CN104870648A - 用于发酵单胞菌发酵中污染控制的稳定化的二氧化氯 - Google Patents

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Abstract

即使通常使用二氧化氯来控制细菌污染，仍开发了一种允许使用稳定化的二氧化氯(SCD)来在将细菌发酵单胞菌用作生物催化剂的发酵期间控制污染的方法，尽管该发酵单胞菌对二氧化氯敏感。确定了在已经添加SCD一段时间后用发酵单胞菌细胞接种用于发酵的组合物的参数。

Description

用于发酵单胞菌发酵中污染控制的稳定化的二氧化氯
技术领域
本发明涉及微生物学和发酵领域。更具体地，开发了当将发酵单胞菌(Zymomonas)用作水解产物培养基中生物催化剂时，利用稳定化的二氧化氯在发酵中控制细菌污染的方法。
背景技术
由可再生资源生产燃料乙醇是针对全球的化石燃料短缺、能源成本增加、以及与大气二氧化碳含量提高相关的全球变暖效应的一种长期解决方案。来自可再生资源的燃料乙醇是通过利用生物催化剂的糖的发酵生产的。当前，最广泛地用于乙醇生产的生物催化剂是酵母。可发酵糖最典型地是得自经处理的生物材料，包括玉米粒、甜菜和甘蔗。替代性的丰富的生物材料糖源是纤维素类或木质纤维素类生物质。利用物理的、化学的和/或酶学的处理，用于加工纤维素类和木质纤维素类生物质，以生产可发酵糖的方法正在被开发。
在大规模发酵过程中维持无菌是困难的，尤其是当生物材料被用作碳水化合物源时。大规模发酵过程通常被可能来自经处理的生物材料、设备、工艺用水或其它来源的细菌污染。通常，污染性细菌是乳酸菌(LAB)，如乳杆菌菌种。污染性细菌通过利用糖和降低主要产物生物催化剂的效果而使发酵产物的收率降低。污染性细菌产生非期望的产物如乙酸和乳酸，它们增加了培养物中的胁迫条件，导致生物催化剂较差的生长和/或生物催化剂产物较低的生产。
在使用酵母作为生物催化剂，通常以糊料或糖浆用作碳水化合物源，用于燃料或酿造的乙醇生产的发酵中，污染性细菌(主要是乳酸菌)已经成为了问题。由于酵母和污染性细菌对一些抗微生物剂的不同敏感度，能够在酵母发酵中使用一些抗微生物剂来控制细菌。成功地在酵母发酵中被用于控制LAB污染的抗微生物剂包括青霉素(Day等人(1954)Agricultural and Food Chemistry，2：252-258)、维吉霉素(Hynes等人(1997)J.of Industrial Microbiology&Biotechnology 18：284-291；Bischoff等人(2009)，Biotechnology and Bioengineering 103：117-122；WO2007145857)、啤酒花酸(US20090042276)、红霉素、泰乐菌素、四环素和二氧化氯(Dupont Company，Wilmington DE；Fatka，Feedstuffs(2008年11月3日)第18页)。
在WO 2007/097874中公开了用ClO2气体处理包含可发酵碳水化合物和酵母的含水物流以降低不期望的微生物浓度。在US 2009/0061490中公开了用二氧化氯处理来自酵母乙醇生产过程的酵母浆液以破坏微生物污染物，同时保持酵母活性。在WO2007/149450公开了包含可发酵糖、种菌(酵母)和用于基本上防止细菌生长的稳定化的二氧化氯的发酵方法。在WO2011038317公开了使用稳定化的二氧化氯保持碳水化合物溶液免于微生物污染。
通过工程化菌株的改进，包括除葡萄糖之外还利用木糖和阿拉伯糖、以及使竞争性代谢途径失活，开发了发酵单胞菌，作为有效的生物催化剂用于生产乙醇。此外，通过提高对纤维素类生物质水解产物中存在的抑制剂的耐受性，已使发酵单胞菌适合用于水解产物发酵培养基中。然而，使用发酵单胞菌作为用于乙醇发酵的生物催化剂显示了在污染控制方面另外的挑战，因为这种生物催化剂与主要的污染物一样是细菌。因此抗微生物剂对酵母和细菌的不同活性不能够被用于使用酵母生物催化剂生产乙醇的方法中。
仍然存在对在使用细菌发酵单胞菌生物催化剂的发酵中控制细菌污染的方法的需求。
发明内容
本发明提供了用于在发酵中控制细菌污染的组合物和方法，其中发酵单胞菌是生物催化剂。
因此，本发明提供了用于在包含发酵单胞菌生物催化剂的发酵过程中控制细菌污染的发酵方法，所述方法包括：
a)提供生长培养基，所述生长培养基具有被细菌菌种污染的可能性；
b)将有效量的稳定化的二氧化氯添加至(a)的生长培养基，从而形成稳定化的二氧化氯混合物，其中稳定化的二氧化氯混合物的温度大于约33℃；
c)在适于发酵单胞菌细胞的温度下，用发酵单胞菌细胞接种b)的混合物，以产生接种的培养液；以及
d)在适于发酵单胞菌细胞生长的条件下，使接种的培养液发酵；其中细菌污染在发酵期间是受控的。
在一个实施例中，发酵单胞菌是产乙醇生物，并且在该方法的发酵液中产生乙醇。
在另一个实施例中，本发明提供了发酵培养基混合物组合物，其包含：
a)纤维素类生物质水解产物发酵培养基；和
b)稳定化的二氧化氯。
在另一个实施例中，本发明提供了糖化反应浆液混合物组合物，其包含：
a)纤维素类生物质；
b)至少一种纤维素酶；和
c)稳定化的二氧化氯。
在本发明的另一方面，提供了用于在包含发酵单胞菌生物催化剂的发酵过程中控制细菌污染的发酵方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供缺乏纤维素类生物质水解产物的种子培养基，其选自：i)限定培养基，ii)包含非纤维素类生物材料糖源的培养基，和iii)澄清的纤维素类生物质水解产物；
b)用发酵单胞菌产乙醇生物细胞接种a)的种子培养基，以形成种子培养物；
c)使发酵单胞菌细胞在b)的种子培养物中生长；
d)用c)的种子培养物接种糖化反应浆液，以产生接种糖化浆液；
e)将接种糖化浆液与发酵培养基混合，以产生发酵啤酒；以及
f)在由此产生乙醇的条件下，使发酵单胞菌产乙醇生物细胞在发酵啤酒中生长；
其中：
稳定化的二氧化氯被添加至下列中的至少一者：i)步骤a)的种子培养基；ii)步骤d)的糖化反应浆液；或iii)步骤e)的发酵培养基；并且
其中：
如果将稳定化的二氧化氯添加至步骤a)的种子培养基，则在用发酵单胞菌产乙醇生物接种种子培养基之前，将种子培养基在至少约33℃的温度下保持至少约6小时；并且
其中：
如果将稳定化的二氧化氯添加至步骤d)的糖化反应浆液，则在用种子培养物接种糖化反应浆液之前，将糖化反应浆液在至少约33℃的温度下保持至少约8小时；并且
其中：
如果将稳定化的二氧化氯添加至步骤e)的发酵培养基，则在将发酵培养基与糖化反应浆液混合之前，将发酵培养基在至少约33℃的温度下保持至少约8小时；并且
其中：
在发酵单胞菌细胞生长期间，包含发酵单胞菌细胞的种子培养物、接种糖化浆液或发酵啤酒中的任何一者包含小于约5g/L的乳酸。
附图说明
图1示出了在针对木糖利用工程化的发酵单胞菌中的乙醇发酵途径的图表。
图2是示出发酵单胞菌细胞在包含不同量的稳定化的二氧化氯(SCD)的MRM3G10培养基中生长的图。
图3是示出通过发酵单胞菌细胞在水解产物培养基中生产乙醇的图，该培养基添加298mg/kg SCD或未添加SCD，在用发酵单胞菌细胞在33℃下接种之前在33℃或47℃下保持6小时。
图4示出了通过发酵单胞菌细胞在水解产物培养基中生产乙醇的图，该培养基添加151mg/kg或301mg/kg二氧化氯，并且4(A)中立即接种；或者4(B)中47℃下保持24小时或48小时之后在33℃下接种。
图5示出了通过发酵单胞菌细胞的乳酸生产(A)和乙醇生产(B)的图，该发酵单胞菌细胞被接种到由糖化反应产生的水解产物中，在糖化开始时将不同量的SCD添加该水解产物，在47℃、初始pH 5.3条件下保持48小时之后在33℃下接种。在另外的样品中，在糖化24小时之后添加316mg/kg SCD，在47℃下保持48小时，随后在33℃下接种。
图6示出了通过发酵单胞菌细胞在MRM3G6培养基中生产乙醇的图，该培养基添加301mg/kg二氧化氯，并且在33℃保持在19.5小时或23小时之后接种。
图7示出了通过发酵单胞菌细胞在培养基中生产乙醇的图，该培养基添加301mg/kg二氧化氯，并且在47℃保持8、16、24或48小时之后在33℃下在接种，其中(A)为水解产物培养基，并且(B)为MRM3G6培养基。
具体实施方式
本发明涉及使用稳定化的二氧化氯(SCD)作为用于控制发酵中的污染细菌的抗菌剂，该发酵利用发酵单胞菌作为生物催化剂，例如用于制备乙醇。存在于碳水化合物溶液或浆液中的污染细菌受到SCD的控制，然而本文发现SCD对发酵单胞菌细胞的生长和生产有害。开发了一种用于控制在利用稳定化的二氧化氯的发酵单胞菌发酵期间的污染的方法。具体地，将稳定化的二氧化氯添加至生长培养基(其可包括发酵培养基或糖化反应浆液)，其保持在大于33℃的温度下一段时间，随后降温至适于发酵的温度(如果需要的话)，并且用发酵单胞菌细胞接种，形成发酵液。如果SCD混合物保持的温度高于适于发酵的温度，降温是需要的。通过允许在添加SCD和用发酵单胞菌细胞接种之间经历高温阶段，减轻了SCD的有害效应，使得发酵单胞菌细胞能够有效地生长并产生乙醇。影响所需时间长度的一个因素是添加SCD的生长培养基或发酵培养基的类型、或者是否将SCD添加至糖化反应浆液、以及浆液类型。
就用作燃料添加剂而言，这一方法可用于乙醇从可再生的资源的高效生产，将解决化石添加剂的短缺、降低能源成本和影响全球变暖。
下列定义和缩写用于解释权利要求和说明书。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或者其任何其它变型旨在包括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真实的(或存在的)且B是虚假的(或不存在的)，A是虚假的(或不存在的)且B是真实的(或存在的)，以及A和B都是真实的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
如本文所用，用术语“约”修饰本发明的成分或反应物的数量时是指数值量的变化，它们可能发生在，例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。
术语“产乙醇生物”指通过代谢碳水化合物原料而生产乙醇的生物。
术语“可发酵糖”指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。
术语“同步糖化和发酵(SSF)”指生物质被糖化并且同时糖化产生的可发酵糖通过生物催化剂被用于产生某种产物的方法，其通常在相同反应容器中进行。
术语“纤维素类”指包含纤维素和附加组分的组合物，其可包括半纤维素和木质素。
术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维质材料也可包含半纤维素。
术语“糖化”指由多糖生产可发酵糖。
术语“生物材料”是指是可用于通过生物催化剂的发酵中的碳水化合物源的任何生物来源的材料。生物材料包括纤维素类生物质以及被用作碳水化合物源的其它植物材料和植物来源的材料，例如谷物、糊料、糖浆和原汁(例如来自甜菜和甘蔗的)。
术语“浆液”指不溶解的材料和液体的混合物。
术语“纤维素类生物质糖化反应浆液”是指包含纤维素类生物质和至少一种纤维素酶的混合物，其中纤维素和其它多糖在反应期间发生水解以产生可发酵糖。生物质也可经预处理后被添加至糖化反应浆液。混合物包含不溶解的材料和液体，并且因此是一种浆液。
术语“预处理的生物质”意指在糖化之前已经经过预处理的生物质。
术语“纤维素类生物质”是指任何纤维素类的或木质纤维素类的材料并包括包含纤维素的，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。纤维素类生物质也可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。纤维素类生物质可来源于单一来源，或者可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，纤维素类生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。纤维素类生物质包括但不限于生物能源作物、农业残留物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。纤维素类生物质的例子包括但不限于玉米棒、作物残留物如玉米皮、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱或大豆纤维类植物材料、从谷物的研磨中获得的纤维素类组分、树、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌丛(木本植物纤维素组分)、蔬菜、水果、花和动物粪肥。
术语“纤维素类生物质水解产物”是指产生自纤维素类或木质纤维素类生物质的糖化作用的产物。也可在糖化前预处理生物质。纤维素类生物质水解产物是包含生物质固体的产物。
术语“澄清的纤维素类生物质水解产物”或“清澈的纤维素类生物质水解产物”是指已经经过加工以去除固体并且不被认为是纤维素类生物质水解产物的纤维素类生物质水解产物。此外
术语“糖化酶”指能够催化生物质组分转化成可发酵糖的酶。如果生物质为预处理的，该酶通常更有效。
术语“实质污染”是指发酵液中乳酸菌污染物的水平，如果该发酵液在没有抗微生物剂的情况下被温育约40小时，其将产生大于约5g/L的乳酸。
术语“乳酸菌”是指产生作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的乳酸的细菌。乳酸菌(LAB)是属于乳杆菌目(Lactobacillales)的革兰氏阳性细菌，并且包括例如下列属：乳杆菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、乳球菌(Lactococcus)、片球菌(Pediococcus)、链球菌(Streptococcus)和肠球菌(Enterococcus)。
术语“生长培养基”是指液体培养基，其能够维持发酵单胞菌生物催化剂的生长。用于本发明的典型生长培养基包括发酵培养基和糖化反应浆液，其可包含纤维素类生物质水解产物。
术语“发酵培养基”是指包含支持被用作生物催化剂的微生物的生长的、诸如营养物质的组分的组合物。发酵培养基可以以任何规模被使用，包括小规模培养和大规模生产发酵。
术语“发酵液”是指包含发酵培养基和生物催化剂细胞的组合物，在其中发酵正在发生或已经发生。根据生物催化剂在发酵液中已生长的时间长短，该发酵液还可包括由生物催化剂产生的产物如乙醇。
术语“种子培养物”是指被用于接种更大体积的发酵培养基以制备发酵培养基的生物催化剂细胞的培养物。通常，种子培养物种菌为发酵液终体积的约0.01％至20％v/v。
术语“污染”是指不是有意地被引入的微生物的存在。通常，所期望的生物催化剂被引入生长培养基以制备发酵液。除被引入的生物催化剂之外的存在于发酵液中的微生物被认为是污染。
本发明的方法提供了对发酵单胞菌细菌在其中是生物催化剂的培养物中非期望的细菌的控制，例如在用于乙醇生产的发酵中。非期望的污染性细菌通常存在于大规模工艺中，尤其是当培养基包含经处理的生物材料时。用于培养基中的经处理的生物材料可包括碳水化合物源，例如玉米或小麦糊、甜菜或甘蔗糖浆和木质纤维素类生物质水解产物。污染性细菌可以从生物材料、加工设备、接种培养物、工艺用水、空气、或其它来源被引入发酵过程中。在生产发酵中控制污染通常使得生物催化剂能够以比在污染性细菌的存在下所实现的更高的水平生长和生产产物，提供了更有效的和经济的发酵工艺。
虽然二氧化氯一般用于控制细菌污染，开发了一种允许使用稳定化的二氧化氯(SCD)来控制发酵期间的污染的方法，该发酵利用细菌发酵单胞菌作为生物催化剂，虽然发酵单胞菌是对二氧化氯敏感的。在利用生物质来源的碳水化合物源的大规模发酵中的主要污染细菌是乳酸菌(LAB)，诸如乳杆菌(Lactobacillus)菌株。污染细菌与可发酵糖的生物催化剂竞争和/或产生抑制生物催化剂生长与生产的物质如乳酸。在本发明方法中，将SCD添加至可能受到污染的发酵培养基或糖化反应浆液中，它们用于提供发酵单胞菌发酵的可发酵糖，允许经过一段时间，并且随后用发酵单胞菌细胞接种包含SCD的混合物。据本文发现，虽然对控制典型的污染细菌有效的SCD含量也对发酵单胞菌细胞生长和乙醇生产产生抑制，如果允许在添加SCD和发酵单胞菌细胞接种之间经历一段时间，发酵单胞菌细胞在发酵期间显示与无SCD处理的那些发酵相当的生长和产物形成水平，同时污染保持低水平。
稳定化的二氧化氯
术语“稳定化的二氧化氯”，本文也称为“SCD”，指一种或多种含二氧化氯的氧-氯络合物、一种或多种含亚氯酸根的化合物、当暴露于酸时能够形成二氧化氯的一种或多种其它物质、以及它们的组合。因此，稳定化的二氧化氯包含至少一种含二氧化氯的氧-氯络合物、含亚氯酸根的化合物、或当暴露于酸时能够在液体基质中形成二氧化氯的物质。
优选的含二氧化氯氧-氯络合物是一种选自二氧化氯与碳酸盐的络合物、二氧化氯与碳酸氢盐的络合物、以及它们的混合物。含亚氯酸根的化合物的例子包括金属亚氯酸盐，具体地讲包括碱金属亚氯酸盐和碱土金属亚氯酸盐。用作二氧化氯前体的、含亚氯酸根的化合物的具体例子是亚氯酸钠，其可用作技术等级亚氯酸钠。
SCD优选地是碱金属亚氯酸盐或碱土金属亚氯酸盐、通常是亚氯酸钠(NaClO2)的水溶液。溶液中的亚氯酸钠在高于7的pH下一般是稳定的，但是当pH低于中性(pH 7)时释放活性二氧化氯(ClO2)。SCD活化速率(即，活性ClO2从稳定形式释放的速率)随着pH降低而提高。
多种SCD组合物，具体地讲包含二氧化氯的氧-氯络合物的确切化学组成尚未被完全理解。某些二氧化氯前体的制造或制备在Gordon，美国专利3,585,147和Lovely，美国专利3,591,515中进行了描述。可商购获得的并且有用的稳定化的二氧化氯制剂的具体例子包括，例如Anthium和购自E.I.du Pont de Nemours and Company(Wilmington，DE)；以及和购自Bio-Cide International，Inc.(Norman，OK)。
可通过以下物质的溶液的形式提供SCD：一种或多种含二氧化氯的氧-氯络合物、一种或多种含亚氯酸根的化合物、当暴露于酸时能够形成二氧化氯的一种或多种其它物质、以及它们的组合。该溶液提供在液体中具有预先确定浓度的活性物质的SCD，它是可利用的二氧化氯(ClO2)。优选地，液体培养基具有足够的SCD以具有有效的二氧化氯浓度，基于液体培养基的总重量，所述浓度按重量计在约0.002％至约40％的范围内，优选地按重量计在约2％至约25％的范围内，更优选地按重量计在约5％至约15％的范围内，该液体培养基包括含二氧化氯的氧-氯络合物、含亚氯酸根的化合物、当暴露于酸时能够形成二氧化氯的其它物质、以及它们的组合。
SCD可以固体材料形式提供，例如包含碱或碱土金属亚氯酸盐粉末、惰性成分、以及任选的干燥激活因子如干酸的组合物。
SCD也可以混合物(或浆液)形式提供，该混合物包含碱或碱土金属亚氯酸盐粉末和附加固体碱或碱土金属亚氯酸盐粉末的饱和溶液。此类浆液提供液体SCD，其具有比溶液形式中的活性成分更高的活性成分水平。
在一个实施例中，SCD是稳定化碱金属亚氯酸盐，更具体地是亚氯酸钠(NaClO2)，它是最常见的和可商购获得的碱金属亚氯酸盐。稳定化碱金属亚氯酸盐指在高于7的pH，优选地9-10的pH下的亚氯酸缓冲溶液。该溶液通常包含溶于水的5-22％重量/重量的亚氯酸钠，但是亚氯酸钠浓度也可为更高或更低的。
通常亚氯酸钠以水溶液形式使用，其基于溶液重量按重量计包含5-22％的亚氯酸钠。可将SCD浓度描述为当将亚氯酸化学当量地转化成二氧化氯(ClO2)时的有效二氧化氯的浓度，“有效的ClO2”。在1g亚氯酸钠中的潜在二氧化氯含量为0.597g。按重量计包含5-22％的亚氯酸钠的亚氯酸钠溶液因此包含2.98-13.13％的有效二氧化氯。ClO2的生成通过以下公式(1)示出：
5NaClO2+4H+→4ClO2(g)+2H2O+Cl-+5Na+    (1)
其中一个NaClO2分子提供0.8个ClO2分子。
SCD的浓度通常指定为在被酸完全活化后可从SCD制备物中释放的二氧化氯量。这标准化了在不同SCD制剂中提供的、在具有不同pH的组合物中使用的二氧化氯浓度。
当SCD是亚氯酸钠水溶液时，该SCD具有大于pH 7的pH。当pH降低时，亚氯酸钠溶液释放活性二氧化氯。当pH从pH约5-6.6降低至2.6时，从SCD水溶液中释放二氧化氯的速率提高。这个速率可取决于多个因素而改变。例如，不同的ClO2前体在相同或相似pH下释放ClO2的速率可不同。其它因素如溶液缓冲能力可影响ClO2从SCD溶液中释放的速率。这些因素是本领域技术人员熟知的。
用于发酵单胞菌发酵的稳定化的二氧化氯混合物
在本发明方法中，将SCD添加至发酵组合物如发酵培养基或糖化反应浆液，形成稳定化的二氧化氯混合物，随后用发酵单胞菌细胞生物催化剂接种混合物。从而将SCD添加至发酵培养基或糖化反应浆液中，它们是发酵单胞菌细胞发酵的可发酵糖来源。本文发现虽然发酵单胞菌细胞对二氧化氯敏感，如果在用发酵单胞菌细胞接种前经历一段时间的话，可将SCD添加至组合物中，该组合物是发酵单胞菌细胞发酵的糖来源。
可将SCD添加至任何类型的生长培养基，该培养基维持用发酵单胞菌作为生物催化剂的发酵期间的生长和生产。本领域技术人员将知道根据下文的信息如何制备任何所描述的类型的培养基。在一个实施例中，该生长培养基是限定培养基。该培养基包含典型的购买的组分，包括诸如葡萄糖的碳水化合物源、氨基酸源和诸如酵母提取物的其它营养成分、以及可包括痕量元素、氮和磷的其它组分，如KH2PO4和MgSO4。限定培养基经常用于培养实验室规模的培养物以及被用作大规模发酵的种菌的种子培养物。
在另一个实施例中，生长培养基包含得自非纤维素类材料如糊料、原果汁、或糖浆的糖。这些糖制备自诸如谷物(如玉米、小麦、大麦和黑麦)的生物材料和诸如甜菜和蔗糖的糖料作物。用于发酵的水解的糊料是从谷物制备的，通常通过加热至高于糊化温度的温度、用α淀粉酶处理以液化和使用诸如葡糖淀粉酶的酶糖化。来自甜菜和甘蔗的糖浆或原汁可被用作发酵培养基中的糖源。这种类型的糖源是非纤维素类生物材料糖源(纤维素类包括木质纤维素类)，因为该糖源主要是淀粉或糖汁。这种类型的糖源通常用于种子培养物中和使用酵母作为生物催化剂的乙醇生产中、以及其它非纤维素类的大规模发酵中。
限定培养基和具有来自非纤维素类源的糖的培养基不含纤维素类(包括木质纤维素类)生物质水解产物。另外，包含得自纤维素类生物质并经高度纯化以去除诸如固体的其它纤维素类组分的糖源的培养基，被认为是不含纤维素类生物质水解产物的培养基。这种类型的培养基包含澄清的纤维素类生物质水解产物。
在另一个实施例中，生长培养基包含从纤维素类(包括木质纤维素类)生物材料制备的纤维素类生物质水解产物。纤维素类生物质水解产物包含生物质固体。纤维素类生物质水解产物是通过纤维素类(包括木质纤维素类)生物质的糖化制备的。该生物质通常在糖化前进行了预处理。本领域技术人员可用任何已知的方法处理生物质，在水解产物中产生可发酵糖。通常该生物质采用物理的和/或化学的处理，以及酶促糖化进行预处理。物理的和化学的处理可包括碾磨、铣削、切割、碱处理如用氨或氢氧化钠和/或酸处理。在其中生物质与包含氨的水性溶液接触的情况下，低氨预处理是特别有用的，以形成生物质-氨水混合物，其中氨的浓度足够维持生物质-氨水混合物的碱性pH，但相对于生物质干重量其小于约12重量％，并且生物质的干重量至少约为15重量％固体(相对于生物质-氨水混合物的重量)，如共同拥有的美国专利US 7,932,063所公开的，其以引用方式并入本文。
纤维素或木质纤维素生物质的酶解糖化通常利用酶组合物或共混物来降解纤维素和/或半纤维素并且产生水解产物，其包含糖，诸如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。糖化酶见Lynd，L.R.等人的综述(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶共混物，其包括一种或更多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”(EC 3.)的酶分类EC 3.2.1.x(EnzymeNomenclature 1992，Academic Press，San Diego，CA，以及增补1(1993)、增补2(1994)、增补3(1995)、增补4(1997)和增补5[分别在Eur.J.Biochem.，223：1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232：1-6，1995；Eur.J.Biochem.，237：1-5，1996；Eur.J.Biochem.，250：1-6，1997；和Eur.J.Biochem.，264：610-6501999中])。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡萄糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外，将其它活性添加至糖化酶聚生体(如肽酶(EC 3.4.x.y)、脂肪酶(EC3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC 1.11.1.x)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73))中以促进从生物质的其它组分中释放多糖是有益的。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如降解纤维素的能力，该活性由具有不同底物特异性的若干种酶或一组酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶、一种或更多种酶或所有酶，它们都可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂，如纤维素酶，可包括多种酶。对于糖化有用的许多糖基水解酶和它们的组合物公开于WO 2011/038019中。
糖化酶可商购获得。此类酶包括，例如，CP纤维素酶、木聚糖酶、1500和DUET(Danisco U.S.Inc.，Genencor International，Rochester，NY)和Novosyme-188(Novozymes，2880Bagsvaerd，Denmark)。此外，糖化酶可以是未经纯化的并以细胞提取物或全细胞制剂的形式提供。可使用已经进行工程改造以表达一种或多种糖化酶的重组微生物制备该酶。例如，本文用于经预处理纤维素类生物质的糖化的H3A蛋白质制备物是由里氏木霉(Trichodermareesei)的遗传工程菌株生产的酶的未纯化的制备物，其包括纤维素酶和半纤维素酶的组合，并且描述于WO 2011/038019中，该文献以引用方式并入本文。
用于糖化的另外酶类包括，例如，糖基水解酶，诸如GH3、GH39、GH43、GH55、GH10和GH11家族的成员。GH是一组酶，其水解两个或更多个碳水化合物间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物基团间的糖苷键。GH家族基于序列类似性进行分类，并且该分类可在碳水化合物-活性酶(CAZy)数据库中得到(Cantarel等人(2009)Nucleic Acids Res.37(Database issue)：D233-238)。这些酶的某一些能够作用于多种底物并且作为糖化酶表现出效能。糖苷水解酶家族3(“GH3”)的酶有许多活性，包括例如β-葡萄糖苷酶(EC：3.2.1.21)、β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)、N-乙酰β-氨基葡萄糖苷酶(EC：3.2.1.52)、葡聚糖β-1，3-葡萄糖苷酶(EC：3.2.1.58)、纤维糊精酶(EC：3.2.1.74)、外-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC：3.2.1)和/或β-半乳醣苷酶(EC 3.2.1.23)活性。糖苷水解酶家族39(“GH39”)酶还具有大量已知活性，包括，例如α-L-艾杜糖醛酸酶(EC：3.2.1.76)和/或β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)的活性。糖苷水解酶家族43(“GH43”)酶具有许多已知的活性，包括例如L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；聚阿拉伯糖内切酶(EC3.2.1.99)；和/或半乳聚糖1，3-β-半乳醣苷酶(EC 3.2.1.145)活性。糖苷水解酶家族51(“GH51”)的酶已知具有，例如，L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)和/或内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)的活性。糖苷水解酶家族10(“GH10”)已被详述于Schmidt等人，1999，Biochemistry 38：2403-2412和Lo Leggio等人，2001，FEBS Lett 509：303-308，并且糖苷水解酶家族11(“GH11”)已被描述于Hakouvainen等人，1996，Biochemistry 35：9617-24。
本发明的发酵培养基混合物组合物包含纤维素类生物质水解产物发酵培养基和SCD。“有效量”的SCD将为任意量的对杀灭污染细菌菌种有效，并且不对生物催化剂有害的SCD。SCD的有效量将根据使用的生长培养基类型而不同。在一个实施例中，如下文进一步所述，其中稳定化的二氧化氯的量以能够在稳定化的二氧化氯被酸完全活化后释放的二氧化氯的量的方式给出，SCD浓度初始为至少约10mg/kg。包含生物质水解产物的发酵培养基可包含一定百分比的水解产物以及一种或多种另外的糖和/或其它添加的组分，或者所述培养基可包含90％或更多的水解产物以及少量的添加物如山梨醇，如下文所述。在各种实施例中，纤维素类生物质水解产物为发酵液终体积的至少约50％、60％、79％、80％、90％或95％。通常发酵液终体积的约10％是种菌。
根据所采用的预处理和糖化方法，生物质水解产物的固体含量通常在介于约10％和40％之间。更典型地，固体含量为约25％，即包含90％纤维素类生物质水解产物的培养基具有约23％的固体。在一个实施例中，纤维素类生物质水解产物发酵培养基和SCD的混合物包含基于生物质干重量对总混合物重量计至少约20％的固体。
在一个实施例中，将SCD添加至糖化反应浆液中，它们是发酵单胞菌细胞发酵的可发酵糖来源。糖化反应浆液可含有有助于不溶解固体形成反应物如谷物(诸如玉米、小麦、大麦和黑麦)和纤维素(或木质纤维素)生物质的任何生物材料，使得反应物成为浆液。此外，如上所述的糖化反应浆液包含用于含淀粉生物材料的至少一种产糖酶如葡糖淀粉酶、或用于纤维素类生物质的至少一种纤维素酶。
在一个实施例中，本发明的糖化反应浆液混合物组合物包含纤维素类生物质、至少一种纤维素酶和稳定化的二氧化氯。在一个实施例中，如下文进一步所述，其中稳定化的二氧化氯的量以能够在稳定化的二氧化氯被酸完全活化后释放的二氧化氯的量的方式给出，SCD浓度初始为至少约10mg/kg。在一个实施例中，混合物包含基于生物质干重量对总混合物重量计至少约20％的固体。
可在糖化反应期间的任何时间将SCD添加至糖化反应浆液，例如在反应开始时、反应结束时、或反应期间的任何时间。当进行混合体糖化和发酵(HSF)时，可将SCD添加至糖化反应浆液。在HSF工艺中，完成部分糖化，随后添加生物催化剂，并且糖化和发酵然后同时发生。当进行HSF时，在糖化期间添加SCD，添加SCD的时间足以获得在下述的发酵单胞菌细胞接种之前的时间段。
用于发酵单胞菌发酵的SCD方法
据本文发现，虽然发酵单胞菌细胞对二氧化氯敏感，如果允许在添加SCD至发酵组合物和发酵单胞菌细胞接种所得SCD混合物之间经历一段时间，细胞能够生长并产生乙醇，类似于接种到未添加SCD的培养基中的细胞。在添加SCD和接种发酵单胞菌细胞之间允许经历的时间段取决于多个因素，包括SCD混合物的pH和温度、添加SCD的组合物类型、以及添加的SCD量。
如上所述，SCD混合物的pH低于7以维持二氧化氯的释放。通常SCD混合物具有小于约6的pH。例如，纤维素类生物质糖化反应通常在介于约5和6之间的pH下进行，并且水解产物培养基通常在介于约5和6之间的pH下，在发酵单胞菌发酵中使用。因此这些组合物可直接与SCD一起使用，不需要进一步的pH调节。
在接种发酵单胞菌细胞之前，SCD混合物的温度保持在大于33℃。可将温度保持在约34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50℃、或更高。将温度保持在低于对发酵所需的营养物质不利的水平。在各种实施例中，SCD混合物的温度保持在35℃或更高、40℃或更高、或约47℃。如果SCD混合物的温度高于适合发酵单胞菌细胞的温度，将该温度降至适于发酵单胞菌细胞的温度，随后进行发酵单胞菌细胞接种。适于发酵单胞菌细胞的温度是在该温度下发酵单胞菌细胞存活的温度，其不需要是对于发酵最佳的温度。其中在所得发酵液冷却至发酵温度后，可将发酵单胞菌细胞接种到混合物中，该混合物的温度高于最适合发酵的温度。在一个实施例中，接种时SCD混合物的温度低于40℃。在其它实施例中，该温度为37℃或更低、35℃或更低、或33℃或更低。
当将SCD添加至包含纤维素类生物质水解产物或糖化反应浆液的发酵培养基中时，在添加SCD和接种发酵单胞菌细胞之间的时间段大于6小时。在各种实施例中，时间段可为7、8、9、10、11、或12、或更多个小时。用于特定类型的纤维素类生物质水解产物培养基或糖化反应浆液、特定剂量的SCD和特定温度的特定时间可容易地由本领域技术人员基于接种后的发酵单胞菌细胞的性能来确定，如本文实例所例示。
当将SCD添加至缺乏纤维素类生物质水解产物的发酵培养基中时，在添加SCD和接种发酵单胞菌细胞之间的时间段大于8小时。在各种实施例中，时间段可为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20、或更多个小时。用于特定类型的缺乏纤维素类生物质水解产物的发酵培养基、特定剂量的SCD和特定温度的特定时间可容易地由本领域技术人员基于接种后的发酵单胞菌细胞的性能来确定，如本文实例所例示。
将有效量的SCD添加至发酵组合物中以控制发酵液中由发酵单胞菌细胞接种该组合物引起的污染。如上所述，SCD的浓度通常指定为在被酸完全活化后可从SCD制备物中释放的二氧化氯(ClO2)量。所需用于在发酵单胞菌发酵液中提供污染控制的ClO2浓度将根椐以下因素而变化：例如使用的发酵单胞菌菌株的生长和生产特性、添加SCD的发酵组合物(如上所述)的类型、温度和pH、以及污染的初始水平。污染性细菌的控制可通过测定发酵液中的乳酸的水平来评估，其中甚至在约40小时的发酵之后小于约5g/L的乳酸的存在表明污染被控制。污染可以被控制在发酵液中小于约5g/L的乳酸，或小于4g/L或3g/L或2g/L或1g/L的乳酸。发酵液中的乳酸的量通常通过HPLC测定，如本领域的技术人员所已知的。有效量的SCD可为至少约10、25、50、75、100、125、150、175、200、250、275、300、350mg/kg、或更高。在特定条件下用于特定发酵组合物的有效量ClO2可由本领域技术人员基于本文实例中所述的实验容易地进行测定。例如，约150mg/kg ClO2的浓度是用于控制在本文实例4所述的条件下接种在水解产物培养基中的5或10体积％的植物乳杆菌(L.plantarum)培养物(OD600为约2)的有效量。
发酵单胞菌细胞的种菌
在本发明方法中，用发酵单胞菌细胞接种产生发酵液。接种可利用任何来源的发酵单胞菌细胞，它们对启动生长培养物有效。通常，发酵单胞菌细胞作为冷冻储液被储存，并且细胞通过在限定培养基中的少量培养物中生长而被复苏。上述少量培养物被用作添加至发酵培养基以制备发酵液或培养物的种菌。少量培养物还可被用于接种种子培养物。发酵单胞菌细胞在种子培养物中生长，然后其作为种菌被添加到大规模的发酵。用作种菌的种子培养物可含有无菌培养基并且不需要用于污染控制的抗菌剂。另选地，如上所述用作种菌的种子培养物可含有任何发酵培养基，其可例如受到工艺设备或生物材料的污染，其中SCD用于如上所述在发酵单胞菌细胞接种之前控制污染。接种通常使用1％至10％的最终体积培养基进行。
发酵单胞菌细胞
发酵单胞菌细胞的任何菌株可被用于本发明的方法中，并且基于包括将要使用的培养基的类型和发酵过程所期望的产物在内的因素被选择。对于所期望的生产过程是有效的生物催化剂的任何发酵单胞菌菌株均可使用。例如，发酵单胞菌细胞天然地利用葡萄糖、果糖和/或蔗糖作为发酵底物生产乙醇，但木糖不被代谢。在一个实施例中，用于本发明的方法和组合物中的发酵单胞菌细胞已经针对木糖的利用经过工程化改造，当使用包含木糖的纤维素类生物质水解产物作为发酵培养基时这是尤其期望的。
产乙醇的发酵单胞菌的菌株，例如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)，已被工程化以将木糖发酵为乙醇。通常，四种基因被引入运动发酵单胞菌，用于表达参与木糖代谢的四种酶，以创建木糖利用代谢途径(图1)，如美国专利5,514,583、美国专利5,712,133、美国专利6,566,107、WO95/28476、Feldmann等人((1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361)，和Zhang等人((1995)Science 267：240-243)所述。这些基因包括编码木糖异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖，以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。另外还表达了戊糖磷酸途径中的两种酶，转酮醇酶和转醛醇酶，它们将5-磷酸木酮糖转化成连接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢成乙醇(参见图1)。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，例如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源可包括黄单胞菌(Xanthomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、埃希氏菌(Escherichia)、红细菌(Rhodobacter)、黄杆菌(Flavobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、农杆菌(Agrobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonads)和发酵单胞菌(Zymomonas)。大肠杆菌(E.coli)的编码区通常被使用。
将编码DNA序列可操作地连接至在发酵单胞菌细胞中表达的启动子如运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(GAP启动子)和运动发酵单胞菌烯醇酶启动子(ENO启动子)。如US 7,989,206(该文献以引用方式并入本文)中所公开的具有提高的表达的突变体GAP启动子，对于在发酵单胞菌中表达也是有用的。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更多个编码区可接合到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得的嵌合基因导入发酵单胞菌细胞并保持在质粒中，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合而整合进基因组中。经工程化改造以表达木糖利用代谢途径的菌株的例子包括CP4(pZB5)(US 5,514,583)、ATCC31821/pZB5(US 6,566,107)、8b(US 2003/0162271；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)和ZW658(ATTCC#PTA-7858)。经工程化以表达木糖利用代谢途径的发酵单胞菌细胞，在能够在包含作为唯一糖的木糖的培养基中生长之前，一般需要在含木糖的培养基中适应一段时间。
在附加的实施例中，所述发酵单胞菌细胞具有改进了菌株的一个或多个另外的遗传修饰，例如提高生长速率和/或细胞群、提高木糖的利用和/或使得能够使用其它糖如阿拉伯糖、提高对抑制性化合物如乙酸盐的耐受性、或提高乙醇的生产。
在一个实施例中，发酵单胞菌细胞可以是针对US 5,843,760(该文献以引用方式并入本文)中描述的阿拉伯糖的利用被另外地工程化的。为了允许阿拉伯糖的利用，除木糖利用途径的基因之外还表达的基因包括：1)使L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的L-阿拉伯糖异构酶，2)使L-核酮糖转化为L-核酮糖-5-磷酸的L-核酮糖激酶，和3)使L-核酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(US 5,843,760)。如US2011/0143408(该文献以引用方式并入本文)中所公开的，通过另外表达阿拉伯糖-质子协同载体，例如通过表达来自araE基因的编码区，可实现改善的阿拉伯糖利用。
在另一个实施例中，编码整合宿主因子的α亚基的内源性himA基因经过了遗传修饰以减少其表达，这改善了在包含乙酸盐的培养基中的生长，如US 7,897,396中所述(该文献以引用方式并入本文)。乙酸盐存在于生物质水解产物中，因此当使用包含生物质水解产物的培养基时，对这种组分的提高的耐受性是所期望的。
在另一个实施例中，进行了使葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)活性降低的遗传修饰，如US7,741,119中所述(该文献以引用方式并入本文)。GFOR以及himA基因的表达的降低，可以是通过任何方法，例如上文关于降低醛糖还原酶活性所描述的那些。
在另一个实施例中，进行了使核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活性升高的遗传修饰，如在共同拥有和共同未决的美国专利申请13/161734中所公开的，该文献以引用方式并入本文。RPI表达的提高可通过提高内源性RPI编码基因的表达，例如用比天然启动子活性更高的启动子，或通过在发酵单胞菌中表达编码具有核糖-5-磷酸异构酶活性的任何蛋白质或多肽的异源性基因而实现。有两组核糖-5-磷酸异构酶，称为RPI-A和RPI-B，如美国专利申请13/161734中所述，二者中任何一种均可被表达。
在另一个实施例中，使用US 7,989,206和US 7,998,722(这些文献以引用方式并入本文)中所公开的突变的、高活性的启动子，表达了作为木糖利用代谢途径的部分被表达的木糖异构酶。本文所公开的突变体启动子是运动发酵单孢菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子。
在另一个实施例中，作为木糖利用代谢途径的部分表达的木糖异构酶是包括在按照EC 5.3.1.5鉴定的酶分类中的组I木糖异构酶，如共同拥有和共同未决的美国专利申请13/161749中所公开的。在其中公开了组I的木糖异构酶，例如从分离自密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)的编码区(编码区带有针对发酵单胞菌：SEQ ID NO：13优化的密码子)表达的木糖异构酶，它们在发酵单胞菌中具有比组2的木糖异构酶更高的活性。组I木糖异构酶是通过分子系统发育生物信息学分析(使用PHYLIP邻接算法，如在PHYLIP(Phylogeny Inference Package版本3.5c；Felsenstein(1989)Cladistics 5：164-166)、GroupSim分析(Capra和Singh(2008)Bioinformatics 24：1473-1480)和Profile Hidden Markov Model(使用HMMER软件包的hmmsearch算法；Janelia Farm Research Campus，Ashburn，VA)而限定于其中的。
在另一个实施例中，发酵单胞菌细胞已适应了在包含乙醇和乙酸铵的胁迫培养物中生长，如美国专利申请公布2011-0014670-A1中所公开的，该文献以引用方式并入本文。当使用包含纤维素类生物质水解产物的发酵培养基(其包含乙酸盐)时，具有改善的乙酸盐耐受性的这些发酵单胞菌菌株是尤其有用的。
上文的参考文献中公开的菌株和本文所述菌株提供了可用于本发明的方法中的菌株的例子，包括ATCC31821/pZB5、ZW658(ATCC#PTA-7858)、ZW800、ZW801-4、ZW801-4：：ΔhimA、AcR#3、ZW705、AR37-321和ZW1-XA111。
发酵单胞菌发酵
在本发明方法中，以前用SCD处理过并且随后经一段时间后用发酵单胞菌细胞接种过的发酵培养基或糖化反应浆液(其因此是发酵液)保持在适于发酵单胞菌细胞生长的条件下。在一个实施例中，发酵单胞菌细胞是对于在发酵中使用的条件下的乙醇生产而言是有效的生物催化剂的发酵单胞菌菌株，并且乙醇在所述发酵液中被生产。当发酵培养基中的糖浓度高，使得生长被抑制时，培养基包括山梨醇、甘露糖醇、或它们的混合物，如共同拥有的美国专利7,629,156中所公开的，该文献以引用方式并入本文。通常，培养基中存在终浓度约5mM的山梨醇或甘露糖醇。
通常，使用温度为介于约30℃和约37℃之间、pH介于约4.5和约6.5之间的条件。通常，培养物没有补充空气、氧气、或其它气体地被温育(这可包括诸如厌氧、微氧、或微需氧发酵的条件)至少约20小时，并可进行约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70小时或更久。通常，种子培养物被温育约20小时，而发酵生产培养物被孵育约40小时或更多。为了使起泡最小化，可按需向培养基添加消泡剂(任何类别的-基于有机硅的、有机基的等)。
就商业生产发酵培养而言，多种培养方法可被采用。例如，大规模生产可使用分批和连续培养方法。经典的分批培养方法是封闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向系统中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批”培养是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。处于对数期的细胞通常负责乙醇的批量生产。
标准的分批体系的变型是补料-分批体系。分批补料培养方法也适用于本发明的方法和组合物，并且包括典型的分批系统，不同的是底物随着培养进行以递增方式添加。补料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可测量因素例如pH和废气如CO2的分压的改变来评估。分批和补料-分批培养方法是常见的和本领域熟知的，例子可见于Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Crueger、Crueger和Brock，第二版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)
本发明方法也可使用连续培养方法。连续培养是一种开放式系统，其中将培养基连续添加至生物反应器里，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。另选地，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由本领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。
在生产过程中，生产发酵培养通常相继地进行，直到需要对系统进行清理。
本发明方法和组合物也可用于混合糖化和发酵(HSF)工艺，其中部分糖化在添加发酵单胞菌细胞之前进行，随后同时发生进一步糖化和发酵。第二阶段的同步糖化和发酵可描述于美国专利申请公布2011-0318803中，其以引用的方式并入本文。在这种工艺中，发酵单胞菌细胞在糖化-发酵混合物中有高浓度不溶性固体的情况下，于低叶轮搅拌条件下在同时糖化和发酵反应过程中生长，以生产高浓度的乙醇。
实例
本发明将在下面的实例中进一步限定。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的前提下，可以对本发明作出多种变化和修改使其适用于多种用途和条件。
缩写的含义如下：“hr”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“L”是指升，“mL”是指毫升，“μL”是指微升，“g”是指克，“μg”是指微克，“ng”是指纳克，“g/L”是指克每升，“mM”是指毫摩尔，“uM”是指微摩尔，“nm”是指纳米，“μmol”是指微摩尔，“pmol”是指皮摩尔，“OD600”是指在600nm测得的光密度，“EFT”是指经过的发酵时间，“ppm”是指份每一百万份，“G+X”是在纤维素生物质样品中的葡聚糖和木聚糖总量。
一般方法
菌株ZW705的描述
运动发酵单胞菌菌株ZW705产自菌株ZW804-1。ZW801-4是重组利用木糖的运动发酵单胞菌菌株，描述于共同拥有的美国专利7,741,119中，该专利以引用方式并入本文。菌株ZW801-4来源于菌株ZW800，菌株ZW800来源于菌株ZW658，它们均描述于美国专利7,741,119中。ZW658通过经由序贯转座事件将两个操纵子整合到ZW1(ATCC 31821)基因组中，然后通过包含木糖的选择培养基筛选进行构建(美国专利7,629,156)，所述操纵子是PgapxylAB和Pgaptaltkt，它们包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶的四个木糖利用基因。ZW658被保存为ATCC PTA-7858。在ZW658中，使用宿主媒介的基因双交换同源重组和作为选择性标记的奇放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(gfor)的基因插入失活以产生ZW800(U.S.7,741,119)。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组移除由loxP位点束缚的奇放线菌素抗性标记以产生ZW801-4。
运动发酵单胞菌菌株ZW801-4的培养物针对在包含乙酸铵的培养基的胁迫条件下的生长进行适应，从而产生了ZW705，如美国专利申请公布2011-0014670中所描述的，该专利以引用方式并入本文。ZW801-4的连续培养在250ml搅拌的、pH和温度受控的发酵罐(Sixfors；Bottmingen，Switzerland)中进行。发酵基础培养基是5g/L酵母提取物，15mM磷酸铵，1g/L硫酸镁，10mM山梨醇，50g/L木糖和50g/L葡萄糖。通过在97天中逐渐提高加到上述连续培养基中的乙酸铵浓度，同时保持通过特定稀释速率测得的确定生长速率来影响在高浓度乙酸和氨的存在下的适应生长。奖乙酸铵浓度提升至160mM。通过添加磷酸铵至在连续培养139天的末期最终总铵离子浓度为210mM来实现铵离子浓度的进一步提高。通过接种单菌落并扩增一个选择的菌落来从适应种群中分离菌株ZW705。
菌株AR37-31的描述
在菌株ZW705在恒浊器中生长后分离运动发酵单胞菌菌株AR37-31，这描述于共有的和共同未决的美国专利申请13/316597中，其以引用的方式并入本文(在该文献中也称为Adapted 7-31)。在这一连续流动培养装置中，乙酸铵和乙醇的浓度在水解产物培养基中随时间推移而提高。对AR37-31的整个基因组进行测序并与ZW705基因组序列进行比较。发现菌株AR37-31具有在运动发酵单胞菌基因组(NCBI Reference：NC_006526.2)的zmo1432开放阅读框中的遗传修饰，其中zmo1432注释为编码“镰刀菌酸抗性蛋白”。具体地，AR37-31突变位于zmo1432编码区的位点350并且是在该位点从C至T的改变。这一突变导致了氨基酸117的密码子从TCT向TTT的变化，引起了在编码的蛋白质中氨基酸117从丝氨酸向苯丙氨酸的变化。这一突变的效果在于表达了改善该菌株在水解产物培养基中的性能的多肽，由此提高了该菌株对水解产物中的多种生长抑制物的耐受并且提高了乙醇产量。
菌株ZW1-XA111
运动发酵单胞菌菌株ZW1-XA111产自菌株ZW1(ATCC 31821)。如上所述，ZW1经工程化以表达四个木糖利用途径基因：xy1A、xy1B、tkt和tal，用于ZW705。xylA编码区来自密苏里游动放线菌(Actinoploanesmissouriensis)(公开于US 2011/0318801，其以引用的方式并入本文)，并且变异高活性运动发酵单胞菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(公开于US 7,989,206，其以引用的方式并入本文)用于表达xylA和tal/tkt操纵子。xylA和xylB基因的整合使gfor基因座失活((美国专利7,741,119，其以引用的方式并入本文)。菌株经工程化以提高表达核糖-5-磷酸异构酶(Rpi)，如共有的和共同未决的美国专利申请13/161734所公开，其以引用的方式并入本文，以及核酮糖-磷酸3-差向异构酶(Rpe)，如共有的和共同未决的美国专利申请61/577871所公开，其以引用的方式并入本文。如以引用的方式并入本文的美国专利7,629,156所述，所得菌株在木糖培养基中传代4次倍增以进行适应，在此期间在运动发酵单胞菌基因组(NCBIReference：NC_006526.2)的zmo0976开放阅读框中发生遗传修饰，其编码具有NADPH-依赖型木糖还原酶活性的酶，该酶能够将木糖转化成木糖醇(Agrawal和Chen(2011)，Biotechnol Lett.；在线公布于7/01/2011)。破坏zmo0976降低超过90％的NADPH-依赖型木糖还原酶活性，如美国专利申请61/577879所公开，其以引用的方式并入本文，并且改善在含木糖培养基上的生长。
该菌株经工程化以表达大肠杆菌araBAD操纵子，其分别编码L-核酮糖激酶、L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶，结合被导入以利用木糖的转酮醇酶和转醛醇酶活性(US 5,843,760，其以引用的方式并入本文)提供阿拉伯糖同化途径。整合araBAD操纵子使编码多核苷酸磷酸化酶的pnp基因失活，从而提供改善的木糖利用率和乙醇产量，如共有的和共同未决的美国专利申请61/577871所公开，其以引用的方式并入本文。所得菌株在木糖培养基中传代10次倍增以进行适应，如美国专利7,629,156所述。
为了进一步改善木糖利用率，菌株经工程化以表达由大肠杆菌的araE基因编码的异源阿拉伯糖-质子协同载体，如US 2011/143408所公开，其以引用的方式并入本文。在这一步骤中使用的抗氯霉素标记被从基因组中去除，产生ZW1-XA111菌株。
棒组合物
使用ASTM E1758-01方法“通过HPLC测定碳水化合物的标准方法”，如在《国家可再生能源实验室》(Golden，CO)技术报告NREL/TP-510-42618(2008年4月修订)中进一步详述的，测定了起始玉米棒中的纤维素和木聚糖的量。组分经测定为以干重量计34.8％纤维素、29.2％木聚糖、12.8％木质素。
秸秆组合物
在起始秸秆生物质中的纤维素和木聚糖的纤维素量由MicrobacLaboratories，Inc(Boulder，CO)测定。组分经测定为以干重量计34.8％纤维素、21.8％木聚糖、16.9％木质素。
糖化酶
TRIO(Danisco U.S.Inc.，Genencor International，Rochester，NY)
纤维素酶和半纤维素酶生产菌株H3A
菌株H3A是重组里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株，该菌株如下制备。描述于US2008/026376并且是US 7,666,648(两个参考文献均以引用方式并入本文)中所述的quad缺失菌株1A52衍生物的缺失quad的里氏木霉(T.reesei)菌株利用电穿孔，用β-葡糖苷酶表达盒(CBH1启动子、β-葡糖苷酶1编码区、CBH1终止子和amdS基因)与木聚糖内切酶表达盒(CBH1启动子、木聚糖内切酶编码区和CBH1终止子)共转化。一个转化体称为菌株#229。菌株#229与β-木糖苷酶Fv3A表达盒(cbh1启动子、β-木糖苷酶编码区、cbh1终止子和als基因)、β-木糖苷酶Fv43D表达盒(eg1启动子、β-木糖苷酶编码区、天然终止子)和Fv51Aα--阿拉伯呋喃糖苷酶表达盒(eg1启动子、L-α--阿拉伯呋喃糖苷酶编码区、天然终止子)联合使用电穿孔共转化。从这个转化中分离出菌株H3A。
在菌株H3A发酵期间产生的细胞外蛋白通过离心从细胞群中分离出来，通过经由Millipore 10 kD分子截留分子量膜进行的膜超滤进行浓缩，并将pH调节至4.8。使用Weichselbaum和Gornall修改的改性的缩二脲方法测定总蛋白，该方法使用牛血清白蛋白作为校准物(Weichselbaum，1960，Amer.J.Clin.Path.16：40；Gornall等人，1949J.Biol.Chem177：752)。这种H3A细胞外蛋白制剂本文称为H3A蛋白，它用作组合纤维素酶和半纤维素酶制剂，影响络合碳水化合物水解。
玉米棒水解产物FRF10
预处理
玉米棒在酶水解之前使用US 7,932,063描述的低氨方法进行预处理。使用包括围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套的水平Littleford Day 130L反应容器(Littleford Day，Inc.，Florence，KY)进行预处理，以生成称为SSL24的预处理玉米棒。容器载入来自加工种子谷物(尺寸小于1mm)的棒以达到基于湿棒的44v％的反应器填充度(50.21bs；22.77kg)。玉米棒使用带1.0毫米筛网的大型微粒粉磨机减小至小于1毫米(Model#1SH，Serial#10019；Pulverizing Machinery Co.，Summit，NJ)。在碾磨前按需添加一匙干冰到所述棒中以防止设备升温。该微粒粉磨机的主驱动装置是5马力的马达，最大转速为9,600RPM。其具有六个转锤、外壳、并排列有对置的冲击边缘。
所述棒具有0.396g/cm3的松散湿堆积密度和8重量％的水分。在添加28.9重量％的氢氧化铵溶液(9.71bs；4.4kg)和水(17.21bs；7.8kg)到靠近容器顶部以提供容器中相对于生物质干重量6重量％的NH3和60重量％的固体之前向容器施加真空以达到0.1atm。以相同的方式进行了被称为和SSL25的第二SSL26和第三预处理批次，以产生足够用于后续的糖化的材料。在全部的批次中，均将反应器搅拌器设为70rpm并且蒸汽通过容器的夹套。当容器达到内部温度80℃时，将蒸汽导入靠近容器顶部以提高容器内部温度至145℃。保持这一温度20分钟。在保持15分钟后，停止流经夹套的蒸汽流。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之前，施加真空(大约小于1atm；101.3kPa)15分钟以将温度降至小于60℃并从预处理棒中除去多余的氨和水。对于经预处理的玉米棒批次SSL24、SSL25和SSL26，最终的固体重量％分别是61.1％、66.7％和67.8％。
糖化
使用来自SSL24、SSL 25和SSL26制备物的经预处理玉米棒的混合物，通过与上文所述的H3A酶体系的糖化，在200L发酵器中生成了FRF10水解产物。将水底液(124.0kg)添加到发酵器并将夹套加热至121℃并维持20分钟灭菌。将水冷却至47℃，并通过罐顶部的开口添加经预处理的玉米棒混合物；此时添加了21.0kg。以1N H2SO4将pH调节至5.3，并添加酶。酶剂量为4.73kg，相当于将被添加至反应器的总的玉米棒中的每克葡聚糖+木聚糖14mg蛋白质。经过接下来的12小时，每三小时一次，向反应器添加了四次15.5kg玉米棒，在每次添加后用1N H2SO4将pH调节至5.3。这次运行的目标固体载量是25重量％。将发酵器控制在47℃和pH 5.3约72小时。上述时期结束时，移出20升用于这些实验，容器内剩余的内容物被发酵。分析了水解产物的样品，并冷冻储存剩余的直到使用。样品分析的结果显示在表1中。
表1：糖化结束时FRF10的水解产物属性
葡萄糖单体(g/L) 76.26
葡萄糖低聚物(g/L) 7.94
木糖单体(g/L) 61.59
木糖低聚物(g/L) 4.11
阿拉伯糖单体(g/L) 5.58
阿拉伯糖低聚物(g/L) 2.09
乳酸(g/L) 0.00
固体含量(重量％) 23.6％
玉米棒水解产物FRF19
预处理
玉米棒在如上所述进行酶水解之前进行预处理，获得玉米棒水解产物FRF10，不同的是容器载量达到50体积％(60.11bs；27.3kg)。所述玉米棒具有0.420g/cm3的松散湿堆积密度和10.9重量％的水分。添加9.81bs(4.4kg)的28.9重量％氢氧化铵溶液和18.11bs水。第一样品是SSL52，并且以相同方式制备五个另外的样品SSL53-SSL57并合并它们。对于经预处理的玉米棒批次SSL52、SSL53、SSL54、SSL55、SSL56和SSL27，最终固体重量％分别是70.3％、69.4％、68.8％、69.6％、68.7％和70.6％。
糖化
使用来自SSL52至SSL57制备物的经预处理玉米棒的混合物，通过与上文所述的H3A酶体系的处理，在200L发酵器中生成了FRF19水解产物。糖化如上所述进行，不同的是水含量为111.0kg，将初始20.0kg的预处理玉米棒添加至发酵器，并且酶剂量为6.86kg，等同于总玉米棒中将16mg蛋白/g葡聚糖+木聚糖添加至反应器。经过接下来的12小时，每三小时一次，向反应器添加了四次16.0kg玉米棒。这一运行的目标固体载量是27.5重量％。样品水解产物分析在表2中给出。
表2：糖化结束时FRF19的水解产物属性
葡萄糖(g/L) 83.6
木糖(g/L) 75.2
阿拉伯糖(g/L) 7.0
乳酸(g/L) ＜0.2
秸秆水解产物Y018
预化理
玉米秸秆在酶水解之前使用US 7,932,063描述的低氨方法进行预处理。使用水平Eirich 340L反应容器进行预处理以生成称为Y018的预处理棒，该反应容器包含围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套。容器的秸秆载量达到60体积％(40.8kg)。秸秆被减小至小于1/32英寸(0.8mm)。
玉米秸秆具有0.200g/cm3的松散湿堆积密度和8.0重量％的水分。在将秸秆装入后，在添加氢氧化铵溶液至相对生物质干重量的8重量％的NH3以及在容器内有65重量％固体之前，对容器施加至达到-0.9巴(-90千帕)。在全部的批次中，均将反应器搅拌器设为40Hz(42rpm)并且夹套上的蒸汽压为3.2巴。一旦添加氨溶液，就将16巴(1600千帕)的蒸汽加入容器以提高并保持内部容器温度为140℃。保持这一温度30分钟。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之前，施加真空以达到-0.9巴(-90千帕)以降低温度并从预处理秸秆中除去多余的氨和水。对于如上所述制备的经预处理的秸秆批次Y018-X、Y018-5和Y018-10，固体最终重量％分别为55.5％、67.0％和64.4％。
糖化
使用来自上述批次的经预处理玉米秸秆的混合物，通过用TRIO处理，在1000L发酵器中生成了Y018水解产物。将水底液添加到发酵器并将夹套加热至121℃并维持20分钟灭菌。将水冷却至47℃，并通过罐顶部的开口添加经预处理的玉米秸秆混合物；此时浆液为大约8重量％的固体。以5重量％H2SO4将pH调节至5.3，并添加酶。酶剂量相当于将被添加至反应器的总的玉米秸秆中的每克葡聚糖+木聚糖14mg蛋白质。随后经过24小时，将剩余的秸秆添加至目标为25重量％固体，用5重量％H2SO4将pH控制在5.3。将发酵器控制在47℃和pH 5.3约72小时。上述时期结束时，移出20升用于这些实验，容器内剩余的内容物被发酵。分析了水解产物的样品，并冷冻储存剩余的直到使用。样品分析的结果显示在表3中。
表3：糖化结束时Y018的水解产物属性
葡萄糖单体(g/L) 63.45
葡萄糖低聚物(g/L) 18.68
木糖单体(g/L) 38.81
木糖低聚物(g/L) 16.16
阿拉伯糖单体(g/L) 8.02
阿拉伯糖低聚物(g/L) 3.38
乳酸(g/L) 0.41
固体含量(重量％) 25.0％
HP196预处理的玉米秸秆
玉米秸秆在酶水解之前使用US 7,932,063描述的低氨方法进行预处理。使用水平Eirich 6.7L反应容器进行预处理以生成称为HP196的预处理棒，该反应容器包含围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套。容器载入秸秆，达到基于湿秸秆的70体积％的反应器填充度(797.5g)。秸秆已经被减小至小于1/32英寸(0.8mm)。
玉米秸秆具有0.170g/cm3的松散湿堆积密度和9.43重量％的水分。在将秸秆装入后，在添加氢氧化铵溶液至相对生物质干重量的8重量％的NH3以及在容器内有60重量％固体之前，对容器施加至达到-0.9巴(-90千帕)。在全部的批次中，均将反应器搅拌器设为20rpm并且夹套上的蒸汽压为4.1巴(410千帕)。一旦添加氨溶液，就将4.5巴(450千帕)的蒸汽加入容器以使容器内部有50重量％的固体。提高夹套蒸汽压力并随后进行控制以保持内部容器温度为140℃。保持这一温度20分钟。在预处理末期，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收经预处理的生物质之前，施加真空以达到-0.7巴(-70千帕)以降低温度并从预处理秸秆中除去多余的氨和水。对于经预处理的秸秆批次HP196，固体最终重量％为63.55％。
培养基
MRS＝10g/L蛋白胨、8g/L肉提取物、4g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖、5g/L三水乙酸钠、1g/L Tween 80、2g/L K2HPO4、2g/L柠檬酸三铵、0.2g/L MgSO4*7H2O、0.05g/L MnSO4*4H2O、pH 6.2
MRM3G10每升包含：酵母提取物(10g)，KH2PO4(2g)和MgSO4.7H2O(1g)，葡萄糖(100g)，pH 5.5
MRM3G6每升包含：酵母提取物(10g)，KH2PO4(2g)和MgSO4.7H2O(1g)，葡萄糖(60g)，pH 5.5
分析
HPLC分析乙醇、乳酸
在固定的时间间隔采集发酵样品并分析EtOH、残余糖和其它代谢产物如乙酸、乳酸和甘油，该分析使用Waters HPLC系统(Alliance system，Waters Corp.，Milford，MA)或Agilent 1100Series LC进行；条件＝0.6mL/分钟的0.01N H2SO4，注射体积＝5μL，自动取样机温度＝10℃，柱温＝55℃，运行时间＝25分钟，通过折射率进行检测(保持在40℃)。HPLC柱购自BioRad(Aminex HPX-87H，BioRad Inc.，Hercules，CA)。通过折射率检测定量分析物并与已知的标准品进行比较。
实例1
运动发酵单胞菌对稳定化的二氧化氯的敏感性
运动发酵单胞菌菌株ZW705(参见一般方法)生长作为MRM3G10(参见一般方法)中的起始培养物。MRM3G10培养基的样品利用XL原液(购自E.I.du Pont de Nemours and Company，Wilmington，DE)补充有稳定化的二氧化氯(SCD)，二氧化氯浓度为0、7.5、15或224mg/kg。二氧化氯以被酸完全活化后可从XL溶液内的SCD中释放的二氧化氯的量的方式给出。ZW705起始培养物用于以1％的最终体积接种包含SCD的培养基样品以及无SCD对照样品至0.1的OD600。培养物在32℃下培养并通过OD600监测生长。如图2所示，发酵单胞菌细胞生长受到所有水平二氧化氯的显著抑制。在7.5mg/kg二氧化氯中，存在长时间的滞后期，从那时起细胞在约27小时后恢复并随后类似于未添加SCD的对照而生长。在具有较多二氧化氯的样品中的细胞在实验期间不恢复。
实例2
运动发酵单胞菌在延迟接种后对稳定化的二氧化氯的敏感性
进行一个实验以确定是否在添加SCD后，在用运动发酵单胞菌细胞接种之前的滞后期能够减小二氧化氯对细胞的毒性。使用XL原液(购自E.I.du Pont de Nemours and Company，Wilmington，DE)添加二氧化氯至其在11mL FRF10玉米棒水解产物(pH 5.3；参见一般方法)中的浓度为298mg/kg。二氧化氯以被酸完全活化后可从XL溶液内的SCD中释放的二氧化氯的量的方式给出。对于对照样品，取代XL，添加水到FRF10玉米棒水解产物中。随后水解产物在33℃或47℃下培养6小时。随后将样品保持在33℃并用10体积％(最终体积)的运动发酵单胞菌AR37-31(参见一般方法)细胞培养物接种，该细胞培养物在10g/L BBL酵母提取物，2g/L KH2PO4，5g/L MgSO4*7H2O，10mm山梨醇，150g/L葡萄糖中，在33℃下pH 5.5和pH 5.5(4N NH4OH用于pH控制)，生长至OD600为约10(F0820)，起始OD600为约1。通过HPLC监测培养物中的乙醇产量(参见一般方法)。图3示出发酵成功的对照样品，其包含～50g/L乙醇，而包含357mg/kg二氧化氯的样品仅包含～15g/L乙醇。因此在这些条件下，6小时的滞后期不足以从发酵单胞菌细胞中获取正常的乙醇生产水平。
实例3
运动发酵单胞菌在延长的延迟接种后对稳定化的二氧化氯的敏感性
为了检查在SCD和细胞接种之间的较长滞后时间的效应，使用XL原液(购自E.I.du Pont de Nemours and Company，Wilmington，DE)添加151mg/kg或301mg/kg二氧化氯至FRF19玉米棒水解产物(参见一般方法)+10mM山梨醇，pH5.8中。二氧化氯以被酸完全活化后可从XL溶液内的SCD中释放的二氧化氯的量的方式给出。样品在47℃下培养24或48小时。随后将样品保持在33℃并用10体积％(最终体积)的运动发酵单胞菌AR37-31(参见一般方法)培养物接种，该细胞培养物在10g/L BBL酵母提取物，2g/L KH2PO4，5g/LMgSO4*7H2O，10mm山梨醇，150g/L葡萄糖中，在33℃下pH 5.5(4NNH4OH用于pH控制)，生长至OD600为约10(F1153)，起始OD600为约1。在平行对照实验0中，将151mg/kg或301mg/kg二氧化氯添加至FRF19玉米棒水解产物+10mM山梨醇，pH 5.8中，其立即以同样方式接种运动发酵单胞菌AR37-31。通过HPLC监测培养物中的乙醇产量(参见一般方法)。
图4A示出在添加SCD后立即接种有运动发酵单胞菌的培养物中，在任意剂量下不产生乙醇，而未添加SCD的对照样品包含约80g/L乙醇。图4B示出在接种运动发酵单胞菌之前孵育包含151mg/kg或301mg/kg二氧化氯的培养基24或48小时，乙醇量类似于在缺乏二氧化氯的对照中的量。因此在pH 5.5的水解产物培养基中，在47℃下，24小时的时间段是在添加SCD和接种发酵单胞菌细胞之间的充足时间，使得在发酵单胞菌发酵期间获得正常的乙醇产量。
实例4
使用稳定化的二氧化氯在水解产物培养基中控制植物乳杆菌(L. plantarum)
使用植物乳杆菌菌株ATCC8014作为代表性的LAB污染物测试SCD控制污染纤维素类生物质水解产物的乳酸菌(LAB)的能力。使用XL原液添加SCD至Y018玉米秸秆水解产物+10mM山梨醇，pH 5.8中，浓度为151mg/kg或301mg/kg二氧化氯。二氧化氯以被酸完全活化后可从XL溶液内的SCD中释放的二氧化氯的量的方式给出。这些培养基的样品随后保持在33℃并接种有10或5体积％(最终体积)的植物乳杆菌ATCC8014，其从在33℃的MRS培养基中生长至OD600为约2的培养物中收获。对于任何样品，在接种之前无延迟。通过HPLC(参见一般方法)分析培养基在0、24和48小时EFT的乳酸含量。结果示于表4中。在48小时后，在任意接种剂量下添加SCD的培养物具有1g/L或更少的乳酸形成物，而无SCD的对照培养物产生＞7g/L的乳酸。这些结果表明二氧化氯能够通过常见的纤维素水解产物污染阻止乳酸形成。
表4：在水解产物培养基中的乳酸产量
**添加1ml无菌水
*添加0.5ml培养物和0.5ml水
实例5
在运动发酵单胞菌发酵之前的糖化期间的SCD处理效应
通过在发酵中用于产生水解产物的糖化期间添加SCD，测试在发酵单胞菌发酵期间使用SCD控制污染的效果。经预处理的玉米秸秆(样品HP196；参见一般方法)被高压消毒。随后将生玉米秸秆添加经高压消毒的预处理秸秆，占经预处理秸秆总重量的1％。
糖化利用以下条件进行：47℃，初始pH 5.3，分批补料至25％固体，2mg TRIO/g G+X。进行包含1％生秸秆生物质的两次糖化。生秸秆包含天然存在的污染物。在糖化开始时向一次运行添加SCD，并且不向另一次运行添加SCD。使用XL原液将SCD添加至糖化混合物至浓度为316mg/kg二氧化氯。二氧化氯以被酸完全活化后可从XL溶液内的SCD中释放的二氧化氯的量的方式给出。
在糖化48小时后，两次糖化运行中产生的水解产物样品取样进行乳酸分析，随后将水解产物的pH调节至5.8，温度降低至33℃，并且添加10体积％(最终体积)的运动发酵单胞菌菌株ZW1-X111(参见一般方法)培养物。用于接种的ZW1-X111培养物已经生长至OD600为约12.9，其在10g/L BBL酵母提取物，2g/L KH2PO4，5g/L MgSO4*7H2O，10mM山梨醇，150g/L葡萄糖中，在33℃下pH 5.5和pH 5.5(4N NH4OH用于pH控制)。发酵在33℃下继续，并且在24小时后分析培养基的乙醇。
在糖化末期(48小时糖化样品)，来自未添加SCD的糖化运行的水解产物包含1.6g/L乳酸。来自添加SCD的糖化运行的水解产物无可检测到的乳酸，指示对污染细菌的控制。在已经添加SCD的水解产物中的发酵在24小时时达到约36.09g/L乙醇，指示阳性发酵。在未添加SCD的水解产物中的发酵包含约34.95g/L乙醇。
实例6
在运动发酵单胞菌发酵之前的糖化期间的较低剂量SCD处理
使用经预处理的玉米秸秆(样品YT08-P-2；参见一般方法)与1％生玉米秸秆的混合物进行如实例5的糖化。在分开的糖化运行开始时使用XL原液添加SCD至浓度为0、40、79、119、158、或316mg/kg二氧化氯。二氧化氯以被酸完全活化后可从XL溶液内的SCD中释放的二氧化氯的量的方式给出。在分开的糖化运行中，在糖化开始24小时后添加316mg/kg二氧化氯。在糖化48小时后，将产生的水解产物的pH调节至5.8，温度降低至33℃，并且添加10体积％(最终体积)的运动发酵单胞菌菌株AR37-31培养物，其在10g/L BBL酵母提取物，2g/LKH2PO4，5g/L MgSO4*7H2O，10mM山梨醇，150g/L葡萄糖中生长至OD600为约1.4，在33℃下为pH 5.5和pH 5.5(4N NH4OH用于pH控制)。随后对产生的水解产物取样进行乳酸分析，其是发酵的0时样品(图5)。发酵和糖化在33℃下继续，并且在24小时后分析培养基的乙醇。
在0发酵时间点(在糖化48小时后)，未添加SCD的水解产物包含几乎6g/L乳酸，如图5A所示。在相同时间点，添加158mg/kg或更少二氧化氯的水解产物全部发生乳酸形成的小量减少；产生4至5g/L乳酸。在其中添加316mg/kg二氧化氯的水解产物中，形成的乳酸在0时间点减少至＜1g/L，并且在整个发酵期间保持在小于1g/L。当在糖化开始时或在糖化24小时后添加时(在图5A和B中为0/316mg/kg样品)，在316mg/kg的二氧化氯水平下的SCD处理是有效的。在45小时后这些发酵均包含＞50g/L乙醇(图5B)。利用添加较少SCD至糖化而产生的水解产物的发酵具有减少的乙醇产量(图5B)。
实例7
运动发酵单胞菌在延长的延迟接种后对稳定化的二氧化氯的敏感性
为了检查在SCD和细胞接种之间的较长滞后时间的效应，使用XL原液(购自E.I.du Pont de Nemours and Company，Wilmington，DE)添加301mg二氧化氯至Y018玉米秸秆水解产物(参见一般方法)+10mM山梨醇，pH 5.8或MRM3G6培养基中。二氧化氯以被酸完全活化后可从XL溶液内的SCD中释放的二氧化氯的量的方式给出。样品在33℃或47℃下培养不同的时间。随后将样品保持在33℃并用10体积％(最终体积)的运动发酵单胞菌ZW1-XA111(参见一般方法)培养物接种，该培养物在10g/L BBL酵母提取物，2g/L KH2PO4，1g/LMgSO4*7H2O，10mM山梨醇，150g/L葡萄糖中，在33℃下pH 5.5(4NNH4OH用于pH控制)，生长至OD600为约10(F1360)，其起始OD600为约1(33℃的孵育实验)或接种有10体积％(最终体积)运动发酵单胞菌AR3 7-31，其在10g/L BBL酵母提取物，2g/L KH2PO4，1g/LMgSO4*7H2O，60g/L葡萄糖中，在33℃下pH 5.5，生长至OD600为约2.5，其起始OD600为约0.3(47℃孵育实验)。通过HPLC监测培养物中的乙醇产量(参见一般方法)。
图6示出在MRM3G6培养基中，在33℃下用SCD孵育19.5和23小时后接种导致完全抑制乙醇形成，而无SCD的对照在20小时时包含大于30g/L乙醇。
图7A示出在47℃下，在Y018玉米秸秆水解产物中，在用SCD孵育8小时后接种产生的乙醇产量水平类似于无SCD的对照和在接种前具有较长孵育时间的样品，指示对于允许用于运动发酵单胞菌发酵的培养基，在47℃下8小时是足够的延迟时间段。当使用MRM3G6培养基时，在用SCD在47℃下孵育16小时后的接种足以得到类似于无SCD的对照和在接种前具有较长孵育时间的样品的乙醇产量水平(图7B)。在8小时和0小时孵育(立即接种)后接种的样品不含有任何乙醇。

Claims (26)

1.一种用于在包含发酵单胞菌(Zymomonas)生物催化剂的发酵过程中控制细菌污染的发酵方法，所述方法包括：
a)提供生长培养基，所述生长培养基具有被细菌菌种污染的可能性；
b)将有效量的稳定化的二氧化氯添加至(a)的生长培养基，从而形成稳定化的二氧化氯混合物，其中所述稳定化的二氧化氯混合物的温度大于约33℃；
c)在适于发酵单胞菌细胞的温度下，用发酵单胞菌细胞接种b)的混合物，以产生接种的培养液；以及
d)在适于所述发酵单胞菌细胞生长的条件下，使所述接种的培养液发酵；
其中细菌污染在发酵期间是受控的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基包含纤维素类生物质水解产物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵单胞菌细胞是产乙醇生物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)最初添加有效量的稳定化的二氧化氯至步骤c)接种发酵单胞菌细胞的时间段为至少6小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)最初添加有效量的稳定化的二氧化氯至步骤c)接种发酵单胞菌细胞的时间段为至少8小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其中步骤b)最初添加有效量的稳定化的二氧化氯至步骤c)接种发酵单胞菌细胞的时间段为至少16小时。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述生长培养基为包含至少一种纤维素酶的糖化反应浆液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生长培养基缺乏纤维素类生物质水解产物且选自：i)限定培养基，ii)包含非纤维素类生物材料糖源的培养基，和iii)澄清的纤维素类生物质水解产物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述接种的培养液的温度小于约40℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其中(b)的混合物的pH小于约7。
11.根据权利要求2所述的方法，其中所述水解产物来源于选自下列的纤维素类生物质：玉米棒、玉米皮、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱和木本植物纤维素组分。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在所述发酵单胞菌细胞生长期间，步骤d)的接种的培养液包含小于约5g/L的乳酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述细菌污染源是产生乳酸的细菌。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的生长培养基中稳定化的二氧化氯的浓度初始为至少约10mg/kg。
15.一种用于在包含发酵单胞菌生物催化剂的发酵过程中控制细菌污染的发酵方法，所述方法包括：
a)提供缺乏纤维素类生物质水解产物的种子培养基，所述种子培养基选自：i)限定培养基，ii)包含非纤维素类生物材料糖源的培养基，和iii)澄清的纤维素类生物质水解产物；
b)用发酵单胞菌产乙醇生物细胞接种a)的种子培养基，以形成种子培养物；
c)使所述发酵单胞菌细胞在b)的种子培养物中生长；
d)用c)的种子培养物接种发酵培养基，以产生接种的发酵培养基；
e)提供糖化反应浆液；
f)将所述接种的发酵培养基与所述糖化反应浆液混合，以形成发酵啤酒；以及
g)在由此产生乙醇的条件下，使所述发酵单胞菌产乙醇生物细胞在所述发酵啤酒中生长；
其中：
所述发酵啤酒和所述糖化反应浆液中的任一者包含纤维素类生物质水解产物；并且
其中：
稳定化的二氧化氯被添加至下列中的至少一者：i)步骤a)的种子培养基；ii)步骤e)的糖化反应浆液；或iii)步骤d)的发酵培养基；并且
其中：
如果将所述稳定化的二氧化氯添加至步骤a)的种子培养基，则在用所述发酵单胞菌产乙醇生物接种所述种子培养基之前，将所述种子培养基在至少约33℃的温度下保持至少约6小时；并且
其中：
如果将所述稳定化的二氧化氯添加至步骤e)的糖化反应浆液，则在将所述糖化反应浆液与所述接种的发酵培养基混合之前，将所述糖化反应浆液在至少约33℃的温度下保持至少约8小时；并且
其中：
如果将所述稳定化的二氧化氯添加至步骤d)的发酵培养基，则在将所述发酵培养基与所述糖化反应浆液混合之前，将所述发酵培养基在至少约33℃的温度下保持至少约8小时；并且
其中：
在所述发酵单胞菌细胞生长期间，包含发酵单胞菌细胞的种子培养物、接种的发酵培养基或发酵啤酒中的任一者包含小于约5g/L的乳酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中将所述种子培养物、所述接种的发酵培养基和所述发酵啤酒保持在小于约40℃的温度下。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述糖化反应浆液包含至少一种纤维素酶。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述细菌污染源是产生乳酸的细菌。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述纤维素类生物质选自：玉米棒、玉米皮、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱和木本植物纤维素组分。
20.根据权利要求15所述的方法，其中步骤a)的种子培养基、步骤d)的糖化反应浆液或步骤e)的发酵培养基中稳定化的二氧化氯的浓度初始为至少约10mg/kg。
21.根据权利要求15所述的方法，其中包含所述稳定化的二氧化氯的步骤d)的糖化反应浆液或步骤e)的发酵培养基包含基于生物质干重量对总混合物重量计至少约20％固体的固体。
22.一种发酵培养基组合物，所述发酵培养基组合物包含：
a)包含纤维素类生物质水解产物的发酵培养基；和
b)稳定化的二氧化氯。
23.一种糖化反应浆液组合物，所述糖化反应浆液组合物包含：
a)纤维素类生物质；
b)至少一种纤维素酶；和
c)稳定化的二氧化氯。
24.根据权利要求22或23所述的组合物，其中所述稳定化的二氧化氯的浓度初始为至少约10mg/kg，其中所述稳定化的二氧化氯的量以能够在稳定化的二氧化氯被酸完全活化后释放的二氧化氯的量的方式给出。
25.根据权利要求22或23所述的组合物，其中所述组合物包含基于生物质干重量对总组合物重量计至少约20％固体的固体。
26.根据权利要求22或23所述的组合物，其中所述纤维素类生物质选自：玉米棒、玉米皮、玉米秸秆、草、小麦、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱和木本植物纤维素组分。
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