BRPI0715282A2 - linhagem de zymomonas recombinante e processo de geraÇço de um linhagem de zymomonas - Google Patents

Abstract

LINHAGEM DE ZYMOMONAS RECOMBINANTE E PROCESSO DE GERAÇçO DE UMA LINHAGEM DE ZYMOMONAS. Foi elaborada uma linhagem de Zymomonas que utiliza xilose com uma modificação genética no gene de glicose-frutose oxidorreductase que resulta na expressão reduzida da atividade de enzimas GFOR. A linhagem elaborada exibe produção reduzida de xilitol, um subproduto prejudicial do metabolismo de xilose. Ela também consome mais xilose e produz mais etanol durante a fermentação de açúcares misturados sob condições relevantes do processo.

Description

"LINHAGEM DE ZYMOMONAS RECOMBINANTE E PROCESSO DE GERAÇÃO DE UMA LINHAGEM DE ZYMOMONAS"

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório Norte-Americano n° 60/847813, depositado em 28 de setembro de 2006, que é integralmente incorporado como parte do presente para todos os propósitos.

Declaração de Direitos Governamentais A presente invenção foi realizada com suporte do governo dos Estados Unidos com base nos Contratos n° 04-03-CA-70224 e DE-FC36- 03G013146 concedidos pelo Departamento de Energia. O governo detém

certos direitos sobre a presente invenção.

Campo da Invenção A presente invenção refere-se aos campos de microbiologia e engenharia genética. Mais especificamente, foi desenvolvida uma linhagem de Zimomonas que utiliza xilose com uma modificação genética do gene glicose- frutose oxidorreductase. A linhagem exibe produção reduzida de xilitol, um subproduto prejudicial do metabolismo de xilose, durante a fermentação e produção de etanol.

Antecedentes da Invenção

A produção de etanol por micro-organismos fornece uma fonte de energia alternativa aos combustíveis fósseis e é, portanto, uma área importante de pesquisa atual. Zymomonas mobilis é um etanologênico bacteriano que cresce sobre glicose, frutose e sacarose, metabolizando esses açúcares em CO2 e etanol por meio do processo de Entner-Douderoff. Embora linhagens do tipo selvagem não possam utilizar xilose como uma fonte de carbono, foram elaboradas linhagens recombinantes de Z mobilis que são capazes de crescer sobre esse açúcar (US 5.514.583, US 5.712.133, WO 95/28476, Feldmann et al (1992), Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 354-361, Zhang et al (1995), Science 267: 240-243). Xilose é a principal pentose em materiais lignocelulósicos hidrolisados e, portanto, pode fornecer um substrato de carbono com baixo custo e abundantemente disponível para uso em fermentação. Z. mobilis foi elaborado para expressão de quatro enzimas necessárias para o metabolismo de xilose: 1) xilose isomerase, que catalisa a conversão de xilose em xilulose; 2) xiluloquinase, que fosforila xilulose para formar 5-fosfato de xilulose; 3) transquetolase; e 4) transaldolase (US 5.514.583, US 6.566.107; Zhang et al (1995), Science 267: 240-243). Por meio das ações combinadas destas quatro enzimas e da maquinaria metabólica normal da célula, três moléculas de xilose são convertidas em duas moléculas de 6-fosfato de glicose e uma molécula de 3-fosfato de gliceraldeído, que são convertidas em seguida em etanol e CO2 sobre o lado de glicose do processo (vide Figura 1).

Embora tenha havido sucesso na elaboração de linhagens de Z. mobilis para o metabolismo de xilose, as linhagens não crescem e produzem etanol sobre xilose tão bem quanto sobre glicose. Um fator que causa o baixo crescimento sobre xilose é a produção de xilitol como um subproduto do metabolismo de xilose (Feldmann et al, acima; Kim et al (2000), Applied and Environmental Microbiology 66: 186-193). Xilitol é fosforilado por xilulose quinase para produzir 5-fosfato de xilitol, que se acumula na célula e inibe o crescimento bacteriano. A síntese de xilitol também reduz o rendimento de etanol, pois linhagens recombinantes de Z. mobilis que utilizam xilose não podem converter xilitol em etanol. Além disso, xilitol é um inibidor potente de xilose isomerase (Smith et al (1991), Biochem. J. 277: 255-261), que catalisa a primeira etapa da utilização de xilose no processo de metabolismo de xilose elaborada. Vide Figura 2 para um diagrama que exibe a síntese e os efeitos de xilitol.

O processo fisiológico e as enzimas que são responsáveis pela síntese de xilitol in vivo não foram determinados. Demonstrou-se, entretanto, que extratos livres de células de Z. mobilis do tipo selvagem são capazes de reduzir xilose em xilitol quando são suplementados com NADPH (Feldmann et al, acima) e que essa reação é catalisada por uma aldose reductase dependente de NADPH. Também se demonstrou que extratos livres de células de Z. mobilis são capazes de converter uma pequena quantidade de xilose em xilitol sem suplementação de NADPH e que a produção de xilitol sob essas condições aumenta de três a quatro vezes ao também adicionar-se xilose isomerase purificada à mistura de reação (Danielson, 2001, Tese de Mestrado da Universidade do Colorado). Como xilose isomerase é capaz de converter xilose em xilulose, a implicação clara deste último experimento é que a enzima glicose-frutose oxidorreductase (GFOR) de Z. mobilis pode utilizar xilose como um doador de elétrons e xilulose como um receptor de elétrons para gerar xilitol, como será discutido com mais detalhes abaixo. Desta forma, existem pelo menos dois processos de produção de xilitol em Z. mobilis com base nos experimentos in vitro, mas permanece a ser determinado até que ponto eles contribuem com a formação de xilitol sob condições fisiológicas.

Para a produção de etanol em alto nível, Z mobilis é cultivado em altas concentrações de uma fonte de carbono fermentável, o que pode resultar em choque osmótico. O choque osmótico manifesta-se como um longo período de demora antes do início do crescimento quando linhagens do tipo selvagem são transferidas para meios líquidos que contêm > 200 g/l de glicose ou frutose ou > 360 g/l de sacarose (Loos et al (1994), J. Bacteriol. 176: 7688-7693). Além disso, a adição de sorbitol ao meio de crescimento reduz o período de demora quando linhagens do tipo selvagem são alteradas para altas concentrações desses açúcares (Wiegert et al (1996), Arch. Microbiol. 166: 32-41, Loos et al, acima).

Também se demonstrou que a enzima periplasmática glicose- frutose oxidorreductase (GFOR) desempenha um papel importante no equilibrio osmotico quando Ζ. mobilis do tipo selvagem e cultivado em misturas concentradas de glicose e frutose (Loos et al, acima) ou solugoes concentradas de sacarose (Wiegert et al, acima, Loos et al, acima). Resumidamente, GFOR1 com ο seu cofator firmemente unido, catalisa a oxidagiao de glicose em gluconolactona e subsequente redugao de frutose em sorbitol em um classico mecanismo Ping Pong Bi, conforme exibido no Diagrama I. O sorbitol que e gerado no espago periplasmatico e transportado para celulas contra um gradiente de concentragao onde se acumula ate altos niveis, pois nao e adicionalmente metabolizado. A alta concentragao de sorbitol no interior das celulas elimina a diferenga de pressao osmotica ao Iongo da membrana de plasma e restaura ο equilibrio osmotico.

Demonstrou-se que um mutante espontaneo de Z. mobilis do tipo selvagem que nao pode gerar sorbitol produz niveis mais altos de etanol que celulas do tipo selvagem quando cultivado sobre baixas concentragoes de sacarose (< 150 g/l), mas esta Iinhagem nao pode crescer sobre altas concentrates de sacarose (Kirk e Doelle (1993), Biotechnol. Letters 15: 985- 990). Demonstrou-se em seguida que esse mutante nao possui a expressao de glicose-frutose oxidorreductase (GFOR), ο que justifica a sua incapacidade de conversao de qualquer frutose derivada de sacarose no subproduto indesejado sorbitol (Wiegert et al, acima). Tambem se demonstrou que ο crescimento do mutante com deficiencia de sorbitol em altas concentragoes de sacarose podera ser restaurado por meio da adi^ao de sorbitol ao meio de crescimento (Wiegert et al, acima). Desta forma, GFOR desempenha um papel fundamental no equilibrio osmotico por sintetizar sorbitol quando Z. mobilis e cultivado em misturas concentradas de glicose e frutose ou altas concentragoes de sacarose, que e hidrolisada em glicose e frutose pela invertase da celula hospedeira.

glicose + GFOR-NADp+ gluconolactona + GFOR-nadph GFOR-NADPH + frutose sorbitol + GFOR-NADP Diagrama I

CN 1600850 (A) descreve uma Iinhagem mutante de Z. mobilis que nao utiliza xilose e contem um gene GFOR desativado e a produgao de etanol utilizando esta linhagem. A faIta de produgao de sorbitol com esta Iinhagem resultou em niveis mais altos de etanol quando glicose, frutose ou

sacarose era a fonte de carbono.

Os efeitos da redupao ou eliminagao da atividade da enzima glicose-frutose oxidorreductase em uma linhagem de Z. mobilis que utiliza xilose elaborada que e cultivada sob re uma mistura de xilose e glicose (na ausencia de qualquer sacarose ou frutose adicionada) nao sao conhecidos.

Permanece a necessidade de uma linhagem de Z. mobilis que utiliza xilose que seja capaz de produzir quantidades maiores de etanol quando cultivada sobre um meio que contem xilose. Os depositantes solucionaram ο problema determinando ο principio do processo de produgao de xilitol in vivo e eliminando a atividade enzimatica que e responsavel pela sua formagao por meio de desativagao genetica, de forma a criar uma linhagem de Z. mobilis com maior produgao de etanol.

Descricao Resumida da Invencao 2o A presente inven^ao refere-se a uma linhagem de Zymomonas1

tal como Zymomonas mobilis, que reduziu a produgao de xilitol e aumentou a produgao de etanol quando cultivado na presenga de xilose. Os depositantes descobriram que a produgao de xilitol em Z. mobilis que metabolisa xilose e predominantemente mediada pela enzima glicose-frutose oxidorreductase (GFOR). Uma linhagem geneticamente modificada que nao expressa GFOR (um mutante knockout GFOR) foi elaborada e descobriu-se que ela produz quantidades reduzidas de xilitol quando cultivada sobe misturas de agCicar que

contem xilose. O mutante knockout GFOR tambem consumiu mais xilose e produziu concentragoes mais altas de etanol quando cultivado em misturas com alto teor de agucar na presenga de sorbitol que a Iinhagem parental que expressa GFOR. Alem disso, ο rendimento de etanol (a quantidade de etanol produzida por grama de agiicar consumido) foi significativamente mais alto para a Iinhagem knockout GFOR.

Consequentemente, a presente invengao fornece um micro- organismo recombinante do genero Zymomonas que e capaz de utilizar xilose para produzir etanol por meio de fermentagao em um meio de carbo-hidrato, em que ο mencionado micro-organismo compreende pelo menos uma modificagao genetica que resulta em atividade mais baixa da enzima glicose- frutose oxidorreductase. A presente invengao inclui Iinhagens de Zymomonas capazes de utilizar xilose para produzir etanol que exibem atividade de GFOR reduzida como resultado de uma modificagao genetica do gene GFOR. Qualquer redugao da atividade de GFOR encontra-se dentro do escopo da presente invengao, incluindo uma mutagao que desative completamente ο gene de atividade de GFOR e/ou suspenda completamente a atividade de enzima GFOR.

Alem disso, a presente invengao fornece um processo de geragao da Iinhagem de Zymomonas com reduzida atividade de GFOR, que compreende:

a. fornecimento de uma Iinhagem de Zymomonas

recombinante capaz de utilizar xilose para produzir etanol sob condi^oes apropriadas; e

b. introdugao de pelo menos uma modificagao genetica na Iinhagem de Zymomonas recombinante de (a), em que a mencionada modificagao reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase.

Breve Descricao pas Figuras. Depositos Biologicos ε Descricoes de

Sequencias

A presente invengao pode ser compreendida mais completamente a partir da descrigao detalhada a seguir, das Figuras e das descrigoes de sequencias anexas que fazem parte do presente pedido.

A Figura 1 exibe um diagrams das quatro enzimas (em caixas) que foram utilizadas para elaborar Z. mobilis para utiliza^So de xilose e processos bioquimicos de produgao de etanol utilizando xilose.

A Figura 2 exibe um diagrama das duas primeiras eta pas do processo de xilose elaborado (em caixas), sintese de xilitol, formagao de 5- fosfato de xilitol (um intermediario final toxico) e inibigao de xilose isomerase por xilitol.

A Figura 3 exibe as estrategias de testes de enzimas de transquetolase (A), transaldolase (B), xilose isomerase (C) e xiuloquinase (D).

A Figura 4 exibe um mapa de plasmideos de pMODPgaptaltktCm.

A Figura 5 exibe um mapa de plasmideos de

pMODPgapxylABCm.

A Figura 6 exibe um grafico das atividades de xilose isomerase (XI) e xiluloquinase (XK) em Iinhagens T2C, T3C, T4C e T5C transformadas com PgapxylAB.

A Figura 7 exibe um grafico das atividades de transaldolse (TAL) e transquetolase (TKT) em Iinhagens T2C, T3C, T4C e T5C transformadas com PgapxylAB.

A Figura 8 exibe um grafico do percentual de rendimento teorico de etanol e do percentual de utiliza^ao de xilose de colonias de Iinhagens que utilizam xilose adaptadas selecionadas.

A Figura 9 exibe um grafico do crescimento de Iinhagens que utilizam xilose adaptadas apos setenta horas sobre RM (meio rico) com 5% de xilose (RMX5%) antes e depois do cultivo de cinquenta gerag5es em RM com 5% de glicose (RMG).

A Figura 10 exibe graficos de crescimento, utilizagao de glicose ou xilose e produgao de etanol e xilitol para a Iinhagem selecionada, ZW658, em comparagao com ο controle, 8b, em RM + 10% glicose (RMG10%) (A, B) e RM + 8% xilose (RMX8%) (C, D).

A Figura 11 exibe graficos de crescimento, utilizagio de glicose e xilose e produgao de etanol e xilitol para a Iinhagem selecionada, ZW658, em comparagao com ο controle, 8b, em RM + 10% glicose e 8% xilose sem acetato (A, B) ou com 0,6% acetato (C, D).

A Figura 12 exibe mapas de plasmideos elaborados durante a formagao de uma construgao suicida para desativagao por insergao do gene GFOR e ο produto final: GFORSp-9VWV.

A Figura 13 exibe mapas de plasmideos elaborados para a construgao de um plasmideo de expressao de xilose isomease: pZB188/Kan- XyIA e um diagrama do conjunto de expressao de xilose isomerase de E. coli que foi utilizado para esta constru^ao (em caixas). A Figura 14 exibe graficos da produgao de xilitol e xilulose por

Iinhagens ZW1 com e sem desativagao de genes GFOR, na presenga e ausencia da expressao de xilose isomerase.

A Figura 15 exibe graficos de crescimento, utilizagao de glicose e xilose e produgao de etanol de Iinhagens de Z. mobilis que utilizam xilose sem (A) e com (B) desativagao de genes GFOR, cultivadas sobre 97 g/l de xilose + glicose total.

A Figura 16 exibe graficos de crescimento, utilizagao de glicose e xilose e produgao de etanol de Iinhagens de Z. mobilis que utilizam xilose sem (A) e com (B) desativagao de gene GFOR, cultivadas sobre 188 g/l de total de

xilose + glicose.

A Figura 17 exibe um grafico de crescimento de uma Iinhagem de Z. mobilis que utiliza xilose com desativagao do gene GFOR na presenga de

diferentes concentragoes de sorbitol. A Figura 18 exibe graficos da utiliza?ao de xilose, produgao de etanol e produgao de xilitol de Iinhagens de Z. mobilis que utilizam xilose sem (A, C) e com (B, D) desativagao de gene GFOR, na ausencia (A, B) e presenga (C, D) de acetato em 174 g/l de total de xilose + glicose.

A Figura 19 exibe graficos da utilizagao de xilose, produgao de etanol e produ?§o de xilitol de Iinhagens de Z. mobilis que utilizam xilose sem (A, C) e com (B, D) desativagao de gene GFOR, na ausencia (A, B) e presenga (C, D) de acetato em 203 g/l de total de xilose + glicose.

A Figura 20 exibe graficos da utilizagao de xilose, produgao de etanol e produgao de xilitol de Iinhagens de Z. mobilis que utilizam xilose sem (A, C) e com (B, D) desativa9§o de gene GFOR, na ausencia (A, B) e presenga (C, D) de acetato em 203 g/l de total de xilose + glicose com bicarbonato de potassio adicional para maior capacidade de tamponamento.

A Figura 21 exibe um grafico de utiliza^ao de xilose e glicose, produgao de etanol e produgao de xilitol de uma Iinhagem de Z. mobilis que utiliza xilose com desativagao de gene GFOR, na presenga de acetato em 189 g/l de total de xilose + glicose em uma condugao de fermentagao com pH controlado.

A Figura 22 exibe mapas de plasmideos de pZB188/Kan e pZB188/kan-Cre, um vetor de expressao de Cre que pode reproduzir-se em Z mobilis.

A Figura 23A exibe uma comparagao do crescimento de ZW801-4 e ZW800 em alto teor de glicose + xilose com acetato sob condigSes de pH controlado. A Figura 23B exibe um grafico da utilizagao de glicose e xilose e produgao de etanol para ZW801-4 em comparagao com ZW800.

A Figura 24 exibe um alinhamento da sequencia mutante traduzida em ZW801-4 com a proteina GFOR do tipo selvagem.

A presente invengao pode ser compreendida mais completamente a partir da descrigao detalhada a seguir e das descrigoes de sequencias anexas que fazem parte do presente pedido.

As sequencias a seguir estao de acordo com 37 C. F. R. 1.821- 1.825 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules) e consistentes com ο Padrao ST.25 (1998) da Organiza^ao Mundial da Propriedade Intelectual (OMPI) e as exigencias de Iistagens de sequencias do EPO e PCT (Regras 5.2 e 49.5 (a-bis) e Capitulo 208 e Anexo C das Instates Administrativas). Os simbolos e formato utilizados para dados de sequencias de aminoacidos e de nucleotideos atendem as regras definidas em 37 C. F. R. §1.822.

έ fornecida com ο presente uma Listagem de Sequencias em Disco Compacto. O conteCido do Disco Compacto que contem a Listagem de Sequencias e incorporado ao presente como referencia de acordo com 37 CFR 1.52 (e). Os Discos Compactos sao apresentados em duplicata e sao identicos entre si. Os discos sao marcados "Copia 1 - Listagem de Sequencias" e "Copia 2 - Listagem de Sequencias". Os discos contem ο arquivo a seguir: CL3604 seq list.ST25.

SEQ ID N° 1 e 2 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplifica^ao de um fragmento de DNA que contem ο promotor genetico 3- fosfato de gliceraldeido desidrogenase (Pgap) de pZB4.

SEQ ID N0 3 e 4 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplificagao de um fragmento de DNA que contem uma regiao de

codificagao fa/de pZB4. SEQ ID N0 5 e 6 sao as sequencias de nucleotideos de primers

para amplificagao de um fragmento de DNA que contem Pgapia/ dos fragmentos de Pgap e tal.

SEQ ID N0 7 e 8 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplificagao de um fragmento de DNA que contem loxP::Cm de pZB186.

SEQ ID N。9 e a sequSncia de nucleotideos completa para ο plasmideo pMODPgaptaltktCm.

SEQ ID N0 10 e 11 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplificagao de um fragmento de DNA de 3 kb que contem regioes de codificagao tale tktem transformadores que recebem pMODPgaptaltktCm.

SEQ ID N° 12 e a sequencia de nucleotideos completa para ο

plasmideo pMODPgapxylABCm.

SEQ ID N° 13 e 14 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplifica^ao de um fragmento de DNA de PgapxyIA de 1,6 kb dos integrantes T2C, T3C, T4C e T5C com pMODPgapxylABCvn.

SEQ ID N° 15 e 16 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplificagao de um fragmento de DNA de xylB de 1,3 kb dos integrantes T2C, T3C, T4C e T5C com pMODPgapxylABCm. SEQ ID N0 17 e 18 sao as sequencias de nucleotideos de primers

para amplificagao de um fragmento de DNA de 2268 bp de DNA genomico de Z. mobilis W1 que contem uma parte da extremidade 3’ do gene pgm, ο gene Idh e uma parte da extremidade 5' do gene adhl.

SEQ ID N0 19 e 20 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplificagao do conjunto de resistencia a tetraciclina de pACYC184.

SEQ ID N0 21 e 22 sao sequencias de oligonucleotideos utilizadas para criar um local IoxP.

SEQ ID N° 23 e 24 sao sequencias de oligonucleotideos utilizadas para criar um local IoxP. SEQ ID N0 25 e 26 sao as sequencias de nucleotideos de primers

para amplificagao do conjunto Specr de pHP15578.

SEQ ID N0 27 e 28 sao as sequencias de nucleotideos de primers

para amplificagao de DNA que Iadeia 3' GFOR de DNA genomico de ZW1. SEQ ID N0 29 e 30 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplificagao de DNA que Iadeia 5' GFOR de DNA genomico de ZW1.

SEQ ID N0 31 e a sequencia de nucleotideos do plasmideo pGF0RSp-9M.

SEQ ID N° 32 e 33 sao as sequencias de nucleotideos de primers

para amplifica^ao do conjunto Kanr de pET-24a.

SEQ ID N0 34 e a sequencia de nucleotideos do conjunto de expressao de xylA de E. coli que foi derivada de pZB4.

SEQ ID N0 35 e 36 sao as sequencias de nucleotideos de primers para amplifica9ao de um conjunto de expressao de Cre.

SEQ ID N0 37 e a sequencia de nucleotideos completa da regiao de codificagao de GFOR rompida em ZW801-4 (do codon de inicio original ate ο codon de parada original).

SEQ ID N0 38 e a sequencia de nucleotideos completa da regiao de codifica9ao de GFOR do tipo selvagem (do codon de inicio original ate ο codon de parada original).

Os depositantes realizaram ο deposito biologico a seguir com base nos termos do Tratado de Budapeste Sobre ο Reconhecimento Internacional do Deposito de Micro-Organismos para os Propositos de Procedimento de Patentes na Colegao Norteamericana de Cultivos de Tipos (ATCC)1 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209:_

Identificagao de referencia do depositante Designa^ao do depositario internacional Data do deposito ZW658 ATCC n° PTA-7858 12 de setembro de 2006

Descricao Detalhada da Invencao

A presente invengao descreve Iinhagens de Zymomonas recombinantes que utilizam xilose que sao adicionalmente elaboradas por meio

de modificagao do gene glicose-frutose oxidorreductase (GFOR) endogeno e um processo de gera^ao de Iinhagens de Zymomonas com GFOR modificada. O processo descrito no presente inclui qualquer modificagao gen6tica que elimine ou reduza a atividade da enzima GFOR, ο que resulta em redugao da produ?ao de xilitol durante ο metabolismo de xilose e aumento da produgao de etanol. Linhagens de Zymomonas que utilizam xilose geneticamente modificadas com redu?ao da atividade da enzima GFOR podem ser utilizadas em um processo de produgao de etanol por meio de fermentag§o. O etanol produzido pela nova Iinhagem de Zymomonas pode ser utilizado como uma fonte de energia alternativa para os combustiveis fosseis. As definigoes e abreviagdes a seguir serao utilizadas para a

interpretagao do relatorio descritivo e das reivindicag5es.

"Glicose-frutose oxidorreductase" e abreviada GFOR.

RM e meio rico.

RMG5% έ RM + 5% glicose. RMG10% e RM + 10% glicose.

RMX8% e RM + 8% de xilose.

RMX2% e RM + 2% de xilose.

RMX5% e RM + 5% de xilose.

RMGX10%8% e RM + 10% de glicose e 8% de xilose. RMGX5%8% e RM + 5% de glicose e 8% de xilose.

"Gene" indica um fragmento de acido nucleico que expressa uma proteina especifica, que inclui sequencias reguladoras anteriores (sequencias nao codificadoras 5') e posteriores (sequencias nao codificadoras 3') a sequencia de codificagao. "Gene nativo" ou "gene do tipo selvagem" designa um gene conforme encontrado na natureza com as suas proprias sequencias reguladoras. "Gene quimerico" indica qualquer gene que nao seja um gene nativo, que compreende sequencias reguladoras e de codificagao que nao sao

encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimerico pode compreender sequencias reguladoras e sequencias de codificagao que sao derivadas de fontes diferentes ou sequencias reguladoras e sequencias de codificagao derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma forma diferente da encontrada na natureza. "Gene endogeno" indica um gene nativo no seu local natural no genoma de um organismo. Gene "exogeno" indica um gene normalmente nao encontrado no organismo hospedeiro, mas que e introduzido no organismo hospedeiro por meio de transferencia genetica. Genes exogenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo nao nativo ou genes quim6ricos.

A expressao "construgao genetica" indica um fragmento de acido

nucleic。que codifica a expressao de uma ou mais proteinas especificas. Na constru^ao genetica, ο gene pode ser de natureza nativa, quimerica ou exogena. Tipicamente, uma construgao genetica compreendera uma "sequencia de codificaqiao". "Sequencia de codificagao" designa uma sequencia de DNA que codifica uma sequencia de aminoacidos especifica.

"Promotor" ou "regioes de controle de inicio" designa uma sequencia de DNA capaz de controlar a expressao de uma sequencia de codificagao ou RNA funcional. Geralmente, uma sequencia de codificagao esta Iocalizada a 3’ de uma sequencia promotora. Promotores podem ser completamente derivados de um gene nativo ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sinteticos. Os tecnicos no assunto compreendem que diferentes promotores podem dirigir a expressao de um gene em diferentes tecidos ou tipos de celulas, ou em diferentes estagios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condigoes ambientais. Promotores que causam a expressao de um gene na maior parte dos tipos de celulas na maior parte das vezes sao comumente denominados "promotores constitutivos". O termo "expressao", da forma utilizada no presente, indica a transcrigao e acCimulo estavel de RNA com (mRNA) ou sem sentido derivado de um gene. Expressao pode tambem designar a tradugao de mRNA em um polipeptideo. "Inibigao sem sentido" indica a produgao de transcritos de RNA sem sentido capazes de suprimir a expressao da proteina alvo. "Sobre- expressao" indica a elaboragao de um produto genetico em organismos transgenicos que excede os niveis de produgao em organismos normais ou nao transformados. "Cossupressao" indica a produgao de fragmentos ou transcritos de RNA com sentido capazes de suprimir a expressao de genes endogenos ou exogenos identicos ou substancialmente similares (US 5.231.020).

A expressao "RNA mensageiro (mRNA)", da forma utilizada no presente, indica ο RNA que nao contem introns e que pode ser traduzido em proteina pela celula.

A expressao "gene nao funcional", da forma utilizada no presente,

indica um gene que nao expressa a proteina codificada normalmente como na Iinhagem do tipo selvagem em que ο gene e endogeno. A expressao de um gene nao funcional pode ser rompida em qualquer nivel, tal como transcrigao, processamento de RNA ou tradugao. Um gene nao funcional possui tipicamente pouca ou nenhuma expressao da proteina codificada. Ele pode tambem codificar, entretanto, uma proteina modificada que possui atividade enzimatica mais baixa que a proteina do tipo selvagem.

O termo "transforma9ao", da forma utilizada no presente, designa a transferencia de um fragmento de acido nucleico para um organismo hospedeiro, resultando em heranga geneticamente estavel. O acido nucleico transferido pode apresentar-se na forma de um plasmideo mantido na celula hospedeira ou parte do acido nucleico transferido pode ser integrado ao

genoma da celula hospedeira. Os organismos hospedeiros que contem os fragmentos de acidos nucleicos transformados sao denominados organismos "transgenicos", "recombinantes" ou "transformados".

Os termos "plasmideo" e "vetor", da forma utilizada no presente, designam um element。cromossomico adicional que frequentemente conduz genes que nao sao parte do metabolismo central da celula e, normalmente, encontram-se na forma de moleculas de DNA de fita dupla circulares. Esses elementos podem ser sequencias reprodutoras autonomas, sequencias integrantes de genomas, sequencias de fagos ou nucleotideos, Iineares ou circulares, de um RNA ou DNA de fita simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, em que uma serie de sequencias de nucleotideos uniu-se ou recombinou-se em uma Cinica construgao que e capaz de introduzir um fragmento promotor e sequencia de DNA para um produto genetico selecionado junto com sequencia nao traduzida 3’ apropriada em uma celula.

A expressao "ligado operativamente" designa a associagao de sequencias de acidos nucleicos sob re um Cinico fragmento de cicido nucleico, de tal forma que a fungao de um seja afetada pelo outro. Um promotor e ligado operativamente com uma sequencia de codificagao, por exemplo, quando for capaz de afetar a expressao daquela sequencia de codificagao (ou seja, aquela sequencia de codificagao encontra-se sob ο controle transcricional do promotor). Sequencias de codificagao podem ser Iigadas operativamente a sequencias reguladoras em orientagao com ou sem sentido.

A expressao "marcador selecionavel" indica um fator de identificagao, normalmente um gene de resistencia a antibioticos ou substancias quimicas, que possa ser selecionado com base no efeito do gene marcador, ou seja, resistencia a um antibiotico, em que ο efeito e utilizado para rastrear a heranga de um acido nucleico de interesse e/ou para identificar uma celula ou organismo que tenha herdado ο acido nucleico de interesse.

As expressoes produgao de xilitol "substancialmente eliminada" e "substancialmente nenhum" subproduto de xilitol designam ο caso em que a quantidade de xilitol detectada utilizando analise Iaboratorial tipica e proxima de zero.

A expressao "alta concentragao de agCicares misturados" designa uma concentragao total de agiicar no meio que resulta na inibigao do crescimento de Z. mobilis que utiliza xilose mutante de GFOR. Esta e tipicamente de mais de cerca de 100 g/l, embora a concentra^So exata possa variar dependendo de outros componentes no meio.

A expressao "agucar fermentavel" designa oligossacarideos e monossacarideos que podem ser utilizados como uma fonte de carbono por um micro-organismo em um processo de fermentagao.

O termo "lignocelulosico" designa uma composigao que compreende Iignina e celulose. Material lignocelulosico pode tambem compreender hemicelulose. O termo "celulosico" designa uma composi^ao que compreende

celulose e componentes adicionais, que incluem hemicelulose.

O termo "sacarifica^ao" indica a produgao de a?Licares fermentaveis a partir de polissacarideos.

A expressao "biomassa previamente tratada" indica biomassa que tenha sido submetida a tratamento previo antes da sacarificagao.

"Biomassa" indica qualquer material celulosico ou lignocelulosico e inclui materials que compreendem celulose e, opcionalmente, que compreendem adicionalmente hemicelulose, Iignina1 amido, oligossacarideos e/ou monossacarideos. Biomassa pode tambem compreender componentes adicionais, tais como proteina e/ou lipidio. Biomassa pode ser derivada de uma Cinica fonte ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; biomassa podera compreender, por exemplo, uma mistura de

espigas de milho e forragem de milho, ou uma mistura de gramas e folhas. Biomassa inclui, mas sem limitar-se a safras bioenergeticas, residuos agricolas, Iixo solido municipal, Iixo s6lido industrial, Iodo de fabrica?ao de papel, residuos de jardinagem, madeira e residuos florestais. Exemplos de biomassa incluem, mas sem limitar-se a graos de milho, espigas de milho, residuos de safra tais como cascas de milho, forragem de milho, grama, trigo, palha de trigo, cevada, palha de cevada, feno, palha de arroz, brotos de grama, residuos de papel, bagapo de cana de agucar, sorgo, soja, componentes obtidos a partir da moagem de graos, arvores’ ramos, raizes, folhas, flocos de madeira, serragem, moitas e arbustos, legumes, frutas, flores e esterco animal. "Hidrolisado de biomassa" indica ο produto resultante da

sacarificagao de biomassa. A biomassa pode tambem ser tratada previamente

antes da sacarificagao.

Os metodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrao utilizados no presente sao bem conhecidos na tecnica e descritos por Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis1 T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edigao; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989 (a seguir, "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan1 M. L. e Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions·, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1984; e por Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, publicado pela Greene Publishing e Wiley-

lnterscience, 1987.

A presente invengao refere-se a Iinhagens elaboradas de Zymomonas que utilizam xilose que apresentam produ^ao de etanol aprimorada. Um desafio para aumentar a produgao de etanol por Z. mobilis que utiliza xilose e a redu^ao ou eliminagao da sintese de xilitol, que (a) representa um sifao de carbono que nao agrega valor; (b) inibe a primeira eta pa da utilizagao de xilose; e (c) e fosforilado ate um intermediario final toxico que inibe ο crescimento bacteriano. Os depositantes descobriram que a enzima endogena GFOR e predominantemente responsavel pela sintese de xilitol in vivo e que, reduzindo-se ou eliminando-se a atividade da enzima GFOR, aprimora-se a produgao de etanol (velocidade, rendimento e titulo) a partir de xilose.

Qualquer Iinhagem de Zymomonas que seja capaz de utilizar xilose como uma fonte de carbono pode ser empregada como um hospedeiro para preparer as Iinhagens de acordo com a presente inven^ao. Linhagens de Zymomonas, tais como Z. mobilis que tenham sido elaboradas para fermenta^ao de xilose em etanol sao particularmente uteis. Genes endogenos podem fornecer parte do processo metabolico ou podem ser alterados por meio de qualquer metodo conhecido de manipulagao genetica para fornecer uma proteina com atividade enzimatica Litil para metabolismo de xilose. A transquetolase endogena pode complementar, por exemplo, as atividades de outras enzimas introduzidas na criagao de um processo de utilizagao de xilose. Tipicamente, foram introduzidos quatro genes em Z. mobilis para expressao de quatro enzimas envolvidas no metabolismo de xilose (Figura 1), conforme descrito em US 5.514.583, que e incorporada ao presente como referenda. Estas incluem genes que codificam xilose isomerase, que catalisa a conversao de xilose em xilulose e xiluloquinase, que fosforila xilulose para formar 5-fosfato de xilulose. Alem disso, transquetolase e transaldolase, duas enzimas do processo de fosfato de pentose, convertem 5-fosfato de xilulose em intermediarios que acoplam metabolismo de pentose no processo gIicolitico de Entner-Douderoff que permite ο metabolismo de xilose em etanol. Sequencias de DNA que codificam estas enzimas podem ser obtidas a partir de qualquer dentre numerosos micro-organismos que sejam capazes de metabolizar xilose, tais como bacterias entericas, e algumas Ieveduras e fungos. Fontes das regioes de codificagao incluem Xanthomonas, Klebsiella, Escherichia, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter1 Gluconobacter, Rhizobium, Agrobacterium1 Salmonella, Pseudomonas e Zymomonas. Sao particularmente Citeis as regioes de codificagao de E. coli.

As sequencias de DNA codificadoras sao Iigadas operativamente a promotores que sao expressos em celulas de Z. mobilis tais como os promotores de 3-fosfato de gliceraldeido desidrogenase de Z mobilis (promotor de GAP) e enolase de Z. mobilis (promotor de ENO). As regioes de codificagao podem ser expresses individualmente a partir de promotores ou duas ou mais regioes de codificagao podem ser unidas em um operador com expressao do mesmo promotor. Os genes quimericos resultantes podem ser introduzidos em Zymomonas e mantidos sob re um plasmideo ou integrados ao genoma utilizando, por exemplo, recombinagao homologa, integragao dirigida a local ou integra?ao aleatoria. Linhagens que utilizam xilose que sao de uso especifico incluem CP4 (pZB5) (US 5.514.583), ATCC31821/pZB5 (US 6.566.107), 8b (US 20030162271; Mohagheghi et al (2004)，Biotechnol. Lett. 25; 321-325) e ZW658 (descritos no presente; depositado, ATCC n° PTA-7858).

Linhagens de Zymomonas qu e sao adicionalmente elaboradas para utilizar a^Cicares diferentes de xilose que nao sejam substratos naturais podem tambem ser empregadas no processo do presente. Um exemplo e uma Iinhagem de Z. mobilis elaborada para utilizagao de arabinose conforme descrito em US 5.843.760, que e incorporada ao presente como referenda. Descoberta da sintese de xilitol por meio de GFOR Sintese do subproduto xilitol indesejado por Iinhagens que utilizam xilose de Z. mobilis reduz ο rendimento de etanol e resuIta na formagao de 5-fosfato de xilitol que e um composto toxico que inibe ο crescimento bacteriano (vide a Figura 2). Alem disso, xilitol e um inibidor potente de xilose isomerase, a primeira enzima no processo elaborado para utilizagao de xilose,

e a sua sintese reduz a capacidade das celulas para metabolizar xilose. Embora experimentos in vitro tenham estabelecido que existem pelo menos dois processos de formagao de xilitol em Z. mobilis (Feldmann et al, acima, Danielson et al, acima), os depositantes descobriram que a maior parte do xilitol que e produzido fisiologicamente e ο resultado da atividade de enzimas GFOR. Os depositantes descobriram que a quantidade de xilitol que e sintetizada por Iinhagens de Z. mobilis que podem utilizar xilose (ou derivados de sintese de xilulose de Z. mobilis do tipo selvagem) que sao cultivadas sobre meios que contem xilose e grandemente reduzida na ausencia da atividade de enzima GFOR. Os depositantes tambem descobriram que a conversao de xilose em xilulose e um requisito previo de produgiao de xilitol mediada por GFOR in vivo e que esta reagao pode ocorrer apenas em Iinhagens de Z. mobilis que expressam xilose isomerase. Desta forma, propoe-se que a principal fonte fisiologica de xilitol em Iinhagens de Z. mobilis que sao elaboradas para cuItivo sobre xilose seja sintetizada por GFOR por meio de uma ou das duas reagoes que sao ilustradas nos Diagramas Il e III.

Diagrama Il

xilose + GFOR-NADp+ ^ acido xilonico + GFOR-nadph GFOR-NADPH + xilulose " xilitol + GFOR-NADP+

Diagrama Il

glicose + GFOr-NADP+ ^ gluconolactona + GFOR-NADPH

GFOR-NADPH + xilulose xilitol + GFOR-NADP+ Salientamos que, nos dois esquemas, xilulose serve de aceitador de eletrons obrigatorio para GFOR e que este composto e reduzido em xilitol ao contrario da reagao conhecida com frutose que resulta na produ^ao de sorbitol (Diagrama I). Embora GFOR seja bastante especifica para glicose e frutose, demonstrou-se que ele pode utilizar outros agCicares como doadores de eletrons e receptores de eletrons, embora de forma um tanto

fraca (Zachariou e Scopes (1986), Journal of Bacteriology 167: 863-869). Desta forma, ao incubar-se xilose e frutose com a proteina purificada, observou-se produgao de sorbitol, mas houve uma redupao de cerca de doze vezes da atividade de enzima GFOR em comparagao com a reagao de controle com glicose. No mesmo documento, demonstrou-se que xilulose pode substituir frutose como um aceitador de eletrons e que esta reagao gera xilitol conforme ilustrado no Diagrama III. Com esta combinagao de substratos, entretanto, houve uma redupao de cerca de quatorze vezes da atividade de enzima GFOR. Alem destas observagoes, tambem se demonstrou que extratos Iivres de celulas preparados a partir de Z. mobilis do tipo selvagem sao capazes de gerar xilitol a partir de xilose ao adicionar-se xilose isomerase a mistura de reagao para fornecer uma fonte de xilulose (Danielson1 acima), de forma a demonstrar que GFOR pode tambem catalisar a rea?ao que e ilustrada no Diagrama II. Se essas reagoes mediadas por GFOR ocorrem em celulas vivas e, se ocorrerem, ο ponto ate ο qual elas contribuem com a forma^ao de xilitol in vivo, entretanto, permanecia sem ser determinado ate a descoberta dos depositantes. As mesmas incertezas referentes a atividade de aldose reductase dependente de NADPH que tambem esta presente em extratos Iivres de celulas de Z. mobilis do tipo selvagem, que e capaz de converter diretamente xilose em xilitol (Feldmann et al, acima). De fato, nenhum dos experimentos com extratos Iivres de celulas indicados acima forneceu nenhuma indicaqiao das contribuigoes relativas de GFOR e aldose reductase dependente de NADPH para a formagao de xilitol in vitro, muito menos in vivo sob condiqioes relevantes de processo. Desta forma, a descoberta dos depositantes que GFOR e principalmente responsavel pela produ9§o de xilitol em Iinhagens de Z. mobilis que sao elaboradas para crescimento sobre xilose sob condigoes fisiologicas em meios que contem

xilose foi surpreendente e nao poderia ser antecipada a partir do estado da tecnica. Alteracao da expressao de gene GFOR Uma Iinhagem de Zymomonas que utiliza xilose de acordo com a presente inver^ao e elaborada de tal forma que haja expressao reduzida ou nenhuma do gene que codifica GFOR1 de forma que a sintese de xilitol seja reduzida. Qualquer metodo de modificagao genetica conhecido dos tecnicos no assunto para reduzir a presenga de uma enzima funcional pode ser utilizado para alterar a expressao de GFOR. Os metodos incluem, mas sem limitar-se a exclusao do gene com ρ Ieto ou de uma parte do gene que codifica GFOR, insergao de um fragmento de DNA no gene GFOR (na regiao promotora ou de codifica^ao), de tal forma que a proteina nao seja expressa ou seja expressa em niveis mais baixos, introdugao de uma mutagao na regiao de codificagao de GFOR que adiciona um codon de parada ou alteragao de quadro, de tal forma que nao seja expressa uma proteina funcional, e introdugao de uma ou mais mutagoes na regiao de codifica^ao de GFOR para alterar aminoacidos, de forma que seja expressa uma proteina nao funcional ou enzimaticamente menos ativa. Alem disso, a expressao de GFOR pode ser bloqueada pela expressao de um RNA sem sentido ou um RNA interferente e podem ser introduzidas construgoes que resultam em cossupressao. Todos esses metodos podem ser facilmente praticados pelos tecnicos no assunto, utilizando a sequencia conhecida que codifica a enzima GFOR (SEQ ID N° 38). Sequencias de DNA que rodeiam a sequencia de codificagao de GFOR tambem sao Citeis em alguns procedimentos de modificagao e sao disponiveis para Z mobilis na sequencia de genoma completa (Acesso GenBank n° AE008692).

Um metodo particularmente apropriado de criagao de uma Iinhagem de GFOR geneticamente modificada, conforme exemplificado no

presente nos Exemplos 3 e 5’ e a utilizagao de recombinagao homologa mediada por sequencias de DNA laterals de GFOR que unem um gene de resistencia a espectinomicina ou outro marcador selecionavel, gerando a inser9ao do marcador selecionavel na regiao de codificagao de GFOR de tal forma que uma enzima GFOR funcional nao seja expressa. AI6m disso, ο marcador selecionavel pode ser unido por Iocais de recombinagSo especificos de locais, de tal forma que, apos a expressao da recombinase especifica de Iocais correspondente, ο gene de resistencia e extirpado do gene GFOR sem reativar este Ciltimo. A recombinagao especifica de local deixa para tras um local de recombina^ao que rompe a expressao da enzima GFOR. O vetor de recombina^ao homologo pode ser construido para tambem deixar uma exclusao no gene GFOR apos a extirpagao do marcador selecionavel, como e bem conhecido dos tecnicos no assunto.

Prefere-se eliminar completamente a expressao de GFOR, mas a expressao grandemente reduzida de GFOR tambem e uma realizagao da presente inven?ao. Neste caso, um gene GFOR nao funcional designa ο nao funcionamento da forma normal, de tal forma que niveis abaixo do normal de enzima GFOR estejam presentes. Alguns metodos de desativapao genetica podem resultar em alguma expressao de baixo nivel remanescente, tal como cossupressao. No presente, Iinhagem de GFOR modificada designa uma Iinhagem geneticamente modificada com atividade de enzima GFOR reduzida ou inexistente.

Crescimento ε producao de etanol por linhagem modificada de GFOR

Uma linhagem de Zymomo门as que utiliza xilose modificada por GFOR utilizada no processo do presente e cultivada em um meio que contem xilose na ausencia ou presenga de outros apiicares ("apCicares misturados"). Os agCicares misturados incluem pelo menos um aguicar adicional a xilose. Qualquer agiicar que possa fornecer uma fonte de energia para ο metabolismo

das celulas de Zymomonas ou qualquer agiicar que esteja presente em uma mistura que contem xilose pode ser incluido. έ desejavel cultivar c^lulas de Z mobilis que utilizam xilose modificadas por GFOR sob re agiicares que sejam produzidos a partir da sacarificapao de biomassa. Tipicamente, a biomassa e previamente tratada, tal como conforme descrito no Pedido de Patente n0 WO 2004/081185 e no Pedido de Patente Norteamericano copendente e de propriedade comum n° 60/670437, e tratada em seguida com enzimas de sacarificag§o, conforme analisado em Lynd, L. R. et al (Microbiol. Moi Biol. Rev. (2002) 66:506-577). Sacarificagao de biomassa produz a?Cicares que podem incluir tipicamente uma mistura de xilose com glicose, frutose, sacarose, galactose, manose e/ou arabinose. E preferida uma composigao de agCicares misturados que inclui xilose e glicose, na qual podem estar presentes agiicares adicionais.

A razao entre diferentes a^Cicares pode variar na mistura, com xilose tipicamente em pelo menos cerca de 10% da quantidade total de agijcares. Preferencialmente1 xilose e de cerca de 40% a cerca de 60%. Frutose esta presente em agiicares produzidos por meio da sacarificagao de alguma biomassa tal como bagago de cana de agCicar e pode substituir uma parte de xilose ou glicose, de tal forma que xilose permanega em pelo menos cerca de 10% da mistura de agCicares. Alem disso, arabinose έ derivada de hemicelulose e, portanto, e um componente tipico de agCicares misturados derivados de biomassa sacarificada que contem hemicelulose.

Sob condigoes de fermentagao em que xilitol nao seria produzido por uma Iinhagem de Z mobilis que utiliza xilose que nao seja uma Iinhagem modificada por GFOR1 Iinhagens de Z mobilis que utilizam xilose modificada por GFOR de acordo com a presente inven^ao crescem e produzem etanol comparativamente com Iinhagens nao modificadas por GFOR. Em meio com baixo teor de agCicar, por exemplo, tal como cerca de 100 g/l de agiicares

misturados com uma razao 5:4 entre glicose e xilose, as celulas de Z mobilis que utilizam xilose modificadas por GFOR apresentam desempenho similar a Iinhagens nao modificadas por GFOR.

Para maxima produ^ao de etanol e eficiencia de fermentagao, e desejavel cultivar um etanologenico que utilize xilose em um meio que contem altos niveis de aciicares, incluindo xilose. Os a^iicares misturados podem ser empregados em uma alta concentra^ao no meio para ο creseimento das Iinhagens de Z. mobilis de acordo com a presente invengao. Isso permite ο uso direto de agCicares de sacarifica^ao de biomassa ou uso com pouca diluigao, de forma a reduzir os volumes de fermentagao, ο que e desejavel para a produgao de etanol em escala comercial. Sao utilizadas aItas concentragoes de agiicar, de forma que possam ser produzidas concentragoes mais aItas de etanol. A concentra^ao de agiicares misturados no meio de fermentagao e de tipicamente pelo menos cerca de 120 g/l e ate cerca de 300 g/l. E particularmente util uma alta concentragao de agiicares misturados que seja de cerca de 150 g/l a cerca de 235 g/l.

Nas condigoes de agiicares misturados sob alta concentra^ao desejadas para a produgao de etanol, sorbitol e incluido no meio de fermentagao para ο Ζ. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR. Os depositantes descobriram surpreendentemente que a adigao de sorbitol ao meio com alto teor de agCicares misturados permitiu bom crescimento de Z mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR1 enquanto sem a inclusao de sorbitol ο Ζ. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR exibiu pouco ou nenhum crescimento. Isso ocorre em notavel contraste com Iinhagens produtoras de GFOR que sao capazes de adaptar-se a mistura de agiicar concentrada sem adigao de sorbitol apos um periodo de demora de 12 a 36 horas. Em meio que nao contem frutose nem sacarose (como fonte de frutose), nao se esperava que GFOR sintetizasse sorbitol ou desempenhasse um papel

na adaptagao osmotica. Sem a presenga de frutose no meio de crescimento, a . 27 reagao conhecida de GFOR para sintese de sorbitol, exibida no Diagrama I’ nao pode processar-se. A capacidade de Iinhagens de Z. mobilis que utiliza xilose com atividade de enzima GFOR normal para crescimento em uma mistura concentrada de glicose e xilose, embora com um Iongo periodo de espera, sugeriu que a sintese de sorbitol por GFOR nao era necessaria para adaptagao osmotica, pois sem frutose nao se esperaria que GFOR sintetizasse sorbitol. Desta forma, nao se esperava que a elimina^ao da atividade de enzima GFOR apresentasse efeito sobre ο nivel de produgao de sorbitol em meio de crescimento sem frutose e a necessidade de sorbitol para crescimento da Iinhagem de Z mobilis que utiliza xilose modificada por GFOR em misturas concentradas de glicose e xilose era completamente inesperada.

Sorbitol (D-sorbitol e/ou L-sorbitol) pode estar presente no meio em concentra^oes que sao de cerca de 2 mM a 200 mM. Concentragoes finais mais apropriadas no meio sao concentrates de cerca de 2 mM a 100 mM, em que sao preferidas concentragoes de 5 mM a 20 mM. Manitol pode ser utilizado no meio no Iugar de sorbitol, ou em combinagao com sorbitol. Descobriu-se que manitol possui efeitos similares aos de sorbitol no Pedido de Patente Norteamericano copendente e de propriedade comum n0 60/847.997, que e incorporado ao presente como referencia. Alem disso, descobriu-se que galactilol e/ou ribitol podem ser utilizados no Iugar de sorbitol e/ou manitol, ou em combina^ao com estes. Sorbitol, manitol, galactilol, ribitol ou suas combinagoes sao todos utilizados nas mesmas concentragoes descritas para sorbitol.

Sob condigoes de fermentaq;ao em que xilitol seria produzido por uma Iinhagem de Z. mobilis que utiliza xilose que nao e uma Iinhagem modificada por GFOR1 tal como em meio com alto teor de agiicar na presenga ou ausencia de inibidores tais como acetato, Iinhagens de Z. mobilis que utilizam xilose modificadas por GFOR de acordo com a presente invengao superam ο desempenho de Iinhagens nao modificadas por GFOR. Os depositantes descobriram que a quantidade total de xilose que e consumida e ο titulo final de etanol sao maiores para uma Iinhagem modificada por GFOR que uma Iinhagem nao modificada. Alem disso, nenhum xilitol foi produzido em fermentagoes por Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR sob condigoes relevantes do processo, embora pequenas quantidades pudessem ser sintetizadas por um mecanismo nao de GFOR sob certas circunstancias, conforme exibido no Exemplo 6 do presente.

O aumento da utilizagao de xilose e produgao de etanol varia sob diferentes condig5es de fermentagao. Sob condigoes em que e produzido um nivel mais alto de xilitol por uma Iinhagem de Z. mobilis que utiliza xilose nao modificada por GFOR, a falta de sintese de xilitol gera um efeito maior da mutagao de GFOR. Quando um inibidor tal como acetato estiver presente no meio, por exemplo, quantidades maiores de xilitol sao produzidas por Iinhagens nao modificadas por GFOR. Esta produgao de xilitol e completamente eliminada pela mutagao de GFOR, ο que permite um aumento maior da utilizagao de xilose e produgao de etanol que em condigoes em que teriam sido produzidas baixas quantidades de xilitol sem a mutagao de GFOR. Como acetato esta tipicamerite presente em biomassa celulosica tratada, redugao da sensibilidade a acetato e desejavel em um etanologenico a ser cultivado sobre fontes de carbono derivadas de biomassa celulosica tratada. Desta forma, a fermentagao empregando uma Iinhagem de Z. mobilis que utiliza xilose modificada por GFOR e particularmente benefica ao utilizar-se hidrolisado de

biomassa na fermentagao. Fermentacao para producao de etanol

Para a produgao de etanol, Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR recombinante e colocado em contato com meio que contem agiicares misturados que incluem xilose. Quando a concentragao de agiicares misturados for alta a ponto de inibir ο crescimento, ο meio inclui sorbitol, manitol ou uma de suas misturas. Galactilol ou ribitol podem substituir sorbitol ou manitol, ou ser combinados com eles. Z. mobilis cresce no meio em que ocorre a fermentagao e e produzido etanol. A fermenta^ao e conduzida sem a suplementapao de ar, oxigenio ou outros gases (que podem incluir condigaes tais como fermentagao anaerobica, microaerobica ou microaerofilica) por pelo menos cerca de 24 horas e pode ser conduzida por trinta horas ou mais. O tempo para atingir a produgao maxima de etanol e variavel, dependendo das condigoes de fermentagao. Tipicamente1 caso estejam presentes inibidores no meio, e necessario um periodo de fermentagao mais longo. As fermentagoes podem ser conduzidas sob temperaturas de cerca de 30 0C a cerca de 37 °C, sob pH de cerca de 4,5 a cerca de 7,5.

O Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR pode ser cultivado em meio que contem agiicares misturados que incluem xilose em fermentadores em escala de Iaboratorio e em fermentagao em escalas maiores, onde sao produzidas quantidades comerciais de etanol. Ao desejar-se a produgao comercial de etanol, pode-se aplicar uma serie de metodologias de cultivo. A produgao em Iarga escala a partir de Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR1 por exemplo, pode ser atingida por meio de metodologias de bateladas e cultivo continuo. Um metodo de cultivo por bateladas classico e um sistema fechado em que a composigao do meio e definida no inicio do cultivo e nao submetida a alteragoes artificiais durante ο processo de cultivo. Desta forma, no inicio do processo de cultivo, ο meio e inoculado com ο organismo desejado e permite-se a ocorrencia de crescimento ou atividade metabolica sem adicionar nada ao sistema. Tipicamente, entretanto, um cultivo de "bateladas" e em bateladas com rela^ao a adi?ao de fonte de carbono e frequentemente sao reaIizadas tentativas de controle de fatores tais como pH e a concentragao de oxigenio. Em sistemas em bateladas, as composi9oes de biomassa e de metaboIitos do sistema alteram-se constantemente ate ο momento do termino do cuItivo. Em cultivos em bateladas, as celulas sao moderadas ao Iongo de uma fase de demora estatica ate uma fase de registro de alto crescimento e, por fim, ate uma fase estacionaria na quai a velocidade de crescimento e reduzida ou suspensa. Caso nao sejam tratadas, as celulas na fase estacionaria eventualmente morrerao. As celulas na fase de registro sao frequentemente responsaveis pelo grande volume de elabora?ao de produto final ou intermediario em alguns sistemas. A produ?ao em fase p0s-exponencial ou estacionaria pode ser obtida

em outros sistemas.

Uma varia^ao do sistema de bateladas padrao e ο sistema de

Bateladas Alimentadas. Processos de cultivo de Bateladas Alimentadas tambem sao apropriados para ο crescimento de Z. mobilis que utiliza xilose modificado por GFOR e compreendem um sistema de bateladas tipico, com excegao da adigao do substrato em parcelas a medida que ο cultivo progride. Os sistemas de Bateladas Alimentadas sao Citeis quando a repressao de catabolitos estiver apta a inibir ο metabolismo das celulas e for desejavel ter quantidades Iimitadas de substrato no meio. A medi9§o da concentra?ao real de substratos em sistemas de Bateladas Alimentadas e dificil e, portanto, estimada com base nas alteragoes de fatores mensuraveis tais como pH e a pressao parcial de gases residuais tais como CO2. Metodos de cultivo em bateladas e bateladas alimentadas sao comuns e bem conhecidos na tecnica e exemplos podem ser encontrados em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger e Brock, segunda edigao (1989)， Sinauer Associates, Inc., Sunderland MA, ou Deshpande, Mukund V., App/. Biochem. Biotechnol., 36, 227 (1992)，incorporados ao presente como referencia.

A produgao comercial de etanol pode tambem ser realizada com um cultivo continuo. Os cultivos continuos sao sistemas abertos em que um meio de cultivo definido e adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado e removida simultaneamente para processamento. Os cultivos continuos geralmente mantem as celulas em uma alta densidade de fase Iiquida constante em que as celulas encontram-se principalmente em crescimento de fase de registro. Alternativamente, ο cultivo continuo pode ser praticado com celulas imobilizadas, em que carbono e ηutrientes s§o adicionados continuamente, e produtos valiosos, subprodutos ou produtos residuais sao removidos continuamente da massa celular. A imobilizagao celular pode ser realizada utilizando uma ampla variedade de suportes solidos compostos de materials naturais e/ou sinteticos, como sabem

os tecnicos no assunto.

Cultivo continuo ou semicontinuo permite a modula^ao de um fator ou qualquer quantidade de fatores que afetam ο crescimento celular ou a concentragao de produto final. Um metodo mantera, por exemplo, um nutriente limitador tai como a fonte de carbono ou ο nivel de nitrogenio em uma velocidade fixa e permitira a modera^ao de todos os demais parametros. Em outros sistemas, pode-se alterar continuamente uma serie de fatores que afetam ο crescimento enquanto a concentra?ao celular, medida pela turvagao do meio, e mantida constante. Sistemas continuos Iutam para manter as condigoes de crescimento em estado estavel e, desta forma, a perda celular devido a retirada do meio deve ser equilibrada contra a velocidade de crescimento celular no cultivo. Metodos de modulagao de nutrientes e fatores de crescimento para processos de cultivo continuos, bem como metodos de maximizagao da velocidade de formagao de produtos, sao bem conhecidos na tecnica de microbiologia industrial e uma serie de metodos e detalhada por Brock, acima.

έ particularmente apropriado para a produgao de etanol um

regime de fermentagao conforme segue. A Iinhagem de Z. mobilis que utiliza xilose modificada por GFOR desejada e cultivada em frascos de agita^ao em meio semicomplexo a cerca de 30 0C at6 cerca de 37 0C com agita^ao a cerca de 150 rpm em agitadores orbitais e transferida em seguida para um fermentador de sementes de dez Iitros contendo meio similar. O cultivo de sementes e realized ο no fermentador de sementes de forma anaerobica ate que OD6OO seja de 3 a 6, quando e transferido para ο fermentador de produgao em que os parametros de fermentagao sao otimizados para a produgao de etanol. Os volumes de inoculado tipicos transferidos do tanque de sementes para ο tanque de produ^ao variam de cerca de 2% a cerca de 20% v/v. Meio de fermentapao tipico contem componentes de meio minimos tais como fosfato de potassio (1,0 a 10,0 g/l), sulfato de amonio (O a 2,0 g/l), suIfato de magnesio (O a 5,0 g/l), uma fonte de nitrogenio com ρ Iexa tal como extrato de Ievedura ou ρ rod utos com base em soja (O a 10 g/l). Uma concentragao final de cerca de 5 mM de sorbitol ou manitol esta presente no meio. Agijcares misturados que incluem xilose e pelo menos um agiicar adicional tal como glicose (ou sacarose), fornecendo uma fonte de carbono, sao adicionados continuamente ao recipiente de fermentagao mediante esgotamento da fonte de carbono em bateladas inicial (50 a 200 g/l) para maximizar ο titulo e a taxa de etanol. As velocidades de alimentagao de fontes de carbono sao ajustadas dinamicamente para garantir que ο cultivo nao esteja acumulando glicose em excesso, ο que poderia gerar aciimulo de subprodutos toxicos tais como acido acetico. A fim de maximizar ο rendimento de etanol produzido a partir de substrato utilizado, ο crescimento de biomassa e restringido pela quantidade de fosfato que e colocada em bateladas iniciais ou que e alimentada no transcurso da fermentagao. A fermentagao e controlada sob pH 5,0 a 6,0 utilizando solugao caustica (tal como hidroxido de amonio, hidroxido de potassio ou hidroxido de sodio) e acido sulfCirico ou fosforico. A temperatura do fermentador

e controlada a 30 0C ate 35 0C. A fim de maximizar a formagao de espuma, agentes antiespumantes (qualquer classe; com base em silicone, com base organica etc.) sao adicionados ao recipiente conforme ο necessario. Um antibiotico, para ο qual existe um marcador resistente a antibioticos na linhagem, tal como canamicina, pode ser opcionalmente utilizado para minimizar a contamina^ao.

Qualquer conjunto de condigoes descritas no presente e, adicionalmente, variagoes dessas condigoes que sao bem conhecidas dos tecnicos no assunto sao condi?oes apropriadas de produ^ao de etanol por uma

Exemplos

A presente inven^ao e adicionalmente definida nos Exemplos a seguir. Dever-se-a compreender que estes Exemplos, embora indiquem realizag5es preferidas da presente invengao, sao fornecidos apenas como forma de ilustra^ao. A partir da discussao acima e destes Exemplos, os tecnicos no assunto podem determinar as caracteristicas essenciais da presente inven^ao e, sem abandonar ο seu espirito e escopo, podem reaIizar varias alteragaes e modificagoes da presente invengao para adapta-la aos varios usos e condigoes.

Metodos gerais

Os metodos de clonagem molecular e DNA recombinante padrao

utilizados no presente sao bem conhecidos na tecnica e descritos por Sambrook, J., Fritsch1 E. F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edigao, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989) (a seguir, "Maniatis"); e por Silhavy, T. J., Bennan, M. L. e Enquist, L. W·, Experiments with Gene Fusions; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1984); e por Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, publicado pela Greene Publishing Assoc. e

Wiley-Interscience1 Hoboken NJ (1987). O significado das abreviag5es e ο seguinte: "kb" indica quilobase(s), "bp" indica pares de bases, "nt" indica nucleotideo(s), "h" indica hora(s), "min" indica minuto(s), "seg" indica segundo(s), "d" indica dia(s), "I" indica litro(s), "ml" indica mililitro(s), "μΙ" indica microlitro(s), "Mg" indica micrograma(s), "ng" indica nanograma(s), "mM" indica milimolar, "μΜ" indica micromolar, "nm" indica nanometro(s), ‘‘μηιοΓ' indica micromol(es), "pmol" indica picomol(es), "Cm" indica cloranfenicol, "Cmr" indica resistente a cloranfenicol, "Cms" indica sensivel a cloranfenicol, "Spr" indica resistencia a espectinomicina, "Sps" indica sensivel a espectinomicina, "XI" e xilose isomerase, "XK" e xiluloquinase, "TAL" e transaldolase, "TKT" e transquetolase, "EFT" indica tempo de fermentagao decorrido, "RM" indica meio rico que contem 10 g/l de extrato de Ievedura mais 2 g/l de KH2PO4, "MM" indica meio de acasalamento que contem 10 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4 e 0,2 g/l de KH2PO4. Preparacao de extratos livres de celulas de Zymomonas para testes

enzimaticos

Celulas foram cuItivadas em 50 ml de RM + 2% de glicose a 30 0C por uma noite ate OD600 de 1,0 a 1,2. As celulas foram colhidas por meio de centrifugagao a 4500 rpm por dez minutos a 4 0C. O sobrenadante foi descartado e a pelota celular foi Iavada com 25 ml de tampao de sonicagao resfriado com gelo (10 mM de Tris, pH 7,6, 10 mM de MgCI2), seguida por centrifugagao a 4500 rpm por dez minutos. A pelota foi novamente suspensa em 2,0 a 2,5 ml de tampao de sonicapao mais 1 mM de ditiotreitol. Uma parcela de 500 μΙ foi centrifugada por um minuto em uma centrifuga Eppendorf a 4 0C. A maior parte do sobrenadante foi descartada, deixando cerca de 10 a 20 μΙ para tras para evitar a secagem da pelota. As celulas foram congeladas e armazenadas a -80 0C ate ο teste. Antes do teste, as celulas foram

descongeladas e novamente suspenses com 500 μΙ de tampao de sonica9§o mais 1 mM de ditiotreitol. A mistura foi sonicada por duas vezes por 45 segundos em ciclo de trabalho de 62% e um controle de saida de 2 utilizando um sonificador Branson 450’ mantendo as amostras em resfriamento por cerca de tres a cinco minutos entre as sonica^oes. Amostras foram centrifugadas a 14.000 rpm por sessenta minutos em um microcentrifugador Beckman a 4 0C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e mantido a 4 0C. O teste BCA Pierce foi utilizado para determinar concentra9oes de proteina.

0 teste de transquetolase (TKT) foi normalmente realizado em primeiro lugar, pois esta enzima e mais instavel que as demais. Um diagrama

a do teste de TKT e exibido na Figura 3A.

Em um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato Iivre de celulas foram adicionados a cad a recipiente em uma mistura de reagao, a 30 0C1 que incluiu as concentrates finais de componentes a seguir: 0,37 mM de NADP, 50 mM de TrisHCI1 pH 7,5, 8,4 mM de MgCI2, 0,1 mM de TPP (pirofosfato cloreto de tiamina), 0,6 mM de E4P (4-fosfato de eritrose), 4 mM de BHP (beta- hidroxipiruvato), 4 U/ml de PGI (fosfoglicose isomerase) e 4 U/ml de G6PD (6- fosfato de glicose desidrogenase). A340 foi lido sob re um Ieitor de placas por tres a cinco minutos. A atividade de TKT foi calculada conforme segue:

1 unidade corresponde a formagao de 1 μηιοΙ de 6-fosfato de D- frutose/min a 30 0C.

U (mol/min) = inclinagao (d/\340/min) * volume de reagao (μΙ) / 6220 I 0,55 cm

(moles de NADP — NADPH e 6220 A340 por mol por Iitro em uma cu beta de 1 cm)

(comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

0,55 cm)

Atividade especifica (pmol/min-mg) = pmol/min/concentragao de

proteina (mg) A base do teste de transaldolase (TAL) e exibida na Figura 3B. Em um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato Iivre de celulas foram adicionados a cada recipiente em uma mistura de rea?ao, a 30 0C, que incluiu as concentragoes finais de componentes a seguir: 0,38 mM de NADH1 87 mM de trietanolamina, 17 mM de EDTA1 33 mM de F6P (6-fosfato de frutose), 1,2 mM de E4P (4-fosfato de eritrose), 2,0 U/ml de GDH (3-fosfato de glicerol desidrogenase) e 20 U/ml de TPI (fosfato de triose isomerase). A placa foi incubada por cinco minutos e, em seguida, A340 foi lido por tres a cinco minutos. A atividade de TAL foi calculada conforme segue: 1 unidade corresponde a formagao de 1 μηιοΙ de D-gliceraldeido por minuto a 30 0C.

U (mol/min) = inclinagao (dA34o/min) * volume de reagao (μΙ) /

6220 / 0,55 cm

(moles de NADH — NAD e 6220 A340 por mol por Iitro em uma cu beta de 1 cm)

(comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

0,55 cm)

Atividade especifica (pmol/min-mg) = pmol/min/proteina A base do teste de xilose isomerase (XI) e exibida na Figura 3C. Em um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato Iivre de celulas foram adicionados a cada recipiente em uma mistura de reagao, a 30 0C1 que incluiu as concentrates finais de componentes a seguir: 0,256 mM de NADH, 50 mM de xilose, 10 mM de MgSO4, 10 mM de trietanolamina e 1 U/ml de SDH (sorbitol desidrogenase). A340 foi lido sobre um Ieitor de placas por tres a cinco minutos. A atividade de Xl foi calculada conforme segue: 1 unidade de Xl corresponde a formagao de 1 pmol de D-xilulose por minuto a 30 0C.

U (mol/min) = inclinagao (dA340/min) * volume de reagao (μΙ) /

6220 / 0,55 cm

(moles de NADHP — NAD e 6220 A340 por mol por Iitro em uma cubeta de 1 cm)

(comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

0,55 cm)

Atividade especifica (pmol/min-mg) = pmol/min/concentra^ao de

proteina (mg)

A base do teste de xiluloquinase (XK) e exibida na Figura 3D.

Em um teste de microplacas, 20 μΙ de extrato Iivre de celulas foram adicionados a cad a cavidade em uma mistura de reagao, a 30 0C1 que incluiu as concentragoes finais de componentes a seguir: 0,2 mM de NADH1 50 mM de Tris HCI1 pH 7,5, 2,0 mm de MgCI2-6H20, 2,0 M de ATP, 0,2 M de PEP (fosfoenolpiruvato), 8,5 mM de D-xilulose, 5 U/ml de PK (piruvato quinase) e 5 U/ml de LDH (lactato desidrogenase). A340 foi lido sobre um Ieitor de placas por tres a cinco minutos. A atividade de Xl foi calculada conforme segue:

1 unidade corresponde a forma^ad de 1 pmol de D-xilulose em 5- fosfato de D-xilulose por minuto a 30 0C.

U (mol/min) = inclina^ao (dA340/min) * volume de reagao (μΙ) / cm

(moles de NADH — NAD e 6220 A340 por mol por Iitro em uma cm)

(comprimento de trajeto de 200 μΙ por cavidade em microplaca =

Atividade especifica (mol/min-mg) = pmol/min/concentragao de proteina (mg)

Metodo HPLC

A analise foi realizada com um HPLC serie Aligent 1100 e

software Agilent ChemStation para LC 3D. A coluna foi BioRad Aminex HPX- 87H (Coluna de Analise Organica HPLC 125-0140) com Cation de Cartucho

6220 / 0,55 cu beta de 1

20

0,55 cm)

BioRad Micro-Guard H (125-0129). As condi^oes de opera^ao foram: Fluxo: 0,6 ml/min.

Solvente: 0,01 N de H2SO4.

Tempo de parada: 25 minutos

Volume de injegao: 5 μΙ· Autoamostrador: temperatura controlada a 10 0C ou 4 0C.

Temperatura da coluna: 55 0C-

Detector: indice de refragao (40 0C) com curvas de calibragem padrao externas.

Exemplo 1

construcao de ZW658. uma llnhagem de ZYMOMONAS MOBIUS de

Fermentacao de Xilose

ZW658 foi construido por meio da integragao de dois operadores, PgapXyIAB e Pgaptaltkt, que contem quatro genes que utilizam xilose codificadores de xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquelotase, no genoma de ZW1 (ATCC n° 31821) por meio de eventos de transposigao sequenciais, seguido pela adaptagao sobre meios seletivos que contem xilose. Anteriormente1 foi construida uma Iinhagem de Zymomonas mobilis de fermentagao de xilose denominada 8b, conforme descrito no Pedido de Patente Norteamericano n0 20030162271’ por meio de integra^ao dos dois operadores PgapxylAxylB e Pen。taltkt, junto com marcadores antibioticos selecionaveis, no genoma de Zymomonas mobilis 5C por meio de uma combinagao de abordagens de recombinagao homologa e transpossons seguida por adaptagao e mutagenese de NTG. Na preparagao de ZW658, foi utiiizada a transposipao (sistema de transposigao in vitro EZ::Tn da Epicentre), ao contrario de recombinagao homologa especifica de locais, pois essa abordagem oferece as vantagens de diversas escolhas de locais de integragao e frequencia de insergoes relativamente alta. Os quatro genes que codificam as enzimas de utilizagao de xilose foram dispostas e clonadas na forma de dois operadores separados: PgapXyIAB e Paf^taltkt para a integra^ao. Um marcador de resistencia a antibioticos, um gene de resistencia a cloranfenicol (Cmr) Iadeado por duas sequencias de reconhecimento de Cre-recombinase fago P1 (IoxP), foi Iigado a cada operador para a selegao de integrantes. A integra^ao dos dois operadores foi realizada de uma forma sequencial em duas etapas: Pgaptaltkt seguido por PgapxylAB. A selegao da resistencia de Cm foi utilizada nos dois eventos de integragao, pois foi removida por meio da expressao de uma Cre recombinase sobre um plasmideo seguida por cura do plasmideo apos cada integragao. Este processo permitiu a utilizagao do mesmo marcador de antibiotico para diversos tempos de selegao. De forma mais importante, ele permitiu a remogao do marcador antibiotico introduzido para selegao da integragao dos operadores. Este processo eliminou ο impacto negative* de gene(s) de resistencia a antibioticos sobre a Iinhagem de fermentapao para uso comercial.

Construcao de ρΜΟΡΡ^ρΓ^γκτΟμ para transposicao

Conforme descrito no Pedido de Patente Norteamericano n0 20030162271 (Exemplo 9), um fragmento de DNA de 2,2 kb que contem a regiao de codificagao de transquetolase (tkt) de E. coli foi isolado de pUCtaltkt (Pedido de Patente Norteamericano n0 20030162271) por meio de digestao de Bglll/Xbal e clonado em um vetor pMOD (Epicentre Biotechnologies, Madison Wl) digerido com BamHI/Xbal, ο que resulta em pMODtkt. Um fragmento de PCR denominado Pgaptal foi gerado por meio da fusao da regiao promotora do gene gap de Zymomonas mobilis (Pgap； 3-fosfato de g Iiceraldeido desidrogenase) a regiao de codificagao de transaldolase (tal) de E. coli conforme segue. Um fragmento de Pgap foi amplificado a partir de pZB4, cuja constru?ao e descrita em US 5.514.583 (Exemplo 3)，utilizando primers com SEQ ID N0 1 e 2. pZB4 contem um operador Pgap-xylA/xy旧 e um operador ΡεΝο-tal/tkt. Um fragmento de regiao de codificagao tal foi amplificado a partir de pZB4 utilizando primers com SEQ ID N0 3 e 4. Um fragmento de Pgaptal foi amplificado utilizando os fragmentos Pgap e tal como modelo empregando primers com SEQ ID N0 5 e 6. Este fragmento foi digerido com Xbal e clonado no plasmideo pMODf/cf, acima no fluxo da regiao de codifica9§o tkt. Um fragmento de /oxP::Cm foi gerado por meio de PCR utilizando primers Cmlox(F, sfi) e Cmlox(R, sfi) (SEQ ID N0 7 e 8) e pZB186 como modelo. pZB186 e uma combinagao de um plasmideo de Z. mobilis nativo e pACYC184, descrito em US 5.514.583 (Exemplo 3) e Zhang et al ((1995) Science 267: 240-243). Por fim, ο fragmento de PCR /oxP::Cm foi inserido no local Sfil do plasmideo que contem Pgaptaltkt para formar ο plasmideo integrante pMODPgapia/i/(iCm (Figura 4). Neste plasmideo, ο fragmento de Pgaptaltkt /oxP::Cm foi inserido entre duas extremidades de mosaico (locais de uniao de transposase) no vetor pMOD. A sequencia de nucleotideos completa para ο plasmideo pMODPgapia/f/ciCm e

fornecida como SEQ ID N0 9. Transposicao ε transformacao de pMODP^taltktCm em ZW1

O plasmideo pMOD e um vetor com base em pUC e, portanto, e um vetor nao reprodutivo em Zymomonas. O plasmideo pMODPgaptaltktCrr\ foi tratado com transposase na presenga de Mg2+ a temperatura ambiente por uma hora e utilizado para transformar celulas ZW1 por meio de eletroporagao (utilizando um Pulsionador de Genes BioRad definido em 200 ohms, 25 pF e 16 kV/cm). Celulas eletroporadas foram incubadas em um meio de acasalamento (MM) que consiste de 10 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de K2HPO4) suplementado com 50 g/l de glicose e 1 mM de MgSO4 por seis horas a 30 0C. A mistura de transformagao foi colocada em placas sobre placas Agar contendo 15 g/l de Agar Bacto em MM suplementado com 50 g/l de glicose e 120 pg/ml de cloranfenicol e incubada anaerobicamente a 30 0C. Os transformadores foram visiveis apos cerca de dois dias. A frequencia de transformagao e transposigao foi de cerca de 3 χ IO1^g de DNA. Foi obtido um total de 39 colonias de transformadores Cmr. Vinte e uma colonias foram tomadas e adicionalmente analisadas por meio de PCR e testes de atividade enzimatica. PCR utilizando os primers SEQ ID N0 10 e 11 confirmou a presenga de um fragmento de DNA de 3 kb que cont^m regioes de codificagao tal e tkt nos transformadores. Transformagao reversa com DNA de plasmideo das 21 colonias integrantes nao gerou transformadores reversos em E. coli, ο que sugere que ο tal e tkt foram integrados ao genoma de ZW1. Estes integrantes foram testados para determinar as atividades de transaldolase e transquetolase utilizando protocolos modificados para microplacas (Metodos Gerais). O teste de proteinas BCA Pierce foi utilizado para a determinagao de concentrates de proteinas. Os transformadores foram cultivados em meio RM contendo 2% (p/v) de glicose suplementado com 120 Mg/ml de cloranfenicol em 50 ml de tubos centrifugos conicos a 30 0C. As Iinhagens de controle 8b e ZW1 tambem foram cultivadas (RM + 2% glicose foi utilizado para ZW1) para testes enzimaticos. Foram colhidas celulas quando OD600 atingiu 1,0. As c6lulas foram Iavadas uma vez e novamente suspensas em tampao de sonica^ao (10 mM de Tris-HCI, pH 7,6 e 10 mM de MgCI2). Foram conduzidos testes enzimaticos conforme descrito no Pedido de Patente Norteamericano n0 20030162271. As unidades sao fornecidas como mol/min-mg. Todas as amostras apresentaram atividades de transaldolase e transquetolase, exceto uma.

Hibridizagao Southern foi realizada sobre DNA de plasmideo e genomico de integrantes selecionados digeridos com Pstl utilizando uma sonda tkt. DNA de ZW1 nao se hibridizou com a sonda tkt. Uma faixa de 1,5 kb comum era visivel em tod as as amostras de DNA genomico integrantes, que e ο fragmento de DNA esperado entre um local Pstl em tkt e um local Pstl em tal. Uma segunda faixa com alto peso molecular (6 kb ou mais) visivel era Cinica entre as Iinhas independentes T2, T3, T4 e T5, ο que indica um local de integragao genomico separado em cad a linha. De forma interessante, DNA genomico e de plasmideo de T5 hibridizaram-se com a sonda tkt, ο que indica que era provavel que Pgaptaltkt tamb6m era integrado em T5 sobre ο plasmideo nativo. Estas quatro Iinhagens (T2, T3, T4 e T5) foram selecionadas para tratamento de Cre adicional para remogao do marcador Cmr. Tratamento de Cre para remover marcador Cmr de integrantes taltkt

Para remover ο marcador Cmr do cromossomo, T2, T3, T4 e T5 foram transformados com pZB188/Spec-Cre. Este plasmideo e um derivado do vetor impulsionador de Zymomo门as-E. coli pZB188 (Zhang et al (1995), Science 267: 240-243; US 5.514.583) que contem um conjunto de expressao para Cre Recombinase. pZB188/Spec-Cre e identico ao vetor de Expressao de Cre que e descrito no Exemplo 10 (pZB188/Kan-Cre), exceto pelo fato de que e um gene de resistencia a espectinomicina em vez de um gene de resistencia a canamicina. Os transformadores foram selecionados sobre placas Agar MM suplementadas com 2% de glicose e 200 μρ/ιπΙ de espectinomicina). As colonias resistentes a Spr foram tomadas sobre placas Agar RM suplementadas com 2% de glicose e 200 pg/ml de espectinomicina e placas Agar RM suplementadas com 2% de glicose e 120 Mg/ml de Cm. Cem por cento das colonias tomadas eram Cms, ο que indica a extirpagao com alta eficiencia de Cmr por Cre. Os transformadores SprCms foram cultivados em RM mais 2% de glicose a 37 0C para duas a cinco transferencias diarias para curar pZB188aadACreF. Em cada transferencia, as celulas foram diluidas e colocadas em placas sobre placas Agar RM mais 2% glicose para tomada sobre placas adicionais do mesmo meio com ou sem 200 Mg/ml de Sp. Colonias de Sps foram analisadas por meio de PCR para confirmar a perda de pZB188aadACreF. Os descendentes curados por plasmideo dos integrantes foram denominados T2C, T3C, T4C e T5C. Para examinar se esses integrantes de transposigao eram estaveis, estas quatro Iinhagens foram cultivadas em RM + 2% glicose e transferidas em seguida para 10 ml do mesmo meio e cultivadas a 37 0C em tubos de ensaio em duplicata. As celulas foram transferidas diariamente por dez dias ou cerca de cem gerases. As colonias foram diluidas e colocadas em placas sobre placas RMG para isolamento de colonias apos a primeira e d^cima transferencias. Doze colonias de cada transferencia de cada Iinhagem apresentaram resultados de teste positivos para a preser^a de Pgaptaltkt por meio de PCR de colonia utilizando primers 5' Pgap e 3' tkt (SEQ ID N0 1 e 11). Atividades de transaldolase e transquetolase tambem foram medidas para determinar isolados apos as primeira e decima transferencias (conforme descrito em Metodos Gerais). Todos os quatro integrantes continham niveis similares de atividades de TAL e TKT apos cem geragoes sobre ο meio nao seletivo, ο que sugere que estes integrantes eram geneticamente estaveis.

Construcao de pMODP^pXylABCm para transposicAo A etapa seguinte foi a integra^ao adicional do operador PgapXyIAB /oxP::Cm nos integrantes ZW1::Pgaptaltkt (T2C, T3C, T4C e T5C). O plasmideo integrante pMODPgapxy/ABCm (Figura 5) foi construido com base no plasmideo pMODPgaptaltktCm (Figura 4). O fragmento de DNA Pgaptaltkt foi removido por meio de digestao de Sacl/Sfil. Um fragmento adaptador que cont§m Iocais de restrigao Sacl1 Notl e Sfil foi introduzido por meio de ligagao. Um fragmento de Notl de PgapXylAB, que foi isolado de pZB4 (US 5.514.583), foi clonado em seguida no local Notl do adaptador. Xilose isomerase (XI) e codificada por xylA e xiluloquinase (XK) e codificada por xylB. A sequencia de nucleotideos completa para ο plasmideo pMODPgapxylABCm e fornecida como SEQ ID N0 12.

transposicao e transformacao de ρμοόρ^pxylabcm em T2C. T3C. T4C e

Utilizando uma abordagem similar a integragao de PgaptaltktCm, T2C, T3C, T4C e T5C foram transformados/transpostos com pMODPgapxylABCm (descrito acima) tratado com transposase. Seis integrantes (T3CCmX1, T3CCmX2, T3CCmX3, T4CCmX1, T5CCmX1, T5CCmX2) foram obtidos em dois experimentos de transformagao e transposigao apos selepao de Cm. Todos tiveram confirmada a presen^a de xylAB por meio de PCR utilizando dois conjuntos de primers: SEQ ID N0 13 e 14 e SEQ ID N0 15 e 16, exceto por T2CcmX1 e T2CcmX6 dos quais nenhum fragmento de PCR foi detectado utilizando os primers SEQ ID N0 13 e 14.

Os integrantes, incluindo as duas Iinhagens negatives para PCR1 foram testados para determinar as atividades de XI, XK, TAL e TKT (Metodos Gerais). Os resuItados exibidos nas Figuras 6 e 7 indicaram que todos os seis integrantes xylAB T3CCmX1, T3CCmX2, T3CCmX3, T4CCmX1, T5CCmX1 e T5CCmX2 apresentaram atividades XI, XK1 TAL e TKT. As atividades Xl e XK foram recem obtidas em comparagao com os controles parentais negativos (Figura 6). As atividades de TAL e TKT foram mantidas como nos controles parentais. Todos os resultados indicaram que as proteinas foram elaboradas e eram funcionais. Os niveis de atividade enzimatica variaram, com atividades de Tl e XK similares as de integrantes ZW1 transformados/transpostos com ο mesmo plasmideo. Os niveis de atividades de XI, XK1 TAL e TKT foram mais baixos que os da Iinhagem 8b. A integragao do operador xylAB foi confirmada por meio de

hibridizagao Southern. DNA de plasmideo e genomico das seis Iinhas foi digerido com Sphl e hibridizado em uma sonda xylB marcada por digoxenina. Uma faixa comum de cerca de 3 kb, que e gerada a partir de um local Sphl em xylB e um outro local Sphl nos Iocais de clonagem adjacentes sob re ο vetor pMOD, estava presente em todas as amostras de DNA genomicas e, adicionalmente, faixas hibridizantes com peso molecular mais alto nas amostras de DNA genomico indicaram que havia quatro Iocais de integra9§o

para ο operador PgapXytAB no cromossomo. T3CCmX1 e T3CCmX2 aparentemente possuem ο mesmo local de integragao, T3CCmX3 e T4CCmX1 podem possuir ο mesmo local de integragao e T5CCmX1 e T5CCmX2 possuem um local de integragao separado cad a um. Digestao do mesmo DNA com Pstl seguida por hibridizagao Southern com a sonda tkt demonstrou que cada integrante possuia ο mesmo padrao de hibridiza^ao da sua Iinhagem parental correspondente.

Adaptacao dps integrantes ZW1:: P^apTALtkt P^a^xylAB Cm sobre meios de

Apesar da presen?a de tod as as quatro atividades enzimaticas da utilizagao de xilose, observagoes anteriores (Pedido de Patente Norteamericano n° 20030162271) indicaram que os integrantes podem nao crescer sobre xilose imediatamente. O crescimento sobre xilose pode ocorrer apos incuba9§o prolongada sobre meio de xilose (em tubos de ensaio ou sobre placas), um processo denominado adaptagao. As Iinhagens foram adaptadas conforme segue. Linhagens

integrantes de Z\/\n ::PgaptaltktPgapxylABCm foram inoculadas em tubos de ensaio e placas contendo RMX (que contem 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 20 g/l ou 2% (p/v) xilose, bem como RMGX (RM com 0,025% (p/v) de glicose, 4% (p/v) xilose). O baixo nivel de glicose foi utilizado para sustentar o crescimento inicial para aumentar a possibilidade de muta?ao durante a adapta^ao. Uma dentre pelo menos cinco tentativas de adaptagao sobre xilose nos cuItivos e placas foi bem sucedida. Apos dez dias de incubagao anaerobica a 30 0C1 17 e 19 colonias foram visiveis sobre MMGX em placas com celulas T3CCmX1 e T3CCmX2, respectivamente. As colonias eram pequenas e nao pareciam saudaveis (estavam transparentes) sobre as placas. Doze colonias (quatro da forma^ao de placas de T3CCmX1: T3CCmX11, T3CCmX12, T3CCmX13 e T3CCmX110; oito de formagao de placas de T3CCmX2:

T3CCmX24, T3CCmX25, T3CCmX26, T3CCmX27, T3CCmX28, T3CCmX29, T3CCmX211 e T3CCmX212) foram inoculadas em RMGCm120 e transferidas para 3 ml de RMX para adaptagao adicional, para obter Iinhagens que foram capazes de crescer mais rapidamente sob re xilose.

A adaptagao de integrantes em tubos de ensaio que contem 3 ml de RMX foi conduzida a 30 0C. ODeoo foi monitorado constantemente em um espectrofotdmetro Spectronic 601. Quando ο crescimento atingiu a metade da fase de registro, os cultivos foram transferidos para tubos novos de RMX. Este processo prosseguiu por sete transferencias. As velocidades de crescimento e ODs finais (leituras nao lineares) aumentaram ao Iongo das transferencias. Na sexta transferencia, os cultivos foram riscados sob re placas

RMX para isolar colonias isoladas. Tres integrantes cresceram mais rapidamente que os demais sobre placas riscadas RMX: T3CCmX13, T3CCmX26 e T3CCmX27, que sao denominadas X13, X26 e X27 nas tabelas e na discussao abaixo. Para selecionar os melhores cultivos de xilose, selecionamos quatro colonias grandes (L1-4) e quatro pequenas (S 1-4) para TX13, X26 e X27 cada e as cultivamos em tubos de ensaio RMX, de forma que pudemos monitorar ο crescimento, utilizagao de a^Cicar e produgao de etanol. As colonias foram cultivadas por uma noite a 30 0C1 seguidas por inocula^ao de OD600 = 0,05 em 3 ml de RMX em tubos de ensaio em duplicatas. X27 cresceu mais Ientamente em RMG que os demais cultivos e foi novamente inoculado seis horas e meia mais tarde. Apos 69 horas (62,5 horas para X27), foram retiradas amostras para analise HPLC (Metodos Gerais). A Figura 8 mapeia ο rendimento medio de etanol (percentual de rendimento teorico) e utilizagao de xilose (%) para cultivos apos 69 horas (62,5 horas para todos os cultivos X27). Nao houve diferen^a significativa entre as colonias grandes e pequenas. Embora ο desempenho de X27 fosse melhor em comparagao com X26 sobre xilose, ele exibiu crescimento mais lento sobre glicose. Portanto1 os melhores

produtores, grandes colonias de X13 (X13L3) e X26 (X26L1), foram selecionados para avaliagao adicional em fermentagoes com pH controlado. As fermentagoes foram conduzidas em RMG (6% glicose), RMX (6% xilose) e RMGX (8%:4%; glicose:xilose) a 37 0C para as Iinhagens X13L3 e X26L1, bem como a Iinhagem de controle 8b. A fermentagao de glicose por X13L3 e X26L1 cuItivados em RMG (6%) e RMGX (8%:4%) processou-se de forma razoavelmente rapida. A fermenta^ao de xilose no RMGX (8%:4%) foi mais Ienta para X13L3 e X26L1 em comparagao com a da Iinhagem 8b. Alem disso, ο crescimento sobre RMX (6%) a 37 0C ocorreu apos uma Ionga demora para X13L3 e X26L1. Varios isolados, X13b, X13c e X13FL, foram recuperados de fermentagoes de RMX (6%). Estes isolados, junto com as Iinhagens originais X13a (um isolado de X13L3) e X26, foram submetidos a tratamento Cre, conforme descrito anteriormente neste Exemplo, para remover ο marcador Cmr de Iinhagens ZW1 ::PgaptaItktPgapxyIABCm. Os integrantes Iivres de Cmr tratados com Cre resultantes foram denominados: X13aC, X13bC, X13cC, X13FLC e X26C.

Adaptacao de integrantes em meio de xilose por meio de transfer白ncias em

serle em RMX f5%) a 37 0C

Conforme descrito anteriormente, a adaptagao das Iinhagens ZW1::PgaptaItkiPgapxylABCm iniciais sobre RMX a 30 0C aumentou muito ο crescimento de Iinhagens nessas condi^oes. As Iinhagens adaptadas sofreram, entretanto, uma Ionga demora durante ο crescimento e fermentagao em RMX (6%) a 37 0C. Para aumentar adicionalmente os integrantes para fermentagao de xilose sob condigoes de processamento preferidas que incluem concentragao de a^iicar e temperatura mais altas, ο processo de adaptagao ou evolutivo prosseguiu em RMX (5%) a 37 0C. Foram conduzidas transferencias em serie e os melhores produtores foram selecionados. Os integrantes utilizados neste processo incluiram X13aC, X13bC, X13cC, X26C e X13FLC.

Estas cinco Iinhagens foram cultivadas em RMX a 30 0C para seis transferencias antes da sua transferencia para RMX (5%) a 37 0C para outras cinco a dezesseis transferencias. Durante e apos tod as as transferencias, os cultivos foram riscados sobre placas RMX e incubados a 37 0C para isolar colonias isoladas. Colonias grandes foram adicionalmente riscadas sobre placas RMX e incubadas a 37 0C por tres a quatro vezes para purificar as colonias. CoISnias grandes finais foram selecionadas para ο teste de crescimento em RMX (5%) a 37 0C.

Avaliacao de linhagens de adaptacao em meio RMX (5%) a 37 oC

Dezoito colonias isoladas apos adaptagao com transferencias em serie foram testadas em tubos de ensaio RMX (5%) a 37 0C inicialmente. Doze linhagens foram selecionadas para uma segunda avaliagao em tubo de ensaio. A Iinhagem 8b foi incluida em tod as as avaliagoes para comparagao. As dezoito colonias foram cultivadas em RMG a 37 0C por uma noite, centrifugadas e as celulas foram inoculadas em 4 ml de RMX (5%) a 37 0C1 estaticamente em tubos de ensaio para a primeira avaliagao. Com base nos resultados de crescimento (OD600, nao linear) e HPLC de ponto final (baixa xilose residual e alto etanol), doze linhagens foram selecionadas para a segunda avaliagao.

Um dos propositos da segunda avaliagao foi ο teste da estabilidade de crescimento aprimorado sobre xilose e a capacidade de utilizagao de xilose das linhagens. Todas as doze linhagens foram submetidas a um estudo de estabilidade para observar se as linhagens adaptadas eram estaveis apos a exposigao a um meio nao seletivo no qual foram transferidas em serie a 37 0C por cinquenta geragoes. Cultivos antes e depois de transferencias de RMG (5%) foram inoculados em tubos de ensaio com RMX (5%) e cultivados a 37 0C para avaliagao. Os ODs nao Iineares foram monitorados por meio de Ieitura direta de tubos de ensaio em um

espectrofotometro Spectronic 601. Os ODs na 70a hora de crescimento em RMX (5%) antes e depois de cinquenta geragoes de crescimento em RMG sao plotados na Figura 9. Os resuItados indicaram que a maior parte das Iinhagens era estavel apos cinquenta geragoes em RMG a 37 0C. Os sobrenadantes finais (na fase estacionaria) tambem foram analisados por meio de HPLC para determinar as concentragoes de xilose e etanol. As baixas concentragoes residuais de xilose e altas de etanol nesses cultivos sustentaram ο fato de que a Iinhagem cresceu e fermentou bem xilose.

Com base nos resuItados da avaliagao em tubo de ensaio acima (baixa concentragao residual de xilose, aIta de etanol e OD mais alto) e uma selegao de cuItivo de placas de microtitulos subsequente com altas concentragdes de glicose e/ou xilose (ate 20%) e misturas de gIicose e xilose com acetato para selecionar melhores produtores com altos teores de agiicar e na presenga de acetato, tais como a Iinhagem n0 26’ denominada ZW658, que exibiu ο melhor desempenho geral. Exemplo 2

Avaliacao da Fermentacao de Linhagens de Utilizacao de Xilose Aprimoradas Superiores a 37 °C O exemplo a seguir ilustra ο desempenho de fermentagao da Iinhagem de Zymomonas que utiliza xilose aprimorada ZW658 sob condigoes de fermenta^ao que imitam as concentragoes de agiicar e ο nivel de acido acetico esperado em um hidrolisado de biomassa. A Iinhagem ZW658 foi inoculada em fermentadores que contem meio RM suplementado com 10% de glicose (RMG10%), 8% xilose (RMX8%), 10% glicose + 8% xilose (RMGX10%8%) e 10% glicose + 8% xilose + 0,6% acido acetico (RMGXAcl 0%8%0,6%), respectivamente. Todas as fermentagoes foram conduzidas em Sixfors com 300 ml de meios a 150 rpm, pH 5,5 e 37 0C. Nitrogenio foi purgado atraves do meio nos fermentadores por uma noite e

suspenso pouco antes da inoculagao. Nenhum nitrogenio foi purgado durante a fermentagao. Foram preparados inoculados para a fermenta^ao com RMGX (10%, 4%) a 37 0C em frascos de agitagao (150 rpm) apos renascimento dos estoques de trabalho em RMG5%. A Iinhagem 8b foi utilizada como um controle sob as mesmas condigoes. Conforme exibido na Figura 10, ZW658 cresceu mais Ientamente sobre RMG10% em comparagao com 8b (A e B) e cresceu sob velocidade similar a 8b sobre RMX8% (C e D). Apesar da menor velocidade de crescimento, a Figura 10 demonstra que ο rendimento de etanol de ZW658 (93%) era similar ao de 8b ao final da fermenta^ao em meio de glicose. Em meio RMX8%, ο rendimento de etanol era mais alto para ZW658 (0,46 g de etanol/g de agCicar) em comparagao com 8b (0,44 g de etanol/g de agiicar). ZW658 produziu cerca de 4 g/l mais etanol em compara^ao com 8b em RMX8%. De forma interessante, ZW658 nao produziu nenhum xilitol, enquanto 8b produziu um baixo nivel de xilitol (0,7 g/l) ao final da fermentagao em RMX8%. Os dados exibidos na Figura 11 demonstram que ZW658 apresentou melhor desempenho em compara?ao com 8b na fermentagao de 10% glicose + 8% xilose com (C, D) ou sem (A, B) acetato, indicado por maior consumo de glicose e xilose, menor produgao de xilitol e maior produgao de etanol. A maior parte da glicose foi utilizada e xilose residual substancial permaneceu ao final da fermentagao para as duas Iinhagens em RMG10%X8% a 37 0C e sob pH 5,5, embora ZW658 utilizasse cerca de 8 g/l mais xilose que 8b. A produgao de xilitol (4,9 g/l) em ZW658 em RMG10%X8% a 37 0C e sob pH 5,5 ao final da fermentagao foi significativamente mais baixa que a de 8b (8,2 g/l). Na presenga de acetato (6 g/l), ο crescimento celular das duas Iinhagens foi reduzido significativamente, resultando em baixo desempenho de fermentagao de glicose e xilose, embora ZW658 exibisse desempenho de fermentagao Ievemente melhor em termos de maior consumo de glicose e xilose, menor produ^ao de xilitol e maior produgao de etanol. Ao contrario de RMX8%, as duas Iinhagens geraram ο subproduto xilitol em RMG10%X8% com ou sem acetato, embora menos xilitol fosse produzido por ZW658 em comparapao com 8b. O desempenho de fermentagao das duas Iinhagens encontra-se resumido na Tabela 1. Ao final, ZW658 apresentou melhor desempenho que 8b em fermentagoes com agiicar puro. Conforme descrito no Exemplo 1 ’ ZW658 e Iivre de marcadores de selegao de antibidticos, ο que e uma propriedade valiosa para organismos de fermentagao em aplicagoes comerciais.

Tabela 1

Resumo do Desempenho de Fermentacao de ZW658 ε 8b para Producao de

Etanol

Rendimento de etanol Vol. Etanol CPI g etanol/g asiicar prod. g/1 g/g g/l/h 8b (GIu) 0,47 5,15 52 21 ZW658 (GIu) 0,48 4,13 52 15 8b (XyI) 0,44 1,66 37 24 ZW658 (XyI) 0,46 1,83 41 23 8b (Glu Xyl) 0,43 1,80 58 52 ZW658 (Glu Xyl) 0,45 2,03 65 35 8b (Glu Xyl Ac) 0,46 0,67 48 136 ZW658 (Glu Xyl Ac) 0,47 1,04 50 90

CPI e ο indice de Produtividade Celular: g etanol/g de peso seco

de celulas.

Exemplo3

Preparacao de uma Construcao Suicida para Desativacao por Insercao do Gene Glicose-Frutose Oxidorreductase (GFOR) em ZW1 ε ZW658

A constru^ao suicida utilizada para realizar knockout do gene que codifica glicose-frutose oxidorreductase em ZW1 e ZW658 ("GFORSp-9WW") foi derivada de uma outra construgao suicida ("pLDHSp-9") que foi utilizada anteriormente para desativar por inserg§o ο gene para D-Iactato desidrogenase em Z. mobilis utilizando recombinagao homologa cruzada dupla mediada por hospedeiro e resistencia a espectinomicina como um marcador selecionavel. pLDHSp-9WW tambem foi derivado de uma serie de outras construgoes que foram geradas anteriormente. O precursor inicial de todas essas construg5es foi ο vetor de plasmideo pNEB193 (NEB n。N3051S; New England Biolabs). Este plasmideo foi selecionado porque pode reproduzir-se em E. coli, mas nao pode reproduzir-se em Z. mobilis. Todas as etapas e intermediarios que foram envolvidos na geragao da construgao de knockout de GFOR sao descritos abaixo em ordem cronologica a partir do plasmideo pNEB193.

Construcao de PLDH193 pNEB193 sofreu dupla digestao com Sbfl e Ascl para insergao do fragmento de DNA que e descrito abaixo. Os dois Iocais de restrigao sao exclusivos e Iocalizados na regiao de clonagem miiltipla do plasmideo. O fragmento de DNA de plasmideo pNEB193 Iinearizado por Sbfl/Ascl foi purificado utilizando ο Kit de Purificagao QIAQuick da Qiagen (catalogo n° 28104) de acordo com ο protocolo do fabricante. O fragmento de DNA que foi clonado em pNEB193 foi um fragmento de 2268 bp que foi amplificado por PCR a partir de DNA genomico de Z. mobilis, que foi isolado a partir da Iinhagem ZW1 utilizando Kit Maxi de Cultivo de Sangue e Celulas da Qiagen (catalogo n° 13362). Os oligonucleotideos sinteticos que foram utilizados para amplificagao por PCR deste fragmento foram os Primers 1 e 2:

Primer 1 (SEQ ID N0 17):

Primer 2 (SEQ ID N0 18):

CATCTTACTgaca caccAAAAATCTGCGGCTGACATAC

As bases sublinhadas de Primer 1 (primer frontal) hibridizam-se aos nucleotídeos 1262739-1262720 do número de acesso GenBank AE008692 na extremidade 3' do quadro de leitura aberta que codifica fosfogliceromutase (pgm), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Sbfl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas de Primer 2 (primer reverso) hibridizam-se nos nucleotídeos 1260490-1260472 do número de acesso GenBank AE008692, que está um pouco acima no fluxo do quadro de leitura aberta que codifica álcool desidrogenase I (adhl), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Ascl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O fragmento de DNA com 2268 bp que foi o alvo de amplificação por PCR consiste, portanto, dos elementos a seguir, a partir do local Sbfl e terminando no local Asei: (a) a extremidade 3' do gene pgm; (b) o gene Idh completo que codifica D-Iactato desidrogenase; e (c) uma região 5' não traduzida do gene adhl. O produto de PCR foi cortado com Sbfl e Ascl e o fragmento de DNA resultante foi ligado ao vetor pNEB193 Iinearizado por Sbfl/Ascl que foi descrito acima. A mistura de reação de ligação foi utilizada para transformar E. coli JM110 e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha ampicilina (100 Mg/ml). Transformadores resistentes a ampicilina que continham plasmídeos com o inserto com tamanho correto foram identificados inicialmente por meio de PCR utilizando colônias novamente suspensas ("PCR de colônia") e os Primers 1 e 2. Confirmação subsequente de clones positivos decorreu de análise de digestão de restrição de DNA de plasmídeo com Sbfl e Ascl e análise de seqüências de DNA do fragmento de 2268 bp que foi gerado por meio de PCR de colônia com os transformadores resistentes a ampicilina. O plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é denominado abaixo pLDH193.

Construção de pLDHTc139#7 O plasmídeo pLDH193 contém um local Ncol exclusivo que está localizado perto do meio do quadro de leitura aberta Idh. Este local foi utilizado para inserir um fragmento de DNA que confere resistência a tetraciclina. O conjunto de resistência a tetraciclina (conjunto Tcr) que foi utilizado para esta manipulação foi gerado por meio de PCR utilizando o plasmídeo pACYC184 (acesso GenBank n° X06403) como um modelo de DNA e os Primers 3 e 4 como primers de PCR.

Primer 3 (SEQ ID N0 19):

ACTCATTTccataaCGATCGCACTATqcaaccacAATGTAGCACCT GAAGTCAGCC

Primer 4 (SEQ ID N0 20): ATCTCACTccataaCCGGCCAACTAffaatfaaGAATTGATTGGCTC

CAATTCTTG

As bases sublinhadas e em negrito do Primer 3 (primer frontal) hibridizam-se pouco acima do fluxo do promotor para o gene de resistência à tetraciclina. O Primer 3 também possui três locais de restrição (Ncol1 AsiSI e Notl) que foram adicionados à sua extremidade 5'. O local Ncol encontra-se em letras minúsculas. O local AsiSI é sublinhado com uma linha fina. O local Not I encontra-se em letras minúsculas, em itálico. As bases sublinhadas e em negrito do Primer 4 (primer reverso) hibridizam-se pouco abaixo no fluxo do códon de parada para o gene de resistência à tetraciclina e este primer também contém três locais de restrição (Ncol, Fsel e Pacl) que foram adicionados à sua extremidade 5'. De forma similar à marcação acima, o local Ncol encontra-se em letras minúsculas, o local Fsel é sublinhado com uma linha fina e o local Pacl encontra-se em letras minúsculas, em itálico. O conjunto Tcr de 1448 bp que foi gerado com os Primers 3 e 4 foi cortado com Ncol e purificado por meio de eletroforese de gel de agarose preparativa. O fragmento de DNA resultante foi ligado em seguida ao local Ncol exclusivo que está presente no quadro de leitura aberta Idh do plasmídeo, pLDH193. Para minimizar a possibilidade de recirculação do vetor sem um inserto, o pNEB193 digerido por Ncol foi desfosforilado com fosfatase alcalina de intestino de bezerro antes da ligação. A mistura de reação de ligação foi introduzida em Escherichia coli JM110 e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 20 pg/ml de tetraciclina. Transformadores resistentes a tetraciclina que continham plasmídeos com o inserto correto foram identificados por meio de análise de digestão de restrição com Ncol, AsiSI1 Notl1 Fsel e Pacl e a orientação do conjunto Tcr foi confirmada por meio de análise de PCR utilizando primers apropriados. Um diagrama de círculo do plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional (pLDHTc139#7) é exibido na Figura 12. Em experimentos não descritos no presente, esta construção suicida foi utilizada para desativar por inserção (ou seja, fazer "knockout" ou "romper") o gene D-Iactato desidrogenase em ZW1 utilizando recombinação homóloga cruzada dupla mediada por hospedeiro e crescimento sobre tetraciclina como a seleção. Construção de pLDHTc139#7-9WW

Após demonstrar que pLDHTc139#7 poderia ser utilizado para realizar "knockout" do gene D-Iactato desidrogenase em ZW1, a etapa seguinte foi a modificação desta construção, de forma que fosse possível remover o marcador selecionável do cromossomo após o rompimento genético, utilizando Cre recombinase. Para atingir esse objetivo, foram adicionados dois locais IoxP do tipo selvagem (Lee e Saito, 1998) a pLDHTc139#7, utilizando os quatro locais de restrição exclusivos que ladeiam o conjunto Tcr1 nomeadamente AsiSI e Notl na extremidade 5' e Pacl e Fsel na extremidade 3'. O primeiro local IoxP foi inserido entre os locais AsiSI e Notl do plasmídeo pLDHTc139#7 após o corte da construção com as duas enzimas e purificação do fragmento de DNA grande resultante. O local IoxP que foi inserido nesse local foi gerado a partir de dois oligonucleotídeos sintéticos 5 e 6 (SEQ ID N0 21 e 22) que foram ambos fosforilados na sua extremidade 5'. Oligonucleotídeo 5 (SEQ ID N0 21):

cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc

Oligonucleotídeo 6 (SEQ ID N0 22):

ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat Estes oligonucleotídeos são complementares entre si e, quando

combinados, formam um local IoxP do tipo selvagem com fita dupla e comprimento total que possui sobreposições de fita única nas duas extremidades, que permitem a ligação do fragmento de DNA entre os locais AsiSI e Notl de pLDHTc139#7. As letras maiúsculas nos oligonucleotídeos correspondem ao local IoxP do tipo selvagem com comprimento total, enquanto as letras minúsculas indicam os nucleotídeos que foram utilizados para ligar o fragmento de DNA de fita dupla nos locais AsiSI e Notl de pLDHTc139#7.

A mistura de reação de ligação foi utilizada para transformar E. coli DH10B e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 20 pg/ml de tetraciclina. Transformadores resistentes a tetraciclina que continham plasmídeos com o local IoxP inserido corretamente nos locais AsiSi e Notl de pLDHTc139#7 foram identificados por meio de análise de digestão de restrição, PCR de colônia e análise de seqüências de DNA das regiões relevantes. O plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é indicado abaixo como pLDHTcl 39#7-9W.

Em seguida, um segundo local IoxP do tipo selvagem foi inserido entre os locais Pacl e Fsel na outra extremidade do conjunto Tcr em pLDHTcl 39#7-9W, após o corte do plasmídeo com as duas enzimas e purificação do fragmento de vetor grande resultante. O local IoxP que foi inserido neste local também foi gerado com dois oligonucleotídeos sintéticos 7 e 8 (SEQ ID N0 23 e 24) que foram ambos fosforilados na sua extremidade 5'.

Oligonucleotídeo 7 (SEQ ID N0 23):

taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg Oligonucleotídeo 8 (SEQ ID N0 24):

ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat

Os oligonucleotídeos 7 e 8 são complementares entre si e, quando hibridizados, formam um local IoxP do tipo selvagem com fita dupla e comprimento total que possui sobreposições de fita única nas duas extremidades que permitem a ligação do fragmento de DNA entre os locais Pacl e Fsel de pLDHTcl 39#7-9W. As letras maiúsculas nos oligonucleotídeos correspondem ao local IoxP de comprimento total e as letras minúsculas indicam os nucleotídeos que foram utilizados para ligar o fragmento de DNA de fita dupla nos locais Pacl e Fsel de pLDHTcl 39#7-9W.

A mistura de reação de ligação foi utilizada para transformar E. coli DH10B e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 20 pg/ml de tetraciclina. Transformadores resistentes a tetraciclina que continham plasmídeos com o local IoxP do tipo selvagem inserido corretamente nos locais Pacl e Fsel de pLDHTcl 39#7-9W foram identificados por meio de análise de digestão de restrição, PCR de colônia e análise de seqüências de DNA das regiões relevantes. O plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é indicado abaixo como pLDHTcl 39#7-9WW e um diagrama de círculo desta construção é exibido na Figura 12.

Construção de pLDHSp-9WW

pLDHSp-9WW é idêntico a pLDHTcl 39#7-9WW, mas o conjunto de resistência a tetraciclina nesta última construção foi substituído com um fragmento de DNA que confere resistência a espectinomicina (ou seja, um conjunto Specr). Este último foi gerado por meio de PCR utilizando o plasmídeo pHP15578 (Cahoon et al, 2003) como modelo e os Primers 9 e 10. pHP15578 contém a seqüência de nucleotídeos completa para o conjunto Specr e seu promotor, que é baseado na seqüência publicada do gene Transposon Tn7 aadA (acesso GenBank n° X03403) que codifica 3' (9)-0-nucleotidiltransferase. Primer 9 (SEQ ID N0 25): ATAAAAqnaaccacAGCACAGGATGA Primer 10 (SEQ ID N0 26): GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG

As bases sublinhadas do Primer 9 (primer frontal) hibridizam-se pouco acima no fluxo do promotor para o conjunto Specr (para nts 6-17 do acesso GenBank n° X03043), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Notl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 10 (primer reverso) hibridizam cerca de 130 bases abaixo no fluxo do códon de parada para o conjunto Specr (até nts 1006-1019 do acesso GenBank n° X03043), enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Pacl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O conjunto Specr gerado por PCR de 1040 bp sofreu digestão dupla com Notl e Pacl e o fragmento de DNA resultante foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O plasmídeo pLDHTc139#7-9WW também foi cortado com as mesmas duas enzimas de restrição para remover o conjunto Tcr e o fragmento de vetor grande resultante foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. Os dois fragmentos de DNA de interesse foram ligados entre si em seguida e a mistura de reação de transformação foi introduzida em E. coli DH10B utilizando eletroporação. Os transformadores foram colocados em placas sobre meio LB que continha espectinomicina (200 Mg/ml) e cultivados a 37 °C. Transformadores resistentes a espectinomicina que continham plasmídeos com o inserto com o tamanho correto foram identificados por meio de análise de digestão de restrição com Notl e Pacl e o plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é indicado abaixo como pLDHSp- 9WW; um diagrama de círculo desta construção é exibido na Figura 12. Em experimentos não descritos no presente, pLDHSp-9WW foi utilizado para realizar knockout do gene para D-Iactato desidrogenase em ZW1 utilizando a resistência à espectinomicina como o marcador selecionável. Desativação genética com a construção suicida ocorreu por meio de recombinação homóloga mediada por hospedeiro, cruzada dupla (WO 01/83784 A2), o que resultou na inserção do marcador selecionável (o conjunto Specr) que é ladeado por dois locais IoxP do tipo selvagem no meio do quadro de leitura aberta ldh. O evento cruzado duplo foi direcionado ao gene Idh por dois fragmentos de DNA que ladeiam o conjunto Specr em pLDHSp-9WW. Um destes fragmentos (indicado abaixo como DNA lateral 5' Idh) está exatamente acima no fluxo do conjunto Specr e está localizado entre os locais Sbfl e AsiSI. A seqüência de nucleotídeos deste fragmento de DNA de cerca de 1100 bp é idêntica ao DNA cromossômico ZW1 que codifica a extremidade 3' do gene pgm e cerca da primeira metade do quadro de leitura aberta ldh. O outro fragmento de DNA (indicado abaixo como o DNA lateral 3' Idh) está localizado na extremidade oposta do conjunto Specr entre os locais Fsel e Ascl. A seqüência de nucleotídeos do DNA lateral 3' Idh (que também é de cerca de 1100 bp) é idêntica ao DNA cromossômico que codifica a outra metade do gene Idh e parte da região não traduzida 5' do gene adhl. Um evento cruzado dobrado ocorre quando os dois fragmentos de DNA laterais 5' e 3' Idh interagem com os seus correspondentes cromossômicos e sofrem recombinação homóloga. Este fenômeno, que é essencialmente irreversível e completamente mediado pela maquinaria enzimática do hospedeiro, desativa o gene Idh cromossômico por meio da inserção do conjunto Specr no meio do quadro de leitura aberta. Como a construção não pode reproduzir-se em Z. mobilis, tornando-o uma construção suicida, a única forma de gerar colônias resistentes a espectinomicina estáveis com pLDHSp-9WW (além de mutantes resistentes a drogas espontâneos que ocorrem em uma freqüência muito baixa) é um evento cruzado duplo por meio de recombinação homóloga. É importante observar que o conjunto Specr que fica inserido no cromossomo pelo evento cruzado duplo ainda é colocado em sanduíche entre os dois locais IoxP do tipo selvagem que estavam presentes na construção suicida. Devido a esta disposição, fica fácil remover o marcador selecionável do gene D-Iactato desidrogenase sem reativá-lo utilizando o vetor de expressão Cre que é

descrito no Exemplo 10.

Construção de pGFORSp-9WW

pLDHSp-9WW foi convertido em uma construção suicida para desativação genética de glicose-frutose oxidorreductase (GFOR) de Z. mobilis em um procedimento de duas etapas conforme descrito abaixo. A primeira etapa foi a remoção do DNA lateral de 3' Idh e sua substituição com um fragmento de DNA análogo que dirigiria a construção de plasmídeo para o gene cromossômico que codifica GFOR. O último fragmento de DNA (denominado abaixo DNA lateral de 3' GFOR) foi gerado por meio de PCR utilizando DNA genômico ZW1 como modelo e os Primers 11 e 12 como

primers de PCR.

Primer 11 (SEQIDN0 27):

rTArTr.ATggrrnnr.r.TCAGAACGATCCTGCACAGC

Primer 12 (SEQ ID N0 28):

r. δ TP.TT A P.Tg g rg cg ccG GAC GAG GTTC ATCTC AG G

As bases sublinhadas do Primer 11 (primer frontal) hibridizam-se nos nucleotídeos 684324-684305 do acesso GenBank n° AE008692 que se encontram aproximadamente no meio do quadro de leitura aberta de GFOR, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Fsel que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 12 (primer reverso) hibridizam-se nos nucleotídeos 683124-683143 do acesso GenBank n° AE008692 que se encontra a cerca de 625 bp abaixo no fluxo do códon de parada de GFOR, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Ascl que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O fragmento de PCR de 1234 bp foi cortado com Fsel e Ascl. pLDHSp-9WW também foi cortado com as mesmas enzimas de restrição para remover o DNA lateral 3' Idh e o fragmento de vetor grande resultante dessa manipulação foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O DNA lateral de 3' GFOR gerado por PCR foi ligado em seguida entre os locais Fsel e Ascl do fragmento de vetor grande purificado com gel descrito acima e uma parcela da mistura de reação de ligação foi eletroporada em E. coli DH10B. As células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha 200 μg/ml de espectinomicina e as placas foram incubadas a 37 °C. Transformadores resistentes a espectinomicina que continham plasmídeos com o inserto correto foram identificados por meio de PCR de colônia e análise de digestão de restrição com Fsel e Ascl e o plasmídeo que foi selecionado para manipulação adicional é denominado abaixo pLDH/GFORSp-9. A etapa seguinte foi a remoção do DNA lateral 5' Idh de

pLDH/GFORSp-9WW e sua substituição com DNA lateral de 5' GFOR1 de forma que um evento cruzado duplo pudesse ocorrer nos alvos cromossômicos que foram selecionados para rompimento do quadro de leitura aberta de GFOR. O fragmento de DNA lateral de 5' GFOR foi gerado por meio de PCR utilizando DNA genômico de ZW1 como modelo e os Primers 13 e 14 como Primers de PCR.

Primer 13 (SEQ ID N0 29):

Γ.Τ A HTCATata catGTC C AG AAAAG AC AG CATTC C Primer 14 (SEQ ID N0 30): Γ. ΔΤΓ.ΤΤ A CTa ca atca cTG C ACG GTTC ATTG GAT

As bases sublinhadas do Primer 13 (primer frontal) hibridizam-se nos nucleotídeos 685584-685564 do acesso GenBank n° AE008692 que se encontram a cerca de 520 bp acima no fluxo do códon de início de GFOR1 enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Nsil que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 14 (primer reverso) hibridizam-se nos nucleotídeos 684396-684415 do acesso GenBank n° AE008692 que estão próximos do meio do quadro de leitura aberta GFOR e exatamente abaixo no fluxo do local de união para o Primer 11, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local AsiSI que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O produto de PCR de 1217 bp foi cortado com Nsil e AsiSI e pLDH/GF0RSp-9WW sofreu digestão dupla com Sbfl e AsiSI para remover o DNA lateral 5' Idh; o fragmento de vetor grande resultante desta última manipulação foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O DNA lateral de 5' GFOR gerado por PCR foi ligado em seguida aos locais Sbfl e AsiSI do fragmento de vetor grande purificado com gel descrito acima e uma parcela da mistura de reação de ligação foi eletroporada em E. coli SCS110 (que é dcm" e dam) para obter DNA de plasmídeo não metilado para transformação subsequente de ZW1 e ZW658, que é descrita em detalhes abaixo nos Exemplos 5 e 7. Observe-se que o uso de DNA de plasmídeo não metilado para transformação de manchas de Z mobilis que são derivadas de ZM4 é fundamental para o sucesso, pois DNA de plasmídeo metilado que é isolado de linhagens de E. coli do tipo selvagem, como DH10B, é facilmente destruído pelo sistema de modificação e restrição do hospedeiro (descrito em US 6.566.107 B1). Observe-se ainda que Nsil e Sbfl possuem extremidades adesivas compatíveis, mas os dois locais são destruídos quando são unidos entre si. Os transformadores foram colocados em placas sobre meio LB que continha 100 pg/ml de espectinomicina e as placas foram incubadas a 37 °C. Transformadores resistentes a espectinomicina que continham plasmídeos com o inserto correto foram identificados por meio de PCR de colônia e análise de digestão de restrição. Esta construção suicida resultante que foi utilizada para realizar "knockout" do gene GFOR em ZW1 e ZW658 é denominada abaixo pGF0RSp-9WW. Um diagrama em círculo deste plasmídeo é exibido na Figura 12 e a sua seqüência de nucleotídeos completa é descrita em SEQ ID N0 31. É importante observar que um evento cruzado duplo entre esta construção suicida e o cromossomo de Z. mobilis resulta na inserção de um conjunto Specr que é ladeado por dois locais IoxP do tipo selvagem, análogos à situação

descrita acima para pLDH-Spec-9M.

Exemplo 4

Geração de um Vetor de Expressão de Xilose Isomerase de e. coli para Z.

mobilis

Foi gerada uma construção de plasmídeo para expressão de xilose isomerase de E. coli em Z. mobilis (pZB188/Kan-XylA) conforme descrito abaixo utilizando um vetor impulsionador de E. coli/Z. mobilis (pZB188) como material de partida (Figura 13). As etapas envolvidas na construção de pZB188 são descritas em US 5.514.583. Resumidamente, este plasmídeo de 7008 bp é capaz de reproduzir-se em E. coli e Z. mobilis porque possui duas origens de reprodução diferentes, uma para cada espécie de bactéria. pZB188 também contém um fragmento de DNA que confere resistência a tetraciclina (ou seja, um conjunto Tcr). A primeira etapa da construção de pZB188/Kan-XylA foi a remoção do conjunto Tcr de pZB188 e sua substituição com um fragmento de DNA que confere resistência a canamicina (ou seja, conjunto Kane). Para extirpar o conjunto Tcr de pZB188, o plasmídeo foi cortado com Xbal e BssHII e o fragmento de vetor grande resultante foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O conjunto Kane foi gerado por meio de PCR utilizando o plasmídeo pET-24a (Novagen) como modelo e os Primers 15 e 16 para amplificação por PCR. pET-24a contém o quadro de leitura aberta completo para o gene Kanr e o seu promotor associado.

Primer 15 (SEQ ID N0 32): GCtetaaaGCAGCAGATTACGCGC Primer 16 (SEQ ID N0 33): AnATTGacacacTTAGAAAAACTCATC As bases sublinhadas do Primer 15 (primer frontal) hibridizam-se a cerca de 160 bp acima no fluxo do códon de início para o gene Kanr em pET- 24a, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Xbal que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 16 (primer reverso) hibridizam-se na outra extremidade do quadro de leitura aberta para o gene Kanr e incluem o códon de término, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local BssHII que foi adicionado à extremidade 5' do primer. O conjunto Kanr gerado por PCR de 991 bp foi cortado com Xbal e Bsshll e purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O fragmento de DNA resultante foi inserido em seguida entre os

locais Xbal e BssHII do fragmento de DNA pZB188 descrito acima em uma reação de ligação padrão. A mistura de reação de transformação foi introduzida em E. coli DH10B utilizando eletroporação e as células foram colocadas em placas sobre meio LB que continha canamicina (50 Mg/ml); o crescimento ocorreu a 37 °C. DNA de plasmídeo foi isolado a partir de um dos transformadores resistentes a canamicina e a construção resultante é denominada abaixo pZB188/Kan; um diagrama de círculo deste vetor

impulsionador é exibido na Figura 13.

Na etapa a seguir, um conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli foi inserido entre os locais Ncol e Acll de pZB188/Kan após o corte desta última com as duas enzimas e purificação do fragmento de vetor grande por meio de eletroforese de gel de agarose. O fragmento de DNA de cerca de 2 kbp que serviu de conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli foi derivado do plasmídeo pZB4 após o corte da construção posterior com Ncol e Clal e purificação do fragmento de DNA relevante por meio de eletroforese de gel de agarose. O plasmídeo pZB4 é descrito em detalhes em US 5.514.583 e uma representação esquemática do conjunto de expressão de E. coli PgapXyIA (SEQ ID N0 34) é exibida no diagrama em caixas da Figura 13. Os locais Ncol e Clal foram posicionados nas extremidades 5' e 3', respectivamente, do conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli. Conforme descrito em US 5.514.583, este fragmento contém o promotor 3- fosfato de gliceraldeído desidrogenase (GAP) de Z. mobilis constitutivo, que é fundido precisamente ao quadro de leitura aberta completo do gene xylA de E. coli que codifica xilose isomerase. Ele também contém a região de circuito de haste pequena que se segue imediatamente ao códon de parada de xilose isomerase. O conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli foi inserido entre os locais Ncol e Acll de pZB188/Kan em uma reação de ligação padrão. Observe-se que Clal e Acll geram "extremidades adesivas" compatíveis, mas os dois locais são destruídos quando ligados entre si. A mistura de reação de ligação foi eletroporada em seguida em E. coli SSC110 (dcm", dam") para obter DNA de plasmídeo não metilado para transformação subsequente de Z. mobilis conforme descrito abaixo no Exemplo 6 e células transformadas foram colocadas em placas sobre meio LB que continha canamicina (50 Mg/ml); o crescimento ocorreu a 37 °C. Transformadores resistentes a canamicina que continham um plasmídeo com um inserto com o tamanho correto foram identificados por meio de análise de digestão de restrição e PCR de colônia. O plasmídeo que foi utilizado para expressar xilose isomerase de E. coli em Z. mobilis é denominado abaixo "pZB188/Kan-XylA"; um diagrama de círculo desta construção é exibido na Figura 13.

Exemplo 5

Geração do Mutante KnockoutZWI GFOR

Para eliminar a atividade da enzima GFOR em ZW1 (a linhagem do tipo selvagem da qual ZW658 foi originalmente derivada), utilizou-se a construção suicida pGFORSp-9WW, que foi descrita em detalhes no Exemplo 3. O DNA de plasmídeo sem repetição foi introduzido no hospedeiro bacteriano utilizando eletroporação, essencialmente conforme descrito em US 5.514.583. Resumidamente, 50 μΙ de reações de transformação continham cerca de 1010 células/ml em 10% (v/v) de glicerol e cerca de 0,9 pg de DNA de plasmídeo não metilado que foi isolado de E. coli SSC110 conforme descrito no Exemplo 3. A reação de controle foi tratada de forma idêntica, mas não recebeu nenhum DNA de plasmídeo. As configurações do eletroporador foram de 16 kv/cm, 200 Ω e 25 pF e a largura da lacuna da cubeta foi de 0,1 cm. Após eletroporação, as reações de transformação foram diluídas com 1,0 ml de meios MMG (50 g/l de glicose, 10 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4, 0,2 g/l de K2HPO4 e 1 mM de MgSO4) e as células foram mantidas em recuperação por cerca de cinco horas a 30 °C. As células foram colhidas em seguida por meio de centrifugação à temperatura ambiente (13.000 χ g, 5 min) em tubos de microcentrifugação estéreis de 1,5 ml e os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos. Pelotas celulares foram novamente suspensas em 150 μΙ de meios MMG líquidos e parcelas de 50 e 100 μΙ da suspensão celular foram colocadas em placas sobre meio MMG que continham 1,5% de Agar e 200 μg/ml de espectinomicina. As placas foram incubadas em uma câmara anaeróbica a 30 0C e 50 a 150 colônias apareceram nas placas experimentais após dois a três dias. Nenhuma colônia resistente a espectinomicina encontrava-se sobre as placas de controle nesse momento, embora algumas aparecessem após um outro período de incubação de 48 horas. Duas das colônias resistentes a espectinomicina que resultaram da transformação com a construção knockout de GFOR foram selecionadas para manipulação adicional

conforme descrito abaixo.

Experimentos anteriores com Z mobilis e construções suicidas que são similares a pGFORSp-9WW revelaram que a interação inicial entre o cromossomo e o DNA de plasmídeo é um evento de cruzamento único em um dos dois locais alvo e que eventos de cruzamento único eventualmente geram eventos de cruzamento duplo. A transição do evento de cruzamento duplo normalmente ocorre muito rapidamente após algumas transferências em série em meio líquido que contém o agente seletivo para a construção suicida. Para facilitar o evento de cruzamento duplo para os dois transformadores ZW1 selecionados que resultaram da construção knockout de GFOR, as células foram inoculadas em 10 ml de meios RM (10 g/l de extrato de levedura e 2 g/l de KH2PO4) que continha 100 g/l de glicose e 200 pg/ml de espectinomicina. Os dois cultivos atingiram fase estacionária após um período de incubação de 24 horas a 30 °C. Em seguida, parcelas de 10 μΙ dos cultivos de primeira passagem foram utilizadas para inocular 10 ml do mesmo meio de cultivo e estes dois cultivos também atingiram fase estacionária após 24 horas a 30 °C. Por fim, parcelas de 10 μΙ dos cultivos de segunda passagem foram inoculadas em 10 ml do mesmo meio de cultivo e permitiu-se a efetivação do crescimento por mais 24 horas a 30 °C. Após a última transferência em meio líquido, parcelas dos cultivos de terceira passagem foram diluídas e colocadas em placas sobre meio MMG que continha espectinomicina (200 pg/ml) para obter colônias isoladas e as placas foram incubadas a 30 0C por 48 horas sob

condições anaeróbicas.

A confirmação de que o evento cruzado duplo realmente ocorreu foi obtida por meio de experimentos de PCR de colônia utilizando três pares diferentes de primers. O primeiro par de primers de PCR somente pode gerar um fragmento de DNA com o tamanho correto caso o DNA lateral de 5' GFOR na construção suicida tenha passado por um evento de cruzamento único com o seu parceiro cromossômico. De forma similar, o segundo par de primers de PCR somente pode gerar um fragmento de DNA com o tamanho correto caso o DNA lateral de 3' GFOR na construção suicida tenha passado por um evento de cruzamento isolado com o seu parceiro cromossômico. Por fim, o terceiro par de primers de PCR somente pode gerar um fragmento de DNA com o tamanho correto caso tenha ocorrido um evento de cruzamento duplo e, além disso, seja eliminada a possibilidade de uma população misturada de eventos de cruzamento único e duplo. As duas colônias resistentes a espectinomicina que foram utilizadas para esta análise foram derivadas de dois transformadores primários diferentes da reação de eletroporação de ZW1 com a construção suicida que foram transferidos três vezes em meio líquido e colocados em placas para a obtenção de colônias isoladas conforme descrito acima e o controle para este experimento foi a linhagem parental, ZW1. Como os dois transformadores geraram resultados positivos com os três conjuntos diferentes de primers de PCR1 apenas um deles foi selecionado para análise adicional. Esta linhagem (o mutante knockout ZW1 GFOR) é denominada abaixo ZW1- AGFOR.

Exemplo 6

Glicose-Frutose Oxidorreductase Pode Ser um Colaborador Importante para a Formação de Xilitol sob Condições Fisiológicas

o mutante knockout ZW1 GFOR (ZW1-AGFOR) foi utilizado para

testar a hipótese de que a formação de xilitol em linhagens recombinantes que utilizam xilose de Z. mobilis é ao menos parcialmente mediada pela enzima periplasmática GFOR ou o seu precursor citosólico com peso molecular maior que também é enzimaticamente ativo (Loos et al, acima). Conforme exibido no Exemplo 2 (Figura 11), xilitol é um subproduto importante de linhagens que utilizam xilose 8b e ZW658, mas somente é formado quando xilose está presente no meio de crescimento. Embora linhagens do tipo selvagem de Z. mobilis, como CP4, possuam uma aldose reductase dependente de NADPH que pode reduzir diretamente xilose em xilitol (Feldmann et al, acima), é concebível que GFOR possa também contribuir com a formação de xilitol in vivo quando o meio de crescimento contiver xilose ou uma mistura de glicose e xilose conforme ilustrado nos Diagramas Il e III. Para que qualquer dessas reações ocorra, entretanto, a enzima necessitaria ter acesso a xilulose, pois este composto é o receptor de elétrons obrigatório para a produção de xilitol mediada por GFOR conforme exibido em testes de caracterização de enzima GFOR in vitro (Zachariou e Scopes, acima) e experimentos realizados com extratos livres de células brutos (Danielson1 acima). Em linhagens de Z. mobilis que são elaboradas para crescimento sobre xilose, a xilulose que seria necessária para síntese de xilitol seria gerada por xilose isomerase, que catalisa a primeira etapa de metabolismo de xilose (Figura 1) e é ausente em linhagens do tipo selvagem, tais como ZW1.

Para testar a possibilidade de geração de xilitol por GFOR quando xilose e glicose estiverem ambas presentes no meio de crescimento, o vetor de expressão de xilose isomerase de E. coli (pZB188/Kan-XylA) que foi descrito no Exemplo 4 foi introduzido em ZW1 e ZW1-AGFOR. A estratégia foi o fornecimento de um processo de xilose em xilulose em duas linhagens que não podem crescer sobre nenhum desses açúcares e determinação se GFOR poderá gerar xilitol. O procedimento de eletroporação que foi utilizado para transformação foi essencialmente conforme descrito no Exemplo 5 mas, após o período de recuperação, as células transformadas foram colocadas em placas sobre meio MMG que continha 300 pg/ml de canamicina. Como controles para este experimento, ZW1 e ZW1-AGFOR também foram transformados com pZB188/Kan (Figura 13), que é idêntico a pZB188/Kan-XylA, mas não contém o conjunto de expressão de xilose isomerase de E. coli. Colônias resistentes a canamicina que abrigam o pZB188/Kan-XylA ou o plasmídeo controle foram identificadas por meio de PCR de colônia e uma colônia representativa de cada reação de transformação foi selecionada aleatoriamente para o experimento que é exibido na Figura 14. Estas quatro linhagens portadoras de plasmídeos são denominadas abaixo ZW1 (pZB188/Kan), ZW1 (pZB188/Kan-XylA), ZW1- AGFOR (pZB188/Kan) e ZW1-AGFOR (pZB188/Kan-XylA).

Cultivos por uma noite cresceram em tubos de ensaio tampados •

de 15 ml a 30 0C em 5 ml de 60 g/l de glicose, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de MgSO2 (7 H2O) e 300 Mg/ml de canamicina. Parcelas desses cultivos por uma noite foram utilizadas em seguida para inocular cultivos de 20 ml (em tubos de ensaio tampados de 50 ml) que continham o mesmo meio de crescimento, com ou sem 20 g/l de xilose. O crescimento ocorreu a 30 0C com suave agitação e valores OD6oo iniciais foram de cerca de 0,1. Após 0, 24, 48 e 120 horas de crescimento, parcelas de 1,0 ml dos cultivos foram removidas para análise de HPLC utilizando um HP 1100 equipado com um detector de índice de refração (Hewlett-Packard, Palo Alto CA) para determinar as concentrações de xilose, xilulose e xilitol que estavam presentes no caldo de fermentação. Antes da análise de HPLC, as células foram removidas por meio de centrifugação e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de tubo centrífugo Spin-X de 0,22 μιτι de acetato de celulose (Costar, catálogo n° 8160) para remover partículas pequenas. Os compostos foram separados sobre uma coluna Aminex HPX-87H (Bio-Rad) que foi conduzida a 55 0C sob condições isocráticas utilizando uma velocidade de fluxo de 0,6 ml/min e 0,01 N de H2SO4 como a fase móvel. Padrões autênticos com concentração conhecida foram utilizados para quantificar os picos de interesse e todos os resultados são expressos em g/l. Os resultados demonstram que, quando ZW1 (pZB188/Kan), a

linhagem de controle com o vetor "vazio", foi cultivado na presença de glicose e xilose, apenas uma pequena quantidade de xilitol acumulou-se no meio de crescimento após um período de incubação de 120 horas (Figura 14A). A quantidade máxima de xilitol que foi observada com esta linhagem foi de <0,5 g/l. Por outro lado, nenhum xilitol foi formado quando ZW1 (pZB188/Kan) foi cultivado na mesma concentração de glicose mas xilose foi omitida e isso foi verdadeiro também para as outras três linhagens. Consequentemente, somente os experimentos que foram realizados na presença de glicose e xilose são exibidos na Figura 14. Notadamente, a expressão de xilose isomerase de E. coli em ZW1 aumentou muito a quantidade de xilitol que apareceu no caldo de fermentação e, após 120 horas, ZW1 (pZB188/Kan-XylA) havia gerado cinco vezes mais este composto que ZW1 (pZB188/Kan) (Figura 14B). Conforme antecipado, a expressão de xilose isomerase em ZW1 também resultou na produção de xilulose, pois xilose isomerase catalisa a isomerização de xilose em xilulose. Observe-se que, neste experimento, cerca de 16% da xilose total que foi adicionada ao meio de crescimento foram convertidos em xilulose ou xilitol. Também se observa que existe um relacionamento de produto e precursor aparente entre estes dois compostos (xilulose caiu à medida que xilitol aumentou), consistente com a hipótese de que GFOR é capaz de converter xilulose em xilitol sob condições fisiológicas quando glicose e xilose estiverem ambos presentes no meio de crescimento.

De forma similar a ZW1, muito pouco xilitol foi gerado por ZW1- AGFOR na ausência do vetor de expressão de xilose isomerase (Figura 14C). A pequena quantidade de xilitol que foi formada sob estas condições pode vir de uma aldose reductase dependente de NADPH, conforme sugerido por Feldmann et al (1992, acima). Surpreendentemente, quando xilose isomerase foi expressa no mutante knockout de ZW1 GFOR, nenhum xilitol adicional foi gerado (Figura 14D), ao contrário dos resultados que foram obtidos com ZW1 (pZB188/Kan-XylA). Ao contrário, ZW1-AGFOR (pZB188/Kan-XylA) produziu quantidades massivas de xilulose e a quantidade deste composto que foi formada era muito similar à quantidade total de xilulose e xilitol que foi gerada pela linhagem ZW1 correspondente (ou seja, ZWI (pZB188/Kan-XylA)). Estes experimentos demonstram claramente que GFOR pode contribuir substancialmente para a formação de xilitol in vivo quando a enzima possuir acesso a xilulose, o que certamente é o caso de linhagens recombinantes de Z. mobilis que utilizam xilose e são cultivadas em misturas de glicose e xilose. Estes resultados indicam adicionalmente que aldose reductases dependentes de NADPH desempenham um papel menor na produção de xilitol quando linhagens recombinantes de Z mobilis são cultivadas em meios que contêm xilose, ao contrário das expectativas da literatura (Feldmann et al, acima; Kim et al, acima).

Exemplo 7

Geração do Mutante Knockout GFOR ZW658 e Demonstração que Esta

Linhagem Não Produz uma Enzima GFOR Funcional

O gene que codifica GFOR, que pode contribuir com a formação de xilitol em Z. mobilis sob condições fisiológicas quando glicose e xilulose forem ambos disponíveis conforme exibido no Exemplo 6, foi desativado por meio de inserção em ZW658 utilizando a construção suicida, pGFORSp-9WW (descrita no Exemplo 3). Todas as etapas deste procedimento foram idênticas às descritas para o mutante knockout ZW1 GFOR no Exemplo 5, incluindo a confirmação do evento de cruzamento duplo com os três conjuntos de primers de PCR. O mutante knockout ZW658 que foi selecionado para o experimento subsequente descrito abaixo foi denominado ZW800.

Para demonstrar que ZW800 não produz uma enzima que pode gerar sorbitol a partir de glicose e frutose, que é a reação fisiológica que é catalisada por GFOR, foi realizado o experimento a seguir. Cultivos de 1,5 ml de ZW800 e a linhagem parental ZW658 foram cultivados até a fase estacionária inicial em tubos de ensaio de 10 ml tampados a 30 0C em meio líquido que continha 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4 e 1 g/l de MgSO4. Quando os cultivos atingiram OD60O de cerca de 5,5, as células foram colhidas por meio de centrifugação e o sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado. Em seguida, as pelotas celulares foram novamente suspensas em 5 ml de meio de cultivo novo que possuía a composição a seguir: 110 g/l de glicose, 110 g/l de frutose, 10 g/l 10

de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4 e 4 g/l de KHCO3. Todas as etapas acima foram realizadas sob condições estéreis e o pH inicial do meio de cultivo foi ajustado em 5,8 com ácido fosfórico concentrado antes da nova suspensão das células. Os cultivos resultantes cresceram em seguida a 30 0C com suave agitação (150 rpm) e nos momentos indicados na Tabela 2, as amostras foram removidas para análise de HPLC do caldo de fermentação utilizando o mesmo procedimento que foi descrito no Exemplo 6. Os picos de interesse para este experimento foram glicose, frutose, sorbitol e etanol e os padrões autênticos de quantidade conhecida foram utilizados para calcular as suas concentrações no caldo de fermentação após a remoção das células por meio de centrifugação; todas as concentrações são expressas em g/l na Tabela 2.

Tabela 2

Produção de Sorbitol em ZW658 ε ZW800 - Medições inVivo

Linhagem

ZW658

ZW658

ZW658

ZW800

ZW800

ZW800

Hora

23

47

0

23 47

Glicose

110

5,99

1,55

110

Frutose

110

61,43

21,98

110

60,44

6,79

Sorbitol

45,99

45,89

10,21

Etanol

49,36

69,04

73,85

96,21

Conforme exibido na Tabela 2, o cultivo de ZW658 consumiu quase toda a glicose e cerca da metade da frutose após 23 horas e gerou quantidades comparáveis de sorbitol e etanol como produtos importantes; os valores para os dois últimos compostos durante o primeiro momento foram de 45,99 g/l e 49,36 g/l, respectivamente. Desta forma, mais de 40% da frutose original foram convertidos em sorbitol por GFOR no cultivo de ZW658. Em contraste surpreendente, nenhum sorbitol foi detectado no caldo de fermentação do cultivo de ZW800 após um período de incubação de 23 horas e, no seu lugar, a glicose e a frutose foram convertidas quase quantitativamente em etanol, o que estava muito próximo do seu valor teórico de 0,51 gramas de etanol por grama de açúcar consumido. Observe-se que não houve aumento adicional da quantidade de sorbitol no cultivo de ZW658 após mais 24 horas de crescimento. Isso era esperado, pois quase toda a glicose foi esgotada anteriormente e não houve doador de elétrons para a reação de GFOR com frutose. De forma interessante, uma pequena quantidade de sorbitol (10,21 g/l) foi encontrada no caldo de fermentação do cultivo de ZW800 após 47 horas e isso pode haver sido gerado por uma aldose reductase dependente de NADPH (Feldmann et al, acima) ou alguma outra enzima que permanece sem ser elucidada. Entretanto, os resultados acima fornecem evidência que o conjunto Specr que foi inserido no meio do quadro de leitura aberta GFOR de ZW800 aboliu em grande parte, se não inteiramente, a atividade enzimática de GFOR. Suporte adicional para esta conclusão vem de experimentos in

vitro com extratos livres de células que foram preparados a partir de ZW1, ZW658 e ZW800. O objetivo foi de determinar se ZW658 pode converter xilose em xilitol na ausência de outros cofatores ou substratos adicionados e observar se ZW800 perdeu a capacidade de condução desta reação como resultado da desativação de GFOR. Existem três exigências para a produção de xilitol mediada por GFOR com extratos livres de células de Z. mobilis: 1) um doador de elétrons de açúcar como glicose ou xilose que é capaz de reduzir o cofator unido firmemente de GFOR; 2) xilulose como um aceitador de elétrons, pois ele é o composto que a enzima realmente reduz em xilitol; e 3) uma enzima GFOR funcional. Caso xilulose não seja adicionada à mistura de reação, o extrato livre de células deve também conter xilose isomerase para conversão de xilose em xilulose.

Extratos livres de células foram preparados com cultivos de 100 h

ml que cresceram a 33 0C em frascos de agitação de 250 ml que continham 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4 e 50 g/l de glicose. As células foram colhidas por meio de centrifugação em OD6oo de 2 a 3 e foram lavadas por duas vezes com 50 mM de Tris-HCI resfriado com gelo (pH 7,0), 1,0 mM de MgCI2 e 1 mM de ditiotreitol. As pelotas finais foram novamente suspensas em 1,0 ml do mesmo tampão e as células foram rompidas por meio de sonicação. Após a remoção dos fragmentos celulares por meio de centrifugação a 4 0C (16.000 χ g, 60 min), os extratos livres de células foram imediatamente testados para determinar a produção de xilitol conforme descrito abaixo. As reações de 500 μΙ foram conduzidas em tubos de microcentrifugação de polipropileno e continham concentrações finais dos componentes a seguir: 50 mM de Tris-HCI (pH 7,0), 1,0 mM de MgCI2, 1 mM de ditiotreitol, 66 mM de xilose e 0,32 a 0,35 mg de proteína de extrato livre de células; as concentrações de proteínas foram determinadas por meio do Teste de Proteína BCA (Pierce) utilizando albumina de soro bovino como padrão. Após um período de incubação de quinze horas a 40 °C, as reações foram encerradas com uma concentração final de 30 mM de ácido piválico e parcelas foram analisadas por meio de HPLC utilizando uma coluna SH1011 (Showdex) com 0,01 N de ácido sulfúrico como a fase móvel. A temperatura da coluna foi mantida a 50 0C e a velocidade de fluxo foi de 1,0 ml/min. O controle para este experimento não recebeu extrato livre de células, mas no restante foi tratado de forma idêntica.

Conforme exibido na Tabela 3, ao adicionar-se o extrato livre de células ZW1 à mistura de reação, xilose não foi convertida em xilulose ou xilitol durante o período de incubação de quinze horas. Conforme já observado, esperava-se este resultado pois ZW1 é uma linhagem do tipo selvagem que não expressa xilose isomerase de E. coli, ao contrário de ZW658 e ZW800. Por outro lado, quantidades significativas de xilulose e xilitol foram geradas ao utilizar-se o extrato livre de células ZW658, pois ele continha as duas enzimas que são necessárias para a formação destes dois compostos. Observe-se que, neste caso, cerca de 8% dos 66 mM de xilose originais foram utilizados para a produção de xilitol, pois duas moléculas de xilose são consumidas para cada molécula de xilitol que é gerada quando xilose é o único substrato de GFOR que é adicionado à mistura de reação. Por fim, e mais importante, o extrato livre de células ZW800 somente foi capaz de converter xilose em xilulose pois, embora possuísse atividade de xilose isomerase, ele não possuía atividade de enzima GFOR. Estes resultados fornecem evidências adicionais que ZW800 não produz uma enzima GFOR funcional e demonstram ainda que esta proteína é capaz de utilizar xilose como um doador de elétrons para reduzir xilulose em xilitol, conforme exibido anteriormente com extratos livres de células do tipo selvagem que foram cravejados com xilose isomerase purificada (Danielson, acima). Tabela 3

Produção Mediada por GFOR de Xilitol a Partir de Xilose também Necessita de Xilulose - Medições in vitro

Extrato livre de células Xilulose (mM) Xilitol (mM) Nenhum 0 0 ZW1 0 0 ZW658 9,45 2,6 ZW800 10,63 0

Exemplo 8

Sorbitol é Necessário para o Crescimento de ZW800 em Misturas Concentradas de Glicose ε Xilose

Foi testado o desempenho de fermentação para a produção de etanol por ZW800 em uma mistura concentrada de glicose e xilose. Os experimentos foram conduzidos em fermentadores com pH controlado • utilizando uma razão fixa entre glicose e xilose de cerca de 5:4 a 97 g/l ou 188 g/l de açúcar total.

Cultivos de sementes de ZW658 e ZW800 cresceram em frascos de agitação a 37 0C em meio líquido que continha 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4 e 1 g/l de MgSO4; o pH inicial foi ajustado em 5,5 com 4 N KOH. Quando ODeoo atingiu cerca de 5,0, foram utilizadas parcelas de 50 ml dos cultivos de sementes para inocular fermentadores de um litro (sistema B-DCU da BIOSTAT®, Sartorius BBI System Inc., Bethlehem, Pensilvânia, Estados Unidos) que continham 450 ml de meio de cultivo. Os cultivos de 500 ml finais continham 5 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de MgSO4 e uma baixa concentração de açúcar (54 g/l de glicose e 43 g/l de xilose) ou uma alta concentração de açúcar (104 g/l de glicose e 84 g/l de xilose). O cultivo deu-se a 33 0C e o pH foi mantido em 5,5 por meio de adição automática de 4N KOH. A velocidade de mistura foi definida em 150 rpm. Em vários momentos, foram removidas parcelas para análise de HPLC do caldo de fermentação utilizando o mesmo procedimento e condições que foram descritos no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose e etanol e foram utilizados padrões autênticos com concentração conhecida para quantificar os picos dos cromatogramas. O crescimento celular foi também monitorado seguindo-se as alterações da turvação com um espectrofotômetro que foi definido em uma densidade ótica de 600 nm e os valores OD6oo resultantes foram plotados.

Conforme exibido na Figura 15, a desativação de GFOR não apresentou efeito sobre o crescimento, consumo de açúcar ou título de etanol quando o fermentador continha uma baixa concentração de açúcar (54 g/l de glicose, 43 g/l de xilose). Foi observada, entretanto, uma grande diferença do desempenho de fermentação quando a concentração total de açúcar aumentou cerca de duas vezes conforme observado na Figura 16. ZW658 experimentou um período de atraso de cerca de trinta horas, o que é típico para linhagens recombinantes que utilizam xilose de Z. mobilis quando são alteradas de uma mistura diluída de glicose e xilose para uma mistura concentrada dos mesmos açúcares que excede cerca de 180 g/l de açúcar total. Após o período de demora, as células começaram a crescer e consumiram toda a glicose no meio e cerca de 75% da xilose, de forma a resultar em um título final de etanol de cerca de 73 g/l (Figura 16A). Por outro lado, o cultivo de ZW800 não se recuperou do período de demora mesmo após um período de incubação de 130 horas (Figura 16B) e este resultado foi obtido em duas ocasiões separadas.

Como ZW800 cresceu bem na mistura diluída de glicose e xilose conforme exibido na Figura 15, pareceu possível que a incapacidade desta linhagem de recuperar-se na mistura com alto teor de açúcar apresentasse alguma relação com tensão osmótica. De fato, GFOR desempenha um papel fundamental na manutenção do equilíbrio osmótico por meio da geração de sorbitol quando Z. mobilis do tipo selvagem é transferido para misturas concentradas de glicose e frutose ou altas concentrações de sacarose, o que também gera glicose e frutose por meio da ação de invertase (Loos et al, acima). O sorbitol que é produzido por GFOR no espaço periplasmático é transportado para células contra um gradiente de concentração onde é acumulado até altos níveis, pois ele não é adicionalmente metabolizado. Isso elimina a diferença de pressão osmótica ao longo da membrana de plasma e restaura o equilíbrio osmótico (Wiegert et al, acima). Um requisito prévio da produção de sorbitol mediada por GFOR, entretanto, é a presença simultânea de glicose e frutose e esta reação não deverá ocorrer em meios de crescimento que não contenham frutose. Entretanto, como sorbitol é o produto fisiologicamente importante de GFOR e esta enzima é inativa em ZW800, o efeito da adição de sorbitol à mistura concentrada de glicose e xilose foi testado no experimento descrito abaixo.

Após cerca de setenta horas na mistura com alto teor de açúcar (momento designado pela seta vertical da Figura 16), cinco parcelas de 4,5 ml do cultivo de ZW800 suspenso foram removidas do fermentador e transferidas para tubos de ensaio de 15 ml tampados. Quatro dos tubos foram suplementados em seguida com 0 a 20 mM de sorbitol (concentração final) e o volume total dos cultivos foi ajustado em 5,0 ml com água deionizada em todos os casos; a solução padrão de sorbitol que foi utilizada para este experimento também foi composta em água. Para controlar a diluição a 10% do meio de cultivo ao adicionar-se a água e sorbitol, nada foi adicionado ao quinto cultivo. Todos os cultivos foram incubados em seguida a 33 0C com suave agitação (200 rpm) e o crescimento foi monitorado espectrofotometricamente. As células começaram a crescer quase imediatamente ao adicionar-se sorbitol ao meio de cultivo conforme exibido na Figura 17, mesmo com a mais baixa concentração testada (5 mM). Algum estímulo de crescimento também foi observado quando sorbitol não era adicionado, mas o cultivo foi diluído a 10% com água, o que reduziu a concentração total de açúcar de 188 g/l para 169 g/l. O efeito estimulante de sorbitol sobre o crescimento, entretanto, era muito maior que o

efeito de diluição.

O resgate de crescimento de ZW800 por sorbitol era completamente inesperado, pois ZW658 recuperou-se do período de demora e cresceu bem na mistura concentrada de glicose e xilose, sem uma fonte conhecida de frutose. Como este último composto é um receptor de elétrons obrigatório para a produção de sorbitol mediada por GFOR, não era evidente que GFOR pudesse sintetizar sorbitol ou desempenhar um papel no equilíbrio osmótico em meios que contêm altas concentrações de glicose e xilose. Desta forma, não havia indicação que sorbitol pudesse ser um fator importante para o crescimento de ZW658 ou ZW800 em misturas concentradas de glicose e xilose.

Exemplo 9

Desativação de GFOR Aumenta a Produção de Etanol a Partir de Xilose Sob Condições Relevantes de Processo

Os desempenhos de fermentação de ZW658 e ZW800 em misturas concentradas de glicose e xilose sob condições relevantes de processo foram comparados lado a lado para determinar se a desativação de GFOR é uma estratégia de elaboração metabólica benéfica ou prejudicial. Como altas concentrações de glicose e xilose foram utilizadas nestes experimentos, adicionou-se sorbitol ao meio para permitir o crescimento de ZW800. Em experimentos que não são descritos no presente, também se descobriu que sorbitol elimina o período de demora para ZW658. Desta forma, suplementação de sorbitol ao meio de crescimento fornece uma forma ideal de comparação destas duas linhagens sob condições relevantes de processo.

ZW658 e ZW800 foram comparados sob seis condições diferentes utilizando duas concentrações de açúcares totais, na presença e na ausência de acetato e, para a mistura de açúcar mais concentrada, foram examinadas duas capacidades de tamponamento diferentes. Estes experimentos foram conduzidos com cultivos de 20 ml que cresceram a 30 0C em tubos de ensaio de 50 ml com suave agitação (150 rpm). O pH não foi controlado, mas o pH inicial do meio de crescimento foi ajustado em 5,8 com ácido fosfórico concentrado antes da inoculação com o cultivo de semente. O meio de crescimento básico continha 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4, 5 mM de sorbitol e 4 g/l (Figuras 18 e 19) ou 8 g/l (Figura 20) de KHCO3. Todos os valores fornecidos acima e abaixo são concentrações finais após a adição do cultivo de semente. O KHCO3 foi utilizado para aumentar a capacidade de tamponamento do meio de crescimento para minimizar a queda de pH que normalmente ocorre durante o crescimento bacteriano. A fonte de carbono para todos estes experimentos foi uma mistura de glicose e xilose que aproximou a razão destes dois açúcares em hidrolisato de forragem de milho previamente tratado em duas concentrações diferentes de açúcar total. As concentrações iniciais de glicose e xilose foram de 92 g/l e 82 g/l, respectivamente (Figura 18) ou 107 g/l e 96 g/l (Figuras 19 e 20). Quando indicado, 6 g/l de acetato (um inibidor que está presente em hidrolisato de forragem de milho previamente tratado) também estavam presentes. O cultivo de sementes cresceu a 30 0C até ODeoo de cerca de 5,0 em meios líquidos que continham 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4 e um décimo do volume foi utilizado para inocular os cultivos experimentais. Em vários momentos, foram removidas parcelas para análise de HPLC do caldo de fermentação conforme descrito anteriormente no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose, etanol e xilitol e todos os valores são relatados em g/l. Como virtualmente toda a glicose foi consumida antes da tomada dos primeiros momentos, os valores para este açúcar não foram plotados nos gráficos.

A partir dos experimentos que são exibidos nas Figuras 18 a 20, fica claro que ZW800 apresentou melhor desempenho que ZW658 sob todas as condições testadas conforme julgado por meio de dois critérios diferentes: (a) a quantidade total de xilose que foi consumida no transcurso do experimento; e (b) o título máximo de etanol que foi atingido. Também é evidente a partir destes dados que os efeitos benéficos de desativação de GFOR ocorreram em grande parte durante a última etapa de fermentação, quando foram encontradas as condições mais estressantes (ou seja, depois que toda a glicose foi esgotada e a concentração de etanol começou a aproximar-se de níveis tóxicos). De fato, as diferenças mais surpreendentes entre as duas linhagens foram observadas quando uma concentração inibidora de acetato estava presente no meio de crescimento, o que constitui uma tensão adicional. O aumento médio do título de etanol para ZW800 na presença de acetato para os três conjuntos de condições experimentais foi de 10,2% com valores que variam de 4,4% a 13,7%. ZW800 também produziu mais etanol que ZW658 na ausência de acetato em todos os três experimentos, em que o aumento médio neste caso é de 3,2%. Conforme antecipado, ZW658 converteu quantidades significativas de xilose no subproduto indesejado xilitol e os níveis mais altos deste composto foram observados quando as condições eram as de maior tensão (ou seja, durante as últimas etapas de fermentação e com a presença de acetato no meio de crescimento). Nos experimentos com acetato que são exibidos nas Figuras 18 a 20, por exemplo, ZW658 converteu 8,1%, 8,3% e 9,9% do total de xilose que foi consumido em xilitol. Por outro lado, nenhum xilitol foi encontrado nos cultivos de ZW80Ô sob nenhuma das condições que foram testadas. Estes resultados demonstram claramente que a desativação de GFOR é benéfica para o metabolismo de xilose para a produção de etanol sob condições relevantes de processo, especialmente na presença de concentrações inibidoras de acetato. Os experimentos em tubos de ensaio que são exibidos nas Figuras 18 e 19 foram realizados duas vezes e foram obtidos resultados virtualmente idênticos.

Um outro experimento lado a lado com ZW800 e ZW658 em uma mistura concentrada de glicose e xilose com acetato foi realizado utilizando fermentadores com pH controlado. Subprodutos de metabolismo tais como ácidos orgânicos e dióxido de carbono produzidos por Z. mobilis podem reduzir o pH do meio de cultivo, o que aumenta a razão entre ácido acético e acetato, e sabe-se que a substância protonada é o composto que realmente inibe o crescimento bacteriano (Kim et al (2000), Applied Biochemistry and Biotechnology, 84-86: 357-370). Desta forma, o controle de pH é muito importante em fermentação em larga escala, pois uma queda de pH de 5,8 para 5,0 resultaria em um aumento de cerca de cinco vezes na concentração de ácido acético.

Cultivos de sementes para ZW800 e ZW658 cresceram em frascos com agitação a 37 0C em meio líquido que continha 75 g/l de glicose, g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de KH2PO4, 2 g/l de (NH4)2SO4 e 1 g/l de MgSO4; o pH inicial foi ajustado em 5,5 com 4 N KOH. Quando OD6oo atingiu cerca de 5,0, parcelas de 50 ml dos cultivos de sementes foram utilizadas para inocular fermentadores de um litro (sistema B-DCU da BIOSTAT®, Sartorius BBI System Inc., Bethlehem, Pensilvânia, Estados Unidos) que continham 450 ml de meio de cultivo. Os cultivos finais de 500 ml continham 92 g/l de glicose, 97 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 10 mM de sorbitol e 7,2 g/l de acetato. O crescimento deu-se a 33 0C e o pH foi mantido em 5,5 por meio da adição automática de 4 N KOH; a velocidade de mistura foi de 150 rpm. Em vários momentos, foram removidas parcelas para análise de HPLC do caldo de fermentação utilizando o mesmo procedimento que é descrito no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose, etanol e xilitol e o crescimento celular (ODeoo) também foi monitorado. A Figura 21 exibe o transcurso total desses parâmetros para o fermentador conduzido com o cultivo ZW800 e a Tabela 4 resume valores finais para xilose, etanol e xililol para as duas linhagens.

Tabela 4

Valores Finais para Xilose. Etanol ε Xilitol em Fermentadores com pH

Controlado com ZW800 e ZW658

zw658 zw800 Etanol (g/l) 65,95 72,31 Xilose consumida (g/l) 60,71 69,14 Xilitol (g/l) 3,92 0 Rendimento de etanol (g de etanol/g de açúcar) 0,43 0,45 De forma similar aos resultados de tubos de ensaio com acetato (Figuras 18 a 20), ZW800 consumiu 14% mais xilose e gerou 9,6% mais etanol que ZW658 nos fermentadores com pH controlado (Figura 21). O rendimento de etanol para ZW800 também foi cerca de 5% mais alto, pois esta linhagem não produziu nenhum xilitol detectável. Por outro lado, a concentração final de xilitol em caldo de fermentação para ZW658 foi de 3,92 g/l, o que representa cerca de 6,5% do total de xilose que foi consumido no transcurso do experimento. Estes experimentos fornecem evidências adicionais que a desativação de GFOR aumenta a produção de etanol a partir de xilose por meio da eliminação da formação de xilitol. Conforme já observado, o subproduto indesejado xilitol interfere com o metabolismo de xilose em pelo menos duas formas diferentes e inibe o crescimento bacteriano, o que resulta em níveis mais baixos de ATP. Desta forma, quando GFOR gera xilitol, ele reduz a capacidade de Z. mobilis de atingir todas as demais tensões de consumo de energia que normalmente encontra durante a produção de etanol a partir de estoques de alimentação de lignocelulose. Como ZW800 não necessita competir com tensões relativas a xilitol ao contrário de ZW658, ele consome mais xilose, produz mais ATP e gera mais etanol durante a última etapa de fermentação quando é encontrado o nível de tensão mais alto. Exemplo 10

Remoção do Marcador Selecionável de ZW800 e Caracterização da

Linhagem Resultante, ZW801-4 Geração da construção de expressão de Cre. pZB188-Kan/Cre

Conforme descrito no Exemplo 3, o conjunto Specr que foi inserido no quadro de leitura aberta GFOR em ZW800 é colocado em sanduíche entre dois locais IoxP do tipo selvagem. Esta disposição facilita a remoção do marcador selecionável do cromossomo utilizando Cre Recombinase (Sternberg e Hamilton (1981), J. MoL Bioi 150: 467-486; Lee e Saito, acima; Trinh et al (2000), Journal of Immunological Methods 244 (2): 185-193). A fim de fazê-lo, entretanto, foi necessário em primeiro lugar gerar um vetor de Expressão de Cre que pode reproduzir-se em Z. mobilis (Fig. 22). O precursor do vetor de Expressão de Cre foi pZB188/Kan, que foi descrito em detalhes no Exemplo 4. Resumidamente, pZB188/Kan é um vetor impulsionador que pode reproduzir-se em E. coli e Z. mobilis porque possui uma origem de reprodução para as duas espécies bacterianas. Ela também contém um fragmento de DNA que confere resistência a canamicina (ou seja, um conjunto Kanr). pZB188/Kan sofreu digestão dupla com Ncol e Notl e o fragmento de vetor grande foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. A etapa seguinte foi a geração de um conjunto de expressão de Cre e isso foi obtido por meio de PCR, utilizando os primers 17 e 18. O modelo de DNA que foi utilizado para amplificação do conjunto de expressão de Cre foi um plasmídeo que continha o gene de comprimento total para o bacteriófago Pl Cre Recombinase, incluindo o seu promotor (Sternberg et al (1986), J. Moi Biol. 187(2): 197-212).

Primer 17 (SEQ ID N0 35):

CTACTCATccataaCATCTTGAGCTTGAGAAAAACC Primer 18 (SEQ ID N0 36): r.ATnTTACTacaaccacTTATGGCTAATCGCCATCTTC

As bases sublinhadas do Primer 17 (primer frontal) hibridizam-se em NT 286-307 da seqüência de acesso GenBank n° X03453, que se encontra a cerca de 200 bp acima no fluxo a partir do códon de início de Cre, enquanto as letras minúsculas correspondem a um local Ncol que foi adicionado à extremidade 5' do primer. As bases sublinhadas do Primer 18 (primer reverso) unem-se na outra extremidade do quadro de leitura aberta de Cre a nt 1523- 1503 da seqüência de acesso Genbank n° X03453, enquanto as letras minúsculas indicam um local Notl que foi adicionado à extremidade 5' desse primer. O produto de PCR de 1238 bp sofreu digestão dupla com Ncol e Notl e o fragmento de DNA resultante, que contém o quadro de leitura aberta completa para Cre Recombinase e seus supostos promotores (Sternberg et al, 1986, acima), foi purificado por meio de eletroforese de gel de agarose. O conjunto de expressão de Cre foi inserido em seguida entre os locais Ncol e Notl do fragmento de DNA pZB188/Kan que foi descrito acima em uma reação de ligação padrão. Uma parcela da mistura de reação de ligação sofreu eletroporação em E. coli DH10B e as células transformadas foram colocadas em placas sobre meios LB que continham canamicina (50 pg/ml); o crescimento deu-se a 37 °C. DNA de plasmídeo foi isolado de um dos transformadores resistentes a canamicina e esta preparação foi introduzida em seguida em E. coli JM110 (dcm~, dam") para obter DNA de plasmídeo não metilado para transformação subsequente de Z mobilis (vide abaixo). Um mapa de plasmídeos do vetor de Expressão de Cre pZB188/Kan-Cre é exibido na Figura 22.

Tratamento de Cre para remover o marcador selecionável do cromossomo de ZW800 e cura do vetor de expressão de Cre:

Cre recombinase de bacteriófago P1 (Cre) é capaz de reconhecer uma seqüência de DNA de 34 bp específica, um "local IoxP", que contém duas repetições invertidas de 13 bp que ladeiam um núcleo assimétrico de 8 bp (Sternberg e Hamilton, 1981, acima; Lee e Saito, acima; Trinh et al, acima). Cre também é capaz de extirpar qualquer fragmento de DNA interveniente que esteja situado entre dois locais IoxP idênticos e a reação de extirpação é muito rápida. Para remover o conjunto Specr do quadro de leitura aberta GFOR, o vetor de Expressão de Cre (pZB188/Kan-Cre) foi introduzido em ZW800. O protocolo de transformação foi essencialmente conforme descrito no Exemplo 5 mas, após o período de recuperação, as células foram colocadas em placas sobre meios MMG que continham 350 Mg/ml de canamicina, que é o agente seletivo para o vetor de Expressão de Cre. Os transformadores primários que foram recuperados a partir deste processo não foram mais resistentes a espectinomicina, pois o conjunto Specr que foi removido do cromossomo por Cre é um pedaço circular de DNA que não pode reproduzir-se em Z. mobilis. Após um período de incubação de 48 horas a 30 0C sob condições anaeróbicas, dois dos transformadores primários de KanVSpecs foram submetidos ao processo de cura de plasmídeo Cre. Embora pZB188/Kan- Cre possa reproduzir-se em Z. mobilis, é relativamente fácil curar este plasmídeo por meio do cultivo das células em meio que não contém canamicina. Para curar o vetor de Expressão de Cre na presente invenção, as células foram cultivadas sob temperatura elevada (37 0C) em meios MMG líquidos que não continham canamicina; as células foram transferidas para meios de cultivo novos com a mesma composição a cada 24-36 horas. Após a ocorrência de pelo menos cinqüenta gerações, colônias separadas foram isoladas sobre placas MMG e cinco colônias dos transformadores primários originais foram selecionadas aleatoriamente para caracterização adicional. Conforme antecipado, nenhuma dessas colônias foi capaz de crescer sobre placas MMG que continham canamicina (350 pg/ml) ou espectinomicina (200 pg/ml). Embora a incapacidade de crescimento sobre canamicina fosse uma boa indicação de que o processo de cura de plasmídeos foi bem sucedido, esta conclusão foi confirmada por meio de PCR de colônia utilizando primers que se hibridizam no conjunto de expressão de Cre. Com base nestes experimentos, três dos derivados de ZW800 curados por plasmídeo e tratados com Cre foram selecionados para caracterização adicional e essas linhagens são denominadas abaixo ZW801-4, ZW801-5 e ZW801-6.

Para observar o desempenho dessas linhagens em uma mistura concentrada de glicose e xilose na presença de uma concentração inibidora de acetato, foram realizados experimentos de frascos de agitação. ZW658 e ZW800 foram também incluídos nesta análise. Os cultivos de sementes cresceram a 30 0C até OD600 de cerca de 3,0 em meios líquidos que continham 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4 e um inoculado a 10% foi utilizado para os cultivos expderimentais de 15 ml. Estes últimos foram cultivados em tubos de ensaio de 50 ml a 30 0C com suave agitação (150 rpm). O meio de crescimento continha 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4, 5 mM de sorbitol, 40 mM de KHCO3, 95 g/l de glicose, 90 g/l de xilose e 7,7 g/l de acetato; o pH inicial foi ajustado em 5,8 com ácido fosfórico concentrado. Em vários momentos, parcelas dos cultivos foram removidas para análise por HPLC do caldo de fermentação conforme descrito anteriormente no Exemplo 6. Os compostos de interesse para este experimento foram glicose, xilose, etanol e xilitol e todos os valores são relatados em g/l.

Conforme exibido na Tabela 5, ZW658 produziu 66,35 g/l de etanol e deixou para trás 40,6 g/l de xilose residual. ZW658 também produziu 3,19 g/l do subproduto indesejado xilitol, pois ele possui uma enzima GFOR funcional. De forma similar ao observado anteriormente em outros experimentos lado a lado, ZW800 consumiu 17% mais xilose e produziu 6,2% mais etanol que ZW658 e não produziu nenhum xilitol detectável. Embora fossem obtidos resultados levemente melhores com ZW801-4 e ZW801-6, estas diferenças provavelmente encontram-se dentro de erros experimentais e não são estatisticamente significativas. O desempenho relativamente ruim de ZW801-5 que foi observado neste experimento não é compreendido e não foi investigado adicionalmente. Com base nestes resultados, a linhagem ZW801-4 foi selecionada para análise adicional. Tabela 5

Experimentos de Frascos de Agitação com ZW658. ZW800. ZW801-4, ZW801-5 ε ZW801-6 em Alto Teor de Açúcar Mais Acetato

Linhagem Horas Glicose Xilose Xilitol Etanol ZW658 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW658 15,5 27,75 80,93 0 37,39 ZW658 38 0 42,71 1,85 66,53 ZW658 62 0 40,6 3,19 66,35 ZW800 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW800 15,5 30,64 81,36 0 36,05 ZW800 38 0 37,29 0 69,82 ZW800 62 0 32,34 0 70,47 ZW801-4 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW801-4 15,5 28,04 80,82 0 37,75 ZW801-4 38 0 36,13 0 70,54 ZW801-4 62 0 30,28 0 71,25 ZW801-5 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW801-5 15,5 55,61 85,62 0 21,86 ZW801-5 38 0 46,83 0 64,92 ZW801-5 62 0 39,54 0 66,19 ZW801-6 0 95,7 89,3 0 3,2 ZW801-6 15,5 32,34 82,02 0 34,89 ZW801-6 38 0 36,39 0 70,64 ZW801-6 62 0 29,55 0 71,74

Para confirmar os resultados dos experimentos de frasco de agitação que sugeriram que ZW801-4 apresentou resultados tão bons quanto ZW800, estas duas linhagens foram comparadas sob condições de pH controlado. Os cultivos de semente cresceram a 30 0C em meios que continham 75 g/l de glicose, 25 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4 e 1 g/l de MgSO4. Quando ODeoo atingiu cerca de 4,6, parcelas de 17 ml dos cultivos de semente foram utilizadas para inocular os biorreatores com pH controlado que continham 153 ml de meio de cultivo. Os cultivos finais de 170 ml continham 105 g/l de glicose, 100 g/l de xilose, 10 g/l de extrato de levedura, 2 g/l de KH2PO4, 1 g/l de MgSO4, 5 mM de sorbitol e 7,2 g/l de acetato. O crescimento ocorreu a 33 0C e o pH foi mantido em 5,5 por meio de adição automática de 4 N KOH; a velocidade de mistura foi de cerca de 150 rpm. Em vários momentos, parcelas dos cultivos foram removidas dos biorreatores para análise de HPLC do caldo de fermentação conforme descrito acima e OD6oo também foi monitorado. Sob estas condições experimentais, as curvas de crescimento para ZW800 e ZW801-4 puderam ser quase sobrepostas (Fig. 23A). Os períodos de tempo para consumo de glicose e xilose também foram virtualmente idênticos e as duas linhagens produziram a mesma quantidade de etanol com cinética similar (Fig. 23B). Além disso, nenhuma destas linhagens produziu xilitol detectável. Com base nestas observações, concluímos que a remoção do conjunto Specr do quadro de leitura aberta GFOR não restaurou nem restaurou parcialmente a atividade de enzima GFOR e que esta manipulação não prejudicou o desempenho de fermentação. Embora ZW800 e ZW801-4 apresentassem ambos melhor desempenho que a linhagem parental (ZW658), que possui uma enzima GFOR funcional, a linhagem preferida para aplicações comerciais é ZW801-4, pois ela não contém um gene exógeno que confere resistência a um antibiótico. Análise de seqüências de DNA genômico de ZW801-4 forneceu

prova inequívoca de que ocorreu o evento de extirpação de Cre correto. A seqüência de nucleotídeos completa da leitura aberta de GFOR rompida em ZW801-4 (do códon de início original até o códon de parada original) é fornecida em SEQ ID N0 37 e a Figura 24 exibe um alinhamento da seqüência mutante traduzida com a proteína GFOR do tipo selvagem; esta última é codificada pelo complemento reverso de nt 683751-685052 do acesso GenBank n° AE008692. Conforme antecipado, a extirpação de Cre do conjunto Specr deixou um único local IoxP do tipo selvagem no meio do quadro de leitura aberta GFOR e este evento de inserção resultou em um códon de parada em quadro que trunca prematuramente a proteína; o local da "cicatriz de lox" é indicado pelos resíduos indicados em cinza. A seqüência de nucleotídeos mutante também não contém cerca de 72 bp da seqüência de nucleotídeos GFOR do tipo selvagem original no mesmo local como resultado do projeto da construção suicida.

Claims (9)

1. LINHAGEM DE ZYMOMONAS RECOMBINANTE, capaz de utilizar xilose para produzir etanol, que compreende pelo menos uma modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase.

2. LINHAGEM DE ZYMOMONAS RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, em que a modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase é selecionada a partir do grupo que consiste de inserção, exclusão, mutação, cossupressão e expressão de RNA sem sentido.

3. LINHAGEM DE ZYMOMONAS RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, em que a modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase é uma inserção introduzida no gene de glicose-frutose oxidorreductase da mencionada linhagem, por meio de recombinação homóloga.

4. LINHAGEM DE ZYMOMONAS, de acordo com a reivindicação 1, identificada como uma linhagem selecionada a partir do grupo que consiste de ZW800, ZW801-4 e ZW801-6.

5. LINHAGEM DE ZYMOMONAS, de acordo com a reivindicação 1, em que a mencionada linhagem produz uma quantidade reduzida de xilitol em comparação com uma linhagem sem modificação genética que reduz a atividade de glicose-frutose oxidorreductase.

6. LINHAGEM DE ZYMOMONAS, de acordo com a reivindicação 5, em que a linhagem substancialmente não produz xilitol.

7. PROCESSO DE GERAÇÃO DE UMA LINHAGEM DE ZYMOMONAS, capaz de utilizar xilose para produzir etanol que possui reduzida atividade de GFOR, que compreende: a. fornecimento de uma linhagem de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilose para produzir etanol sob condições apropriadas; e b. introdução de pelo menos uma modificação genética na linhagem de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilose para produzir etanol de (a), em que a mencionada modificação reduz a atividade de glicose- frutose oxidorreductase.

8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 7, em que a linhagem de Zymomonas recombinante capaz de utilizar xilose para produzir etanol de (a) é selecionada a partir do grupo que consiste de ATCC31821/pZB5, Z. mobilis 8b, ZW658, ZM4 (pZB5) e Z. mobilis CP4: pZB5.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 8, em que a modificação genética é selecionada a partir do grupo que consiste de inserção, exclusão, mutação, cossupressão e expressão de RNA sem sentido.