode ser encontrado nos hidrolisados de biomassa previamente tratada é descrito em Delegenes et al. ((1996) Enzymes and Microbial Technology 19:220-224). A adaptação de Zymomonas mobilis que fermenta xilose para hidrolisado de hemicelulose álamo (poplar) amarelo ácido diluído é descrito em Lawford et al. ((1999), Applied Biochemistry and Biotechnology 77:191-204).

[006] Permanece a necessidade em isolar linhagens de Zymomonasetanologênico, que utilizam xilose, com produção aprimorada de etanol durante a fermentação no meio hidrolisado de biomassa, e métodos para a transformação genética para produzir linhagens aprimoradas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção fornece linhagens recombinantes de Zymomonas que utilizam xilose com crescimento e produção de etanol aprimorados no meio hidrolisado de biomassa. Ainda, a presente invenção refere-se a métodos para a produção de linhagens aprimoradas de Zymomonas para uso em meio hidrolisado e métodos para a produção de etanol utilizando ditas linhagens.

[008] Assim, a presente invenção fornece um microrganismo recombinante que produz etanol, e utiliza xilose, do gênero Zymomonas, que possui pelo menos uma modificação genética na fase aberta de leitura (open reading frame) zmo1432.

[009] Em um aspecto, a presente invenção fornece um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, e polinucleotídeos que codificam tal sequência.

[010] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de Zymomonas recombinante etanologênico, que compreende: (a) fornecer um microrganismo que produza etanol, e utiliza xilose, do gênero Zymomonas; (b) fornecer um polinucleotídeo que codifica uma proteína que possui a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4; e (c) introduzir o polinucleotídeo de (b) no microrganismo de (a); em que a região endógena de codificação de zmo1432 é interrompida.

[011] Em um aspecto alternativo, a presente invenção fornece um método para a produção de Zymomonas recombinante etanologênico, que compreende: (a) fornecer um microrganismo que produza etanol, e utiliza xilose, do gênero Zymomonas que compreende uma fase aberta de leitura zmo1432 que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos conforme definida em SEQ ID NO: 2; e (b) introduzir uma mutação na fase aberta de leitura zmo1432 de (a) de forma que a expressão da fase aberta de leitura mutada expresse um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4.

[012] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a produção de etanol que compreende: (a) fornecer o Zymomonas recombinante da presente invenção; (b) fornecer um meio hidrolisado de biomassa que compreende xilose; e (c) cultivar o Zymomonas de (a) no meio hidrolisado de biomassa de (b), em que etanol é produzido.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS, DEPÓSITOS BIOLÓGICOS E LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[013] O Depositante realizou os seguintes depósitos biológicos sob os termos do tratado de Budapeste no reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para os propósitos do processamento de patente: INFORMAÇÃO SOBRE LINHAGENS DEPOSITADAS

[014] A figura 1 mostra um gráfico de fermentação de hidrolisado de sabugo de milho ao longo do tempo, comparando a utilização de glicose e xilose e a produção de etanol para as linhagens de Zymomonas e 7-31 adaptadas.

[015] A figura 2 mostra um gráfico de fermentação de hidrolisado de sabugo de milho ao longo do tempo, comparando a utilização de glicose e xilose e a produção de etanol para linhagens de Zymomonas ZW705, 7-31 adaptadas, e 5-6 adaptadas.

[016] A figura 3 mostra um alinhamento de proteína codificada por zmo1432 e a proteína Bcemn03_1426 de Burkholderia cenocepacia.

[017] A figura 4 mostra um alinhamento de proteína codificada por zmo1432 e a proteína AaeB de E. coli.

[018] As sequências a seguir estão de acordo com a regra 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825 (“requisitos para pedidos de patentes contendo descrição de sequências de nucleotídeos e/ou de sequências de aminoácidos - as regras das sequências”) e são consistentes com o padrão ST.25 (2009) da Organização Mundial da Propriedade Intelectual (WIPO) e os requisitos de listagem de sequências do EPO e PCT (regras 5.2 e 49.5(a-bis), e seção 208 e anexo C das instruções administrativas. Os símbolos e formatos utilizados para os dados das sequências de nucleotídeos e aminoácidos cumprem com as regras descritas no 37 C.F.R. § 1.822.

[019] A SEQ ID NO:1 é a sequência de nucleotídeos da região codificadora designada zmo1432 na sequência genômica de Zymomonas mobilis publicada (referência NCBI: NC_006526.2).

[020] A SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos codificada pela região de codificação designada zmo1432 na sequência genômica de Zymomonas mobilis publicada (referência NCBI: NC_006526.2).

[021] A SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, mas com o aminoácido da posição No. 366 trocado por arginina.

[022] A SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, mas com o aminoácido da posição No. 117 trocado por fenilalanina.

[023] A SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácidos da proteína de Burkholderia cenocepacia codificada por fusC (Acesso P24128).

[024] A SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos da proteína de desintoxicação de ácido fusárico de Klebsiella oxytoca (Acesso: Q48403).

[025] A SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácidos da proteína de Burkholderia cenocepacia codificada por Bcenmc03_1426.

[026] A SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácidos da proteína AaeB de E. coli.

[027] A SEQ ID NO:9 é a sequência de aminoácidos de Xyn3 imaturo que incorpora uma sequência sinal prevista que corresponde às posições 1 a 16.

[028] A SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácidos de Fv3A imaturo que incorpora uma sequência sinal prevista que corresponde às posições 1 a 23.

[029] A SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos de Fv43D imaturo, que incorpora uma sequência sinal prevista que corresponde às posições 1 a 20.

[030] A SEQ ID NO:12 é a sequência de aminoácidos de Fv51A imaturo que incorpora uma sequência sinal prevista que corresponde às posições 1 a 19.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[031] A presente invenção descreve a adaptação de células de Zymomonas que utilizam xilose em meio hidrolisado de biomassa, para aprimorar o crescimento de produção de etanol. A caracterização das mutações em linhagens adaptadas identificou mutações características para o aprimoramento, que podem ser modificadas em linhagens não adaptadas de Zymomonas que utilizam xilose. Tais linhagens são utilizadas para a produção de etanol de forma mais eficiente, para produzir etanol como substituição de um combustível fóssil.

[032] As seguintes abreviações e definições serão utilizadas para a interpretação do relatório descritivo e das reivindicações.

[033] Conforme utilizado no presente, os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “possui”, “possuindo”, “contém”, “contendo”, ou qualquer outra variação dos mesmos pretendem cobrir uma inclusão não exaustiva. Por exemplo, uma composição, uma mistura, processo, método, artigo, ou aparelho que compreendem uma lista de elementos não estão necessariamente limitados apenas a estes elementos, mas podem incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Ainda, a menos que expressamente definido em contrário, “ou” refere-se a um ou inclusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou ausente), A é falso (ou ausente) e B é verdadeiro (ou presente), e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

[034] Adicionalmente, artigos indefinidos “um” e “uma” que precedem um elemento ou componente da presente invenção são descritos de forma não restritiva com relação ao número de casos (ocorrência) do elemento ou componente. Portanto, “um” ou “uma” devem ser lidos como incluindo um ou pelo menos um, e a forma da palavra singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número é obviamente significativo de singular.

[035] Da forma utilizada no presente, “células de Zymomonas que utilizam xilose” refere-se a uma célula ou células de uma linhagem que foram geneticamente modificadas para expressar enzimas que conferem a capacidade de utilizar xilose como fonte de carboidrato para a fermentação.

[036] O termo “linhagem adaptada” refere-se a um microrganismo que foi selecionado para crescimento sob condições particulares a fim de aprimorar sua capacidade de crescer e produzir um produto em tais condições.

[037] Da forma utilizada no presente, “linhagem correspondente não-adaptada” refere-se à linhagem original de Zymomonas que utiliza xilose, que é uma linhagem a partir da qual linhagens aprimoradas são produzidas utilizando o processo de adaptação de hidrolisado de biomassa descrito no presente.

[038] Da forma utilizada no presente “meio de crescimento de alimentação” refere-se ao meio que é adicionado no recipiente de cultura contínua.

[039] O termo “biomassa lignocelulósica” ou “biomassa” refere-se a qualquer material lignocelulósico e inclui materiais que compreendem celulose, hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. Biomassa pode ainda compreender componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídeo. A biomassa pode ser derivada de uma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; por exemplo, a biomassa poderia compreender uma mistura de espigas de milho e palha de milho, ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa lignocelulósica inclui, mas sem limitar-se, culturas de bioenergia, resíduos agrícolas, resíduos sólidos urbanos, resíduos sólidos industriais, lodo de fabricação de papel, resíduos de jardim, madeira e resíduo florestal. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitar-se a, espigas de milho, resíduos de cultura, tais como palha de milho, cabelo de milho, capim, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas, resíduos de papel, bagaço de cana, material vegetal de sorgo, material vegetal de soja, componentes obtidos a partir da moagem de grãos, árvores, ramos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbustos e moitas, legumes, frutas e flores.

[040] Da forma utilizada no presente “hidrolisado de biomassa” e “hidrolisado celulósico” refere-se a um produto produzido a partir da biomassa, que é material celulósico, tipicamente através de processos de sacarificação e pré-tratamento. Açúcares fermentáveis estão presentes no hidrolisado, bem como outros produtos.

[041] Conforme utilizado no presente, “meio hidrolisado de biomassa” refere-se ao meio que contém pelo menos cerca de 50% de hidrolisado preparado a partir de biomassa celulósica e/ou lignocelulósico. O hidrolisado é preparado por sacarificação de biomassa, tipicamente precedida por pré-tratamento. Além do hidrolisado, o meio pode incluir componentes definidos para produção e crescimento de biocatalisador.

[042] “Xyn3” é uma xilanase da família GH10 de Trichoderma reesei. Xyn3 (SEQ ID NO:9) mostrou ter uma atividade endoxilanase indiretamente por observação de sua capacidade de catalisar uma produção aumentada de monômero xilose na presença de xilobiosidase quando as enzimas atuam na biomassa previamente tratada ou em hemicelulose isolada.

[043] “Fv3A” é uma enzima da família GH3 de Fusarium verticillioides. Fv3A (SEQ ID NO:10) mostrou ter uma atividade β-xilosidase, por exemplo, em um ensaio enzimático utilizando p-nitrofenil-β-xilopiranosideo, xilobiose, oligômeros xilo lineares misturados, oligômeros arabinoxilan ramificados de hemicelulose, ou grão de milho previamente tratado com amônia diluida como substratos.

[044] “Fv43D” é uma enzima da família GH43 de Fusarium verticillioides. Fv43D (SEQ ID NO:11) mostrou ter uma atividade β-xilosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático utilizando p-nitofenil-β-xilopiranosideo, xilobiose, e/ou oligômeros xilo lineares, misturados, como substratos.

[045] “Fv51A” é uma enzima da família GH51 de Fusarium verticillioides. Fv51A (SEQ ID NO:12) mostrou ter uma atividade L-α- arabinofuranosidase em, por exemplo, um ensaio enzimático utilizando 4- nitrofenil- Iα-L-arabinofuranosideo como substrato.

[046] "Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteína ou molécula de RNA funcional específicas, que pode opcionalmente incluir sequências regulatórias precedentes à sequência codificante (sequências não codificantes 5’) e subsequentes à sequência codificante (sequências não codificantes 3’). “Gene nativo” ou “gene do tipo selvagem”, refere-se a um gene tal como encontrado na natureza com suas próprias sequências regulatórias. “Gene quimérico” refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo sequências reguladoras e codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Assim, um gene quimérico pode compreender sequências regulatórias e sequências codificantes que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências regulatórias e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas arranjadas de forma diferente daquela encontrada na natureza. “Gene endógeno” refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um “gene exógeno” refere-se a um gene não normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência genética. Gene exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos.

[047] O termo “construção genética” refere-se a um fragmento de ácido nucleico que codifica para a expressão de uma ou mais proteínas específicas ou moléculas de RNA funcionais. Na construção genética, o gene pode ser nativo, quimérico, ou exógeno na natureza. Tipicamente, uma construção genética irá compreender uma “sequência codificante”. Uma “sequência codificante” refere-se a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos específica.

[048] “Promotor” ou “regiões de controle inicial”, refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificante ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificante está localizada 3’ a uma sequência promotora. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou podem ser compostos de elementos diferentes derivados de promotores diferentes encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos sintéticos de DNA. É compreendido por técnicos no assunto, que promotores diferentes podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tipos de tecidos ou células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores que causam a expressão de um gene na maioria dos tipos celulares, na maioria das vezes, são comumente chamados de “promotores constitutivos”.

[049] O termo “expressão”, da forma utilizada no presente, refere- se a transcrição e acúmulo estável do RNA codificante (mRNA) ou RNA funcional derivado de um gene. A expressão pode ainda se referir à tradução do mRNA em um polipeptídeo. “Sobreexpressão” refere-se à produção de um produto genético em organismos transgênicos que excede os níveis de produção em organismos normais ou não transformados.

[050] O termo “transformação”, da forma utilizada no presente, refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucleico em um organismo hospedeiro, resultando em uma herança geneticamente estável. O ácido nucléico transferido pode estar na forma de um plasmídeo mantido na célula hospedeira, ou alguns ácidos nucleicos transferidos podem ser integrados ao genoma da célula hospedeira. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referenciados como organismos “transgênicos” ou “recombinantes” ou “transformados”.

[051] Os termos “plasmídeo” e “vetor”, conforme descritos no presente, referem-se a um elemento extra cromossomal que normalmente carregam genes que não são parte do metabolismo central da célula, e normalmente na forma de moléculas de DNA circulares, de fita dupla. Tais elementos podem ser sequências de replicação autônomas, sequências de integração ao genoma, fagos ou sequências de nucleotídeos, DNA ou RNA, linear ou circular, de fita simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, em que um número de sequências de nucleotídeos foram reunidas ou recombinadas em uma única construção que é capaz de introduzir na célula, um fragmento promotor e sequência de DNA para um produto genético selecionado junto com sequências não traduzidas 3’ apropriadas.

[052] O termo “operacionalmente ligado” refere-se à associação de sequências de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico, de forma que a função de um é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma sequência codificante quando ele é capaz de afetar a expressão de dita sequência codificante (ou seja, que a sequência codificante está sob o controle transcricional do promotor). As sequências codificantes podem se operacionalmente ligadas à sequências regulatórias na orientação sense ou antisense.

[053] O termo “marcador selecionável” significa um fator de identificação, normalmente um gene de resistência química ou a antibiótico, que é capaz de ser selecionado com base no efeito do gene marcador, por exemplo, resistência a um antibiótico, quando o efeito é usado para triar a hereditariedade de um ácido nucleico de interesse e/ou para identificar uma célula ou um organismo que tenha recebido o ácido nucleico de interesse.

[054] O termo “identidade percentual”, como conhecido no estado da técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinada por comparação das sequências. No estado da técnica, “identidade” também significa o grau de parentesco de sequência entre sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo, como o caso, pode ser conforme determinado pela correspondência entre as fitas de tais sequências. “Identidade” e “similaridade” podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos, incluindo, mas sem limitar-se a, os métodos descritos em: 1) Computational Molecular Biology(Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988); 2) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3) Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); e 5) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).

[055] Métodos preferidos para determinar a identidade são desenhados para dar a melhor comparação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computadores publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequências e cálculos de identidade percentual podem ser realizados utilizando o programa MegAlign™ da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI). O alinhamento múltiplo das sequências é realizado utilizando o “método clustal de alinhamento”, que engloba diversas variedades do algoritmo, incluindo o “método de alinhamento clustal V”, que corresponde ao método de alinhamento chamado Clustal V (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8:189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlign™da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.). Para alinhamentos múltiplos, os valores padrões correspondem à GAP PENALTY=10 e GAP LENGTH PENALTY=10. Os parâmetros padrões para alinhamentos de pares de bases e cálculo de identidade percentual das sequências de proteínas utilizando o método Clustal são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos, tais parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências utilizando o programa Clustal V, é possível obter uma “identidade percentual” pela verificação da tabela das “distâncias das sequências” no mesmo programa. Ainda, o “método de alinhamento Clustal W” está disponível e corresponde ao método de alinhamento chamado Clustal W (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189-191(1992)) e encontrado no programa MegAlign™v6.1 da LASERGENE bioinformatics computing suite (DNASTAR Inc.). Parâmetros padrões para alinhamento múltiplo (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,2, atraso na divergência de sequências (%)=30, peso do DNA de transição=0,5, matriz de peso proteico = série Gonnet, matriz de peso de DNA =IUB ). Após o alinhamento das sequências que utilizam o programa Clustal W, é possível obter um “percentual de identidade” pela verificação da tabela das “distâncias das sequências” no mesmo programa.

PRODUÇÃO DE LINHAGENS DE ZYMOMONAS COM FERMENTAÇÃO APRIMORADA NO MEIO HIDROLIDADO

[056] A presente invenção fornece um microrganismo recombinante do gênero Zymomonas que produz etanol e utiliza xilose, que possui pelo menos uma modificação genética na fase aberta de leitura zmo1432. O efeito desta mutação é expressar um polipeptídeo que melhora o comportamento da linhagem no meio hidrolisado, aumentando a tolerância da linhagem à diversos inibidores do crescimento no hidrolisado e aumentando o rendimento do etanol. Os melhoramentos no comportamento de fermentação foram ligados à mutações na região zmo 1432 do genoma de Zymomonas (referência NCBI: NC_006526.2), definida no presente como SEQ ID NO:1, codificando o polipeptídeo da SEQ ID NO:2.

[057] Assim, é aqui colocado que uma fermentação aprimorada em meio hidrolisado pode ser conferida a linhagens de Zymomonas que são capazes de utilizar xilose como fonte de carbono e que produzem etanol, pela introdução de pelo menos uma modificação genética na fase aberta de leitura (ORF) que codifica uma proteína que possui pelo menos cerca de 95% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO:2, antes da modificação. A proteína pode possuir pelo menos cerca de 95%, 96%, 96%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:2. Qualquer modificação genética na mencionada proteína pode ser feita, o que aumenta a produção de etanol pela linhagem que carrega dita proteína mutante na presença de meio hidrolisado. O aumento na produção de etanol é determinado pela comparação para produção por uma linhagem de Zymomonas que não possui a modificação genética, sob as mesmas condições da fermentação. Uma linhagem com uma modificação genética na mencionada ORF pode ser facilmente analisada por um técnico no assunto, para verificar produção aumentada de etanol na presença de hidrolisado de biomassa por métodos tais como descritos no exemplo 3 dado mais adiante. Dita linhagem aprimorada possui maior tolerância ao hidrolisado de biomassa e inibidores presentes no hidrolisado de biomassa, onde tolerância refere-se à capacidade da linhagem de crescer e produzir etanol similarmente no meio com um nível especificado de hidrolisado (nível de tolerância), conforme comparado no meio com menos hidrolisado, ou nenhum hidrolisado. Uma maior tolerância é determinadas pela comparação com uma linhagem de Zymomonas que não possui a modificação genética.

[058] Em uma realização, a modificação genética resulta em uma alteração na posição 366 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 que substitui arginina por treonina. Em outra realização, a modificação genética resulta em uma alteração na posição 117 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 que substitui fenilalanina por serina. Qualquer alteração pode ser feita na sequência de nucleotídeo que resulta na alteração do códon 366 para codificar arginina, ou resulta na alteração do códon 117 para codificar fenilalanina. Códons que codificam arginina são CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, e AGG. Códons que codificam fenilalanina são TTT e TTC.

[059] Em uma realização, a modificação genética é na região codificante que possui pelo menos 95% de identidade de sequência a ORF zmo1432, conforme denominada na sequência genômica de Zymomonas mobilis publicada (referência NCBI: NC_006526.2), que é o complemento dos nucleotídeos 1446603 a 1448633 que possuem a SEQ ID NO:1. A ORF da SEQ ID NO:1 pode ser chamada por nomes alternativos, mas em qualquer caso, pode ser identificada como zmo1432 em comparação à sequência de SEQ ID NO:1. Pode haver alguma variação na sequência das regiões codificantes identificadas como zmo1432 entre linhagens ou espécies de Zymomonas. Assim, uma região codificante identificada como zmo1432 pode ter pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1, e a região codificante com a modificação genética pode ter pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 antes da modificação genética. Tal região codificante, antes da modificação, é o alvo para a modificação genética.

[060] Pelo menos uma das modificações genéticas descritas pode ser criada em uma linhagem de Zymomonas que é capaz de utilizar xilose como fonte de carbono e que produz etanol por qualquer método conhecido pelo técnico no assunto. Tais métodos incluem: por adaptação, conforme descrito abaixo e nos exemplos 1 e 2 do presente pedido; por mutagênese química e seleção; e por engenharia genética.

[061] Engenharia genética para introduzir uma modificação genética na região codificante alvo pode ser por métodos que incluem o uso de recombinação homóloga de dupla reticulação para substituir a região codificante alvo endógena com a mesma região codificante que abriga uma mutação conforme descrita acima. Na recombinação homóloga, sequências de DNA que flanqueiam o sítio de integração alvo são colocados em ligação com um gene de resistência a espectinomicina ou outro marcador selecionável, e a substituição da sequência mutante que leva à inserção do marcador selecionável e a substituição da sequência mutante no sítio genômico alvo. O marcador selecionável está fora da região codificante, de forma que no produto, a região codificante é expressa. Ainda, o marcador selecionável pode ser ligado por sítios de recombinação sítio-específica, de forma que após a expressão da recombinase sítio-específica correspondente, o gene de resistência é excisado do genoma. Particularmente apropriada para integração de uma substituição de sequência mutante é a transposição utilizando o sistema de transposição in vitro EPICENTRE®’s EZ::Tn, que é utilizado nos exemplos 1 e 6 do pedido de patente americano US-2009-0246846-A1.

[062] De forma alternativa, a expressão da região codificante endógena alvo pode ser interrompida em uma célula por uma manipulação, tal como inserção, mutação, ou deleção e um gene expressando a região codificante contendo uma mutação, conforme descrita acima, pode ser introduzido na célula. Um exemplo de recombinação homóloga de dupla reticulação em Zymomonas, utilizada para inativar uma região codificante é descrito na patente americana U.S. 7,741,119. O gene introduzido pode ser o gene endógeno (com região codificante mutante) incluindo seu promotor nativo, ou o gene introduzido pode ser um gene quimérico que compreende um promotor operacionalmente ligado e uma região codificante com pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade com a região codificante interrompida. Tipicamente, uma região terminal 3’ é incluída no gene quimérico. Promotores que podem ser utilizados em Zymomonas incluem ZmPgap e o promotor do gene enolase de Zymomonas.

[063] O gene introduzido pode ser mantido em um plasmídeo, ou pode ser integrado ao genoma, utilizando, por exemplo, recombinação homóloga, integração sítio-direcionada, ou integração randômica. Um gene a ser introduzido é tipicamente construído em ou transferido para um vetor para manipulações adicionais. Os vetores são bem conhecidos no estado da técnica. Em particular, vetores úteis para expressão em Zymomonassão aqueles que podem se replicar tanto em E. coli quanto em Zymomonas, tal como pZB188, que é descrito na patente americana U.S. 5,514,583. Os vetores podem incluir plasmídeos para replicação autônoma em uma célula, e plasmídeos para carregar construções a serem integradas aos genomas bacterianos. Plasmídeos para a integração de DNA podem incluir transposons, regiões de sequência de ácido nucléico homólogas ao genoma bacteriano alvo, ou outras sequências que suportam a integração. Um tipo adicional de vetor pode ser um transpossomo produzido utilizando, por exemplo, um sistema comercialmente disponível a partir de EPICENTRE®. É bem conhecido como escolher um vetor apropriado para o hospedeiro alvo desejado, e a função desejada.

LINHAGEM HOSPEDEIRA

[064] Qualquer linhagem de Zymomonas que é capaz de utilizar xilose como fonte de carbono, e que produz etanol, pode ser uma linhagem de partida para a presente invenção. Tais linhagens são utilizadas para adaptação em meio hidrolisado, para mutagênese química e seleção, ou são geneticamente modificadas para produzir as linhagens aprimoradas descritas no presente. Linhagens de Zymomonas, tais como Z. mobilis, que foram modificadas para expressar uma via de fermentação de xilose para etanol, são particularmente úteis. Genes endógenos podem fornecer parte da via metabólica, ou podem ser alterados por qualquer técnica de manipulação genética conhecida, para fornecer uma proteína com atividade enzimática útil para o metabolismo da xilose. Por exemplo, a transquetolase endógena pode complementar outras atividades enzimáticas introduzidas na criação de uma via de utilização de xilose. Tipicamente, quatro genes podem ser introduzidos em uma linhagem Zymomonas, tais como Z mobilis, para expressão de quatro enzimas envolvidas no metabolismo de xilose, conforme descrito na patente U.S. 5,514,583, que é incorporada ao presente como referência. Estes incluem genes que codificam xilose isomerase, que catalisa a conversão de xilose para xilulose, e xiluloquinase, que fosforila xilulose para formar xilulose 5-fosfato. Ainda, transquetolase e transaldolase, duas enzimas da via fosfato pentose, convertem xilulose 5-fosfate em intermediários que liga o metabolismo da pentose a via glicolítica Entner-Douderoff, permitindo o metabolismo de xilose em etanol. As sequências de DNA que codificam estas enzimas podem ser obtidas a partir de qualquer um dos diversos microrganismos que são capazes de metabolizar xilose, tais como bactérias entéricas, e algumas leveduras e fungos. Fontes para as regiões codificantes incluem Xanthomonas, Klebsiella, Escherichia, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Gluconobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella, Pseudomonads, e Zymomonas. As regiões codificantes de E. colisão particularmente úteis.

[065] As sequências de DNA codificantes são operacionalmente ligadas a promotores que são expressos em células Z. mobilis, tais como os promotores de Z. mobilisgliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (promotor GAP), e Z. mobilis enolase (promotor ENO). As regiões codificantes podem ser expressas individualmente de promotores, ou duas ou mais regiões codificantes podem ser unidas em um operon com expressão para o mesmo promotor. Os genes quiméricos resultantes podem ser introduzidos em Zymomonas e mantidos em um plasmídeo, ou integrados no genoma utilizando, por exemplo, recombinação homóloga, integração sítio-dirigida, ou integração randômica. Linhagens que utilizam xilose que são de uso particular incluem ZM4(pZB5) (descrita nas patentes americanas US 5,514,583, US 6,566,107, e US 5,571,2133, e incorporadas ao presente como referência), 8b (pedido de patente US 2003/0162271; Mohagheghi et al., (2004) Biotechnol. Lett. 25; 321-325), bem como ZW658 (ATCC PTA-7858), ZW800, ZW801-4, ZW801-5, e ZW801-6 (descritas no pedido de patente de mesmo titular US 2008-0286870 A1, que é incorporado ao presente como referência).

[066] Linhagens de Zymomonas que são adicionalmente modificadas para utilizar outros açúcares que não são substratos naturais, podem ainda ser utilizadas no presente processo. Um exemplo é uma linhagem de Z. mobilis modificada para o uso de arabinose, conforme descrito na patente US 5,843,760, incorporada ao presente como referência.

ADAPTAÇÃO

[067] Para adaptação, uma linhagem de Zymomonas que utiliza xilose (uma linhagem de partida conforme descrito acima) é continuamente cultivada em um meio contendo hidrolisado de biomassa. O hidrolisado de biomassa é produzido por sacarificação de biomassa. Tipicamente, a biomassa é previamente tratada antes da sacarificação. A biomassa pode ser tratada por qualquer método conhecido por um técnico no assunto para produzir açúcares fermentáveis em um hidrolisado. De modo típico, a biomassa é previamente tratada utilizando tratamentos físicos e/ou químicos, e enzimaticamente sacarificada. Os tratamentos físicos e químicos podem incluir trituração, moagem, corte, tratamento base tal como com amônia ou NaOH, e tratamento ácido. Particularmente útil é um tratamento prévio de baixa amônia, onde a biomassa é colocada em contato com uma solução aquosa que compreende amônia para formar uma mistura de amônia aquosa e biomassa, onde a concentração de amônia é suficiente para manter um pH alcalino da mistura de amônia aquosa e biomassa, mas é menor que cerca de 12% em peso, em relação ao peso seco de biomassa, e onde o peso seco da biomassa é pelo menos cerca de 15% em peso de sólidos em relação ao peso da mistura de amônis aquosa e biomassa, conforme discutido no pedido de patente americano co-pendente e de mesma titularidade US-20070031918-A1, que é incorporado ao presente como referência.

[068] Sacarificação enzimática tipicamente faz uso de uma composição de enzima ou mistura para quebrar celulose e/ou hemicelulose e para produzir um hidrolisado contendo açúcares, tais como, por exemplo, glicose, xilose, e arabinose. Enzimas de sacarificação estão revisadas em Lynd, L. R., et al. (Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66:506-577, 2002). Pelo menos uma enzima é utilizada, e tipicamente uma mistura de enzima de sacarificação é utilizada, que inclui uma ou mais glicosidases. As glicosidases hidrolisam as ligações éteres de di-, oligo-, e polissacarídeos, e são encontradas na classificação enzimática EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA com Suplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 [em Eur. J. Biochem., 223:1-5, 1994; Eur. J. Biochem., 232:1-6, 1995; Eur. J. Biochem., 237:1-5, 1996; Eur. J. Biochem., 250:1-6, 1997; e Eur. J. Biochem., 264:610-650 1999, respectivamente]) do grupo geral “hidrolases” (EC 3.). As glicosidases úteis no presente método podem ser categorizadas pelos componentes de biomassa que elas hidrolizam. Glicosidases úteis para o método da presente invenção incluem glicosidases que hidrolizam celulose (por exemplo, celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobiohidrolases, β-glicosidases), glicosidases que hidrolizam hemicelulose (por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabino-xilanases, manases, galactases, pectinases, glucuronidases), e glicosidases que hidrolizam amido (por exemplo, amilases, α- amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Ainda, pode ser útil adicionar outras atividades ao consórcio de sacarificação enzimática, tais como peptidases (EC 3.4.x.y), lipases (EC 3.1.1.x and 3.1.4.x), ligninases (EC 1.11.1.x), ou feruloil esterases (EC 3.1.1.73), para promover a liberação de polissacarídeos a partir de outros componentes da biomassa. É conhecido no estado da técnica que microrganismos que produzem enzimas que hidrolizam polissacarídeos normalmente exibem uma atividade, tal como uma capacidade para degradar celulose, que é catalizada por diversas enzimas ou um grupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato. Assim, uma “celulase” de um microrganismo pode compreender um grupo de enzimas, uma ou mais ou todas das quais podem contribuir com a atividade de degradar celulose. Preparações enzimáticas comerciais ou não comerciais, tais como celulase, podem compreender diversas enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado para a obtenção da enzima.

[069] Enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente. Tais enzimas incluem, por exemplo, Spezyme® CP celulase, Multifect® xilanase, Accelerase® 1500, e Accellerase® DUET (Danisco U.S. Inc., Genencor International, Rochester, NY). Ainda, as enzimas de sacarificação podem ser não purificadas e fornecidas como um extrato celular ou uma preparação celular completa. As enzimas podem ser produzidas utilizando microrganismos recombinantes que foram modificados para expressar uma ou mais enzimas de sacarificação.

[070] Enzimas adicionais para sacarificação incluem, por exemplo, glicosil hidrolases tais como os membros das famílias GH3, GH39, GH43, GH55, GH10, e GH11. GHs são um grupo de enzimas que hidrolizam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos, ou entre um carboidrato e uma unidade não carboidrato. As famílias de GHs foram classificadas com base na similaridade de sequência, e a classificação está disponível na base de dados Carbohydrate-Active enzyme (CAZy) (Cantarel et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37:D233-238). Algumas destas enzimas são capazes de agir em diversos substratos e possuem eficácia demonstrada como enzimas de sacarificação. As enzimas da família 3 de glicosídeo hidrolase (“GH3”) possuem uma série de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades β-glucosidase (EC:3.2.1.21); β-xilosidase (EC:3.2.1.37); N-acetil β-glucosaminidase (EC:3.2.1.52); glucan β-1,3-glucosidase (EC:3.2.1.58); celodextrinase (EC:3.2.1.74); exo-1,3-1,4-glucanase (EC:3.2.1); e/ou β-galactosidase (EC 3.2.1.23). As enzimas da família 39 de glicosídeo hidrolase (“GH39”) possuem uma série de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades α-L- iduronidase (EC:3.2.1.76) e/ou β-xilosidase (EC:3.2.1.37). As enzimas da família 43 de glicosídeo hidrolase (“GH43”) possuem uma série de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades L-α-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); β-xilosidase (EC 3.2.1.37); endoarabinanase (EC 3.2.1.99); e/ou galactan 1,3-β-galactosidase (EC 3.2.1.145). As enzimas da família 51 de glicosídeo hidrolase (“GH51”) são conhecidas por possuir, por exemplo, atividades L-α-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) e/ou endoglucanase (EC 3.2.1.4). A família 10 de glicosídeo hidrolase (“GH10”) foi descrita em detalhes em Schmidt et al., 1999, Biochemistry 38:2403-2412 e Lo Leggio et al., 2001, FEBS Lett 509: 303-308, e a família 11 de glicosídeo hidrolase (“GH11”) foi descrita em Hakouvainen et al., 1996, Biochemistry 35:9617-24.

[071] No presente processo de adaptação, Zymomonas que utiliza xilose é continuamente cultivada na presença de proporções aumentadas de hidrolisado de biomassa no meio de cultura, conforme descrito nos exemplos 1 e 2 do presente. Em intervalos periódicos, amostras são retiradas e analisadas quanto a performance no meio hidrolisado, incluindo para utilização de xilose e glicose, e quanto a produção de etanol. Múltiplos períodos de adaptação em um meio contendo proporções aumentadas de hidrolisados, bem como outros componentes de stress tais como acetato e etanol, podem ser utilizados para produzir linhagens com performance aprimorada, tal como as linhagens descritas acima.

FERMENTAÇÃO DE LINHAGEM APRIMORADA QUE UTILIZA XILOSE

[072] Uma linhagem de Zymomonas modificada, que produz etanol e utiliza xilose com pelo menos uma modificação genética descrita no presente, pode ser utilizada na fermentação para produzir etanol. A linhagem Z. mobilis é colocada em contato com meio que contém biomassa hidrolisada que inclui açúcares, que compreende glicose e xilose. Pelo menos uma porção de açúcares é derivada de biomassa celulósica ou lignocelulósica sacarificada e previamente tratada. Açúcares adicionais e/ou outros componentes de meio podem ser incluídos no meio.

[073] Quando a concentração de açúcares é alta, de modo que o crescimento é inibido, o meio inclui sorbitol, manitol, ou uma mistura dos mesmos, conforme descrito na patente de mesmo titular US 7,629,156. Galactitol ou ribitol podem substituir ou ser combinado com sorbitol ou manitol. A Z. mobilis cresce no meio onde a fermentação ocorre, e etanol é produzido. A fermentação é realizada sem ar suplementado, oxigênio ou outros gases (que podem incluir condições tais como fermentação anaeróbica, microaeróbica, ou microaerofílica), por pelo menos cerca de 24 horas, e pode ser realizada por 30 ou mais horas. O tempo para atingir a produção máxima de etanol é variável, dependendo das condições de fermentação. As fermentações podem ser realizadas em temperaturas entre cerca de 30°C e cerca de 37° C, a um pH de cerca de 4,5 a cerca de 7,5.

[074] A presente Z. mobilis pode ser cultivada em um meio contendo açúcares misturados, incluindo xilose, em fermentadores de escala laboratorial, e em fermentação aumentada onde quantidades comerciais de etanol são produzidas. Onde a produção comercial de etanol é desejada, uma variedade de metodologias culturais podem ser aplicadas. Por exemplo, produção em larga escala das linhagens de Z. mobilis da presente invenção pode ser produzida tanto pela metodologia de batelada quanto pela metodologia de cultura contínua. Um método de cultura por batelada clássico é um sistema fechado onde a composição do meio é estabelecida no começo do cultivo e não estará sujeita a alterações artificiais durante o processo de cultivo. Assim, no começo do processo de cultura, o meio é inoculado com o organismo desejado e cultivado, ou a atividade metabólica é permitida sem adição de nada ao sistema. Tipicamente, entretanto, uma cultura de “batelada” é batelada com relação à adição de fonte de carbono, e tentativas são frequentemente realizadas sobre fatores de controle, tais como o pH e concentração de oxigênio. Em sistemas de batelada, o metabólito e composições de biomassa do sistema mudam constantemente até que o período de cultura tenha terminado. Dentro das culturas de batelada, células são moderadas através de uma fase log estática até uma fase log de crescimento mais alta e, finalmente, até a fase estacionária, onde a taxa de crescimento é interrompida ou diminuída. Se não tratadas, as células na fase estacionária irão, eventualmente, morrer. As células na fase log são frequentemente responsáveis pelo volume da produção de etanol.

[075] Uma variação no sistema de batelada padrão é o sistema de batelada por alimentação (Fed-Batch). Processos de cultura por batelada por alimentação também são adequados para o crescimento das linhagens Z. mobilis da presente invenção e compreende um sistema de batelada típico com a exceção que o substrato é adicionado em incrementos conforme a progressão da cultura. A medição da concentração de substrato real em sistemas de batelada por alimentação é difícil e, é portanto estimada com base nas alterações dos fatores de medição, tal como pH e a pressão parcial de gases residuais, tais como CO2. Métodos de cultivo por batelada e batelada por alimentação são comuns e bem conhecidas no estado da técnica, e exemplos podem ser encontrados em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger, e Brock, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, ou Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992), incorporados ao presente como referência.

[076] A produção comercial de etanol pode também ser realizada com uma cultura contínua. Culturas contínuas são sistemas abertos onde o meio de cultura é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. Culturas contínuas geralmente mantêm as células a uma densidade de fase líquida constante alta, onde as células estão, principalmente, em crescimento de fase log. Alternativamente, a cultura contínua pode ser praticada com células imobilizadas, onde carbono e nutrientes são continuamente adicionados, e produtos valiosos, sub produtos ou produtos residuais são continuamente removidos da massa celular. A imobilização celular pode ser realizada utilizando uma ampla faixa de suportes sólidos compostos de materiais naturais e/ou sintéticos, conforme conhecido pelo técnico no assunto.

[077] Um regime de fermentação conforme descrito a seguir é particularmente adequado para a produção de etanol. A linhagem Z. mobilis desejada da presente invenção é cultivada em frascos de agitação em meio semi-complexo a cerca de 30°C a cerca de 37°C com agitação a cerca de 150 rpm em agitadores orbitais, e então transferida a um fermentados de semente de 10 L contendo meio similar. A cultura de semente é crescida anaerobicamente no fermentador de semente até que o OD600 esteja entre 3 e 10, quando então é transferida para o fermentador de produção, onde os parâmetros de fermentação são otimizados para a produção de etanol. Volumes inóculos típicos transferidos do tanque de semente para o tanque de produção variam de cerca de 2% a cerca de 20% volume/volume. Meio de fermentação para as linhagens da presente invenção contém hidrolisado de biomassa em pelo menos cerca de 50% e pode ser suplementado com outros nutrientes, conforme conhecido pelo técnico no assunto. Uma concentração final de cerca de 5mM de sorbitol ou manitol está presente no meio.

[078] A fermentação é controlada a pH 5,0 a 6,0 utilizando solução cáustica (tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, ou hidróxido de sódio), e tanto ácido sulfúrico ou fosfórico. A temperatura do fermentador é controlada de 30°C a 35°C. Para minimizar a formação de espuma, agentes antiespumantes (qualquer classe baseada em silicone, baseada em orgânico, etc) são adicionados ao recipiente conforme necessário. Um antibiótico, para o qual existe um marcador resistente a antibiótico na linhagem ou para o qual a linhagem é resistente, tal como canamicina, pode ser opcionalmente utilizado para minimizar contaminação.

[079] Qualquer conjunto das condições descritas acima, e variações adicionais nestas condições que são bem conhecidas no estado da técnica, são condições apropriadas para a produção de etanol por uma linhagem Zymomonas recombinante que utiliza xilose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[080] É descrito no presente que linhagens Zymomonas que utilizam xilose, com uso aprimorado de glicose e xilose, e produção de etanol, na presença de hidrolisado de biomassa, podem ser obtidas por um processo de adaptação e seleção no meio hidrolisado de biomassa. Aumento no uso de glicose e xilose, e produção de etanol, são medidos em comparação ao uso de glicose e xilose pela linhagem correspondente não adaptada que utiliza xilose. A linhagem correspondente não adaptada é a linhagem utilizada como linhagem de partida para o processo de adaptação de hidrolisado.

[081] Linhagens de Zymomonas mobilis foram isoladas de experimentos de adaptação de hidrolisado, conforme descrito nos exemplos 1 e 2 da presente invenção. Duas linhagens isoladas foram nomeadas Adaptadas 56 (ou AR2 5-6) e Adaptadas 7-31 (ou AR3 7-31), e foram adicionalmente caracterizadas. Quando cultivadas em hidrolisado de sabugo de milho, conforme descrito no exemplo 3 da presente invenção, tais linhagens utilizaram xilose e glicose mais rapidamente que a linhagem correspondente não adaptada ZW705. Em 21 horas de fermentação, cerca de 20% mais de glicose tinha sido utilizada. Ainda, em 21 horas, cerca de 22% mais etanol havia sido produzido, enquanto a 52 horas, cerca de 21% mais xilose havia sido utilizado e 5% mais etanol havia sido produzido. Em geral, o percentual exato aumenta com o uso de glicose, com o uso de xilose, e a produção de etanol em uma linhagem com novas alterações genéticas das linhagens Adaptadas 5-6 ou Adaptadas 7-31, que são descritas abaixo, dependerá de diversos fatores. Tais fatores incluem as condições da fermentação, bem como as características genéticas da linhagem que são adicionais às novas alterações genéticas descritas no presente.

[082] Para identificar qualquer alteração nos genomas das linhagens Adaptadas 5-6 e Adaptadas 7-31, os genomas foram sequenciados. Por comparação de tais sequências genômicas frente a sequências genômicas da linhagem de partida correspondente, ZW705 (descrita no pedido de patente US20110014670A1), linhagem do tipo selvagem ZW1 (ATCC 31821), e a sequência de Zymomonas mobilis publicada da linhagem ATCC 31821 (Seo et. al, Nat. Biotech. 23:63-8 2005; referência NCBI: NC_006526.2), foi determinado que ambas as linhagens possuem uma única nova mutação na mesma região de codificação. Tal região codificante é identificada como a fase aberta de leitura zmo1432 (ORF) na sequência genômica de Zymomonas mobilis publicada (referência NCBI: NC_006526.2) e é o complemento de nucleotídeos 1446603 a 1448633 que possui a SEQ ID NO:1.

[083] A linhagem adaptada 5-6 possui uma mutação na posição No. 1097 em SEQ ID NO:1, que é uma alteração de C para G. Isto resulta na alteração do códon 366, de ACA, que codifica treonina, para AGA, que codifica arginina, na proteína zmo1432 codificada (SEQ ID NO:2), resultando na proteína de SEQ ID NO:3, onde arginina é substituída por treonina No. 366. A linhagem adaptada 7-31 possui uma mutação na posição No. 350 em SEQ ID NO:1, que é uma alteração de C para T. Isto resulta em uma alteração no códon 117, de TCT, que codifica serina, para TTT, que codifica fenilalanina, na proteína zmo1432 codificada (SEQ ID NO:2), resultando na proteína de SEQ ID NO:4, onde fenilalanina é substituída por serina No. 117.

[084] A região codificante hipotética zmo1432 (ou ORF) é anotada na sequência genômica completa de Zymomonas mobilis(referência NCBI: NC_006526.2) como codificando uma “proteína de resistência a ácido fusárico”. É anotada como possuindo uma região conservada de proteína de resistência a ácido fusárico, que é a unidade proteica: PFAM:PFO4632 (Wellcome Trust Sanger Institute, Genome Research Limited, Hinxton, England). Esta unidade é encontrada em proteínas associadas com resistência a ácido fusárico de Burkholderia cepacia (Swiss-Prot::P24128 (SEQ ID NO:5); Utsumi et al. (1991) Agric. Biol. Chem. 55:1913-1918; o organismo foi renomeado de Pseudomonas cepacia) e Klebsiella oxytoca (Swiss-Prot::Q48403 (SEQ ID NO:6); Toyoda et al. (1991) J Phytopathol. 133:165-277), que parecem ser proteínas de transporte de membrana.

[085] Uma região nomeada Bcenm03_1426 da sequência completa do cromossomo 1 de Burkholderia cepaciaé anotada como codificante de proteína transportadora putativa de resistência a ácido fusárico (Acesso YP_001764723; Copeland et al. Submetida em 27/02/2008). Esta proteína (SEQ ID NO:7) possui similaridade com a proteína codificada zmo1432, conforme descrito no exemplo 4 do presente pedido. Ainda, proteína AaeB de E. coli (SEQ ID NO:8), que é um componente de uma bomba de efluxo de ácido carboxílico aromático (VanDyk et al J. Bact. 186:7196-7204 (2004)), possui similaridade com a proteína zmo1432 codificada, conforme descrito no exemplo 4 da presente invenção. Assim, uma proteína transportadora de Zymomonas pode ser o alvo de mutações que melhoram o uso de glicose e xilose, e a produção de etanol em linhagens de Zymomonas que utilizam xilose, que são cultivadas em meio hidrolisado.

EXEMPLOS

[086] A presente invenção é adicionalmente definida nos exemplos a seguir. Deve-se compreender que tais exemplos, embora indiquem realizações preferenciais da presente invenção, são dados apenas a título ilustrativo. Com base no relatório acima e nos presentes exemplos, um técnico no assunto poderá determinar as características essenciais da presente invenção, e sem sair do espírito e escopo de proteção da mesma, poderá realizar diversas alterações e modificações da invenção para adaptá-la aos diversos usos e condições.

[087] O significado das abreviações é conforme segue: “kb” significa kilobase(s), “bp” significa pares de base, “nt” significa nucleotídeo (s), “hr” significa hora(s), “min” significa minuto (s), “sec” significa segundo (s), “d” significa dia(s), “L” significa litro(s), “ml” significa mililitro (s), “DL” ou “□ l " significam microlitro(s), “g” significa micrograma(s), “ng” significa nanograma(s), "g" significa grama(s), “mM” significa millimolar, “M” significa micromolar, “nm” significa nanômetro(s), “ mol” significa micromol(s), “pmol” significa picomol(s), "OD600"é densidade óptica a 600 nm.

MÉTODOS GERAIS TURBIDOSTATO

[088] A adaptação foi no turbidostato (patente US 6,686,194; Heurisko USA, Inc. Newark, DE), que é um dispositivo de cultura de fluxo contínua onde a concentração das células na cultura foi mantida constante pelo controle do fluxo do meio na cultura, de forma que a turvação da cultura foi mantida dentro de limites estreitos especificados. Dois meios estavam disponíveis para o crescimento da cultura no dispositivo de cultura contínuo, um meio de descanso (Meio A) e um meio de desafio (Meio B). Uma cultura foi crescida em meio de descanso e uma câmara de crescimento até a turvação definir o ponto, e então foi diluída a uma conjunto de taxa de diluição para manter aquela densidade celular. A diluição foi realizada pela adição de meio a um volume definido, a cada 10 minutos. Quando o turbidostato entrou em modo de desafio do meio, a escolha de adicionar meio de desafio ou meio de descanso foi realizada com base na taxa de retorno ao ponto definido após a prévia adição de meio. A concentração de estado estacionário do meio na câmara de crescimento foi uma mistura de Meio A e Meio B, sendo que as proporções dos dois meios dependentes da taxa de aproximação de cada meio que permitiu a manutenção da densidade do conjunto de células na taxa de diluição do conjunto. Uma amostra de células representativa da população na câmara de crescimento foi recuperada do fluxo externo do turbidostato (em uma câmara de armadilha) em intervalos semanais. A amostra celular foi crescida uma vez no meio MRM3G6 e salvas como um estoque de glicerol a -80°C.

ENZIMAS

[089] Spezyme®CP-100, Multifect®CX12L, e Accellerase® 1500 foram da Danisco U.S. Inc., Genencor (Rochester, NY).

[090] Novozyme 188 foi da Novozymes (2880 Bagsvaerd, Denmark).

[091] Enzimas adicionais utilizadas no processo de sacarificação da presente invenção foram as glicosil hidrolases (GH) Xyn3, Fv3A, Fv51A e Fv43D. Xyn3 (SEQ ID NO:9) é uma xilanase da família GH10 de Trichoderma reesei, Fv3A (SEQ ID NO:10) é uma enzima da família GH3 de Fusarium verticillioides, Fv43D (SEQ ID NO:11) é uma enzima da família GH43 de Fusarium verticillioides, e Fv51A (SEQ ID NO:12) é uma enzima da família GH51 de Fusarium verticillioides.

MEIO

[092] Hidrolisado de sabugo de milho utilizado na adaptação foi preparado, em primeiro lugar, por tratamento prévido por diluição de amônia do sabugo de milho moido. Um recipiente reator horizontal Littleford Day 130L contendo um revestimento para a passagem de vapor ao longo do corpo do recipiente e um dos lados (Littleford Day, Inc., Florence, KY) foi carregado com sabugo moído. Vácuo foi aplicado ao recipiente para alcançar 0,1 atm antes da introdução de 29% em peso de solução de hidróxido de amônio e água, perto do topo do recipiente, para dar 6% em peso de NH3 em relação ao peso seco da biomassa. Vapor foi introduzido perto do topo do recipiente para alcançar uma temperatura interna no recipiente de 145°C. Esta temperatura foi mantida por 20 minutos. Ao final do tratamento prévio, o reator foi depressurizado para alcançar a pressão atmosférica. Vácuo (aproximadamente a menos de 1 atm) foi subsequentemente aplicado para reduzir a temperatura a menos de 60°C.

[093] O sabugo previamente tratado foi então tratado com e consórcio enzimático, permitindo a hidrólise enzimática dos polímeros de celulose e hemicelulose utilizando uma mistura de enzimas compreendendo: Spezyme CP-100 a 34 mg de proteína por g de glucan no sabugo previamente tratado; Multifect CX12L a 12,5 mg de proteína por g de xilan no sabugo previamente tratado; Novozymes 188 a 6,6 mg de proteína por g de glucan no sabugo previamente tratado. A reação de hidrólise foi realizada a 25% (peso/volume) de matéria seca de sabugo previamente tratado, pH 5,3 e 47°C. A reação foi agitada continuamente e realizada por 72 hrs.

[094] Os sólidos foram removidos do hidrolisado utilizando uma centrifugação inicial contínua para clarificar parcialmente a mistura. A mistura parcialmente clarificada foi novamente centrifugada a 18.000 xG por 20 mins e então passada primeiro através de um filtro de 0,45 micron, seguido de um filtro de 0,22 micron, para produzir um hidrolisado esterilizado por filtro e clarificado.

[095] As concentrações de glicose, xilose e acetate foram determinadas por análise HPLC. O hidrolisado clarificado possuia uma concentração de glicose de 68 g/L, uma concentração de xilose de 46 g/L, e uma concentração de acetato de 5 g/L. O hidrolisado clarificado foi suplementado com 6,2 g/L de acetato de amônia para aumentar a concentração total de acetato de amônia, de forma que a concentração esteja na faixa de 11 a 12 g/L. Onde observado, 0,5% de extrato de levedura (Difco Yeast Extract, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD) foi adicionado para fornecer nutrientes adicionais. Este meio foi marcado como HYAc/YE. O pH do meio HYAc/YE foi ajustado até 5,8 e o meio foi esterilizado por filtro.

[096] Um meio hidrolisado para 1 L de teste de fermentação foi preparado utilizando o método descrito acima, exceto que a composição enzimática utilizada na hidrólise foi alterada para uma mistura de enzimas compreendendo Accellerase® 1500, Xyn3, Fv3A, Fv51A, e Fv43D, que foi adicionada à reação de hidrólise a 21,3 mg de proteína/g glucan + xilan. O hidrolisado foi utilizado ser clarificação nas fermentações de escala de 1 L.

MEIO ADICIONAL

[097] MRM3 contém, por litro: extrato de levedura (10 g), KH2PO4 (2 g) e MgSO4.7H2O (1g).

[098] MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3 é MRM3 contendo 65 g/L de glicose, 45 g/L de xilose, 12,3 g/L de acetato de amônia.

[099] 5 ou MRM3G5 é MRM3 contendo 50g/L de glicose.

[100] G10 ou MRM3G10 é MRM3 contendo 100g/L de glicose.

[101] MRM3G2 é MRM3 contendo 20 g/L de glicose.

[102] MRM3X2 é MRM3 contendo 20 g/l de xilose.

[103] halfYEMaxSM:10 g/L extrato de levedura Difo, 2 g/L de KH2PO4, 5 g/L de MgSO4.7H2O, 10 mM de sorbitol, 150 g/L de glicose.

[104] Para estudos de plaqueamento notados na figura 2, MRM3G2 (20g/L de glicose) e MRM3X2 (20g/L de xilose) foram suplementados com 1,5% de ágar, aquecido para dissolver o ágar, resfriado até 45°C e colocados em placas de petri.

PREPARAÇÃO DE ESTOQUE DE CULTURAS CONGELADAS

[105] Estoques de culturas congeladas foram preparados para a linhagem ZW705, culturas de população de amostra de turbidostato semanal, e clones mutantes isolados. Estoques congelados adicionais foram preparados pelo cultivo do estoque congelado original em meio G5 ou G10 e utilizando a biomassa gerada para preparar novos estoques congelados.

INOCULAÇÃO DA SEMENTE, ADAPTAÇÃO DE BATELADAE CULTURAS DE TURBIDOSTATO

[106] Estoque congelado foi utilizado para inocular culturas de semente G5 ou G10 durante a noite. As culturas de semente foram utilizadas para inocular culturas de adaptação de batelada pela centrifugação do meio de cultura de semente e diluição do pellet celular no meio de adaptação fresco. Para inoculação de turbidostato, todo o pellet celular foi novamente suspenso em 10 a 15 ml de meio de descanso de turbidostato e utilizado para inocular o reator do turbidostato ou 5 ml de semente inoculada durante a noite foram utilizados como um inoculo 10%.

MEDIÇÕES DA CULTURA OD600

[107] Para medir OD da cultura, amostras foram diluídas em 100 g/L de xilose (diluente e branco). A cultura diluída foi deixada descansar por 15 minutos antes da obtenção das medições da OD. Todas as medições de OD foram de 600 nm.

ANÁLISE DE HPLC

[108] Análises de HPLC foram realizadas com um sistema Waters Alliance HPLC. A coluna utilizada foi a coluna Transgenômica ION-300 (#ICE- 99-9850, Transgenomic, Inc) com um BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H (#125-0129, Bio-Rad, Hercules, CA). A coluna foi realizada a 75°C e 0,4 mL/min de taxa de fluxo, utilizando 0,01 N H2SO4 como solvente. As concentrações dos produtos e açúcares de partida foram determinadas com detector de índice refrativo utilizando curvas de calibração externas padrão.

DESCRIÇÃO DA LINHAGEM ZW705

[109] A linhagem ZW705 de Zymomonas mobilis foi produzida a partir da linhagem ZW804-1. ZW801-4 é uma linhagem de Z. mobilis recombinante, que utiliza xilose, que foi descrita na patente americana de mesmo titular US 7,741,119, que é incorporado ao presente como referência. A linhagem ZW801-4 foi derivada da linhagem ZW800, que foi derivada da linhagem ZW658, todas conforme descritas na patente US 7,741,119. ZW658 foi construída pela integração de dois operons, PgapxylAB e Pgaptaltkt, contendo quatro genes que utilizam xilose que codificam xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase, no genoma de ZW1 (ATCC 31821) por meio de eventos de transposição sequenciais, e seguido por adaptação em meio seletivo contendo xilose (US 7,629,156). ZW658 foi depositado como ATCC PTA-7858. No ZW658, o gene que codifica glicose-frutose oxidorredutase foi inativado por inserção utilizando recombinação homóloga de dupla reticulação e mediada por hospedeiro e resistência a espectinomicina como um marcador selecionável para criar ZW800 (US 7,741,119). O marcador de resistência a espectinomicina, que foi ligado por sítios loxP, foi removido por recombinação sítio-específica utilizando Cre recombinase para criar ZW801-4.

[110] Culturas de linhagem ZW801-4 de Z. mobilis foram adaptadas para crescimento sob condições de stress de meio contendo acetato de amônia para produzir ZW705, conforme descrito no pedido de patente americano de mesma titularidade US20110014670A1, que é incorporado ao presente como referência. Uma cultura contínua de ZW801-4 foi realizada em 250 ml de fermentadores mexidos, com pH e temperatura controlados (Sixfors; Bottmingen, Switzerland). O meio base para a fermentação foi 5 g/L de extrato de levedura, 15 mM de fosfato de amônia, 1 g/L de sulfato de magnésio, 10 mM de sorbitol, 50 g/L de xilose e 50 g/L de glicose. Adaptação para crescimento na presença de altas concentrações de acetato e amônia foi realizada pelo aumento gradual da concentração de acetato de amônia adicionado ao meio de cultura contínuo mencionado acima, mantendo ao mesmo tempo uma taxa de crescimento estabilizada, conforme medida pela taxa de diluição específica por um período de 97 dias. Acetato de amônia foi aumentado até uma concentração de 160 mM. Aumentos adicionais na concentração de íon amônio foram alcançados pela adição de fosfato de amônio até uma concentração final total de íon amônio de 210 mM ao final de 139 dias de cultura contínua. A linhagem ZW705 foi isolada a partir da população adaptada por plaqueamento para colônias isoladas e amplificação de uma colônia selecionada.

EXEMPLO 1 ADAPTAÇÃO PARA HIDROLISADO DE SABUGO DE MILHO UTILIZANDO UM APARELHO AUTOMATIZADO DE CULTURA CONTÍNUA DE DENSIDADE CELULAR CONTROLADA

[111] O turbidostato descrito nos métodos gerais foi utilizado para adaptar culturas de Zymomonas mobilis para crescimento em meio hidrolisado de sabugo de milho. Uma cultura da linhagem ZW705 foi cultivada no turbidostato descrito nos métodos gerais até um ponto de ajuste da turbidez arbitrário que indica que a cultura usa toda a glicose e aproximadamente metade da xilose presente no meio de partida, para encontrar o ponto de ajuste da densidade celular na taxa de diluição definida. Utilizando meio de descanso que foi 50% HYAc/YE e 50% MRM3G6.5X4.5NH4Ac12.3. O turbidostato foi realizado conforme descrito nos métodos gerais, utilizando como meio de desafio HYAc/YE. Amostras celulares foram obtidas semanalmente por 6 semanas, a partir da câmara armadilha.

[112] Após 6 semanas de cultura contínua, amostras dos estoques celulares salvos semanalmente foram reativadas em MRM3G6 e cultivadas a cerca de 1 OD600 em 10 ml de cultura estática a 33°C. Estas foram usadas para inocular 12 ml de culturas de meio HYAc/YE até aproximadamente 0,4 OD600 nm, e as culturas foram cultivadas a 30°C. As amostras foram obtidas em tempos diferentes, conforme ilustrado na tabela 1, e testadas para OD600, consumo de açúcar e produção de etanol. Os resultados são exibidos na tabela 1. TABELA 1 ANÁLISE DE AMOSTRAS SEMANAIS DE TURBIDOSTATO CULTIVADAS EM 12 ML DE FERMENTAÇÕES HYAC/YE

[113] Todas as culturas retiveram a capacidade de crescer em xilose, mas a taxa de xilose utilizada parece ter diminuído após a terceira semana de adaptação. Colônias únicas foram isoladas a partir da cultura de células amostradas ao final da terceira semana. As colônias foram isoladas por crescimento e retiveram estoque de glicerol em MRM3G5, sendo então colocadas em placas MRM3X2. Colônias únicas foram replicadas por partes em placas MRM3X2 e MRM3G2. Partes densas e grandes em ambas fontes de carbono, foram escolhidas como linhagens e mantidas como estoques de glicerol congelados. As linhagens selecionadas foram cultivadas em 12 ml de culturas teste, conforme descrito para o teste de população de estoque congelado detalhado acima. Os resultados para seis linhagens e ZW705 são exibidos na tabela 2. TABELA 2 ANÁLISE DE CULTURAS PURAS ISOLADAS A PARTIR DA TERCEIRA SEMANA DE ADAPTAÇÃO POR TURBIDOSTATO DEZW705 CULTIVADAS EM 12 ML DE FERMENTAÇÕES HYAC/YE

[114] Todas das linhagens selecionadas produziram mais etanol no teste de 12 ml do que a linhagem que entraram em adaptação (ZW705). As linhagens utilizaram um pouco mais xilose do que a linhagem parental. A linhagem 12-18X-2-36 foi selecionada para um ciclo adicional de adaptação.

EXEMPLO 2 ADAPTAÇÃO PARA HIDROLISADO DE SABUGO DE MILHO COM ETANOL ADICIONADO UTILIZANDO UM APARELHO DE CULTURA CONTÍNUA AUTOMATIZADO DE CONTROLE DA DENSIDADE CELULAR

[115] Uma cultura da linhagem 12-18X-2-36 (descrita no exemplo 1) foi cultivada no turbidostato conforme descrito acima para a linhagem ZW705 e nos métodos gerais, exceto pelo fato que o meio de descanso foi HYAc/YE e o meio de desafio foi HYAc/YE + 9% em peso de etanol. O turbidostato foi realizado por quatro semanas com amostragem semanal da câmara de escoamento. Estoques de células congeladas foram realizados a partir das amostras de escoamento. Estoques de células congeladas foram reativadas em MRM3G6 para teste em fermentações de hidrolisado de 12 ml sob as mesmas condições conforme descritas para o primeiro turbidostato realizado, mas com densidade inicial de cerca de 0,5 OD600. Uma fermentação foi no mesmo meio HYAc/YE, e outra fermentação foi no HYAc/YE para o qual etanol foi adicionado a 30 g por L de meio. Os resultados para ambas fermentações são ilustrados na tabela 3. TABELA 3 ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE TURBIDOSTATO SEMANAIS CRESCIDAS EM FERMENTAÇÕES DE ETANOL DE 12 ML EM HYAC/YE OU HYAC/YE + 30G/L

[116] Todas as culturas foram similares ao controle ZW705 nas fermentações de teste sem adição de etanol ao meio HYAc/YE. Nas fermentações com 30 g/L de etanol adicionado ao meio HYAc/YE, as culturas obtidas após as semanas 1 e 2 foram muito melhores na utilização de glicose e produção de etanol do que ZW705 e as amostras das semanas 3 e 4. A cultura armazenada após a semana 2 possuiu a maior titulação de etanol final no teste que começou com etanol adicionado e foi escolhido para isolamento de linhagens derivadas de célula única. O procedimento de isolamento de linhagem descrito para a seleção que derivou a linhagem 12-18X-2-36 foi realizado duas vezes e os resultados de ambos os ciclos de seleção são exibidos nas tabelas 4 e 5. Seleções foram iniciadas em meio HYAc/YE sem adição de etanol, ou com 40 g/L de etanol adicionado. TABELA 4 ANÁLISE DE CULTURAS PURAS ISOLADAS DA SEGUNDA SEMANA DA ADAPTAÇÃO POR TURBIDOSTATO DE CRESCIMENTO 12-18X-2-36 EM FERMENTAÇÕES DE 12 ML EM HYAc/YE OU HYAc/YE + ETANOL (CICLO 1)

[117] Quando inicia-se sem a adição de etanol, a maioria das linhagens utilizaram toda a glicose no meio hidrolisado, mas não utilizaram toda a xilose, de forma que o total de produção de etanol foi dependente da extensão da utilização de xilose. Diversas linhagens utilizaram mais xilose e produziram mais etanol do que a linhagem ZW705 parental não adaptada. Quando 40 g/L de etanol foram adicionados ao meio de partida, o crescimento e utilização de açúcar foram muito inferiores em todas as linhagens. Neste teste, o uso de xilose foi muito baixo ou xilose não foi consumida na maioria dos casos. Três linhagens utilizaram significativamente mais glicose e produziram mais etanol do que ZW705. A melhor destas foi a linhagem Adaptada 5-6, ilustrada na tabela 4. TABELA 5 ANÁLISE DE CULTURAS PURAS ISOLADAS DA SEGUNDA SEMANA DE ADAPTAÇÃO POR TURBIDOSTATO DO CRESCIMENTO DE 12-18X-2-36 EM FERMENTAÇÕES DE 12 ML EM HYAc/YE OU HYAc/YE + ETANOL (CICLO 2)

[118] Os resultados foram similares no segundo experimento de isolamento da linhagem. Diversas linhagens utilizaram mais xilose do que ZW705 no teste sem adição de etanol, e utilizaram mais glicose no teste com adição de etanol. Muitas utilizaram mais glicose nas primeiras 24 horas de crescimento e alcançaram massa celular mais alta, conforme medido por OD600 nm, nas primeiras 24 horas também. A partir destes resultados, a linhagem Adaptada 7-31 foi escolhida para testes adicionais.

EXEMPLO 3 TESTE DE DESEMPENHO DE LINHAGENS ADAPTADAS A HIDROLISADO FERMENTAÇÃO DE SEMENTE

[119] A fermentação de semente foi realizada em um fermentador de 1 L (Sartorious Stedim BIOSTAT). Fermentadores vazios, esterilizados, foram carregados com halfYEMaxSM esterilizada por filtro. As fermentações de semente foram realizadas a 33°C e pH 5,5, utilizando 4 N NH4OH não filtrado como a base para controle do pH 5,5. Fermentações de semente foram inoculadas com volume suficiente de células congeladas em estoque, que foram deixadas crescer por cerca de 7,5 horas até OD600 de cerca de 2,5 em halfYEMaxSM. As células foram diluídas no fermentador de 1L para dar um OD600 nm de partida de cerca de 0,025. De forma geral, as fermentações de semente foram recuperadas quando ~120 g/L de glicose havia sido consumido e/ou OD600 de cerca de 10 havia sido alcançado. As fermentações de semente foram periodicamente testadas para monitorar o crescimento, e recuperadas a cerca de 18,5 hr.

FERMENTAÇÃO HIDROLISADA

[120] A fermentação hidrolisada foi realizada em um fermentador de 1L (Sartorious Stedim BIOSTAT). Fermentadores vazios, esterilizados, foram carregados com 450 ml de hidrolisado de sabugo de milho preparado conforme descrito nos métodos gerais. Fermentações hidrolisadas foram realizadas a pH 5,8 utilizando 4 N NaOH não filtrado como base para ajuste do pH. A fermentação hidrolisada começou a 33°C. As fermentações hidrolisadas foram inoculadas com 10% volume (50 ml) de semente da fermentação de semente (vide acima), para gerar um OD inicial de cerca de 1,0. As fermentações hidrolisadas foram periodicamente testadas para monitorar o progresso da reação. As amostras foram testadas para glicose, xilose e etanol, conforme descrito nos métodos gerais.

[121] Duas fermentações hidrolisadas foram realizadas com 1 semana de intervalo, cada uma com a linhagem controle ZW705 e a linhagem selecionada a partir da adaptação, Adaptada 7-31 (Exemplo 2). O curso de tempo das fermentações é mostrada na figura 1. Adaptada 7-31 utilizou glicose mais rapidamente que ZW705, e utilizou mais xilose total para alcançar uma titulação de etanol mais alta durante o curso da fermentação.

[122] Fermentações hidrolisadas foram realizadas e testadas conforme descrito acima para comparar a linhagem controle ZW705, linhagem Adaptada 7-31, e linhagem Adaptada 5-6 (vide exemplo 2). Os resultados são ilustrados na figura 2. O desempenho da linhagem Adaptada 5-6 foi equivalente ao da linhagem Adaptada 7-31. Ambas tais linhagens adaptadas alcançaram uma titulação final de etanol mais alta utilizando glicose mais rapidamente no começo da fermentação, e utilizando mais xilose ao final da fermentação.

EXEMPLO 4 SEQUENCIAMENTO DE DNA COMPARATIVO DE LINHAGENS ADAPTADAS

[123] Toda a sequência genômica de Zymomonas mobilis do tipo selvagem (ZM4) foi descrita (Jeong-Sun Seo et. al, Nature Biotechnology. 23, 2005). Uma linhagem de partida do tipo selvagem (ZW1; ATCC 31821), uma linhagem intermediária (ZW658; ATCC PTA-7858) e ZW705, foram sequenciadas utilizando a tecnologia high-throughput 454 (Shendure e Ji, Nature Biotech. 26:1135 (2008)) e comparadas com a sequência do tipo selvagem publicada. As linhagens Adaptada 5-6 e Adaptada 7-31 foram sequenciadas utilizando a tecnologia Ilumina (Shendure e Ji, Nature Biotech 26:1135 (2008)). A partir da sequência do tipo selvagem, a sequência de ZW658 e os sítios de inserção determinados separadamente das alterações intencionais da sequência provenientes da inserção de dois operons de utilização de xilose e o knockout do gene GFOR (descrito nos métodos gerais), uma sequência consenso foi produzida, para a qual sequências das linhagens Adaptadas poderiam ser comparadas. A descrição do sequenciamento e conjunto de genoma é dada a seguir.

SEQUENCIAMENTO

[124] Linhagens foram sequenciadas utilizando as tecnologias de sequenciamento Illumina/Solexa e Roche-454. Tais métodos de sequenciamento massivamente paralelos deram um rendimento muito alto de leituras pequenas. No caso da Illumina, ela deu mais de 200 milhões de leituras que são de comprimento de 100 bp. Para Roche-454 1 de saídas lidas são de 500 bp de comprimento. Ambos os métodos permitem o sequenciamento a partir de ambas as extremidades dos fragmentos de DNA genômico para produzir leituras finais de pareamento.

[125] Centenas de milhões de leituras curtas das linhagens Adaptada 5-6 e Adaptada 7-31 foram alinhadas para uma sequência genômica de referência preparada a partir de sequencias ZW658 e ZW705 do tipo selvagem. O alinhamento resultante foi analisado para coletar informações sobre a cobertura e variações. Uma vez que muitas leituras podem se alinhar a uma região específica, o alinhamento é um acúmulo de leituras contra a referência e a cobertura profunda de uma dada posição é o número de leituras que cobre aquela posição. Se, em uma posição, a base consenso é diferente da base de referência, a posição é dita possuidora de uma variação de Polimorfismo de Nucleotídeo Isolado (SNP).

[126] Na comparação das sequências Adaptada 5-6 e Adaptada 731 para a linhagem de partida para sequência ZW705 de adaptação, uma única alteração de base, ou SNP, foi identificada para cada linhagem adaptada. A SNP para Adaptada 5-6 estava na posição 1453116, que está na fase aberta de leitura de um gene designado zmo1330. A SNP para Adaptada 7-31 estava na mesma fase aberta de leitura, mas a alteração foi em uma posição diferente (1453863). A alteração na Adaptada 5-6 está na posição 1097 da região codificante (SEQ ID NO:1), e é uma alteração de C para G naquela posição. Esta mutação resulta em uma alteração do códon para aminoácido 366 de ACA para AGA, resultando em uma alteração no aminoácido 366 de treonina para arginina na proteína codificada. A alteração na Adaptada 7-31 está na posição 350 da região codificante (SEQ ID NO:1), e é uma alteração de C para T naquela posição. Esta mutação resulta em uma alteração do códon para aminoácido 117 de TCT para TTT, resultando em uma alteração no aminoácido 117 de serina para fenilalanina.

[127] A proteína codificada por zmo1330 foi utilizada em um BLAST da base de dados de classificação de transportador (Saier Lab Bioinformatics Group; Saier et al. (2009), Nucl. Acids Res., 37: D274-8), que identificou a proteína como pertencente à família aaeB. Esta família de proteínas é caracterizada por possuir um N-terminal hidrofóbico que prevê de 5 a 6 cruzamentos de membrana, uma seção intermediária hidrofóbica menor e mais longa, e então um cruzamento de membrana de 5 a 6 similar no C-terminal. Este resultado sugere que a proteína que codifica zmo1330 é uma proteína transportadora de membrana.

[128] Na sequência genômica de Z. mobilis publicada (Seo et al., ibid; referência NCBI: NC_006526.2), zmo1330 corresponde a zmo1432, que é anotado como codificante de uma “proteína de resistência a ácido fusárico”. O conjunto de proteínas necessário para resistência a ácido fusárico em Pseudomonas cepacia foi identificado por Utsumi et al. (Agric. Biol. Chem. 55:1919-1918 (1991)). Entre o conjunto de fases aberta de leitura (ORFs) em que pareceu ser um operon que confere resistência a ácido fusárico, é um fusB designado por Utsumi et al. (ibid). A sequência da proteína codificada por fusB é idêntica a Bcenm03_1426 de Burkholderia cenocepacia (SEQ ID NO:7), que foi alinhada com a proteína codificada por zmo1432. As duas sequências de proteínas alinham com 3 intervalos (gaps) pequenos e são 22% idênticas, mas 63% similares (alinhamento Clustal W), conforme ilustrado na figura 3. A sequência de Bcenm03_1426 possui cerca de mesma identidade e similaridade à sequência AaeB (SEQ ID NO:8), que é a maior das duas proteínas codificadas em um operon em E. coli, que mostrou ser necessária para tolerância a ácido p- aminobenzóico (pABA) (VanDyk et al J. Bact. 186:7196-7204 (2004)). Zmo1432 é 17% idêntico e 55% similar a aaeB de E. coli. O alinhamento de proteínas codificadas por zmo1432 e para aaeB é ilustrado na figura 4.

Claims (5)

1. MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE, que produz etanol e utiliza xilose, do gênero Zymomonas, caracterizado por possuir pelo menos uma modificação genética na fase aberta de leitura zmo1432, em que a dita fase aberta de leitura zmo1432 que possui pelo menos uma modificação genética codifica um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos conforme descrita na SEQ ID NO:2, codificada pelo polinucleotídeo tendo sequência de ácidos nucleicos conforme descrita na SEQ ID NO:1, em que a modificação genética é uma mutação na região codificante zmo1432, que resulta em uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: 1) uma substituição na posição 366 na SEQ ID NO:2 de arginina para treonina; e 2) uma substituição na posição 117 na SEQ ID NO:2 de fenilalanina para serina, em que o códon 366 da SEQ ID NO:1 é modificado para um códon que codifica arginina selecionado de CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, e AGG e em que o códon 177 da SEQ ID NO:1 é modificado para um códon que codifica fenilalanina selecionado de TTT e TTC, em que a presença da proteína mutante aumenta a produção de etanol pelo Zymomonas durante a fermentação em meio hidrolisado de biomassa, conforme comparada com a produção por um Zymomonas que não possui a modificação genética sob as mesmas condições.

2. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado por codificar uma proteína que possui a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, em que o códon 366 da SEQ ID NO:1 é modificado para um códon que codifica arginina selecionado de CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, e AGG no polinucleotídeo que codifica a SEQ ID NO:3 e em que o códon 177 da SEQ ID NO:1 é modificado para um códon que codifica fenilalanina selecionado de TTT e TTC no polinucleotídeo que codifica a SEQ ID NO:4.

3. POLIPEPTÍDEO, caracterizado por possuir a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4.

4. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ZYMOMONAS RECOMBINANTE ETANOLOGÊNICO, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender: (a) fornecer um microrganismo que produz etanol e utiliza xilose, do gênero Zymomonas, compreendendo uma fase aberta de leitura zmo1432 que codifica um polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO:2, codificada pelo polinucleotídeo tendo uma sequência de ácidos nucleicos conforme descrita na SEQ ID NO:1; e (b) introduzir uma mutação na fase aberta de leitura zmo1432 de (a), de forma que a expressão da fase aberta de leitura mutada expresse um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, em que a SEQ ID NO:3 consiste de uma substituição na posição 366 da SEQ ID NO:2 de arginina para treonina e a SEQ ID NO:4 consiste em uma substituição na posição 117 na SEQ ID NO:2 de fenilalanina para serina.

5. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender: (a) fornecer o Zymomonas recombinante, conforme definido na reivindicação 1; (b) fornecer um meio hidrolisado de biomassa que compreende xilose; e (c) cultivar o Zymomonas de (a) no meio hidrolisado de biomassa de (b), onde etanol é produzido.

Images