BR112015014850B1 - Métodos de fermentação e meio de fermentação - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE FERMENTAÇÃO E COMPOSIÇÃO DO MEIO DE FERMENTAÇÃO E DA SUSPENSÃO DE REAÇÃO DE SACARIFICAÇÃO A presente invenção se refere a que através do dióxido de cloro que, em geral, é utilizado para o controle da contaminação bacteriana, foi desenvolvido um método que permite a utilização de dióxido de cloro estabilizado (SCD) para o controle da contaminação durante a fermentação que utiliza a bactéria Zymomonas como o biocatalisador, embora a Zymomonas seja sensível ao dióxido de cloro. Os parâmetros foram definidos para a inoculação de uma composição para a fermentação com as células de Zymomonas após um período de tempo decorrido após a adição de SCD.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere aos campos de microbiologia e de fermentação. Mais especificamente, os métodos foram desenvolvidos para o controle da contaminação bacteriana nas fermentações que utilizam o dióxido de cloro estabilizado em que a Zymomonas é utilizada como o biocatalisador em um meio hidrolisado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O etanol combustível produzido a partir de recursos renováveis é uma das soluções a longo prazo para a escassez mundial de combustíveis fósseis, o aumento dos custos de energia, e os efeitos do aquecimento global relacionados ao aumento de dióxido de carbono atmosférico. O etanol combustível, a partir de recursos renováveis, é produzido através da fermentação de açúcares utilizando um biocatalisador. A levedura atual é o biocatalisador mais amplamente utilizado para a produção do etanol. Os açúcares fermentáveis normalmente são obtidos a partir de biomateriais processados, incluindo os grãos de milho, beterraba de açúcar e cana de açúcar. Uma fonte de açúcar de biomaterial abundante alternativa é a biomassa celulósica ou lignocelulósica. Estão sendo desenvolvidos métodos para o processamento da biomassa celulósica ou lignocelulósica para a produção dos açúcares fermentáveis utilizando os tratamentos físicos, químicos e/ou enzimáticos.

[003] É difícil manter a esterilidade em um processo de fermentação em larga escala, particularmente quando o biomaterial é utilizado como uma fonte de carboidratos. Os processos de fermentação em larga escala, normalmente estão contaminados com bactérias que podem ser provenientes do biomaterial processado, equipamento, água de processamento ou de outras fontes. As bactérias contaminantes típicas são as bactérias do ácido lático (LAB), tais como as espécies de Lactobacillus. As bactérias contaminantes reduzem o rendimento do produto de fermentação, através da utilização dos açúcares, e reduzem a eficácia do biocatalisador do produto primário. As bactérias contaminantes produzem os produtos indesejados, tais como o ácido acético e lático que aumentam as condições de tensão na cultura ocasionando um crescimento inferior do biocatalisador e/ou menor produção do produto biocatalisador.

[004] As bactérias contaminantes, predominantemente as bactérias do ácido lático, são um problema nas fermentações que utilizam a levedura como o biocatalisador, normalmente com o mosto ou melaço utilizado como fonte de carboidratos para a produção do etanol para o combustível ou cervejeiro. Devido às diferenças de sensibilidades de levedura e bactérias contaminantes para alguns antimicrobianos, uma série de agentes antimicrobianos pode ser utilizada para o controle das bactérias nas fermentações de levedura. Os antimicrobianos utilizados com sucesso nas fermentações de leveduras para o controle da contaminação LAB incluem a penicilina (Day et al., (1954) Agricultural and Food Chemistry. 2: 252-258)., virginiamicina (Hynes et al., (1997) J. of Industrial Microbiology & Biotechnology 18: 284-291; Bischoff et al., (2009) Biotechnology and Bioengineering 103: 117122; publicação WO 2007/145857), ácidos de lúpulo (patente US 2009/0.042.276), a eritromicina, tilosina, tetraciclina e dióxido de cloro (FermaSure®; Dupont Company, Wilmington DE; Fatka, Feedstuffs (03 de novembro de 2008) página 18).

[005] O tratamento de uma corrente aquosa que compreende um carboidrato fermentável e levedura com gás ClO2 para reduzir a concentração de microrganismos indesejáveis está descrita na publicação WO 2007/097874. O tratamento de uma suspensão de leveduras a partir de um processo de produção de etanol de levedura com o dióxido de cloro para destruir contaminantes microbianos, mantendo as viabilidades da levedura está descrito na patente US 2009/0.061.490. Um processo de fermentação que compreende um açúcar fermentável, um inoculante (levedura), e o dióxido de cloro estabilizado, que é utilizado para substancialmente prevenir o crescimento de bactérias, está descrito na publicação WO 2007/149450. A utilização de dióxido de cloro estabilizado para preservar uma solução de carboidrato contra os microrganismos está descrita na publicação WO 2011/038317.

[006] A Zymomonas está sendo desenvolvida como um biocatalisador eficaz para a produção do etanol através da manipulação dos aprimoramentos da cepa, incluindo a utilização de xilose e arabinose em adição à glicose, e inativação das vias metabólicas competidoras. Além disso, a Zymomonas foi adaptada para a utilização no hidrolisado por meio de fermentação através do aumento da tolerância aos inibidores presentes no hidrolisado da biomassa celulósica. No entanto, a utilização da Zymomonas como um biocatalisador para a fermentação de etanol apresenta desafios adicionais no controle de contaminação uma vez que este biocatalisador é uma bactéria, assim como são os contaminantes mais predominantes. Por conseguinte, a atividade diferencial de agentes antimicrobianos para a levedura e as bactérias não pode ser explorada da mesma maneira como nos processos que produzem o etanol, utilizando um biocatalisador levedura.

[007] Continua a existir uma necessidade de métodos para o controle dos contaminantes bacterianos nas fermentações que utilizam um biocatalisador bacteriano de Zymomonas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção se refere às composições e métodos para o controle da contaminação bacteriana nas fermentações em que a Zymomonas é o biocatalisador.

[009] Consequentemente, a presente invenção se refere a um método de fermentação para o controle da contaminação bacteriana em um processo de fermentação que compreende um biocatalisador de Zymomonas que compreende: (a) fornecer um meio de crescimento que possui o potencial para ser contaminado por uma espécie bacteriana; (b) adicionar uma quantidade eficaz de dióxido de cloro estabilizado para o meio de crescimento de (a) formação de uma mistura de dióxido de cloro estabilizado, em que a temperatura da mistura de dióxido de cloro estabilizado, é superior a cerca de 33 °C; (c) inocular a mistura de (b) com as células de Zymomonas a uma temperatura adequada para as células de Zymomonas para a produção de um caldo inoculado; e (d) fermentar o caldo inoculado sob condições adequadas para o crescimento das células de Zymomonas; - em que a contaminação bacteriana é controlada durante a fermentação.

[010] Em uma realização, a Zymomonas é uma produção de etanol e o etanol é produzido no caldo de fermentação do método.

[011] Em uma outra realização, a presente invenção fornece uma composição de mistura do meio de fermentação que compreende: (a) o meio de fermentação do hidrolisado da biomassa celulósica; e (b) o dióxido de cloro estabilizado.

[012] Em ainda outra realização, a presente invenção fornece uma reação de sacarificação da composição da mistura fluida da suspensão, que compreende: (a) a biomassa celulósica; (b) pelo menos, uma enzima de celulase; e (c) o dióxido de cloro estabilizado.

[013] Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de fermentação para o controle da contaminação bacteriana em um processo de fermentação que contém um biocatalisador Zymomonas que compreende as etapas: (a) fornecer um meio de semente sem o hidrolisado de biomassa celulósica selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) meio definido, (ii) meio que contém uma fonte de açúcar do biomaterial não celulósico, e (iii) hidrolisado de biomassa celulósica clarificada; (b) inocular o meio de semente de (a) com as células de produção de etanol Zymomonas para a formação de uma cultura de sementes; (c) cultivar as células de Zymomonas na cultura de sementes de (b); (d) inocular uma suspensão da reação de sacarificação com a cultura de sementes de (c) para a produção de uma suspensão de sacarificação inoculada; (e) misturar a suspensão de sacarificação inoculada com um meio de fermentação para a produção de um caldo de fermentação; e (f) cultivar as células de Zymomonas de produção de etanol no caldo de fermentação sob condições em que o etanol é produzido; - em que: - o dióxido de cloro estabilizado é adicionado a, pelo menos, um de (i) o meio de sementes da etapa (a); (ii) a suspensão da reação de sacarificação da etapa (d) ou (iii) o meio de fermentação da etapa (e); e - em que: - se o dióxido de cloro estabilizado, for adicionado ao meio de sementes da etapa (a) o meio de sementes é mantido a uma temperatura de, pelo menos, cerca de 33 °C durante, pelo menos, cerca de 6 horas antes da inoculação com a produção de etanol de Zymomonas; e - em que: - se o dióxido de cloro estabilizado, for adicionado à suspensão de reação de sacarificação da etapa (d) a suspensão de reação de sacarificação é mantida a uma temperatura de, pelo menos, cerca de 33 °C durante, pelo menos, cerca de 8 horas antes da inoculação com a cultura de sementes; e - em que: - se o dióxido de cloro estabilizado, for adicionado ao meio de fermentação da etapa (e), o meio de fermentação é mantido a uma temperatura de, pelo menos, cerca de 33 °C durante, pelo menos, cerca de 8 horas antes da mistura com a suspensão da reação de sacarificação; e - em que: - qualquer uma da cultura de sementes, a suspensão inoculada ou a sacarificação do caldo de fermentação que compreende as células de Zymomonas contém uma quantidade inferior a cerca de 5 g/L de ácido láctico durante o período do crescimento das células de Zymomonas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[014] A Figura 1 mostra um diagrama da via de fermentação do etanol da Zymomonas manipulada para a utilização da xilose.

[015] A Figura 2 é um gráfico que mostra o crescimento de células de Zymomonas no meio MRM3G10 que contém diferentes quantidades de dióxido de cloro estabilizado (SCD).

[016] A Figura 3 é um gráfico que mostra a produção de etanol por células de Zymomonas em meio hidrolisado que foi mantido a 33 °C ou 47 °C, com 298 mg/kg, ou nenhum SCD adicionado, durante 6 horas antes da inoculação das células de Zymomonas a 33 °C.

[017] A Figura 4 mostra os gráficos de produção de etanol por meio de células de Zymomonas no meio hidrolisado com 151 mg/kg ou 301 mg/kg de dióxido de cloro e em 4(A) imediatamente inoculado; ou em 4(B) inoculado a 33 °C após 24 ou 48 horas a 47 °C.

[018] A Figura 5 mostra os gráficos de produção de ácido láctico (A) e a produção de etanol (B), pelas células de Zymomonas que foram inoculadas no hidrolisado que foi produzido a partir de reações de sacarificação em que quantidades variáveis de SCD foram acrescentadas no início da sacarificação, com a inoculação a 33 °C após 48 horas a 47 °C, pH inicial de 5,3. Em uma amostra adicional, 316 mg/kg de SCD foram adicionados após 24 horas de sacarificação, seguido de inoculação a 33 °C após 48 horas a 47 °C.

[019] A Figura 6 mostra os gráficos de produção de etanol por células de Zymomonas em meio MRM3G6 que foi administrado com 301 mg/kg de dióxido de cloro e mantido a 33 °C, em seguida, inoculado após 19,5 ou 23 horas.

[020] A Figura 7 mostra os gráficos de produção de etanol por células de Zymomonas em meio que foi administrado com 301 mg/kg de dióxido de cloro e mantido a 47 °C, em seguida, inoculado em 33 °C após 8, 16, 24 ou 48 horas, em que (A) é o meio hidrolisado e (B) é o meio MRM3G6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[021] A presente invenção se refere à utilização de dióxido de cloro estabilizado (SCD) como um agente antimicrobiano para o controle das bactérias contaminantes nas fermentações que utilizam a Zymomonas como o biocatalisador, tal como para a produção do etanol. As bactérias contaminantes presentes em uma solução de carboidrato ou suspensão são controladas por SCD, no entanto, descobriu-se no presente que o SCD é prejudicial para o crescimento e produção de células de Zymomonas. Um processo para o controle da contaminação durante a fermentação Zymomonas que utiliza o dióxido de cloro estabilizado foi desenvolvido. Em particular, o dióxido de cloro estabilizado é adicionado a um meio de crescimento (que pode incluir um meio de fermentação ou suspensão da reação de sacarificação) que é mantido a uma temperatura que é superior a 33 °C durante um período de tempo antes de reduzir a temperatura até uma temperatura que é adequada para a fermentação, caso necessário, e inoculando com as células de Zymomonas formando um caldo de fermentação. A redução da temperatura é necessária, se a temperatura à qual a mistura de SCD é mantida é mais elevada do que é adequado para a fermentação. Ao permitir um período de tempo à temperatura elevada decorrido entre a adição de SCD e inoculação com as células Zymomonas, o efeito prejudicial de SCD é aliviado de tal maneira que as células de Zymomonas efetivamente podem crescer e produzir o etanol. Um fator que afeta o período de tempo necessário é o tipo de meio de crescimento ou meio de fermentação, em que o SCD é adicionado, ou se o SCD é adicionado a uma suspensão da reação de sacarificação, e o tipo de suspensão.

[022] Este processo pode ser utilizado para a produção eficiente de etanol a partir de recursos renováveis para a utilização como aditivo de combustível para tratar a escassez de combustíveis fósseis, reduzir os custos de energia e impactar o aquecimento global.

[023] As seguintes definições e abreviações devem ser utilizadas para a interpretação das reivindicações e da especificação.

[024] Conforme utilizados no presente, os termos “compreende”, “que compreendem”, “inclui”, “incluindo”, “possui”, “possuindo”, “contém” ou “que contém”, ou qualquer outra variação do mesmo, pretendem abranger uma inclusão não exclusiva. Por exemplo, uma composição, mistura, processo, método, artigo ou equipamento que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos que não estejam expressamente listados ou sejam inerentes a essa composição, mistura, processo, método, artigo ou equipamento. Além disso, salvo expressamente indicado em contrário, “ou” se refere a uma inclusão e não a uma exclusão. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer uma das seguintes opções: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente), e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

[025] Além disso, os artigos indefinidos “um” e “uma” que precedem um elemento ou componente da presente invenção pretendem ser não restritivos em relação ao número de casos (isto é, as ocorrências) do elemento ou componente. Por conseguinte, “um” ou “uma” deve ser lido incluindo um ou pelo menos um, e a forma da palavra singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número obviamente signifique o singular.

[026] O termo “invenção” ou “presente invenção”, conforme utilizado no presente é um termo não limitante e não pretende se referir a qualquer realização singular da presente invenção especificada, mas engloba todas as possíveis realizações conforme descritas na presente invenção e nas reivindicações.

[027] Conforme utilizado no presente, o termo “cerca de”, que modifica a quantidade de um ingrediente ou reagente da presente invenção, se refere à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através da medição típica e dos procedimentos para a manipulação de líquidos utilizada na fabricação de concentrados ou da utilização de soluções na prática, através do erro involuntário nestes procedimentos; através de diferenças de fabricação, fonte ou grau de pureza dos ingredientes utilizados para a produção das composições ou realização dos métodos; e similares. O termo “cerca de” também engloba as quantidades que diferem devido a diferentes condições de equilíbrio para uma composição resultante de uma determinada mistura inicial. Sejam ou não alteradas pelo termo “cerca de”, as reivindicações incluem equivalentes para as quantidades. Em uma realização, o termo “cerca de” significa dentro de 10% do valor numérico relatado, de preferência, dentro de 5% do valor numérico relatado.

[028] O termo “produção do etanol” se refere a um organismo que produz o etanol através do metabolismo de fontes de carboidratos.

[029] O termo “açúcar(es) fermentável(is)” se refere aos oligossacarídeos e monossacarídeos que podem ser utilizados como uma fonte de carbono através de um microrganismo em um processo de fermentação.

[030] O termo “sacarificação e fermentação simultâneas (SSF)” se refere a um processo em que a biomassa é sacarificada e os açúcares fermentáveis produzidos a partir de sacarificação são utilizados através de um biocatalisador para a produção de um produto, ao mesmo tempo, normalmente no mesmo recipiente de reação.

[031] O termo “celulose” se refere a uma composição que compreende a celulose e os componentes adicionais, que podem incluir a hemicelulose e lignina.

[032] O termo “lignocelulósico” se refere a uma composição que compreende a lignina e a celulose. O material lignocelulósico também pode compreender a hemicelulose.

[033] O termo “sacarificação” se refere à produção de açúcares fermentáveis a partir de polissacarídeos.

[034] O termo “biomaterial” se refere a qualquer material derivado biológico que é uma fonte de carboidratos que pode ser utilizado na fermentação através de um biocatalisador. O biomaterial inclui a biomassa celulósica, bem como outros materiais de vegetais e materiais derivados de vegetais utilizados como fontes de carboidratos tais como os grãos, mosto, melaço, e sumo bruto (tal como a partir da beterraba de açúcar e da cana de açúcar).

[035] O termo "suspensão" se refere a uma mistura do material insolúvel e um líquido.

[036] O termo "suspensão da reação de sacarificação da biomassa celulósica" se refere a uma mistura que compreende a biomassa celulósica e pelo menos, uma enzima celulase em que a celulose e outros polissacarídeos são hidrolisados para a produção dos açúcares fermentáveis durante a reação. A biomassa também pode ser pré-tratada antes da inclusão em uma suspensão da reação de sacarificação. A mistura contém o material insolúvel e um líquido e, por conseguinte, é uma suspensão.

[037] O termo “biomassa pré-tratada” significa uma biomassa que foi submetida ao pré-tratamento antes da sacarificação.

[038] O termo “biomassa celulósica” se refere a qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui os materiais que compreendem a celulose e, opcionalmente, que ainda compreende a celulose, hemicelulose, lignina, amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa celulósica também pode compreender os componentes adicionais, tais como a proteína e/ou lipídio. A biomassa celulósica pode ser derivada a partir de uma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; por exemplo, a biomassa poderia compreender uma mistura dos sabugos de milho e palha de milho ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa celulósica inclui, mas não está limitada às culturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, resíduos de jardim, resíduos de madeira e de silvicultura. Os exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados aos sabugos de milho, resíduos de plantação, tais como as cascas de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas do gênero Panicum (switchgrass), resíduos de papel, bagaço da cana de açúcar, material de celulose vegetal do sorgo ou soja e os componentes celulósicos obtidos a partir processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbusto e moitas (componentes celulósicos lenhosos), vegetais, frutas, flores e esterco animal.

[039] O termo “hidrolisado de biomassa celulósica” se refere ao produto resultante a partir da sacarificação da biomassa celulósica ou lignocelulósica. A biomassa também pode ser pré-tratada antes da sacarificação. O hidrolisado de biomassa celulósica é um produto que contém os sólidos de biomassa.

[040] O termo “hidrolisado de biomassa celulósica clarificada” ou “hidrolisado de biomassa celulósica clara” se refere a um hidrolisado de biomassa celulósica, que foi processado para remover os sólidos e não é considerado para ser um hidrolisado de biomassa celulósica.

[041] O termo “enzima de sacarificação” se refere a uma enzima que pode catalisar a conversão de um componente de biomassa em açúcares fermentáveis. Normalmente, a enzima é mais eficaz quando a biomassa é pré- tratada.

[042] O termo “contaminação substancial” se refere a um nível de contaminação por bactérias do ácido lático em um caldo de fermentação, que iria produzir uma quantidade superior a cerca de 5 g/L de ácido lático se o caldo de fermentação fosse incubado, sem um agente antimicrobiano durante cerca de 40 horas.

[043] O termo “bactéria do ácido lático” se refere às bactérias que produzem o ácido lático como o produto final metabólico principal da fermentação de carboidratos. As bactérias do ácido lático (LAB) são as bactérias gram positivas que pertencentes à ordem Lactobacillales, e incluem, por exemplo, os genêros Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus, e Enterococcus.

[044] O termo "meio de crescimento" significa um meio líquido capaz de suportar o crescimento de um biocatalisador Zymomonas. Os meios de crescimento típicos úteis na presente invenção incluem o meio de fermentação e de suspensões de reação de sacarificação que podem compreender o hidrolisado de biomassa celulósica.

[045] O termo “meio de fermentação” se refere a uma composição que compreende os componentes, tais como os nutrientes, que suportam o crescimento de um microrganismo utilizado como um biocatalisador. O meio de fermentação pode ser utilizado em qualquer tamanho, incluindo as fermentações de produção de culturas de pequena escala e larga escala.

[046] O termo “caldo de fermentação” se refere a uma composição que compreende o meio de fermentação e as células do biocatalisador em que a fermentação está ocorrendo ou ocorreu. Dependendo do tempo que o biocatalisador está sendo cultivado no caldo de fermentação, este caldo também pode incluir o produto produzido através do biocatalisador, tal como o etanol.

[047] O termo “cultura de semente” é uma cultura de células do biocatalisador que é utilizada para inocular um volume maior do meio de fermentação para a produção de um caldo de fermentação. Normalmente, uma cultura de inóculo de sementes é de cerca de 0,01% a 20% v/v do volume final do caldo de fermentação.

[048] O termo “contaminação” se refere à presença de microrganismos que não são intencionalmente introduzidos. Normalmente um biocatalisador desejado, é introduzido em um meio de crescimento para a produção de um caldo de fermentação. Os microrganismos presentes no caldo de fermentação diferentes do biocatalisador introduzido são considerados contaminação.

[049] O presente método fornece um controle de bactérias indesejadas nas culturas em que uma bactéria Zymomonas é o biocatalisador, tal como na fermentação para a produção do etanol. As bactérias contaminantes indesejadas normalmente estão presentes nos processos em larga escala, particularmente quando os meios contêm o biomaterial processado. O biomaterial processado utilizado nos meios podem incluir as fontes de carboidratos, tal como o milho ou mosto de trigo, melaço de beterraba de açúcar ou de cana de açúcar, e hidrolisado de biomassa lignocelulósica. As bactérias contaminantes podem ser introduzidas em um processo de fermentação a partir dos biomateriais, equipamento do processo, culturas de inoculação, água de processamento, ar, ou outras fontes. O controle da contaminação em uma fermentação de produção normalmente permite que o biocatalisador cresça e produza o produto para um nível mais elevado que o obtido na presença de contaminação de bactérias, fornecendo um processo de fermentação mais eficiente e econômico.

[050] Embora o dióxido de cloro, em geral, seja utilizado para o controle da contaminação bacteriana, foi desenvolvido um método que permite a utilização de dióxido de cloro estabilizado (SCD) para o controle da contaminação durante a fermentação que utiliza a bactéria Zymomonas como o biocatalisador, embora a Zymomonas seja sensível ao dióxido de cloro. As bactérias predominantes contaminantes nas fermentações em larga escala, utilizando fontes de carboidratos derivados de biomassa são bactérias do ácido láctico (LAB), tais como as cepas de Lactobacillus. As bactérias contaminantes competem com o biocatalisador para os açúcares fermentáveis e/ou produz substâncias que são inibidoras para o crescimento e produção de biocatalisador, tal como o ácido láctico. No presente método, o SCD é adicionado a uma suspensão de reação meio de fermentação ou sacarificação potencialmente contaminada que é utilizada para fornecer os açúcares fermentáveis por fermentação de Zymomonas, um período de tempo é permitido e, em seguida, a mistura que contém o SCD é inoculada com as células de Zymomonas. Descobriu-se no presente que, embora um nível de SCD que é eficaz para o controle de bactérias contaminantes típicas também seja inibitório para o crescimento celular e a produção de etanol Zymomonas, se um período de tempo decorre entre a adição de SCD e a inoculação da célula de Zymomonas, as células de Zymomonas mostram os níveis de crescimento e de formação de produto durante a fermentação comparáveis àqueles sem tratamento de SCD, enquanto a contaminação permanece baixa.

DIÓXIDO DE CLORO ESTABILIZADO

[051] O termo “dióxido de cloro estabilizado” também referido no presente como o SCD significa um ou mais complexos do oxi-clorito que contem o dióxido de cloro, um ou mais compostos que contêm o clorito, uma ou mais outras entidades capazes de formar o dióxido de cloro, quando exposto ao ácido, e suas combinações. Por conseguinte, o dióxido de cloro estabilizado compreende, pelo menos, um ou mais complexos do oxi-clorito que contem o dióxido de cloro, um composto que contem o clorito, ou uma entidade capaz de formar o dióxido de cloro em um meio líquido, quando exposto ao ácido.

[052] Entre um complexo do oxi-clorito que contém o dióxido de cloro está aquele que é selecionado a partir do grupo que consiste em um complexo do dióxido de cloro com o carbonato, um complexo de dióxido de cloro com o bicarbonato e suas misturas. Os exemplos dos compostos que contem o clorito incluem os cloritos metálicos e em particular, os cloritos de metais alcalinos e de metais alcalinos terrosos. Um exemplo específico de um composto que contém o clorito que é útil como o precursor do dióxido de cloro é o clorito de sódio, que pode ser utilizado como o clorito de sódio de grau técnico.

[053] O SCD, de preferência, é uma solução aquosa, de um clorito de metal alcalino ou de metal alcalino terroso, normalmente de clorito de sódio (NaClO2). O clorito de sódio na solução, em geral, é, estável a um pH superior a 7, mas liberta o dióxido de cloro ativo (ClO2), quando o pH é reduzido abaixo da neutralidade (pH 7). A taxa de ativação de SCD, isto é, a taxa em que o ClO2 ativo é liberado da forma estável, aumenta à medida que o pH diminui.

[054] A composição química exata de muitas das composições de SCD, e, em particular, dos complexos do oxi-clorito que contem o dióxido de cloro, não é completamente compreendida. A fabricação ou a produção de determinados precursores do dióxido de cloro está descrito por Gordon, patente US 3.585.147 e Lovely, patente US 3.591.515. Os exemplos específicos do dióxido de cloro estabilizado comercialmente disponíveis e úteis incluem, por exemplo, o Anthium Dioxcide® e FermaSure®, disponível pela E.I. du Pont de Nemours and Company, (Wilmington, DE); OXINA® e PUROGENE®, disponível pela Bio-Cide International, Inc. (Norman, OK).

[055] O SCD pode ser fornecido como uma solução de um ou mais complexos do oxi-clorito que contem o dióxido de cloro, um ou mais compostos que contêm o clorito, uma ou mais outras entidades capazes de formar o dióxido de cloro, quando exposto ao ácido, e suas combinações. A solução fornece SCD em um líquido a uma concentração pré-determinada de ingredientes ativos disponíveis, tal como o dióxido de cloro (ClO2). De preferência, o meio líquido possui uma concentração de dióxido de cloro disponível no intervalo de cerca de 0,002% a cerca de 40% em peso, de preferência, no intervalo de cerca de 2% a cerca de 25% em peso, de maior preferência, no intervalo de cerca 5% a cerca de 15% em peso, com base no peso total do meio líquido, incluindo os complexos de oxi-cloro que contém o dióxido de cloro, os compostos que contêm o clorito, outras entidades capazes de formar o dióxido de cloro, quando exposto ao ácido, e suas combinações.

[056] O SCD pode ser fornecido como um material sólido, tal como uma composição que compreende um pó de clorito de metal alcalino ou de metal alcalino terroso, ingredientes inertes e, opcionalmente, um ativador seco, tal como um ácido seco.

[057] O SCD também pode ser fornecido como uma mistura (ou suspensão) que compreende uma solução saturada de pó do clorito de metal alcalino ou alcalino terroso e pó do clorito de metal alcalino ou alcalino terroso adicional. Tais suspensões fornecem um SCD líquido com um nível de ingrediente ativo superior ao disponível na forma de solução.

[058] Em uma realização, o SCD é o clorito estabilizado de metal alcalino, mais especificamente, o clorito de sódio (NaClO2) que é o mais comum e comercialmente disponível dos cloritos de metais alcalinos. O termo “clorito estabilizado de metal alcalino” significa uma solução tamponada do clorito a um pH superior a 7, de preferência, pH de 9 a 10. A solução normalmente compreende de 5 a 22% em peso/peso de clorito de sódio em água, embora a concentração de cloreto de sódio também possa ser superior ou inferior.

[059] Normalmente, o clorito de sódio é utilizado como uma solução aquosa que compreende de 5 a 22% em peso, com base no peso da solução de clorito de sódio em água. As concentrações de SCD podem ser descritas em termos da concentração do dióxido de cloro (ClO2) disponível quando o clorito é estequiometricamente convertido em dióxido de cloro, “ClO2 disponível”. O teor do dióxido de cloro potencial em 1 g do clorito de sódio é de 0,597 g. As soluções do clorito de sódio compreendem de 5 a 22% em peso do clorito de sódio e, por conseguinte, contêm de 2,98 a 13,13% do dióxido de cloro disponível. A geração do ClO2 é ilustrada pela seguinte Equação (1): - 5 NaClO2 + 4H+ ^ 4 CIO2 (g) + 2H2O + CI—+ 5 Na+ (1) - em que uma molécula de NaClO2 fornece 0,8 moléculas de ClO2

[060] As concentrações de SCD normalmente são especificadas como a quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir de uma preparação de SCD após a ativação completa por ácido. Isto uniformiza as concentrações de dióxido de cloro fornecidas em diferentes preparações de SCD, utilizadas em composições com diferentes valores de pH.

[061] Quando SCD é uma solução aquosa de clorito de sódio, o SCD possui um pH superior a pH 7. As soluções de clorito de sódio liberam o dióxido de cloro ativo à medida que o pH é reduzido. A liberação de dióxido de cloro a partir de soluções aquosas de SCD aumenta à medida que o pH é reduzido a partir do pH de cerca de 5 a 6,6, para 2,6. Esta taxa pode variar dependendo de diversos fatores. Por exemplo, diferentes precursores de ClO2 podem liberar o ClO2 a taxas diferentes no mesmo ou pH similar. Outros fatores, tais como a capacidade de tamponamento da solução pode afetar a taxa de liberação de SCD a partir de soluções de ClO2. Estes fatores são bem conhecidos dos técnicos do assunto.

MISTURAS DE DIÓXIDO DE CLORO ESTABILIZADO PARA A FERMENTAÇÃO DE ZYMOMONAS

[062] No presente método, o SCD é adicionado a uma composição para a fermentação, tal como um de meio de fermentação ou suspensão de reação de sacarificação, formando uma mistura de dióxido de cloro estabilizado antes da mistura ser inoculada com um biocatalisador da célula Zymomonas. Por conseguinte, o SCD é adicionado ao meio de fermentação ou suspensão de reação de sacarificação que é uma fonte de açúcares fermentáveis para a fermentação de células Zymomonas. Descobriu-se no presente que, embora as células Zymomonas sejam sensíveis ao dióxido de cloro, o SCD pode ser adicionado às composições que são uma fonte de açúcares para a fermentação de células de Zymomonas se um período de tempo decorrer antes da inoculação com as células de Zymomonas.

[063] O SCD pode ser adicionado ao meio de crescimento de qualquer tipo que suporta o crescimento e produção durante a fermentação com Zymomonas como o biocatalisador. Um técnico do assunto saberá como preparar qualquer um dos tipos dos meios descritos, tendo em conta as informações abaixo. Em uma realização, o meio de crescimento é um meio definido. Este meio contém os componentes adquiridos típicos incluindo uma fonte de carboidratos, tal como a glicose, uma fonte de aminoácidos e outros nutrientes, tal como o extrato de levedura, e outros componentes que podem incluir os elementos de vestígio, nitrogênio e fósforo, tais como o KH2PO4 e MgSO4. O meio definido muitas vezes é utilizado para o cultivo de culturas em escala laboratorial, bem como as culturas de sementes que são utilizadas como o inóculo para as fermentações em larga escala.

[064] Em uma outra realização, o meio de crescimento contém os açúcares obtidos a partir dos materiais não celulósicos, tais como o mosto, sumos bruto, ou melaço. Estes açúcares são preparados a partir dos biomateriais, tais como os grãos de cereais (tais como o milho, trigo, cevada, e centeio), e as culturas de açúcar, tais como a beterraba do açúcar e a cana de açúcar. O mosto hidrolisado utilizado para a fermentação é produzido a partir dos grãos de cereais, normalmente através do aquecimento a uma temperatura acima da temperatura de gelatinação, tratando com a alfa-amilase para a liquefação e sacarificação, utilizando as enzimas tal como a glucoamilase. O melaço ou sumo bruto a partir de beterraba de açúcar e da cana de açúcar pode ser utilizado como fonte de açúcar no meio de fermentação. Este tipo de fonte de açúcar é uma fonte de açúcar do biomaterial não celulósico (celulósico inclui o lignocelulósico), uma vez que a fonte de açúcar principalmente é o amido ou sumo de açúcar. Este tipo de fonte de açúcar normalmente é utilizado nas culturas de sementes e na produção do etanol a partir de levedura como um biocatalisador, e outras fermentações não celulósicos em grandes escala.

[065] Os meios definidos e meios que possuem um açúcar a partir de uma fonte não celulósica não possuem o hidrolisado de biomassa celulósico (incluindo o lignocelulósico). Além disso, os meios que contêm uma fonte de açúcar, que é obtida a partir da biomassa celulósica, e é altamente purificada para remover outros componentes celulósicos, tais como os sólidos, são considerados como sendo o meio que não contém o hidrolisado de biomassa celulósica. Este tipo de meio contém um hidrolisado de biomassa celulósica clarificada.

[066] Em ainda outra realização, o meio de crescimento contém o hidrolisado de biomassa celulósica preparado a partir dos biomateriais da celulose (incluindo a lignocelulósica). O hidrolisado de biomassa celulósica contém os sólidos de biomassa. O hidrolisado de biomassa celulósica é produzido através da sacarificação da biomassa celulósica (incluindo a lignocelulósica). Normalmente, a biomassa é pré-tratada antes da sacarificação. A biomassa pode ser tratada através de qualquer método conhecido por um técnico do assunto para a produção dos açúcares fermentáveis em um hidrolisado. Normalmente, a biomassa é pré-tratada utilizando os tratamentos físicos e/ou químicos, e sacarificada enzimaticamente. Os tratamentos físicos e químicos incluem, mas não estão limitados à trituração, moagem, corte, tratamento base tal como com a amônia ou com o NaOH, e/ou tratamento com o ácido. Particularmente útil, é um pré-tratamento com baixo teor de amônia em que a biomassa é colocada em contato com uma solução aquosa que compreende a amônia para a formação de uma mistura de biomassa - amônia aquosa em que a concentração de amônia é suficiente para manter o pH alcalino da mistura de biomassa - amônia aquosa, mas é inferior a cerca de 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa, e em que o peso seco da biomassa é, pelo menos, cerca de 15% em peso dos sólidos em relação ao peso da mistura de biomassa - amônia aquosa, conforme descrito na patente de propriedade comum US 7.932.063, que está incorporada no presente como referência.

[067] A sacarificação enzimática da biomassa celulósica ou lignocelulósica normalmente utiliza uma composição ou mistura de enzimas para romper a celulose e/ou hemicelulose e para a produção de um hidrolisado que contém os açúcares incluindo a glicose, xilose e arabinose. As enzimas sacarificadas são revistas em Lynd, L.R., et al., (Microbiol. Mol. Biol. Rev., 66:506-577, 2002). Pelo menos, uma enzima é utilizada e, normalmente, uma mistura de enzimas de sacarificação é utilizada que inclui uma ou mais glicosidases. As glicosidases hidrolisam as ligações de éter de di-, oligo- e polissacarídeos e são encontradas na classificação da enzima EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, Califórnia, com Suplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 [na Eur J. Biochem, 223: 1-5, 1994; Eur J. Biochem, 232:1-6, 1995; Eur J. Biochem., 237: 1-5., 1996; Eur J. Biochem, 250: 1-6, 1997; e Eur J. Biochem, 264: 610-650 1999, respectivamente]) das “hidrolases” do grupo geral (EC 3). As glicosidases úteis no presente método podem ser categorizadas pelos componentes da biomassa que hidrolisam. As glicosidases úteis para o presente método incluem as glicosidases que hidrolisam a celulose (por exemplo, as celulases, endoglucanases, exoglucanases, celobioidrolases, β-glucosidases), as glicosidases que hidrolisam a celulose (por exemplo, as xilanases, endoxilanases, exoxilanases, β-xilosidases, arabino-xilanases, mannases, galactases, pectinases, glucuronidases), e as glicosidases que hidrolisam o amido (por exemplo, as amilases, α-amilases, β-amilases, glucoamilases, α-glucosidases, isoamilases). Além disso, pode ser útil para acrescentar outras atividades ao consórcio de enzima de sacarificação, tais como as peptidases (EC 3.4.x.y), lipases (EC 3.1.1.x e 3.1.4.x), ligninases (EC 1.11.1.x), ou esterases de feruloil (EC 3.1.1.73) para promover a liberação dos polissacarídeos de outros componentes da biomassa. É conhecido no estado da técnica que os microrganismos que produzem as enzimas que hidrolisam os polissacarídeos frequentemente exibem uma atividade, tal como uma capacidade para degradar a celulose, que é catalisada por diversas enzimas ou um grupo de enzimas que possuem diferentes especificidades de substrato. Por conseguinte, um “celulase” a partir de um microrganismo pode compreender um grupo de enzimas, uma ou mais ou todas que podem contribuir para a atividade da degradação da celulose. As preparações de enzimas comerciais ou não comerciais, tal como a celulase, pode compreender inúmeras enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima. Muitas enzimas da hidrolase de glicosila e suas composições que são úteis para a sacarificação estão descritas na publicação WO 2011/038019.

[068] As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente. Tais enzimas incluem, por exemplo, a celulase Spezyme® CP, xilanase Multifect®, Accelerase® 1500, e Accellerase® DUET (Danisco US Inc., Genencor International, Rochester, NY), e Novosyme-188 (Novozymes, 2880 Bagsvaerd, Dinamarca). Além disso, as enzimas de sacarificação podem ser não purificadas e fornecidas como uma preparação do extrato de células ou de células inteiras. As enzimas podem ser produzidas utilizando os microrganismos recombinantes que foram manipulados para expressar uma ou mais enzimas de sacarificação. Por exemplo, a preparação da proteína H3A utilizada no presente para a sacarificação da biomassa celulósica pré-tratada é uma preparação de enzimas não purificadas produzidas por uma cepa geneticamente manipulada de Trichoderma reesei, que inclui uma combinação de celulases e hemicelulases e está descrita na publicação WO 2011/038019, que está incorporada no presente como referência.

[069] As enzimas adicionais para a sacarificação incluem, por exemplo, as hidrolases de glicosila, tais como os membros das famílias GH3, GH39, GH43, GH55, GH10, e GH11. As GHs são um grupo de enzimas que hidrolisam a ligação glicosídica entre dois ou mais carboidratos, ou entre um carboidrato e uma porção de não carboidratos. As famílias de GHs foram classificadas com base na similaridade de sequência e a classificação está disponível no banco de dados da enzima ativa de carboidratos (CAZy) (Cantarel et al., (2009) Nucleic Acids Res 37 (edição de banco de dados): D233-238). Algumas destas enzimas são capazes de atuar em diversos substratos e demonstraram a eficácia como enzimas de sacarificação. As enzimas da família 3 das hidrolases do glicosídeo (“GH3”) possuem um determinado número de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades da β-glicosidase (EC: 3.2.1.21); β-xilosidase (EC: 3.2.1.37); β-glucosaminidase de N-acetia (EC: 3.2.1.52); β-1,3-glicosidase de glucano (EC: 3.2.1.58); cellodextrinase (EC: 3.2.1.74); exo-1,3-1,4-glucanase (EC: 3.2.1); e/ou β-galactosidase (EC 3.2.1.23). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 39 (“GH39”) também possuem um determinado número de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades da α-L-iduronidase (EC: 3.2.1.76) e/ou β-xilosidase (EC: 3.2.1.37). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 43 (“GH43”) possuem um determinado número de atividades conhecidas, incluindo, por exemplo, as atividades de L-α-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55); β-xilosidase (EC 3.2.1.37); endoarabinanase (CE 3.2.1.99); e/ ou 1,3-β-galactosidase de galactano (EC 3.2.1.145). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 51 (“GH51”) são conhecidas por possuírem, por exemplo, as atividades de L-α- arabinofuranosidase (CE 3.2.1.55) e/ou endoglucanase (EC 3.2.1.4). As enzimas família das hidrolases do glicosídeo 10 (“GH10”) foram descritas em detalhe em Schmidt et al., 1999, Biochemistry 38: 2.403-2.412 e Leggio Lo et al., 2001, FEBS Lett 509: 303-308) e a família da hidrolase do glicosídeo 11 (“GH11”) foram descritas em Hakouvainen et al., 1996, Biochemistry 35: 9.617-24.

[070] A composição da mistura do meio de fermentação presente compreende o meio de fermentação do hidrolisado de biomassa celulósica e SCD. O termo "quantidades eficazes" de SCD será qualquer quantidade que seja eficaz de matar as espécies bacterianas contaminantes, sem prejudicar o biocatalisador. A quantidade eficaz de SCD irá variar em função do tipo de meio de crescimento utilizado. Em uma realização, a concentração de SCD, inicialmente, é, de pelo menos, cerca de 10 mg/kg, conforme descrito abaixo, com a quantidade de dióxido de cloro estabilizado, fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada após a ativação completa do dióxido de cloro estabilizado pelo ácido. Os meios de fermentação que contém o hidrolisado de biomassa pode conter uma porcentagem do hidrolisado com um ou mais açúcares e/ou outros componentes adicionados, ou os meios podem conter 90% ou superior de hidrolisado com adições inferiores, tal como o sorbitol, conforme descrito abaixo. Em diversas realizações, o hidrolisado de biomassa celulósica é, de pelo menos, cerca de 50%, 60%, 79%, 80%, 90% ou 95% do volume final do caldo de fermentação. Normalmente, cerca de 10% do volume final de meio de fermentação é o inoculo da semente.

[071] O teor dos sólidos do hidrolisado de biomassa normalmente está entre cerca de 10% e 40%, dependendo dos métodos de pré-tratamento e de sacarificação empregados. Mais normalmente, o teor de sólidos é de cerca de 25%, com um meio que contém 90% do hidrolisado de biomassa celulósica que possui cerca de 23% de sólidos. Em uma realização, o meio de fermentação do hidrolisado da biomassa celulósica e a mistura de SCD contêm, pelo menos, cerca de 20% de sólidos com base no peso seco da biomassa para o peso total da mistura.

[072] Em uma realização, o SCD é adicionado a uma suspensão da reação de sacarificação, que é uma fonte de açúcares fermentáveis para a fermentação de células Zymomonas. A suspensão da reação de sacarificação pode conter qualquer biomaterial que contribui com os sólidos insolúveis para a reação, tais como os grãos de cereais (tais como o milho, trigo, cevada, centeio) e biomassa celulósica (ou lignocelulósica), tornando a reação em uma suspensão. Além disso, a suspensão da reação de sacarificação contém, pelo menos, uma enzima geradora de açúcar, tal como a glucoamilase utilizada com os biomateriais que contém o amido ou, pelo menos, uma celulase utilizada com a biomassa celulósica, conforme descrito acima.

[073] Em uma realização, a composição da mistura de suspensão da reação de sacarificação presente compreende a biomassa celulósica, pelo menos, uma enzima celulase, e dióxido de cloro estabilizado. Em uma realização, a concentração de SCD, inicialmente é, de pelo menos, cerca de 10 mg/kg, conforme descrito abaixo, com a quantidade de dióxido de cloro estabilizado, fornecida em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada após a ativação completa do dióxido de cloro estabilizado pelo ácido. Em uma realização, a mistura contém, pelo menos, cerca de 20% de sólidos com base no peso seco da biomassa para o peso total da mistura.

[074] O SCD pode ser adicionado a uma suspensão da reação de sacarificação, a qualquer momento durante a reação de sacarificação, tais como no início da reação, término da reação, ou a qualquer momento durante a reação. O SCD pode ser adicionado a uma suspensão da reação de sacarificação, quando a sacarifação e fermentação híbrida (HSF) é realizada. No processo de HSF, a sacarificação parcial é alcançada antes da adição de um biocatalisador, e a sacarificação e a fermentação ocorrem simultaneamente, em seguida. Ao realizar a HSF, o SCD é adicionado durante a sacarificação no momento que é suficiente para alcançar o período de tempo antes da inoculação das células de Zymomonas que está descrito abaixo.

MÉTODO PARA A UTILIZAÇÃO DE SCD COM AS FERMENTAÇÕES DE ZYMOMONAS

[075] Descobriu-se no presente que, embora as células Zymomonas sejam sensíveis ao dióxido de cloro, se um período de tempo decorrer entre a adição de SCD para uma composição para a fermentação e a inoculação das células Zymomonas da mistura resultante de SCD, as células podem crescer e produzir o etanol de maneira similar às células inoculadas em um meio em que o SCD não foi adicionado. O período de tempo decorrido entre a adição de SCD e a inoculação de células Zymomonas depende de diversos fatores, incluindo o pH e temperatura da mistura de SCD, tipo de composição a que SCD é adicionado, e a quantidade de SCD adicionado.

[076] O pH da mistura de SCD é inferior a 7 para suportar a liberação de dióxido de cloro, conforme descrito acima. Normalmente, a mistura de SCD possui um pH que é inferior a cerca de 6. Por exemplo, as reações de sacarificação de biomassa celulósica normalmente são realizadas a um pH que está entre cerca de 5 e 6, e o meio hidrolisado normalmente é utilizado nas fermentações de Zymomonas a um pH que está entre cerca de 5 e 6. Por conseguinte, estas composições podem ser utilizadas diretamente com o SCD sem outro ajustamento de pH.

[077] Antes da inoculação das células de Zymomonas, a temperatura da mistura de SCD é mantida superior a 33 °C. A temperatura pode ser mantida a cerca de 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 °C, ou superior. A temperatura é mantida abaixo de um nível que é prejudicial para os nutrientes necessários para a fermentação. Em diversas realizações a temperatura da mistura de SCD é mantida a 35 °C ou superior, de 40 °C ou superior, ou cerca de 47 °C. Se a mistura de SCD é a uma temperatura que é mais elevada do que é adequada para as células de Zymomonas, a temperatura é reduzida a uma temperatura que é adequada para as células Zymomonas antes da inoculação das células de Zymomonas. As temperaturas que são adequadas para as células de Zymomonas são temperaturas em que as células de Zymomonas sobrevivem, que não precisam ser ideais para a fermentação. As células de Zymomonas podem ser inoculadas em uma mistura que está a uma temperatura mais elevada que a ideal para a fermentação, em que, em seguida, o caldo de fermentação resultante resfria até a temperatura de fermentação. Em uma realização, a temperatura da mistura de SCD na inoculação é inferior a 40 °C. Em outras realizações, a temperatura é de 37 °C ou inferior, 35 °C ou inferior, ou 33 °C ou inferior.

[078] Quando o SCD é adicionado ao meio de fermentação que compreende o hidrolisado de biomassa celulósica ou suspensão da reação de sacarificação, o período de tempo entre a adição de SCD e a inoculação da célula Zymomonas é superior a 6 horas. Em diversas realizações, o período de tempo pode ser de 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 ou mais horas. O tempo específico utilizado com um tipo específico do meio do hidrolisado da biomassa celulósica ou suspensão da reação de sacarificação, a dose específica de SCD, e a temperatura específica pode ser facilmente determinado por um técnico do assunto com base no desempenho das células de Zymomonas, após a inoculação conforme exemplificado nos Exemplos no presente.

[079] Quando o SCD é adicionado a um meio de fermentação sem o hidrolisado da biomassa celulósica, o período de tempo entre a adição de SCD e a inoculação da célula Zymomonas é superior a 8 horas. Em diversas realizações, o período de tempo pode ser de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20, ou mais horas. O tempo específico utilizado com um tipo específico de meio de fermentação sem o hidrolisado de biomassa celulósica, a dose específica de SCD, e temperatura específica pode ser facilmente determinado por um técnico do assunto com base no desempenho das células de Zymomonas após a inoculação conforme exemplificado nos Exemplos no presente.

[080] O SCD é adicionado a uma composição para a fermentação em uma quantidade eficaz para o controle da contaminação no caldo de fermentação resultante da inoculação das células Zymomonas da composição. Conforme descrito acima, as concentrações de SCD normalmente são especificadas como a quantidade de dióxido de cloro (ClO2) que pode ser liberada a partir de uma preparação de SCD após a ativação completa por ácido. A concentração de ClO2 que é necessária para fornecer o controle da contaminação em um caldo de fermentação de Zymomonas irá variar dependendo de fatores tais como as características do crescimento e produção da cepa Zymomonas utilizadas, tipo, temperatura e pH da composição para a fermentação em que o SCD é adicionado (descrito acima), e o nível inicial de contaminação. O controle de bactérias contaminantes pode ser avaliado através da determinação do nível de ácido láctico em um caldo de fermentação, em que a presença de uma quantidade inferior a cerca de 5 g/L de ácido láctico até após cerca de 40 horas de fermentação indica que a contaminação está controlada. A contaminação pode ser controlada em uma quantidade inferior a cerca de 5 g/L de ácido láctico no caldo de fermentação, ou inferior a 4 g/L ou 3 g/L ou 2 g/L ou 1 g/L de ácido láctico. A quantidade de ácido láctico no caldo de fermentação normalmente é analisada por HPLC, conforme é conhecido por um técnico do assunto. Uma quantidade eficaz de SCD pode ser de, pelo menos, cerca de 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 275, 300, 350 mg/kg, ou superior. A quantidade eficaz de ClO2 utilizada com uma composição específica para a fermentação em condições especificadas, pode ser facilmente determinada por um técnico do assunto com base nas experiências descritas nos Exemplos apresentados no presente. Por exemplo, uma concentração de cerca de 150 mg/kg de ClO2 é uma quantidade eficaz utilizada para o controle da inoculação de 5 ou 10% em volume da cultura de L. plantarum de OD600 de cerca de 2 em meio hidrolisado nas condições descritas no Exemplo 4 no presente.

INOCULO DE CÉLULAS DE ZYMOMONAS

[081] No presente método, a inoculação com as células de Zymomonas produz um caldo de fermentação. A inoculação pode ser utilizando qualquer fonte de células de Zymomonas que seja eficaz em iniciar uma cultura em crescimento. Normalmente, as células de Zymomonas são armazenadas como estoques congelados, e as células são recuperadas através do crescimento em uma pequena cultura em meio definido. A pequena cultura é utilizada como um inóculo que é adicionado ao meio de fermentação para a produção de um caldo de fermentação ou cultura. Uma pequena cultura também pode ser utilizada para inocular uma cultura de semente. As células Zymomonas são cultivadas na cultura de semente que, em seguida, são adicionadas como um inóculo para uma fermentação em escala superior. Uma cultura de sementes utilizada como o inóculo pode conter o meio estéril e não necessita nenhum antimicrobiano para o controle de contaminação. De maneira alternativa, uma cultura de sementes utilizada como um inoculo pode conter qualquer meio de fermentação, conforme descrito acima, que pode ser contaminado, tal como por equipamento de processo ou biomaterial, em que o SCD é utilizado para o controle da contaminação antes da inoculação das células de Zymomonas, conforme descrito acima. A inoculação normalmente é utilizando de 1% a 10% do volume final do meio que é inoculado.

CÉLULAS DE ZYMOMONAS

[082] Qualquer cepa das células de Zymomonas pode ser utilizada nos presentes métodos, e é selecionada com base em fatores incluindo o tipo do meio a ser utilizado e o resultado desejado do processo de fermentação. Qualquer cepa de Zymomonas que é um biocatalisador eficaz para o processo de produção desejada pode ser utilizada. Por exemplo, as células de Zymomonas que naturalmente produzem o etanol utilizando a glicose, frutose e/ou sacarose como substratos de fermentação, mas a xilose não é metabolizada. Em uma realização, as células de Zymomonas utilizados nos presentes métodos e composições foram manipuladas para a utilização de xilose, que é particularmente desejada quando utilizando o hidrolisado de biomassa celulósica, que contém a xilose.

[083] As cepas de Zymomonas produtoras de etanol, tal como a Z. mobilis foram manipuladas para a fermentação de xilose para o etanol. Normalmente quatro genes foram introduzidos na Z. mobilis para a expressão de quatro enzimas envolvidas no metabolismo de xilose para criar uma via metabólica de utilização de xilose (Figura 1), conforme descrito na patente US 5.514.583, patente US 5.712.133, patente US 6.566.107, publicação WO 1995/28476, Feldmann et al., ((1992) Appl Microbiol Biotechnol 38: 354-361), e Zhang et al., ((1995) Science 267: 240-243). Estes incluem os genes que codificam a xilose isomerase que catalisa a conversão de xilose em xilulose, e a xiluloquinase que fosforila a xilulose para formar a xilulose 5-fosfato. Além disso, são expressas a transaldolase e transcetolase, duas enzimas da via das pentoses de fosfato, que convertem a xilulose 5-fosfato em intermediários que acoplam o metabolismo das pentoses para a via glicolítica Entner-Douderoff permitindo o metabolismo de xilose em etanol (vide Figura 1). As sequências de DNA que codificam estas enzimas podem ser obtidas a partir de qualquer um dos numerosos microrganismos que são capazes de metabolizar a xilose, tais como as bactérias entéricas, e algumas leveduras e fungos. As fontes para as regiões codificantes podem incluir a Xanthomonas, Klebsiella, Escherichia, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Gluconobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella, Pseudomonas, e Zymomonas. Normalmente são utilizadas as regiões de codificação de E. coli.

[084] As sequências de DNA de codificação são operativamente ligadas aos promotores que são expressos em células de Zymomonas, tais como o promotor de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato de Z. mobilis (promotor GAP), e Z. mobilis enolase (promotor ENO). Um promotor GAP mutante com aumento da expressão conforme descrito na patente US 7.989.206, que está incorporada no presente como referência, também é útil para a expressão em Zymomonas. As regiões de codificação individualmente podem ser expressas a partir dos promotores, ou duas ou mais regiões de codificação podem ser unidas em um operon com a expressão a partir do mesmo promotor. Os genes quiméricos resultantes podem ser introduzidos nas células de Zymomonas e mantidos em um plasmídeo, ou integrados no genoma, utilizando, por exemplo, a recombinação homóloga, a integração direcionada ao local, ou a integração aleatória. Os exemplos de cepas manipuladas para expressar uma via de utilização de xilose metabólica incluem CP4(pZB5) (patente US 5.514.583), ATCC31821 / pZB5 (patente US 6.566.107), 8b (patente US 2003/0.162.271; Mohagheghi et al., (2004) Biotechnol Lett 25; 321- 325), e ZW658 (ATTCC número PTA-7858). As células de Zymomonas que são manipuladas para a expressão da via de utilização de xilose metabólica, em geral, necessitam de um período de adaptação em um meio que contém xilose a antes de ser capaz de crescer no meio que contém xilose como o único açúcar.

[085] Em realizações adicionais, as células de Zymomonas possuem uma ou mais modificações genéticas adicionais que aprimoram a cepa tal como uma que aumenta a taxa de crescimento e/ou a massa de células, aumenta a utilização de xilose e/ou permite a utilização de outros açúcares tal como a arabinose, aumenta a tolerância aos compostos de inibição tal como o acetato ou aumenta a produção do etanol.

[086] Em uma realização, as células de Zymomonas podem ser adicionalmente modificadas para a utilização de arabinose, que está descrita na patente US 5.843.760, que está incorporada no presente como referência. Para permitir a utilização de arabinose, os genes expressos, além dos genes da via de utilização de xilose incluem: (1) a L-arabinose isomerase para converter a L- arabinose em L-ribulose, (2) a L-ribulocinase para converter a L-ribulose em L- ribulose-5-fosfato, e (3) a L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase para converter a L- ribulose-5-fosfato em D-xilulose (patente US 5.843.760). Conforme descrito na patente US 2011/0.143.408, que está incorporada no presente como referência, uma utilização aprimorada da arabinose pode ser alcançada através de adicionalmente expressar um simportador de arabinose de prótons, tal como através de expressar uma região codificadora a partir de um gene araE.

[087] Em uma outra realização, o gene endógeno himA, que codifica a subunidade alfa do fator hospedeiro de integração, é geneticamente modificado para reduzir a sua expressão que aprimora o crescimento em um meio que contém o acetato, conforme descrito na patente US 7.897.396, que está incorporada no presente como referência. O acetato está presente no hidrolisado de biomassa, por conseguinte, quando se utiliza o meio que contém o hidrolisado de biomassa, é desejada uma maior tolerância para este componente.

[088] Em uma outra realização, é realizada uma modificação genética que reduz a atividade da glicose-frutose oxido redutase (GFOR), conforme descrito na patente US 7.741.119, que está incorporada no presente como referência. A redução da expressão GFOR, bem como do gene himA, pode ser através de qualquer método, tais como os descritos acima para reduzir a atividade da aldose redutase.

[089] Em uma outra realização, é realizada uma modificação genética que aumenta a atividade da ribose-5-fosfato isomerase (RPI), conforme descrito no pedido de patente de propriedade comum e copendente US 2013/161.734, que está incorporado no presente como referência. A expressão RPI aumentada pode ser alcançada através do aumento da expressão do gene que codifica o RPI endógeno, tal como com um promotor que é mais altamente ativo que o promotor nativo, ou através da expressão de um gene heterólogo que codifica qualquer proteína ou polipeptídeo com a atividade da ribose-5- fosfato isomerase em Zymomonas. Existem dois grupos de enzimas isomerase de ribose-5-fosfato, que são denominados RPI-A e RPI-B, conforme descrito na patente 2013/161.734, qualquer um pode ser expresso.

[090] Em uma outra realização, a xilose isomerase que é expressa como parte da via de utilização de xilose metabólica é expressa utilizando um promotor altamente ativo mutante, que está descrito nas patentes US 7.989.206 e US 7.998.722, que estão incorporadas no presente como referência. Os promotores mutantes descritos no presente são os promotores do gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Zymomonas mobilis.

[091] Em uma outra realização, uma xilose isomerase que é expressa como parte da via de xilose utilização metabólica é uma xilose isomerase do Grupo I incluída na classe de enzimas identificadas por EC 5.3.1.5, conforme descrito no pedido de patente de propriedade comum e copendente US 2013/161.749. Está descrito no presente que as xilose isomerases do Grupo I, conforme expressa a partir de uma região codificadora de isolada a partir de Actinoplanes missouriensis (região de codificação com optimização de códons para as Zymomonas: SEQ ID NO: 13),possui uma atividade mais elevada que na Zymomonas que a xilose isomerase do Grupo 2. As xilose isomerases do Grupo I estão definidas no presente através da análise de bioinformática molecular filogenética (utilizando o algoritmo PHYLIP vizinho de ligação implementado em PHYLIP (Phylogeny Inference Package versão 3.5c; Felsenstein (1989) Cladistics 5: 164-166), a análise GroupSim (Capra e Singh (2008) Bioinformatics 24: 1473-1480), e um modelo Profile Hidden Markov (utilizando o algoritmo hmmsearch do pacote de software HMMER; Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA).

[092] Em uma outra realização, as células de Zymomonas foram adaptadas para o crescimento em uma cultura de tensão que contém o etanol e o acetato de amônio, conforme descrito na publicação do pedido de patente US 2011/0.014.670-A1, que está incorporado no presente como referência. Estas cepas Zymomonas com tolerância aprimorada ao acetato são particularmente úteis quando se utiliza o hidrolisado de biomassa celulósica que contém o meio de fermentação, que contém o acetato.

[093] As cepas descritas nas referências acima e as cepas descritas no presente fornecem os exemplos de cepas que podem ser utilizadas nos presentes métodos e incluem ATCC31821 e / pZB5, ZW658 (ATCC número PTA-7858), ZW800, ZW801-4, ZW801-4 :: ΔhimA, AcR número 3, ZW705, AR3 7-321, e ZW1-XA111.

FERMENTAÇÃO DE ZYMOMONAS

[094] No presente método, o meio de fermentação ou a suspensão da reação de sacarificação, que foi previamente tratado com o SCD e, em seguida, após um período de tempo inoculado com as células de Zymomonas, o que é, por conseguinte, um caldo de fermentação, é mantido sob condições adequadas para o crescimento das células de Zymomonas. Em uma realização, as células de Zymomonas são de uma cepa de Zymomonas que é um biocatalisador eficaz para a produção do etanol sob condições utilizadas na fermentação, e o etanol é produzido no caldo de fermentação. Quando a concentração de açúcares no meio de fermentação é elevada de maneira que o crescimento é inibido, o meio inclui o sorbitol, o manitol, ou uma mistura destes conforme descrito no pedido de patente de propriedade comum US 7.629.156, que está incorporado no presente como referência. Normalmente uma concentração final de cerca de 5 mM de sorbitol ou manitol está presente no meio.

[095] As condições típicas são utilizadas com a temperatura que está entre cerca de 30 °C a cerca de 37 °C, e com pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. As culturas típicas são incubadas sem ar, oxigênio ou outros gases suplementados (que podem incluir as condições tais como a fermentação anaeróbia, microaeróbia, ou microaerofílica), durante, pelo menos, cerca de 20 horas, e podem ser executadas por cerca de 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 horas ou superior. As culturas de sementes típicas são incubadas durante cerca de 20 horas, enquanto que as culturas de produção de fermentação são incubadas durante cerca de 40 horas ou superior. Para minimizar a formação de espuma, os agentes antiespumantes de silicone (qualquer classe à base de silicone, base orgânica e similares) podem ser adicionados ao meio, conforme necessário.

[096] Para as culturas de fermentação de produção comercial, podem ser aplicadas uma variedade de metodologias de cultura. Por exemplo, a produção em larga escala pode utilizar as metodologias de cultura contínua e em batelada. Um método de cultura clássica em batelada é um sistema fechado em que a composição do meio é definida no início da cultura e não é submetida às alterações artificiais durante o processo de cultivo. Por conseguinte, no início do processo de cultivo, o meio é inoculado com o organismo desejado, e o crescimento ou a atividade metabólica pode ocorrer sem nenhuma adição ao sistema. Normalmente, no entanto, uma cultura “em batelada” é a batelada em relação à adição da fonte de carbono e as tentativas muitas vezes são realizadas nos fatores de controle tais como o pH e concentração de oxigênio. Nos sistemas em batelada, as composições do metabólito e da biomassa do sistema mudam constantemente até o momento em que a fermentação é interrompida. Dentro da batelada, as células da cultura moderam de uma fase log estática para uma fase log de crescimento elevado e, finalmente, uma fase estacionária, em que a taxa de crescimento é reduzida ou interrompida. Se não tratadas, as células na fase estacionária eventualmente irão morrer. As células da fase log, muitas vezes são responsáveis pela maior parte da produção de etanol.

[097] Uma variação no sistema em batelada padrão é o sistema de batelada alimentada. Os processos de fermentação em batelada alimentada, também são adequados para os presentes métodos e composições, e compreendem um sistema em batelada típico, com a ressalva de que o substrato é adicionado em incrementos à medida que a fermentação progride. A medida da concentração do substrato real em sistemas de batelada alimentada é difícil e, por conseguinte, é estimada com base nas alterações dos fatores mensuráveis, tais como o pH e a pressão parcial de gases residuais, tal como o CO2. Os métodos de cultura em batelada e batelada alimentada são comuns e bem conhecidos no estado da técnica e os exemplos podem ser encontrados em Biotechnology: A Textbook of Microbiology industrial, Crueger, Crueger, e Brock, 2a edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, ou Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992).

[098] Os presentes métodos e composições também podem ser utilizados em um processo de cultura contínua. As culturas contínuas são sistemas abertos, em que o meio de cultura é continuamente adicionado a um biorreator e uma quantidade igual de meios condicionados é removida simultaneamente para o processamento. Em geral, as culturas contínuas mantêm as células a uma densidade elevada e constante na fase líquida, em que as células essencialmente estão no crescimento da fase log. De maneira alternativa, a cultura contínua pode ser praticada com as células imobilizadas em que o carbono e os nutrientes são continuamente adicionados, e os produtos valiosos, subprodutos ou produtos residuais são continuamente removidos da massa de células. A imobilização celular pode ser realizada utilizando um amplo intervalo de suportes sólidos compostos por fibras naturais e/ou materiais sintéticos, conforme é conhecido para um técnico do assunto.

[099] Em um processo de produção, as culturas de fermentação de produção normalmente são executadas uma em seguida da outra, até uma limpeza do sistema ser necessária.

[0100] Os presentes métodos também podem ser utilizados em um processo de sacarificação e fermentação híbrida (HSF), em que a sacarificação parcial é realizada antes da adição de células de Zymomonas, em seguida, ainda mais sacarificação e fermentação ocorrem simultaneamente. O segundo estágio simultâneo de sacarificação e fermentação pode ser conforme descrito na publicação de pedido de patente US 2011/0.318.803, que está incorporado no presente como referência, pode ser utilizado. Neste processo as células Zymomonas são cultivadas nas condições de agitação baixa do impulsor com concentração elevada dos sólidos insolúveis em uma mistura de sacarificação- fermentação durante a reação de fermentação e sacarificação simultânea para a produção de realizações elevadas de etanol.

EXEMPLOS

[0101] A presente descrição é ainda definida nos Exemplos a seguir. Deve ser entendido que esses Exemplos, embora indiquem as realizações preferidas, são apenas fornecidos a título de ilustração. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um técnico no assunto pode verificar as características preferenciais, e sem se desviar de seu espírito e escopo, pode realizar diversas alterações e modificações para adaptá-las às diversas utilizações e condições.

[0102] O significado das abreviações é o seguinte: “h” significa hora(s), “min” significa minuto(s), “sec” significa segundo(s), “d” significa dia(s), “L” significa litro(s), “mL” significa mililitro(s), “μL” significa microlitro(s), “g” significa gramas, “μg” significa micrograma(s), “ng” significa nanograma(s), “g/L”significa gramas por litro, “mM” significa milimolar, “μM” significa micromolar, “nm” significa nanômetro(s), “μmol” significa micromol(es), “pmol” significa picomol(es), “OD600”significa a densidade óptica medida a 600 nm, “ETF” significa o tempo decorrido de fermentação, “ppm” significa partes por milhão, "G + X" é o total de glucano e xilano em uma amostra de biomassa celulósica.

MÉTODOS GERAIS DESCRIÇÃO DA CEPA ZW705

[0103] A cepa Zymomonas mobilis ZW705 foi produzida a partir da cepa ZW804-1. A ZW801-4 é uma cepa recombinante que utiliza a xilose da Z. mobilis, que foi descrita na patente de propriedade comum US 7.741.119, que está incorporada no presente como referência. A cepa ZW801-4 foi derivada a partir da cepa ZW800, que foi derivada a partir da cepa ZW658, todas conforme descritas na patente US 7.741.119. A ZW658 foi construída através da integração de dois operons, PgapxylAB e Pgaptaltkt, que contêm quatro genes que utilizam a xilose que codificam a xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase, no genoma de ZW1 (ATCC 31821) por meio dos eventos de transposição sequencial, e seguido pela adaptação em meios seletivos que contêm a xilose (patente US 7.629.156). O ZW658 foi depositado como ATCC PTA-7858. No ZW658, o gene que codifica a glicose-frutose oxidorredutase (gfor) foi inativado por inserção utilizando uma recombinação homóloga mediada por hospedeiro, duplo-cruzada, e a resistência à espectinomicina como um marcador selecionável para criar o ZW800 (patente US 7.741.119). O marcador de resistência à espectinomicina, que foi delimitado por sítios loxP, foi removido através da recombinação do sítio específico utilizando utilizando a Cre recombinase para criar o ZW801-4.

[0104] As culturas da cepa Z. mobilis ZW801-4 foram adaptadas para o crescimento em condições de tensão do meio que contém o acetato de amônio para a produção do ZW705, conforme descrito no pedido de patente US 2011/0.014.670, que está incorporado no presente como referência. Uma cultura contínua de ZW801-4 foi executada em fermentadores de 250 mL agitados, de pH e temperatura controlados (Sixfors; Bottmingen, Suíça). O meio basal para a fermentação foi de 5 g/L de extrato de levedura, 15 mM de fosfato de amônio, 1 g/L de sulfato de magnésio, 10 mM de sorbitol, 50 g/L de xilose e 50 g/L de glicose. A adaptação ao crescimento na presença de realizações elevadas do acetato e da amônia foi efetuada através do aumento gradual da concentração do acetato de amônio adicionado ao meio de cultura contínuo acima, mantendo uma taxa de crescimento estabelecida conforme medida através da taxa de diluição específica durante um período de 97 dias. O acetato de amônio foi aumentado para uma concentração de 160 mM. Os aumentos adicionais na concentração de íons do amônio foram obtidos através da adição do fosfato de amônio para uma concentração total final do íon de amônio de 210 mM ao final de 139 dias de cultura contínua. A cepa ZW705 foi isolada a partir da população adaptada através do plaqueamento de colônias únicas e amplificação de uma colônia selecionada.

DESCRIÇÃO DA CEPA AR3 7-31

[0105] A cepa Zymomonas mobilis AR3 7-31 foi isolada após o crescimento da cepa ZW705 em um trubidostato, conforme descrito no pedido de patente de propriedade comum e copendente US 2013/316.597, que está incorporado no presente como referência (também denominado no presente Adaptado 7-31). Neste dispositivo de cultura de fluxo contínuo, a concentração de acetato de amônio e o etanol foi aumentada ao longo do tempo em um meio hidrolisado. Todo o genoma de AR3 7-31 foi sequenciado e comparado com a sequência do genoma ZW705. Descobriu-se que a cepa AR3 7-31 possui uma modificação genética na matriz de leitura aberta zmo1432 do genoma de Zymomonas mobilis (Referência NCBI: NC_006526.2), em que o zmo1432 é anotado como codificando uma "proteína de resistência ao ácido fusárico". Especificamente, a mutação AR3 7-31 está na posição 350 da região de codificação do zmo1432 e é uma alteração de C para T nesta posição. Esta mutação resulta em uma alteração de códon para o amino ácido 117 de TCT para TTT, resultando em uma alteração no aminoácido 117 de serina para a fenilalanina. O efeito desta mutação é expressar um polipeptídeo que aprimora o comportamento da cepa em um meio hidrolisado, aumentando a tolerância da cepa a diversos inibidores de crescimento no hidrolisado e aumentando o rendimento de etanol. CEPA ZW1-XA111

[0106] A cepa Zymomonas mobilis ZW1-XA111 foi preparada a partir da cepa ZW1 (ATCC 31821). A ZW1 foi manipulada para expressar os quatro genes de vias de utilização da xilose: xylA, xylB, tkt, e tal conforme descrito para ZW705. A região de codificação xylA foi de Actinoploanes missouriensis (descrito na patente US 2011/0.318.801, que está incorporada no presente como referência) e os promotores de genes de desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato variante de atividade elevada de Z. mobilis (descrito na patente US 7.989.206, que está incorporada no presente como referência) foram utilizados para expressar o operon xylA e tal / tkt. A integração dos genes xylA e xylB inativados do locus gfor ((patente US 7.741.119, que está incorporada no presente como referência). A cepa foi manipulada para aumentar a expressão de ribose-5-fosfato-isomerase (Rpi), conforme descrito no pedido de patente de propriedade comum e copendente US 2013/161.734, que está incorporada no presente como referência, e fosfato de ribulose-3-epimerase (Rpe), conforme descrito no pedido de patente de propriedade comum e copendente US 1961/577.871, que está incorporada no presente como referência. A cepa resultante foi passada por 4 duplicações em meio de xilose para a adaptação, conforme descrito na patente US 7.629.156, que está incorporada no presente como referência, durante o que ocorreu uma modificação genética na matriz de leitura aberta zmo0976 do genoma de Zymomonas mobilis (Referência NCBI: NC_006526.2 ), que codifica para uma enzima que possui a atividade de xilose redutase dependente de NADPH que é capaz de converter a xilose em xilitol (Agrawal e Chen (2011) Biotechnol Lett.; publicação on line em 07 de janeiro de 2011). A perturbação de zmo0976 reduz a atividade de xilose redutase dependente de NADPH em superior a 90%, conforme descrito no pedido de patente US 1961/577.879, que está incorporado no presente como referência, e aprimora o crescimento em meio que contém a xilose.

[0107] A cepa foi manipulada para expressar o operon E. coli araBAD que codifica L-ribulose quinase, a L-arabinose isomerase, e a L-ribulose- 5-fosfato-4-epimerase, respectivamente, que fornecem uma via de arabinose de assimilação, em conjunto com as atividades transcetolase e transaldolase que foram introduzidas para a utilização em xilose (patente US 5.843.760, que está incorporada no presente como referência). A integração de um operon araBAD inativado, o gene pnp que codifica o polinucleótido fosforilase, por conseguinte, fornecendo a utilização aprimorada de xilose e produção de etanol, conforme descrito no pedido de patente de propriedade comum e copendente US 1961/577871, que está incorporado no presente como referência. A cepa resultante foi passada por 10 duplicações em meio de xilose para a adaptação, conforme descrito na patente US 7.629.156.

[0108] Para aprimorar ainda mais a utilização de xilose, a cepa foi manipulada para expressar um simportador de arabinose-próton heterólogo, codificado pelo gene araE de E. coli, conforme descrito na patente US 2011/143.408, que está incorporada no presente como referência. A resistência ao marcador de cloranfenicol utilizado nesta etapa foi removida a partir do genoma de produção da cepa ZW1-XA111. COMPOSIÇÃO DO SABUGO DE MILHO

[0109] A quantidade de celulose e xilana no sabugo de milho inicial foi determinada utilizando o método ASTM E1758-01 “Standard method for the determination of carbohydrates by HPLC”, conforme detalhado no National Renewable Energy Lagoratory (Golden, CO) Relatório Técnico NREL / TP-51042.618 (revisado em abril de 2008). A composição foi determinada como sendo 34,8% de celulose, 29,2% de xilana, 12,8% de lenhina com base no peso seco.

COMPOSIÇÃO DA PALHA

[0110] A quantidade de celulose e xilana na biomassa de partida de palha foi determinada por Microbac Laboratories, Inc (Boulder, CO). A composição foi determinada como sendo de 34,8% de celulose, 21,8% de xilano, 16,9% de lenhina com base no peso seco.

ENZIMAS DE SACARIFICAÇÃO

[0111] Accellerase® TRIO (Danisco US Inc., Genencor International, Rochester, NY)

PRODUÇÃO DA CELULASE E HEMICELULASE NA CEPA H3A

[0112] A cepa H3A é uma cepa de Trichoderma reesei recombinante que foi preparada como a seguir. Um quadrilátero excluído da cepa T. reesei que foi descrito na patente US 2008/026.376 e é um derivado do quadrilátero excluído da cepa 1A52 que está descrito na patente US 7.666.648, ambas as referências incorporadas no presente como referência, foi cotransformado com uma cassete de expressão β-glicosidase (promotor CBH1, região de codificação β-glucosidase1, terminador CBH1, e o gene amdS), e uma cassete de expressão da endoxilanase (promotor CBH1, região de codificação endoxilanase, e terminador CBH1) utilizando a eletroporação. Um transformante foi denominado cepa número 229. A cepa número 229 foi cotransformada com um cassete de expressão de β-xilosidase Fv3A, um cassete de expressão(promotor cbh1, região de codificação β-xilosidase, terminador cbh1, e gene als), β-xilosidase Fv43D, e um cassete de expressão Fv51A(promotor EG1, região de codificação β-xilosidase, terminador nativo), e um cassete de expressão α-arabinofuranosidase Fv51A (promotor EG1, L-α- arabinofuranosidase utilizando a eletroporação. A cepa H3A foi isolada a partir desta etapa de transformação.

[0113]As proteínas extracelulares produzidas durante a fermentação da cepa H3A foram separados a partir da massa de células através da centrifugação, concentradas através da membrana de ultrafiltração por meio de uma membrana Millipore de peso de corte molecular de 10 kD e o pH ajustado para 4,8. A proteína total foi determinada utilizando um método Biuret modificado conforme modificado por Weichselbaum e Gornall utilizando a albumina de soro bovino como um calibrador (Weichselbaum, 1960, Amer J. Clin Path 16:40;.Gornall et al., 1949 J. Biol Chem. 177:752). Esta preparação de proteína extracelular de H3A, também denominada no presente como proteína H3A, foi utilizada como uma combinação da preparação da celulase e hemicelulase efetuando a hidrólise dos complexos de carboidratos.

HIDROLISADO DO SABUGO FRF10 PRÉ-TRATAMENTO

[0114]O sabugo de milho foi pré-tratado antes da hidrolise enzimática, utilizando os métodos de baixo teor de amônia descritos na patente US 7.932.063. Um recipiente de reator horizontal Littleford Day de 130 L que contém um revestimento para a passagem de vapor em torno do corpo do recipiente (Littleford Day, Inc., Florence, KY) foi utilizado para o pré-tratamento para gerar o sabugo pré-tratado denominado SSL24. O recipiente foi carregado com o sabugo a partir do processamento das sementes de milho (tamanho inferior a 1 mm) para alcançar 44% do preenchimento do reator em uma base de sabugo molhado (22,77 kg, 50,2 libras). O sabugo foi reduzido para um tamanho inferior a 1 mm utilizando um grande micropulverizador (Model número 1SH, Série número 10019; Pulverizing Machinery Co., Summit, NJ) com uma tela de 1,0 mm. Uma colherada de gelo seco foi adicionada conforme necessário para o sabugo antes da moagem para evitar que o equipamento se aqueça. A unidade principal do micropulverizador é um motor de 5 h.p., com uma velocidade máxima do rotor de 9.600 RPM. Ele possui seis martelos rotativos, uma concha, e está alinhado com as bordas opostas de impacto.

[0115] O sabugo possuía uma densidade a granel solta molhada de 0.396 g/cm3 e 8% em peso de umidade. O vácuo foi aplicado ao recipiente para alcançar 0,1 atm antes da introdução de uma solução de hidróxido de amônio a 28,9% em peso (4,4 kilos (9,7 libras)) e água (7,8 kilos (17,2 libras)) próximo da parte superior do recipiente para fornecer 6% em peso de NH3 em relação ao peso seco da biomassa e 60% em peso de sólidos na parte interna do recipiente. Um segundo e terceiro pré-tratamento em batelada, denominados SSL25 e SSL26, foram realizados da mesma maneira para gerar material suficiente para a sacarificação posterior. Em todas as bateladas, o agitador do reator foi ajustado para 70 rpm e o vapor foi passado através do revestimento do recipiente. Quando o recipiente alcançou uma temperatura interna de 80 °C, o vapor foi introduzido próximo da parte superior do recipiente para aumentar a temperatura interna do recipiente para 145 °C. Esta temperatura foi mantida durante 20 minutos. Aos 15 minutos deste tempo de retenção, o fluxo de vapor através do revestimento foi interrompido. No final do pré-tratamento, o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação para alcançar a pressão atmosférica. O vácuo (de cerca de inferior a 1 atm; 101,3 kPa) foi posteriormente aplicado durante 15 minutos, para baixar a temperatura para inferior a 60 °C e remover a amônia e água adicional a partir do sabugo pré-tratado antes de abrir a válvula de fundo do recipiente e recuperar a biomassa pré-tratada. A porcentagem (%) do peso final dos sólidos para as bateladas do sabugo pré-tratado SSL24, SSL25, e SSL26 foi de 61,1%, 66,7%, e 67,8%, respectivamente.

SACARIFICAÇÃO

[0116]O hidrolisado FRF10 foi gerado em um fermentador de 200 L utilizando uma mistura de sabugos de milho pré-tratados a partir das preparações de SSL24, SSL 25 e SSL26, por sacarificação com o sistema de enzima H3A, descrito acima. Um resto de água (124,0 kg) foi adicionado ao fermentador e esterilizado com o revestimento de calor a 121 °C, mantido durante 20 minutos. A água foi resfriada até 47 °C e a mistura do sabugo pré-tratado foi adicionada através de um orifício na parte superior do tanque; 21,0 kg foram adicionados neste momento. O pH foi ajustado para 5,3 com 1N de H2SO4 e a enzima foi adicionada. A dosagem de enzima foi de 4,73 kg, o que era equivalente a 14 mg de proteína por g de glucano + xilano no sabugo total a ser adicionado ao reator. Ao longo das 12 horas seguintes, quatro adições de 15,5 kg do sabugo foram realizadas para o reator, de três em três horas, com o pH ajustado para 5,3 com 1N de H2SO4 após cada adição. A carga dos sólidos alvos para esta execução foi de 25% em peso. O fermentador foi controlado a 47 °C e pH 5,3 durante cerca de 72 horas. No final deste período de tempo, 20 L foram retirados para a utilização nestas experiências, e os teores restantes do recipiente foram fermentados. Uma amostra do hidrolisado foi analisada e o restante foi armazenado sob refrigeração até a sua utilização. Os resultados da análise da amostra estão apresentados na Tabela 1. TABELA 1 TÉRMINO DAS PROPRIEDADES DO HIDROLISADO DE SACARIFICAÇÃO PARA A FRF10

[0117] O sabugo de milho foi pré-tratado antes da hidrólise enzimática, conforme descrito acima para a o sabugo FRF10 hidrolisado com exceção que o recipiente foi carregado para alcançar 50% em volume (27,3 kg; 60,1 libras). O sabugo possuía um peso específico solto molhado de 0,420 g/cm3 e 10,9% em peso de umidade. 4,4 kg (9,8 lbs) de 28,9% em peso de uma solução de hidróxido de amônio foram adicionados e 8,21 kg (18,1 lbs) de água. A primeira amostra foi de SSL52, e cinco amostras adicionais de SSL53-SSL57 foram preparadas da mesma maneira e combinadas. O peso final em porcentagem em peso de sólidos para as bateladas do sabugo pré-tratado SSL52, SSL53, SSL54, SSL55, SSL56, e SSL27 foi de 70,3%, 69,4%, 68,8%, 69,6%, 68,7%, e 70,6%, respectivamente.

SACARIFICAÇÃO

[0118] O hidrolisado FRF19 foi gerado em um fermentador de 200 L utilizando uma mistura de sabugos de milho pré-tratados através das preparações de SSL52 SSL57, tratadas com o sistema de enzima H3A descrito acima. A sacarificação foi conforme descrito acima, exceto que o fundo do alambique de água foi de 111,0 kg, inicialmente 20,0 kg de sabugo pré-tratado foram adicionados ao fermentador, e a dosagem de enzima foi de 6,86 kg, equivalente a 16 mg de proteína por grama de glucano + xilano no sabugo total a ser adicionado ao reator. Ao longo das 12 horas seguintes, quatro adições de 16,0 kg de sabugo foram realizadas para o reator a cada três horas. A carga de sólidos alvo para essa execução foi de 27,5% em peso. A análise de hidrolisado da amostra é apresentada na Tabela 2. TABELA 2 TÉRMINO DAS PROPRIEDADES DO HIDROLISADO DE SACARIFICAÇÃO PARA A FRF19

[0119] A palha de milho foi pré-tratada antes da hidrólise enzimática utilizando os métodos de amônia baixa descritos na patente US 7.932.063. Um recipiente de 340 L do reator horizontal Eirich que contém um revestimento para a passagem de vapor em torno do corpo do recipiente foi utilizado para o pré- tratamento para gerar o sabugo pré-tratado denominado Y018. O recipiente foi carregado com a palha para alcançar a 60% em volume (40,8 kg). A palha foi reduzida para inferior a 0,8 mm (1/32 polegadas).

[0120] A palha possuía uma densidade aparente solta molhada de 0,200 g/cm3 e 8,0% em peso de umidade. Após a palha ser carregada, foi aplicado vácuo ao recipiente para alcançar -0,9 barg (-90 kPag) antes da introdução de uma solução de hidróxido de amônio para fornecer 8% em peso de NH3 em relação ao peso seco da biomassa e 65% em peso de sólidos na parte interna do recipiente. Em todas as bateladas, o agitador do reator foi ajustado a 40 Hz (42 rpm) e a pressão do vapor sobre o revestimento foi de 3,2 barg. Uma vez que a solução de amônia foi adicionada, o vapor a 16 barg (1.600 kPag) foi adicionado ao recipiente para aumentar e manter a temperatura interna do recipiente a 140 °C. Esta temperatura foi mantida durante 30 minutos. No final do pré-tratamento, o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação para alcançar a pressão atmosférica. O vácuo posteriormente foi aplicado para alcançar -0,9 barg (-90 kPag) para baixar a temperatura e para remover a amônia e a água adicional da palha pré-tratada antes de abrir a válvula de fundo do recipiente e recuperar a biomassa pré-tratada. A porcentagem em peso final dos sólidos para as bateladas da palha pré-tratada Y018-X, Y018-5, e Y018-10 preparadas conforme descrito foi de 55,5%, 67,0%, e 64,4%, respectivamente.

SACARIFICAÇÃO

[0121] O hidrolisado Y018 foi gerado em um fermentador de 1.000 L, utilizando uma mistura de palha de milho pré-tratada a partir das bateladas descritas acima, tratadas com Accellerase® TRIO. Um fundo do alambique de água foi adicionado ao fermentador e esterilizado com o calor do revestimento a 121 °C, e mantido durante 20 minutos. A água foi resfriada até 47 °C e a mistura de palha pré-tratada foi adicionada através de uma porta na parte superior do tanque; a suspensão era de cerca de 8% em peso de sólidos no momento. O pH foi ajustado para 5,3 com H2SO4 a 5% em peso e a enzima foi adicionada. A dosagem de enzima era o equivalente a 14 mg de proteína por grama de glucano + xilano na palha total a ser adicionada ao reator. Durante as 24 horas seguintes, a palha restante foi adicionada a um alvo de 25% em peso de sólidos, com o pH controlado a 5,3 com 5% em peso de H2SO4. O fermentador foi controlado a 47 °C e pH 5,3 durante cerca de 72 horas. No final deste período de tempo, 20 L foram retirados para a utilização nestas experiências, e os teores restantes do recipiente foram fermentados. Uma amostra do hidrolisado foi analisada e o restante foi armazenado refrigerado até à sua utilização. Os resultados da análise da amostra estão apresentados na Tabela 3. TABELA 3 TÉRMINO DAS PROPRIEDADES DO HIDROLISADO DE SACARIFICAÇÃO PARA Y018

[0122] A palha de milho foi pré-tratada antes da hidrólise enzimática utilizando os métodos de amônia baixa descritos na patente US 7.932.063. Um recipiente de 6,7 L de reator horizontal Eirich que contém um revestimento para a passagem de vapor em torno do corpo do recipiente utilizado para o pré- tratamento para gerar o milho pré-tratado denominado HP196. O recipiente foi carregado com a palha de alcançar 70% em volume do reator preenchido em uma base palha molhada (797,5 g). A palha foi reduzida para inferior a 0,8 mm (1/32 polegadas).

[0123]A palha possuía uma densidade aparente solta molhada de 0,170 g/cm3 e 9,43% em peso de umidade. Após a palha ser carregada, foi aplicado o vácuo ao recipiente para alcançar -0,9 barg (-90 kPag) antes da introdução de uma solução de hidróxido de amônio para fornecer 8% em peso de NH3 em relação ao peso seco da biomassa e 60% em peso de sólidos na parte interna do recipiente. Em todas as bateladas, o agitador do reator foi ajustado para 20 rpm e a pressão de vapor no revestimento foi de 4,1 barg (410 kPag). Uma vez que a solução de amônia foi adicionada, o vapor a 4,5 barg (450 kPag) foi adicionado ao recipiente para obter 50% em peso de sólidos na parte interna do recipiente. A pressão do vapor do revestimento foi aumentada e, em seguida, controlada para manter a temperatura interna do recipiente a 140 °C. Esta temperatura foi mantida durante 20 minutos. No final do pré-tratamento, o reator foi despressurizado através de um condensador de ventilação para alcançar a pressão atmosférica. O vácuo posteriormente foi aplicado para alcançar -0,7 barg (70 kPag) para baixar a temperatura e para remover a amônia e a água adicional da palha pré-tratada antes de abrir a válvula de fundo do recipiente e recuperar a biomassa pré-tratada. A porcentagem em peso final dos sólidos para a batelada de palha pré-tratada HP196 foi 63,55%.

MEIO

[0124] MRS = 10 g/L de peptona, 8 g/L de extrato de carne, 4 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de glucose, 5 g/L de acetato de sódio triidratado, 1 g/L de Tween 80, 2 g/L de K2HPO4, 2 g/L de citrato de triamônio L, 0,2 g/L de MgSO4*7H2O, 0,05 g/L de MnSO4*4H2O, pH 6,2

[0125] MRM3G10 contém por litro: o extrato de levedura (10 g), KH2PO4 (2 g) e MgSO4.7H2O (1 g), glucose (100 g), pH 5,5

[0126] MRM3G6 contém por litro: o extrato de levedura (10 g), KH2PO4 (2 g) e MgSO4.7H2O (1 g), glucose (60 g), pH 5,5

ANALÍTICO ANÁLISE POR HPLC DE ETANOL, ÁCIDO LÁCTICO

[0127]As amostras de fermentação foram retiradas em intervalos de tempo e analisadas para EtOH, açúcares residuais, e outros produtos metabólicos tais como o ácido acético, ácido láctico, e glicerol utilizando um sistema de HPLC Waters (sistema Alliance, Waters Corp., Milford, MA) ou um Agilent 1100 Series LC; condições = 0,6 mL/min de 0,01 N H2SO4, volume de injeção = 5 μL, temperatura autoamostragem = 10°C, temperatura da coluna = 55°C, tempo de execução = 25 min, detecção por índice de refração (mantida a 40°C). A coluna HPLC foi adquirida de BioRad (Aminex HPX-87H, BioRad Inc., Hercules, CA). Os analitos foram quantificados por detecção do índice de refração e comparados com os padrões conhecidos.

EXEMPLO 1 SENSIBILIDADE DA ZYMOMONAS MOBILIS PARA O DIÓXIDO DE CLORO ESTABILIZADO

[0128]A cepa Z. mobilis ZW705 (vide Métodos Gerais) foi cultivada como uma cultura de início em MRM3G10 (vide Métodos Gerais). As amostras do meio foram MRM3G10 suplementadas com o dióxido de cloro estabilizado (SCD), em concentrações de dióxido de cloro de 0, 7,5, 15 ou 224 mg/kg utilizando um estoque de FermaSure®XL (disponível de E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE). O dióxido de cloro é fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir de SCD na solução FermaSure®XL após a ativação completa por ácido. A cultura de início ZW705 foi utilizada para inocular as amostras do meio que contêm o SCD, bem como uma amostra de controle não de SCD, em 1% do volume final para um OD600 de 0,1. As culturas foram incubadas a 32 °C e o crescimento foi monitorado por OD600. Conforme mostrado na Figura 2, o crescimento de células de Zymomonas foi grandemente inibido por todos os níveis de dióxido de cloro. Em 7,5 mg/kg de dióxido de cloro, existiu um período de latência longa a partir de que as células recuperadas após cerca de 27 horas e, em seguida, cultivadas de maneira similar para o controle em que não foi adicionado o SCD. As células nas amostras com mais de dióxido de cloro não recuperou durante a experiência.

EXEMPLO 2 SENSIBILIDADE DA ZYMOMONAS MOBILIS PARA O DIÓXIDO DE CLORO ESTABILIZADO APÓS A INOCULAÇÃO RETARDADA

[0129]Foi realizada uma experiência para determinar se um período de latência após a adição de SCD antes da inoculação com as células de Z. mobilis poderia reduzir a toxicidade de dióxido de cloro para as células. O dióxido de cloro foi adicionado a uma concentração de 298 mg/kg em 11 mL de FRF10 de espiga de milho hidrolisado (pH 5,3; vide Métodos Gerais) utilizando um estoque de FermaSure®XL (disponível de E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE). O dióxido de cloro é fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir de SCD na solução FermaSure®XL após a ativação completa por ácido. Foi adicionada água ao invés de FermaSure®XL para o sabugo hidrolisado FRF10 para amostras de controle. O hidrolisado, em seguida, foi incubado durante 6 horas a 33 °C ou 47 °C. As amostras, em seguida, foram mantidas a 33 °C e inoculadas com 10% em volume (volume final) de cultura de células Z. mobilis AR3 7-31 (vide Métodos Gerais), que foi cultivada em 10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 5 g/L de MgSO4*7H2O, 10 mM de sorbitol, 150 g/L de glicose, pH 5,5 a 33 °C e pH 5,5 (4 N de NH4OH para o controle do pH) para um OD600 de cerca de 10 (F0820), para um OD600 inicial de cerca de 1. A produção de etanol foi monitorada nas culturas por HPLC (vide Métodos Gerais). A Figura 3 mostra que as amostras de controle fermentadas com sucesso contêm cerca de 50 g/L de etanol, enquanto que as amostras que contém 357 mg/kg de dióxido de cloro apenas continham cerca de 15 g/L de etanol. Por conseguinte, sob estas condições, um período de latência de 6 horas não foi suficiente para obter níveis normais de produção de etanol a partir de células de Zymomonas.

EXEMPLO 3 SENSIBILIDADE DA ZYMOMONAS MOBILIS PARA O DIÓXIDO DE CLORO ESTABILIZADO APÓS A INOCULAÇÃO RETARDADA PROLONGADA

[0130] Para examinar o efeito de tempos de latência mais longos entre as adições de células e SCD, 151 mg/kg ou 301 mg/kg de dióxido de cloro foram adicionados ao hidrolisado de espiga de milho FRF19 (vide Métodos Gerais) + 10 mM de sorbitol, pH 5,8 utilizando um estoque de FermaSure®XL (disponível de E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE). O dióxido de cloro é fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir de SCD na solução FermaSure®XL após a ativação completa por ácido. As amostras foram incubadas durante 24 ou 48 h a 47 °C. As amostras, em seguida, foram mantidas a 33 °C e inoculadas com 10% em volume (volume final) de cultura de Z. mobilis AR3 7-31 (vide Métodos Gerais), que foi cultivada em 10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 5 g/L de MgSO4*7H2O, 10 mM de sorbitol, 150 g/L de glicose, pH 5,5 a 33 °C (4 N de NH4OH para o controle do pH) para um OD600 de cerca de 10 (F1153), para um OD600 inicial de cerca de 1. Em um experimento 0 de controle paralelo, 151 mg/kg ou 301 mg/kg de dióxido de cloro foram adicionados ao hidrolisado de espiga de milho FRF19 + 10 mM de sorbitol, pH 5,8, que foi imediatamente inoculado da mesma maneira com a Z. mobilis AR3 7-31. A produção de etanol foi monitorada nas culturas por HPLC (vide Métodos Gerais).

[0131] A Figura 4A mostra que, em culturas inoculadas com a Z. mobilis, imediatamente após a dosagem com o SCD, a produção de etanol foi eliminada nas duas doses, enquanto que a amostra de controle não dosada continha cerca de 80 g/L de etanol. A Figura 4B mostra que após a incubação de meio que contém 151 mg/kg ou 301 mg/kg de dióxido de cloro, durante 24 ou 48 horas antes da inoculação com Z. mobilis, as quantidades de etanol foram similares às quantidades nos controles sem o dióxido de cloro. Por conseguinte, um período de tempo de 24 h a 47 °C em meio hidrolisado com pH de 5,5 era tempo suficiente entre a adição de SCD e a inoculação das células de Zymomonas para permitir a produção normal de etanol durante a fermentação de Zymomonas.

EXEMPLO 4 CONTROLE DE L. PLANTARUM EM MEIO HIDROLISADO UTILIZANDO O DIÓXIDO DE CLORO ESTABILIZADO

[0132] A capacidade de SCD para controlar as bactérias lácticas (LAB) que são contaminantes do hidrolisado da biomassa celulósica foi testada utilizando a cepa L. plantarum ATCC8014 como contaminante LAB representante. O SCD foi adicionado à palha de milho hidrolisada Y018 + 10 mM de sorbitol, pH 5,8 a uma concentração de 151 mg/kg ou 301 mg/kg de dióxido de cloro utilizando um estoque de FermaSure®XL. O dióxido de cloro é fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir de SCD na solução FermaSure®XL após a ativação completa por ácido. As amostras destes meios, em seguida, foram mantidas a 33 °C e inoculadas com 10 ou 5% em volume (volume final) de L. plantarum ATCC8014 que foi coletada a partir de uma cultura crescida em meio MRS a 33 °C, o OD600 de cerca de 2. Não existiu atraso antes da inoculação, para nenhuma das amostras. O meio de cultura foi analisado para o teor de ácido láctico a 0, 24 e 48 h EFT por HPLC (vide Métodos Gerais). Os resultados são fornecidos na Tabela 4. Após 48 h, as culturas em que foi adicionado o SCD possuíam 1 g/L ou inferior da formação de ácido láctico em qualquer dose de inoculação, enquanto que as culturas de controle sem o SCD produziram uma quantidade superior a 7 g/L de ácido láctico. Estes resultados demonstram que o dióxido de cloro é capaz de prevenir a formação de ácido láctico por um contaminante comum no hidrolisado celulósico. TABELA 4 PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO NA TABELA 4 NO MEIO HIDROLISADO

** 1 mL de água estéril, adicionada * 0,5 mL de cultura e 0,5 mL de água adicionada

EXEMPLo 5 EFEITO DO TRATAMENTO DE SCD DURANTE A SACARIFICAÇÃO SEGUIDA POR FERMENTAÇÃO DE Z. MOBILIS

[0133] A eficácia da utilização de SCD para o controle da contaminação durante a fermentação de Zymomonas, pela adição de SCD durante a sacarifação para produzir o hidrolisado utilizado na fermentação, foi testada. A palha de milho pré-tratada (amostra HP196; vide Métodos Gerais) foi autoclavada. A palha de milho bruto, em seguida, foi adicionada à palha pré- tratada em autoclave a 1% do peso total da palha pré-tratada.

[0134] A sacarificação foi realizada utilizando as seguintes condições: 47 °C, pH inicial de 5,3, alimentação em batelada para 25% de sólidos, 12 mg Accellerase® TRIO/g G + X. Dois sacarificações que continham 1% da a biomassa de palha bruta foram executadas. A palha bruta contém os contaminantes de ocorrência natural. Para uma execução, o SCD foi adicionado no início da sacarificação, e nenhum SCD foi adicionado à outra execução. O SCD foi adicionado à mistura de sacarificação a uma concentração de 316 mg/kg de dióxido de cloro utilizando um estoque de FermaSure®XL. O dióxido de cloro é fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir do SCD na solução FermaSure®XL após a ativação completa por ácido.

[0135] Após 48 horas de sacarificação, as amostras dos dois hidrolisados produzidos de execuções de sacarificação foram coletadas para a análise de ácido láctico, em seguida, o pH dos hidrolisados foi ajustado para 5,8, a temperatura reduziu para 33 °C, e 10% em volume (volume final) de uma cultura de cepa Z. mobilis ZW1-X111 (vide Métodos Gerais) foram adicionados. A cultura ZW1-X111 utilizada para a inoculação foi cultivada a OD600 de cerca de 12,9 a 10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 5 g/L de MgSO4*7H2O, 10 mM de sorbitol, 150 g/L de glicose, pH 5,5 a 33 °C e pH 5,5 (NH4OH a 4 N para o controle de pH). A fermentação mantida a 33 °C e o meio foram analisados para o etanol após 24 h.

[0136] No final da sacarificação (amostras de sacarificação 48 h), o hidrolisado a partir da execução de sacarificação sem o SCD adicionado continha 1,6 g/L de ácido láctico. O hidrolisado a partir da execução de sacarificação com o SCD adicionado não possuía o ácido láctico detectável indicando o controle de bactérias contaminantes. A fermentação no hidrolisado que tinha sido adicionado o SCD atingiu cerca de 36,09 g/L de etanol a 24 h, indicando uma fermentação positiva. A fermentação no hidrolisado que não possuía nenhuma adição de SCD continha cerca de 34,95 g/L de etanol.

EXEMPLO 6 TRATAMENTO DE DOSE MAIS BAIXA DE SCD DURANTE A SACARIFICAÇÃO SEGUIDA POR FERMENTAÇÃO DE Z. MOBILIS

[0137] A sacarificação foi realizada como no Exemplo 5, utilizando a palha de milho pré-tratada (amostra YT08-P-2; vide Métodos Gerais) misturada com 1% de palha de milho bruta. O SCD foi adicionado no início das execuções de sacarificação separadas em concentrações de 0, 40, 79, 119, 158, ou 316 mg/kg de dióxido de cloro utilizando um estoque de FermaSure®XL. O dióxido de cloro é fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir do SCD na solução de FermaSure®XL após a ativação completa por ácido. Em uma execução de sacarificação separada, 316 mg/kg de dióxido de cloro foram adicionados após 24 horas do início da sacarificação. Após 48 horas de sacarificação, o pH dos hidrolisados produzidos foi ajustado para 5,8, a temperatura reduziu para 33 °C, e 10% em volume (volume final) de cultura da cepa Z. mobilis AR3 7-31, cultivadas a OD600 de cerca de 1,4 em 10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 5 g/L de MgSO4*7H2O, 10 mM de sorbitol, 150 g/L de glicose, pH 5,5 a 33 °C e pH 5,5 (NH4OH a 4 N para o controle do pH) foram adicionados. As amostras dos hidrolisados produzidos, em seguida, foram coletadas para a análise de ácido láctico que são amostras de tempo 0 para a fermentação (na Figura 5). A fermentação e a sacarificação continuaram a 33 °C e o meio foi analisado para o etanol após 24 h.

[0138] No ponto de tempo 0 de fermentação (após 48 horas de sacarificação), o hidrolisado sem o SCD adicionado continha cerca de 6 g/L de ácido láctico, conforme mostrado na Figura 5A. No mesmo ponto de tempo, todos os hidrolisados em que foram adicionados 158 mg/kg ou inferior de dióxido de cloro, possuíam pequenas reduções na formação de ácido láctico; entre 4 e 5 g/L foram produzidos. No hidrolisado em que foram adicionados 316 mg/kg de dióxido de cloro, a formação de ácido láctico foi reduzida para inferior 1 g/L no ponto de tempo 0, e se manteve inferior a 1 g/L ao longo da fermentação. O tratamento de SCD foi eficaz no nível de 316 mg/kg de dióxido de cloro, quando adicionado no início da sacarificação, ou após 24 h (amostras 0/316 mg/kg na Figura 5 A e B) de sacarificação. Estas duas fermentações continham uma quantidade superior a 50 g/L de etanol após 45 h (Figura 5B). As fermentações que utilizam os hidrolisados produzidos com menos SCD adicionado às sacarificações tinham reduzido a produção de etanol (Figura 5B).

EXEMPLO 7 SENSIBILIDADE DA ZYMOMONAS MOBILIS PARA O DIÓXIDO DE CLORO ESTABILIZADO APÓS A INOCULAÇÃO RETARDADA PROLONGADA

[0139] Para examinar o efeito de tempos de latência mais longos entre as adições de SCD e células, 301 mg/kg de dióxido de cloro foram adicionados à palha de milho hidrolisada Y018 (vide Métodos Gerais) + 10 mM sorbitol, pH 5,8 ou para o meio MRM3G6 utilizando um estoque de FermaSure®XL (disponível de E. I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE). O dióxido de cloro é fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada a partir de SCD na solução FermaSure®XL após a ativação completa por ácido. As amostras foram incubadas durante diversos tempos a 33 °C ou 47 °C. As amostras, em seguida, foram levadas a 33 °C e inoculadas com 10% em volume (volume final) de cultura de Z. mobilis ZW1 - XA111 (vide Métodos Gerais) que foi cultivada em 10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de MgSO4*7H2O, 10 mM de sorbitol, 150 g/L de glicose, pH 5,5 a 33 °C (NH4OH a 4 N para o controle do pH) para um OD600 de cerca de 10 (F1360), para um OD600 inicial de cerca de 1 (para as experiências de incubação a 33 °C) ou inoculadas com 10% em volume (volume final) de Z. mobilis AR3 7-31, que foi cultivada em 10 g/L de extrato de levedura BBL, 2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de MgSO4*7H2O, 60 g/L de glicose, pH 5,5 a 33 °C para um OD600 de cerca de 2,5, para um OD600 inicial de cerca de 0,3 (para as experiências de incubação a 47 °C). A produção de etanol foi monitorada nas culturas por HPLC (vide Métodos Gerais).

[0140] A Figura 6 mostra que no meio MRM3G6, a inoculação após 19,5 e 23 h de incubação com o SCD a 33 °C resultou na inibição completa da formação de etanol enquanto que os controles não dosados continham uma quantidade superior a 30 g/L em 20 horas.

[0141] A Figura 7A mostra que, a 47 °C, no hidrolisado de palha de milho Y018, a inoculação após 8 h de incubação com o SCD permitiu níveis de produção de etanol similares aos níveis de produção nos controles não dosados e amostras com tempos de incubação mais longos antes da inoculação, indicando que 8 horas a 47 °C foi um período de tempo de atraso suficiente para que o meio fosse permissível para a fermentação de Z. mobilis. Ao utilizar o meio MRM3G6, após 16 horas de inoculação, a incubação com o SCD a 47 °C foi suficiente para permitir os níveis de produção de etanol similares aos níveis de produção nos controles não dosados e amostras com tempos de incubação mais longos antes da inoculação (Figura 7B). As amostras com inoculação após 8 horas e 0 horas de incubação (dose imediata) não continham nenhum etanol.

Claims (18)

1. MÉTODO DE FERMENTAÇÃO para o controle da contaminação bacteriana em um processo de fermentação, que compreende um biocatalisador de Zymomonas, caracterizado por compreender: (a) fornecer um meio de crescimento que possui o potencial para ser contaminado por uma espécie bacteriana; (b) adicionar uma quantidade eficaz de dióxido de cloro estabilizado ao meio de crescimento da etapa (a), para assim formar uma mistura de dióxido de cloro estabilizado, em que a temperatura da mistura de dióxido de cloro estabilizado é superior a 33 °C; (c) inocular a mistura de (b) com as células de Zymomonas a uma temperatura adequada para as células de Zymomonas para a produção de um caldo inoculado; e (d) fermentar o caldo inoculado sob condições adequadas para o crescimento das células de Zymomonas; (e) em que a contaminação bacteriana é controlada durante a fermentação e o período de tempo a partir da primeira adição de uma quantidade eficaz de dióxido de cloro estabilizado na etapa (b) para a inoculação de células de Zymomonas na etapa (c) ser de, pelo menos, 6 horas.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas células de Zymomonas serem de produção do etanol (ethanologens).

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo meio de crescimento compreender o hidrolisado da biomassa celulósica.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por: (i) o período de tempo a partir da primeira adição de uma quantidade eficaz de dióxido de cloro estabilizado na etapa (b) para a inoculação de células de Zymomonas na etapa (c) ser de, pelo menos, 8 horas; ou (ii) o meio de crescimento ser uma suspensão da reação de sacarificação que compreende, pelo menos, uma celulase; ou (iii) o hidrolisado ser derivado a partir de uma biomassa celulósica selecionada a partir do grupo que consiste em: sabugos de milho, cascas de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas do gênero Panicum (switchgrass), resíduos de papel, bagaço da cana de açúcar, sorgo e os componentes celulósicos lenhosos.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo período de tempo a partir da primeira adição de uma quantidade eficaz de dióxido de cloro estabilizado na etapa (b) para a inoculação de células de Zymomonas na etapa (c) ser de pelo menos 16 horas.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo meio de crescimento não possuir o hidrolisado da biomassa celulósica e ser selecionado a partir do grupo que consiste em; (i) meio definido, (ii) meio que contém uma fonte de açúcar do biomaterial não celulósico, e (iii) hidrolisado de biomassa celulósica clarificada.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela temperatura do caldo inoculado ser inferior a 40 °C ou o pH da mistura de (b) ser inferior a 7.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo caldo inoculado da etapa (d) conter menos de 5 g/L de ácido láctico durante o período do crescimento das células de Zymomonas ou a fonte de contaminação bacteriana ser a bactéria produtora de ácido láctico.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela concentração de dióxido de cloro estabilizado no meio de crescimento da etapa (b), inicialmente ser de, pelo menos, 10 mg/kg.

10. MÉTODO DE FERMENTAÇÃO, para o controle da contaminação bacteriana em um processo de fermentação que compreende um biocatalisador de Zymomonas, caracterizado por compreender: (a) fornecer um meio de semente sem o hidrolisado de biomassa celulósica selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) meio definido, (ii) meio que contém uma fonte de açúcar do biomaterial não celulósico, e (iii) hidrolisado de biomassa celulósica clarificada; (b) inocular o meio de semente de (a) com as células de Zymomonas de produção de etanol para a formação de uma cultura de sementes; (c) cultivar as células de Zymomonas na cultura de sementes de (b); (d) fornecer um meio de fermentação ou uma suspensão de reação de sacarificação; (e) inocular um meio de fermentação ou uma suspensão de reação de sacarificação de (d) com a cultura de sementes de (c) para formar um caldo de fermentação (fermentation beer); e (f) cultivar as células de Zymomonas de produção de etanol no caldo de fermentação sob condições em que o etanol é produzido; em que: (g) qualquer um do caldo de fermentação (fermentation beer) e a suspensão da reação de sacarificação contém o hidrolisado da biomassa celulósica; e em que: (h) o dióxido de cloro estabilizado é adicionado a, pelo menos, um de (i) meio de sementes da etapa (a); (ii) suspensão da reação de sacarificação da etapa (d) ou (iii) meio de fermentação da etapa (d); e em que: (i) se o dióxido de cloro estabilizado, for adicionado ao meio de sementes da etapa (a) o meio de sementes é mantido a uma temperatura de, pelo menos, 33 °C durante, pelo menos, 6 horas antes da inoculação de células de Zymomonas de produção de etanol; e em que: (j) se o dióxido de cloro estabilizado, for adicionado à suspensão de reação de sacarificação da etapa (d), a suspensão da reação de sacarificação é mantida a uma temperatura de, pelo menos, 33 °C durante, pelo menos, 8 horas antes da inoculação de células Zymomonas de produção de etanol; e em que: (k) se o dióxido de cloro estabilizado, for adicionado ao meio de fermentação da etapa (d), o meio de fermentação é mantido a uma temperatura de, pelo menos, 33 °C durante, pelo menos, 8 horas antes da inoculação de células de Zymomonas de produção de etanol; e em que: (l) qualquer um da cultura de sementes, meio de fermentação inoculado ou caldo de fermentação (fermentation beer) que compreende as células de Zymomonas contém uma quantidade inferior a 5 g/L de ácido láctico durante o período do crescimento das células de Zymomonas.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela cultura de sementes, o meio de fermentação inoculado e o caldo de fermentação (fermentation beer) serem mantidos a uma temperatura inferior a 40 °C.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pela suspensão da reação de sacarificação compreender, pelo menos, uma celulase.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pela fonte de contaminação bacteriana ser a bactéria produtora de ácido láctico.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pela biomassa celulósica ser selecionada a partir do grupo que consiste em sabugos de milho, cascas de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas do gênero Panicum (switchgrass), resíduos de papel, bagaço da cana de açúcar, sorgo e os componentes celulósicos lenhosos.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pela concentração de dióxido de cloro estabilizado, do meio de sementes da etapa (a), da suspensão da reação de sacarificação da etapa (d) ou do meio de fermentação da etapa (d), inicialmente, ser, de pelo menos, 10 mg/kg.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pela suspensão da reação de sacarificação da etapa (d) ou o meio de fermentação da etapa (d) que compreende o dióxido de cloro estabilizado conter sólidos em uma quantidade inferior a 20% de sólidos com base no peso seco da biomassa para o peso total da mistura.

17. MEIO DE FERMENTAÇÃO, caracterizado por compreender uma composição de meio de fermentação e um biocatalisador de Zymomonas, em que o referido meio de fermentação é obtido por um método de acordo com a reivindicação 10, etapas (a) a (e) e a referida composição de meio de fermentação compreende: (a) o meio de fermentação que compreende o hidrolisado da biomassa celulósica; e (b) o dióxido de cloro estabilizado em que na referida composição de meio de fermentação: a concentração de dióxido de cloro estabilizado, inicialmente ser, de pelo menos, 10 mg/kg, com a quantidade de dióxido de cloro estabilizado, fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada após a ativação completa de dióxido de cloro estabilizado por ácido; ou a composição conter os sólidos em pelo menos 20% de sólidos com base no peso seco da biomassa para o peso total da composição; ou a biomassa celulósica ser selecionada a partir do grupo que consiste em sabugos de milho, cascas de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas do gênero Panicum (switchgrass), resíduos de papel, bagaço da cana de açúcar, sorgo e os componentes celulósicos lenhosos.

18. MEIO DE FERMENTAÇÃO, caracterizado por compreender composição da suspensão de reação de sacarificação e um biocatalisador de Zymomonas, em que referido meio de fermentação é obtido por um método de acordo com a reivindicação 10, etapas (a) a (e) e em que a referida composição da suspensão de reação de sacarificação compreende: (a) biomassa celulósica; (b) pelo menos, uma enzima de celulase; e (c) dióxido de cloro estabilizado em que na referida composição de suspensão de reação de sacarificação: a concentração de dióxido de cloro estabilizado, inicialmente ser, de pelo menos, 10 mg/kg, com a quantidade de dióxido de cloro estabilizado, fornecido em termos da quantidade de dióxido de cloro que pode ser liberada após a ativação completa de dióxido de cloro estabilizado por ácido; ou a composição conter os sólidos em pelo menos 20% de sólidos com base no peso seco da biomassa para o peso total da composição; ou a biomassa celulósica ser selecionada a partir do grupo que consiste em sabugos de milho, cascas de milho, palha de milho, gramíneas, trigo, palha de trigo, palha de cevada, feno, palha de arroz, gramíneas do gênero Panicum (switchgrass), resíduos de papel, bagaço da cana de açúcar, sorgo e os componentes celulósicos lenhosos.

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