CN105051202A - 木质纤维素生物质的梯度预处理 - Google Patents

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Abstract

据发现，与在恒定浓度下预处理的当量生物质相比，其中反应混合物中生物质的浓度随时间推移而降低的用氨预处理的木质纤维素生物质在糖化之后产生更多的糖。生物质的浓度为固体浓度，其为基于重量/重量，干生物质相对于总预处理反应混合物的百分比。

Description

木质纤维素生物质的梯度预处理
本申请要求2013年3月12日提交的美国临时申请61/776946的权益，该临时申请全文以引用方式并入。
技术领域
本发明提供了用于处理生物质以获得可发酵糖的方法。具体地，本发明涉及一种用于木质纤维素生物质的预处理方法，该方法使用氨，其中生物质固体的百分比随时间推移而减小。
背景技术
木质纤维素原料和废料，诸如农业残留物、木材、林业废弃物、来自造纸的淤渣、以及市政及工业的固体垃圾为化学品、塑料、燃料和饲料的生产提供了潜在的很大的可再生原料。包含碳水化合物聚合物纤维素和半纤维素以及木质素的木质纤维素的原料和废料一般用多种化学的、机械的和酶的方法进行处理以释放主要地己糖和戊糖的糖，然后这些糖能进行发酵成为有用的产品。
预处理方法用于使木质纤维素生物质的碳水化合物聚合物或多糖更易接近用于糖化的纤维素酶。人们已知多种预处理方法，包括生物质的氨预处理。例如，共同拥有的US7,932,063公开了在高固体含量和低氨水浓度的条件下预处理生物质的方法。所用的氨的浓度至少是足以保持生物质-氨水混合物的pH为碱性的浓度并且相对于生物质干重至多小于约12重量百分比。生物质的干重为生物质-氨水混合物重量的至少约15％至最多约80％。
US2010/0184176公开了一种生物质水热分解设备，在该设备中，将生物质进料到主体中并且从另一端进料热压缩水，使得在该设备内出现生物质浓度的梯度。
仍需要用于使用氨预处理木质纤维素生物质，产生可容易糖化的材料的方法，该方法支持发酵过程中可发酵糖和产生生物催化剂产生的产物的产量增加。
发明内容
本发明提供一种用于预处理木质纤维素生物质的方法，该方法支持糖化之后生物催化剂产生的产物的产量增加。
因此，本发明提供一种由纤维素生物质生产可发酵糖的方法，所述方法包括：
a)在起始时间t0在反应容器中提供包含以下物质的反应混合物：
i)固体浓度在约40％和约70％之间的纤维素生物质，测量为干生物质相对于总混合物的百分比，基于重量/重量；和
ii)氨，其具有相对于生物质的干重在约4％和约24％之间的负载浓度；
b)随时间推移至最终时间tn增大反应混合物的液体含量，其中固体浓度减小约20％至约30％，从而产生预处理的生物质；以及
c)使预处理的生物质与糖化酶聚生体在合适的条件下接触，以产生可发酵糖，其中所述可发酵糖为用于发酵工艺的生物催化剂提供碳水化合物来源。
附图说明
图1为示出以用8％NH3/g干生物质预处理的秸秆起始，在40％固体下，在一个阶段中执行的糖化期间(在24hr、48hr处)葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度，以及发酵期间(在0hr、26hr和第二个48hr处)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图。
图2为示出以用8％NH3/g干生物质预处理的秸秆起始，在52.5％固体下，在一个阶段中执行的糖化期间(在24hr、48hr处)葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度，以及发酵期间(在0hr、26hr和第二个48hr处)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图。
图3为示出以用8％NH3/g干生物质预处理的秸秆起始，在65％固体下，在一个阶段中执行的糖化期间(在24hr、48hr处)葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度，以及发酵期间(在0hr、26hr和第二个48hr处)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图。
图4示出在使用固体％的梯度的预处理中(A)和在使用40％的恒定固体的预处理中(B)的固体％和氨浓度随时间推移的图。
图5为示出以用8％NH3/g干生物质预处理的秸秆起始，梯度为65％、接着52.5％、接着40％固体的在三个阶段中执行的糖化期间(在24hr、48hr处)葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度，以及发酵期间(在0hr、26hr和第二个48hr处)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图。
图6为示出以用8％NH3/g干生物质预处理的秸秆起始，在65％固体下，在一个阶段中执行的糖化期间(在24hr、48hr处)葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度，以及发酵期间(在0hr、26hr和第二个48hr处)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图。
图7为示出以用8％NH3/g干生物质预处理的秸秆起始，在40％固体下，在三个阶段中执行的糖化期间(在24hr、48hr处)葡萄糖、木糖和阿拉伯糖浓度，以及发酵期间(在0hr、26hr和第二个48hr处)葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图。
图8为示出在使用恒定40％、52.5％或65％固体，或梯度65％至40％固体预处理的玉米秸秆的48hr糖化之后，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖收率的图，其中梯度使用蒸汽喷射或干热和水添加来产生。
图9为示出在120hr的发酵之后葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图，发酵使用由玉米秸秆产生的水解产物，玉米秸秆使用恒定40％、52.5％或65％固体，或梯度65％至40％固体预处理，其中梯度使用蒸汽喷射或干热和水添加来产生，其中发酵以2％v/v种菌起始。
图10为示出在发酵的时间＝0时葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图，发酵使用由玉米秸秆产生的水解产物，玉米秸秆使用恒定40％、52.5％或65％固体，或梯度65％至40％固体预处理，其中梯度使用蒸汽喷射或干热和水添加来产生，其中发酵以10％v/v种菌起始。
图11为示出在48hr的发酵之后葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇浓度的图，发酵使用由玉米秸秆产生的水解产物，玉米秸秆使用恒定40％、52.5％或65％固体，或梯度65％至40％固体预处理，其中梯度使用蒸汽喷射或干热和水添加来产生，其中发酵以10％v/v种菌起始。
具体实施方式
本发明涉及一种用于预处理木质纤维素生物质和将预处理的生物质糖化以产生可发酵糖的方法。存在与预处理过程中使用的生物质固体的最佳浓度相关的相反因素，包括可从生物质中释放的糖的量和另外释放的抑制剂的量，以及生物质对预处理剂的可接近性。在本文所述的条件下，能够有效地以高生物质固体浓度起始并且在预处理反应期间降低生物质固体浓度。使用该方法，预处理的生物质产品更有效地糖化，从而在发酵期间产生更高收率的可发酵糖，导致增强的生物催化剂产物合成。
以下定义和缩写将用于权利要求和说明书的解释。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或者其任何其他变型旨在涵盖非排它的包括。例如，包含元素列表的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，但可以包括其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非明确指出相反，“或”是指包含性的或而非排他性的或。例如，条件A或B满足下列任一项：A为真实的(或存在的)且B为虚假的(或不存在的)，A为虚假的(或不存在的)且B为真实的(或存在的)，以及A和B均为真实的(或存在的)。
此外，涉及元素或组分的例子(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数，除非数字明显表示为单数。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单个实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的所有可能的实施例。
如本文所用，所用修饰本发明的成分或反应物的量的术语“约”是指数值量的变化，其可能发生在例如，典型的测量和用于制备浓缩液或实际使用溶液的液体处理程序中；这些程序中的偶然误差中；制造、来源、或用于制备组合物或实施方法的成分的纯度的差异中；等等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否由术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值10％以内，优选地在报告数值5％以内。
术语“可发酵糖”是指在发酵过程中能被微生物用作碳源的低聚糖和单糖。
术语“木质纤维素”是指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维素材料也可包含半纤维素。
术语“纤维素”是指包含纤维素和包括半纤维素在内的附加组分的组合物。
术语“糖化”是指由多糖产生可发酵糖。
术语“预处理的生物质”是指在糖化之前已经过预处理的生物质。
术语“丁醇”是指异丁醇、1-丁醇、2-丁醇、或它们的组合。
术语“纤维素生物质”是指任何木质纤维素材料，并且包括包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质也可包含附加组分，诸如蛋白质、脂质、灰分、和/或提取物。生物质可来源于单一来源，或生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。木质纤维素生物质包括但不限于生物能源作物、农业残留物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的示例包括但不限于玉米棒、作物残余物诸如玉米壳、玉米秸秆、玉米粒纤维、草、甜菜浆、小麦秸秆、小麦壳、燕麦秸秆、大麦秸秆、大麦外壳、干草、稻秆、稻壳、柳枝稷、细叶芒(miscanthus)、大米草、草芦、废纸、甘蔗渣、高粱渣、高粱秸秆、大豆秸秆、从谷物研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木片、锯末、棕榈废料、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。
术语“干物质含量”是指以除去物质的含水量后存在的主体物质的重量计的量。
术语“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。生物质也可在糖化前进行预处理或预加工。
术语“生物质水解产物发酵液体培养基”是指包含产物的液体培养基，所述产物得自包含生物质水解产物的培养基中的生物催化剂生长和生产。该液体培养基包括没有被生物催化剂消耗的生物质水解产物的组分、以及生物催化剂本身和生物催化剂产生的产物。
术语“目标化合物”或“目标产物”是指任何由发酵中的微生物生产宿主细胞产生的产物。目标化合物可为宿主细胞中遗传工程的酶的途径的产物或可由内源性途径产生。典型的目标化合物包括但不限于：酸、醇、烷烃、烯烃、芳烃、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。
使用生物质固体梯度的预处理
在本发明方法中，预处理反应中生物质固体的浓度随反应时间进程的推移而减小。生物质的浓度为固体浓度，其为基于重量/重量，干生物质相对于总预处理反应混合物的百分比。
生物质是指任何纤维素或木质纤维素材料，例如：生物能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、庭院垃圾、木材和林业垃圾、以及它们的组合。在各种实施例中，首先将生物质的尺寸减小，诸如通过碾磨、研磨、撕碎、切碎、圆盘精磨、和/或切割。此外，可将生物质干燥，诸如空气干燥或用热干燥。
预处理反应混合物包括生物质和作为预处理剂的氨。氨可以液体或无水状态使用。氨可为氨溶液、无水氨、氨蒸气、或这些的任何混合物。在一个实施例中，氨的一部分或全部可再循环。预处理反应混合物中氨负载的量为相对于反应混合物中生物质的干重在约4％和约24％之间。在一个实施例中，相对于生物质干重，氨介于约4重量％和约12重量％之间。相对于生物质干重，氨的量在预处理反应期间可变化，剩余在约4％和24％之间。在一个实施例中，反应混合物中氨的浓度随着反应混合物中液体含量的增加而降低。在另一个实施例中，添加另外的氨，以随着液体含量增加维持氨浓度。
在预处理反应的起始时间t0处，生物质的固体浓度在约40％和约70％之间。在各种实施例中，固体浓度为约40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％。在装载到反应容器中之前或之后，将生物质与氨和水(如果需要的话)混合，以达到期望浓度。容器的液体含量随时间推移而增加，以降低生物质固体浓度，使得与初始固体浓度相比，在预处理结束时，即最终时间tn时，浓度降低约20％和约30％之间。在一个实施例中，通过向反应容器中添加蒸汽来增大液体浓度。在另一个实施例中，通过向反应容器中添加水来增大液体浓度。在一个实施例中，通过单独或与蒸汽或水结合向反应容器中添加氨溶液来增大液体浓度。所添加氨的量可相对于生物质固体浓度维持恒定浓度。另选地，可添加氨以保持反应混合物中的浓度恒定，或在反应期间具有在所述范围内变化的浓度。
在一个实施例中，固体浓度从t0至tn的降低是线性的。在另一个实施例中，固体浓度的降低是单调但非线性的。通常，降低速率在反应开始时较快并且朝向时间tn减慢。在另一个实施例中，固体浓度的降低是逐步的，其中固体浓度在t0和tn之间的一个或多个时间被保持恒定。
对反应容器进行加热，使得反应混合物的温度在预处理期间维持在约100℃和约200℃之间。在各种实施例中，在预处理过程中，反应混合物具有约100、120、140、160、180、或200℃的温度，或可在多个这些温度之间变化。在另外的实施例中，在预处理过程中，温度维持在约100℃和约220℃之间，或约100℃和约230℃之间，并且可在多个这些温度之间变化。变化可为温度的增加或降低。可通过任何装置，诸如通过添加蒸汽外部或内部地加热反应容器。
预处理反应混合物的温度维持在约100℃和约200℃之间，或约100℃和约220℃之间，或约100℃和约230℃之间，持续在约10分钟和2小时之间的反应时间，以产生预处理的生物质。反应时间通常在约20分钟和60分钟之间。另外，反应时间可为1、2、3、4、5、6、7、8、或9分钟。一般来讲，在较高的反应温度下较短的反应时间是有效的。
生物质的预处理在任何合适的反应容器中执行。通常该容器是能耐压的容器，可被加热或具有加热机构并且具有用于混合内容物的机构。也可使用缺乏混合或混合未致动的容器。可商购获得的容器包括例如Parr反应器(ParrInstrument，Moline，IL)、反应器(AutoclaveEngineers，Erie，PA)、Jaygo反应器(JaygoManufacturing，Inc.，Mahwah，NJ)、以及蒸汽喷射反应器(AutoclaveEngineers，Erie，PA)。可使用具有相似能力的更大型反应器。
通过本发明的梯度生物质固体浓度方法预处理的生物质在本文中在实例3中示出，以产生可发酵糖，接着如下文所述糖化，收率大于来自在比较性恒定生物质固体浓度方法中预处理的生物质的收率。梯度预处理样品的总的糖收率比恒定预处理样品大至少约4％。在各种实施例中，糖收率比来自在能与之相比的但是非梯度方法中预处理的生物质的收率高至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。
基于葡萄糖和木糖利用、以及乙醇产量，使用生产乙醇的发酵单胞菌(Zymomonas)生物催化剂，来自通过本发明的梯度生物质固体浓度方法预处理的生物质的水解产物中的可发酵糖的发酵在本文中在实例3中示出为比来自在比较性恒定生物质固体浓度方法中预处理的生物质的水解产物的发酵更有效。
糖化
在本发明方法中，可使预处理的生物质与糖化酶聚生体在合适的条件下接触，以产生可发酵糖，并且可发酵糖为用于发酵工艺的生物催化剂提供碳水化合物来源。在糖化之前，可处理预处理的生物质以改变pH、组合物或温度使得糖化酶聚生体中的酶将有活性。可通过添加固体或液体形式的酸改变pH。另选地，可利用可从发酵中回收的二氧化碳(CO2)降低pH。例如，如果存在足够的液体，可从发酵罐中收集CO2并将其进料到闪蒸槽中的预处理产物顶部空间或起泡通过预处理生物质，同时监控pH，直至达到所需的pH。可使温度达到下文提到的适合糖化酶活性的温度。通常，合适的条件可包括在约40℃和50℃之间的温度以及在约4.8和5.8之间的pH。
纤维素或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶组合物或共混物来降解纤维素和/或半纤维素并且产生包含糖，诸如葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的水解产物。糖化酶参见Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.，66：506-577，2002)。使用至少一种酶，并且通常使用糖化酶共混物，其包括一种或多种糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚键，并且存在于广义“水解酶”(EC3.)的酶分类EC3.2.1.x(EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego，CA，以及增补1(1993)、增补2(1994)、增补3(1995)、增补4(1997)和增补5[分别在Eur.J.Biochem.，223：1-5，1994；Eur.J.Biochem.，232：1-6，1995；Eur.J.Biochem.，237：1-5，1996；Eur.J.Biochem.，250：1-6，1997；以及Eur.J.Biochem.，264：610-6501999中])。本发明的方法中可用的糖苷酶能根据它们水解的生物质组分进行分类。可用于本发明方法中的糖苷酶可包括纤维素水解糖苷酶(例如，纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如，木聚糖酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β-木聚糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如，淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、异淀粉酶)。此外，将其他活性加入糖化酶聚生体(诸如肽酶(EC3.4.x.y)、脂肪酶(EC3.1.1.x和3.1.4.x)、木素酶(EC1.11.1.x)或阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73))中以促进从生物质的其他组分中释放多糖可为有用的。本领域熟知生产多糖水解酶的微生物常常表现出某种活性，如降解纤维素的能力，该活性由具有不同底物特异性的若干种酶或一组酶催化。因此，来自微生物的“纤维素酶”可包括一组酶、一种或多种酶或所有酶，它们都可有助于纤维素降解活性。取决于获取酶时利用的纯化方案，商业或非商业酶制剂(诸如纤维素酶)可包括多种酶。对于糖化有用的许多糖基水解酶和它们的组合物公开于WO2011/038019中。
糖化酶可商购获得。此类酶包括例如CP纤维素酶、木聚糖酶、1500、DUET、以及TrioTM(DupontTM/Wilmington，DE)，以及Novozyme-188(诺维信，2880Bagsvaerd，丹麦(Novozymes，2880Bagsvaerd，Denmark))。此外，糖化酶可以是未经纯化的并以细胞提取物或全细胞制剂的形式提供。可使用已经工程化以表达一种或多种糖化酶的重组微生物制备所述酶。
用于糖化的另外酶类包括例如糖基水解酶，诸如GH3、GH39、GH43、GH55、GH10和GH11家族的成员。GH是一组酶，其水解两个或更多个碳水化合物之间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键。GH家族基于序列类似性进行分类，并且所述分类可在碳水化合物-活性酶(CAZy)数据库中得到(Cantarel等人(2009)核酸研究37(数据库问题)(NucleicAcidsRes.37(Databaseissue))：D233-238)。这些酶的某一些能够作用于多种底物并且作为糖化酶表现出效能。糖苷水解酶家族3(“GH3”)的酶有许多已知的活性，包括，例如，β-葡糖苷酶(EC：3.2.1.21)；β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)；N-乙酰基β-氨基葡糖苷酶(EC：3.2.1.52)；葡聚糖β-1，3-葡糖苷酶(EC：3.2.1.58)；纤维糊精酶(EC：3.2.1.74)；外切-1，3-1，4-葡聚糖酶(EC：3.2.1)；和/或β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)活性。糖苷水解酶家族39(“GH39”)的酶还具有许多已知活性，包括，例如，α-L-艾杜糖醛酸酶(EC：3.2.1.76)和/或β-木糖苷酶(EC：3.2.1.37)活性。糖苷水解酶家族43(“GH43”)的酶具有许多已知活性，包括，例如，L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)；聚阿拉伯糖内切酶(EC3.2.1.99)；和/或半乳聚糖1，3-β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.145)活性。糖苷水解酶家族51(“GH51”)的酶已知具有，例如，L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC3.2.1.55)和/或内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)活性。糖苷水解酶家族10(“GH10”)已详细描述于Schmidt等人，1999，Biochemistry38：2403-2412和LoLeggio等人，2001，FEBSLett509：303-308，并且糖苷水解酶家族11(“GH11”)已描述于Hakouvainen等人，1996，Biochemistry35：9617-24中。
生物催化剂
天然地或通过基因工程利用葡萄糖且优选地还利用木糖生产目标化合物的任何生物催化剂可用于使用本发明方法生产的可发酵糖的发酵。可通过发酵生产的目标化合物包括例如酸、醇、烷烃、烯烃、芳烃、醛、酮、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇、甘露糖醇和山梨醇。酸可包括乙酸、甲酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡萄糖酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸、3-羟基丙酸、富马酸、马来酸和乙酰丙酸。氨基酸可包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。附加的目标化合物包括甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。
糖转化为目标化合物的发酵可通过一种或多种适当的生物催化剂在一步或多步发酵过程中进行。生物催化剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母的微生物。生物催化剂可为野生型微生物或重组微生物，并且可包括例如属于埃希氏菌(Escherichia)、发酵单胞菌(Zymomonas)、酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、链霉菌(Streptomyces)、芽胞杆菌(Bacillus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)和梭菌(Clostridiuma)属的生物体。通常，生物催化剂的示例包括重组大肠杆菌、运动发酵单胞菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、酿酒酵母、嗜热梭菌、高温产氢菌、以及树干毕赤酵母。
通常，生物催化剂能够利用葡萄糖和木糖，并且可另外利用阿拉伯糖。例如，对于所期望的目标化合物生产是有效的生物催化剂的任何发酵单胞菌菌株均可使用。发酵单胞菌细胞天然地利用葡萄糖、果糖和/或蔗糖作为发酵底物生产乙醇，但木糖不被代谢。希望使用已针对木糖利用工程化的发酵单胞菌细胞，其已完成如下。通常，四种基因已被引入运动发酵单胞菌(Z.mobilis)，用于表达参与木糖代谢的四种酶，以创建木糖利用代谢途径，如US5,514,583、US5,712,133、US6,566,107、WO95/28476、Feldmann等人((1992)ApplMicrobiolBiotechnol38：354-361)和Zhang等人((1995)Science267：240-243)中所述。这些基因包括编码木糖异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖；以及编码木酮糖激酶的基因，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。另外还表达了戊糖磷酸途径中的两种酶，转酮醇酶和转醛醇酶，它们将5-磷酸木酮糖转化成连接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖代谢成乙醇(参见图1)。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多种微生物中的任何一种获得，诸如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的来源可包括黄单胞菌(Xanthomonas)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、埃希氏菌(Escherichia)、红细菌(Rhodobacter)、黄杆菌(Flavobacterium)、醋杆菌(Acetobacter)、葡糖杆菌(Gluconobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、农杆菌(Agrobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、假单胞菌(Pseudomonads)和发酵单胞菌(Zymomonas)。大肠杆菌(E.coli)的编码区通常被使用。
将编码DNA序列可操作地连接至在发酵单胞菌细胞中表达的启动子诸如运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子(GAP启动子)和运动发酵单胞菌烯醇酶的启动子(ENO启动子)。如US7,989,206中所公开的具有增加的表达的突变体GAP启动子对于在发酵单胞菌中表达也是有用的。编码区可从启动子开始单个表达，或者两个或更多个编码区可接合到一个操纵子中，从相同启动子开始一起表达。可将所得的嵌合基因引入发酵单胞菌细胞并保持在质粒上，或者使用例如同源重组、定点整合、或随机整合而整合进基因组中。经工程化以表达木糖利用代谢途径的菌株的示例包括CP4(pZB5)(US5,514,583)、ATCC31821/pZB5(US6,566,107)、8b(US7,223,575；Mohagheghi等人，(2004)Biotechnol.Lett.25；321-325)、以及ZW658(ATTCC#PTA-7858)。经工程化以表达木糖利用代谢途径的发酵单胞菌细胞在能够在包含木糖作为唯一糖类的培养基中生长之前，一般需要在含木糖的培养基中适应一段时间。
发酵单胞菌细胞可另外工程化，以用于阿拉伯糖利用，如US5,843,760中所述。为了允许阿拉伯糖的利用，除木糖利用途径的基因之外还表达的基因包括：1)使L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖的L-阿拉伯糖异构酶，2)使L-核酮糖转化为L-核酮糖-5-磷酸的L-核酮糖激酶，和3)使L-核酮糖-5-磷酸转化为D-木酮糖的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(US5,843,760)。如US2011/0143408中所公开的，通过另外表达阿拉伯糖-质子协同载体，诸如通过表达来自araE基因的编码区，可实现改善的阿拉伯糖利用。
此外，发酵单胞菌细胞可具有改进了菌株的一个或多个另外的基因修饰，诸如提高生长速率和/或细胞群、提高木糖的利用和/或允许使用其他糖类诸如阿拉伯糖、提高对抑制性化合物诸如乙酸盐的耐受性、或提高乙醇的生产的基因修饰。例如，编码整合宿主因子的α亚基的内源性himA基因可经过基因修饰以减少其表达，这改善了在包含乙酸盐的培养基中的生长，如US7,897,396中所述。乙酸盐存在于生物质水解产物中，因此当使用包含生物质水解产物的培养基时，对这种组分的提高的耐受性是期望的。
在另一个示例中，可进行使葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)活性降低的基因修饰，如US7,741,119中所述。GFOR以及himA基因的表达的降低，可以是通过任何方法，诸如上文关于降低醛糖还原酶活性所描述的那些。
在另一个示例中，可进行使核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活性增加的基因修饰，如在共同拥有和共同未决的US2012/0156746中所公开的。RPI表达的提高可通过提高内源性RPI编码基因的表达而实现，诸如利用活性高于天然启动子的启动子，或通过表达编码在发酵单胞菌中具有核糖-5-磷酸异构酶活性的任何蛋白质或多肽的异源性基因。
在另一个示例中，使用US7,989,206和US7,998,722中所公开的突变的、高活性启动子表达了作为木糖利用代谢途径的部分被表达的木糖异构酶。在其中所公开的突变体启动子是运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子。另外，木糖异构酶可为包括在由EC5.3.1.5鉴定的酶分类中的I组木糖异构酶，如在公布为US8,623,623的共同拥有和共同未决的US2011/0318801中所公开的。在其中公开了I组木糖异构酶，诸如从分离自密苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)的编码区表达的，在发酵单胞菌中具有比2组木糖异构酶更高的活性。在其中通过分子系统发育的生物信息学分析(使用如应用在PHYLIP中的PHYLIP邻接算法(PhylogenyInferencePackage版本3.5c；Felsenstein(1989)Cladistics5：164-166))、GroupSim分析(Capra和Singh(2008)Bioinformatics24：1473-1480)、和剖面隐马尔科夫模型(使用HMMER软件包的hmmsearch算法；JaneliaFarmResearchCampus，Ashburn，VA)定义了I组木糖异构酶。
在另一个示例中，发酵单胞菌细胞可适应生长于包含乙醇和乙酸铵的胁迫培养基中，如US8,247,208中所公开的。当使用包含纤维素生物质水解产物的发酵培养基(其包含乙酸盐)时，具有改善的乙酸盐耐受性的这些发酵单胞菌菌株是尤其有用的。
以上参考文献中所公开的菌株和本文所述的菌株提供了可用作生物催化剂的菌株的示例并且包括ATCC31821/pZB5、ZW658(ATCC#PTA-7858)、ZW800、ZW801-4、ZW801-4：：ΔhimA、AcR#3、ZW705、AR37-321、ZW1-XA111、以及R70B1。
生产乙醇的另外的生物催化剂诸如酵母和经基因修饰的大肠杆菌菌株(Underwood等人，(2002)Appl.Environ.Microbiol.68：6263-6272)，以及生产其他目标化合物的生物催化剂诸如以上列出的那些可在使用本发明方法生产的可发酵糖的发酵中使用。例如，被工程化以表达丁醇合成途径的酵母细胞和被工程化用于生产1，3-丙二醇的大肠杆菌已有所描述。生物催化剂中丁醇合成(包括异丁醇、1-丁醇和2-丁醇)途径的工程化已公开于，例如，US8,206,970、US20070292927、US20090155870、US7,851,188、以及US20080182308。生物催化剂中1，3-丙二醇途径的工程化已公开于US6,514,733、US5,686,276、US7,005,291、US6,013,494、以及US7,629,151。
为了利用木糖作为碳源，可将酵母细胞工程化以表达完全木糖利用途径。将酵母诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)工程化以由木糖生产乙醇描述于Matsushika等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2009)84：37-53)和Kuyper等人(FEMSYeastRes.(2005)5：399-409)中。
通过大肠杆菌重组菌株(Zhou等人，(2003)Appl.Environ.Microbiol.69：399-407)、芽孢杆菌(US7,098,009)和米根霉(Rhizopusoryzae)(Tay和Yang(2002)Biotechnol.Bioeng.80：1-12)的天然菌株在发酵中生产了乳酸。大肠杆菌重组菌株已用作生物催化剂在发酵中生产1，3-丙二醇(US6,013,494、US6,514,733)和己二酸(Niu等人，(2002)Biotechnol.Prog.18：201-211)。使用重组梭菌(Clostridia)(Cheryan等人，(1997)Adv.Appl.Microbiol.43：1-33)和新鉴定的酵母菌株(Freer(2002)WorldJ.Microbiol.Biotechnol.18：271-275)通过发酵制备了乙酸。通过重组大肠杆菌和其他细菌生产琥珀酸公开于US6,159,738中，并且通过重组大肠杆菌突变体生产琥珀酸公开于Lin等人(2005)Metab.Eng.7：116-127中。通过光滑球拟(Torulopsisglabrata)酵母突变体(Li等人，(2001)Appl.Microbiol.Technol.55：680-685)和大肠杆菌突变体(Yokota等人，(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58：2164-2167)生产了丙酮酸。使用大肠杆菌重组菌株作为生物催化剂用于生产对羟基肉桂酸(US20030170834)和奎尼酸(US7,642,083)。
在发酵中使用丙酸丙酸杆菌(Propionibacteriumacidipropionici)突变体生产丙酸(Suwannakham和Yang(2005)Biotechnol.Bioeng.91：325-337)，并且通过酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)(Wu和Yang(2003)Biotechnol.Bioeng.82：93-102)制备丁酸。通过梭菌属(Clostridiumsp.)菌株17cr1(Janssen(2004)Arch.Microbiol.182：482-486)由苏氨酸通过发酵制备丙酸盐和丙醇。使用酵母样普鲁兰出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)(Anantassiadis等人，(2005)Biotechnol.Bioeng.91：494-501)，通过黑曲霉突变体(Singh等人，(2001)IndianJ.Exp.Biol.39：1136-43)制备葡糖酸。通过氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)突变体(Elfari等人，(2005)ApplMicrobiol.Biotech.66：668-674)制备5-酮基-D-葡糖酸，通过土曲霉(Aspergillusterreus)突变体(Reddy和Singh(2002)Bioresour.Technol.85：69-71)生产衣康酸，通过黑曲霉突变体菌株(Ikram-U1-Haq等人，(2005)Bioresour.Technol.96：645-648)生产柠檬酸，并且通过吉利蒙念珠菌FTI20037(Mussatto和Roberto(2003)J.Appl.Microbiol.95：331-337)生产木糖醇。通过重组红串红球菌(Pseudomonasputida)和富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)(Gorenflo等人，(2001)Biomacromolecules2：45-57)生产包含4-羟基戊酸酯和显著量的3-羟基丁酸3-羟基戊酸的生物聚酯。通过重组大肠杆菌(Ui等人，(2004)Lett.Appl.Microbiol.39：533-537)制备L-2，3-丁二醇。
使用棒状杆菌(Corynebacterium)、短杆菌(Brevibacterium)、以及沙雷氏菌(Serratia)的营养缺陷型菌株和氨基酸类似物抗性菌株实现通过发酵生产氨基酸。例如，日本专利公布56008596描述了使用组氨酸类似物抗性菌株生产组氨酸，EP136359描述了使用重组菌株生产组氨酸。日本专利公布47004505和51019037描述了使用色氨酸类似物抗性菌株生产色氨酸。日本专利公布47038995、51006237、54032070描述了使用异亮氨酸类似物抗性菌株生产异亮氨酸。日本专利公布56010035描述了使用苯丙氨酸类似物抗性菌株生产苯丙氨酸。已经描述了使用需要苯丙氨酸生长的酪氨酸抗性菌株(Agr.Chem.Soc.Japan50(1)R79-R87(1976)或重组菌株(EP263515、EP332234)生产酪氨酸，并且描述了使用L-精氨酸类似物抗性菌株(Agr.Biol.Chem.(1972)36：1675-1684，日本专利公布54037235和57150381)生产精氨酸。也在大肠杆菌菌株ATCC31882、31883和31884中通过发酵生产苯丙氨酸。US6,962,805描述了在重组棒状杆菌中生产谷氨酸。在Okamoto和Ikeda(2000)J.BiosciBioeng.89：87-79中描述了通过大肠杆菌突变株生产苏氨酸。通过百合棒状杆菌(Corynebacteriumlilium)突变株(Kumar等人，(2005)Bioresour.Technol.96：287-294)生产甲硫氨酸。
通过生物催化剂也已经制备出有用的肽、酶和其他蛋白质(例如参见US6,861,237、US6,777,207、US6,228,630)。
通过生物催化剂在发酵中生产的目标化合物可使用多种本领域已知的方法进行回收。可通过离心、过滤、微量过滤和纳米过滤从其他发酵组分中分离产品。可通过离子交换、溶剂萃取、或电透析提取产品。可使用絮凝剂以有助于产品分离。作为一个具体示例，可使用ABE发酵领域已知的方法从发酵培养基中分离生物生产的1-丁醇(参见例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及其中的参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等从发酵培养基中去除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基中分离1-丁醇。通过例如使反应混合物经过有机溶剂、蒸馏和柱层析提取，可以实现从发酵液体培养基中纯化1，3-丙二醇(US5,356,812)。就该方法而言尤其好的有机溶剂是环己烷(US5,008,473)。氨基酸可以通过如离子交换树脂吸附和/或结晶的方法从发酵培养基中收集。通常使用蒸馏和分子筛回收醇。
发酵
任何生物催化剂诸如如上所述的那些用于通过本发明方法生产的可发酵糖的发酵。与具体生物催化剂一起使用的发酵条件可如以上引用的参考文献中所述或如本领域技术人员所已知的。
例如，以下描述使用运动发酵单胞菌生产乙醇的大规模发酵。将所需运动发酵单胞菌细胞在摇瓶中在约30℃至约37℃下的半复合培养基中生长，在轨道式振荡器中在约150rpm下振荡，然后将其转移到包含类似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧生长，直至OD600介于3和6之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在约2％至约20％v/v的范围内。发酵培养基可仅由水解产物构成，或可包括水解产物之外的组分，诸如山梨醇或甘露糖醇，最终浓度为约5mM，如US7,629,156中所述。发酵可为分批方法、补料分批方法或连续方法，分批方法和补料-分批培养方法是常用的并且是本领域熟知的，示例可存在于Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，Crueger，Crueger和Brock，第二版(1989)SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)。
通常使用苛性溶液(诸如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)和硫酸或磷酸将发酵控制在pH4.5-6.5。发酵罐的温度控制在30℃-37℃。为使发泡最小化，可根据需要向容器中添加消泡剂(任何类别基于硅氧烷的、基于有机物的等等)。
上述任何条件组和这些条件中在本领域熟知的附加变化是通过利用木糖的重组发酵单胞菌细胞产生乙醇的合适条件。通常，培养物在没有补充空气、氧气、或其他气体的情况下被温育(这可包括诸如厌氧、微氧、或微需氧发酵的条件)，持续至少约20小时，并可进行约48小时、120小时或更长。
此外，可使用同时糖化和发酵(SSF)工艺或混合糖化和发酵(HSF)工艺进行发酵。在HSF中，部分糖化在发酵单胞菌细胞的添加之前进行，然后同时发生进一步的糖化和发酵。第二阶段同时糖化和发酵可如公布为US8,647,850的美国专利申请公布2011/0318803中所述进行。在这种工艺中，发酵单胞菌细胞在糖化-发酵混合物中有高浓度不溶性固体的情况下，于低叶轮搅拌条件下在同时糖化和发酵反应过程中生长，以用于生产高浓度的乙醇。
实例
本发明将在以下的实例中进一步限定。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实例，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
缩写词的含义如下：“hr”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是指天，“L”是指升，“mL”是指毫升，“μL”是指微升，“g”是指克，“μg”是指微克，“ng”是指纳克，“g/L”是指克每升，“mM”是指毫摩尔，“μM”是指微摩尔，“nm”是指纳米，“μmol”是指微摩尔，“pmol”是指皮摩尔，“OD600”是指在600nm测得的光密度，“w/v”是指重量每体积，“w/w”是指重量每重量，“sacc”是糖化，“ferm”是发酵，“av”是平均，“gluc”是葡萄糖，“xyl”是木糖，“arab”是阿拉伯糖。
一般方法
糖化
使用酶混合物TrioTM(Genencor，PaloAlto，CA)将预处理的玉米秸秆酶促水解。用于水解的固体负载保持在20重量％或25重量％。在糖化之前，通过滴定测定将pH调节至5.3所需硫酸的量。糖化在pH5.3、47℃和250rpm搅拌下进行48h。每个水解在具有250g总糖化混合物的1.0L带导流板烧瓶中进行。在24hr和48hr处取样用于HPLC分析。
生物催化剂
菌株CD2
在实例1-3中，使用运动发酵单胞菌菌株C2D作为发酵中的生物催化剂，从而生产乙醇。菌株C2D来源于菌株AR37-31，后者来源于菌株ZW705，其在US8,247,208中公开，该专利以引用方式并入本文。在菌株ZW705在恒浊器中生长之后，分离菌株AR37-31，如US2012/0329114中所述，该专利以引用方式并入本文；该菌株在其中也称为适应型7-31。在该连续流动培养装置中，乙酸铵和乙醇在水解产物培养基中的浓度随时间推移而增大。将AR37-31的整个基因组测序并且与ZW705基因组的序列相比较。发现菌株AR37-31在运动发酵单胞菌基因组(NCBIReference：NC_006526.2)的zmo1432开放阅读框中具有基因修饰，其中zmo1432注释为编码“镰孢菌酸抗性蛋白”。这种修饰的效果是改善菌株在水解产物培养基中的表现。
对菌株AR37-31进行进一步修饰以改善其性能。通过引入araB、araA和araD基因表达作为Pgap-BAD操纵子来加入阿拉伯糖利用途径，如US2011/0143408中所述，该专利以引用方式并入本文。Pgap-BAD操纵子整合进pnp基因座中，从而导致由pnp基因座表达C-端截短蛋白，如共同拥有和共同未决的美国专利申请#13/711646中所公开，该专利申请以引用方式并入本文。araE阿拉伯糖-质子协同载体被表达，以改善阿拉伯糖利用，如US2011/0143408中所公开，该专利以引用方式并入本文。通过引入编码RPI的另外的基因，核糖-5-磷酸异构酶活性的提高表达被工程化，如US2012/0156746中所公开，该专利以引用方式并入本文。所得的经修饰的C2D菌株利用木糖和阿拉伯糖在水解产物培养基中生产乙醇。
菌株R70B1
由菌株ZW1(ATCC31821)制备运动发酵单胞菌菌株ZW1-XA111。将ZW1工程化，以表达四种木糖利用途径基因：xylA、xylB、tkt和tal，如以上针对ZW705所述。xylA编码区来自密苏里游动放线菌(公开于US2011/0318801，其以引用方式并入本文)并且使用变异的高活性运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(公开于共同拥有的US7,989,206，其以引用方式并入本文)表达xylA和tal/tkt操纵子。xylA和xylB基因的整合使gfor基因座失活(共同拥有的U.S.7,741,119，其以引用方式并入本文)。该菌株被工程化，以增加核糖-5-磷酸异构酶(Rpi)的表达，如共同拥有和共同未决的美国专利申请#13/161734中所公开，其以引用方式并入本文，并且增加核酮糖-磷酸3-表异构酶(Rpe)的表达，如共同拥有和共同未决的美国专利申请US-2013-0157331中所公开，其以引用方式并入本文。将所得的菌株在木糖培养基中传代4倍以便适应，如U.S7,629,156中所述，该专利以引用方式并入本文，在此期间，在运动发酵单胞菌基因组(NCBIReference：NC_006526.2)的zmo0976开放阅读框中发生基因修饰，该开放阅读框编码具有NADPH依赖性木糖还原酶活性的能够将木糖转化为木糖醇的酶(Agrawal和Chen(2011)BiotechnolLett.；onlinepublication7/01/2011)。zmo0976的破坏将NADPH依赖性木糖还原酶活性降低大于90％，如美国专利申请US-2013-0157332中所公开，其以引用方式并入本文，并且改善了在含木糖培养基上的生长。
菌株被工程化以表达大肠杆菌araBAD操纵子，该操纵子分别编码L-核酮糖激酶、L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸-4-表异构酶，它们与针对木糖利用所引入的转酮醇酶和转醛醇酶活性结合提供阿拉伯糖同化途径(US5,843,760，其以引用方式并入本文)。araBAD操纵子的整合使编码多核苷酸磷酸化酶的pnp基因失活，从而提供改善的木糖利用和乙醇生产，如共同拥有和共同未决的美国专利申请US-2013-0157331中所公开的，其以引用方式并入本文。将所得的菌株在木糖培养基中传代10倍以便适应，如U.S7,629,156中所述。
为了进一步改善木糖利用，将菌株工程化，以表达由大肠杆菌的araE基因编码的异源性阿拉伯糖-质子协同载体，如US2011/143408中所公开，其以引用方式并入本文。将此步骤中使用的氯霉素抗性标记从基因组中去除，从而产生ZW1-XA111菌株。
由ZW1-XA111通过连续适应开发运动发酵单胞菌菌株R70B1。简而言之，使ZW1-XA111复苏并且放置到玉米秸秆水解产物Y018中。
在所有葡萄糖和大约一半的木糖被消耗之后，移除10体积％的培养物并且将其放置到具有玉米秸秆水解产物的新管中。重复70次转移。在第70次转移之后，将群体涂平板，以分离单菌落，其中R70B1为所分离菌落之一。
秸秆水解产物Y018
预处理
将玉米秸秆在酶促水解之前进行预处理，所述预处理使用US7,932,063中所述的低氨方法。使用水平式Eirich340L反应容器进行预处理以生成称为Y018的预处理芯，所述反应容器包含围绕容器主体用于传输蒸汽的夹套。将秸秆装进该容器，以达到60v％(40.8kg)。将秸秆缩减至小于1/32英寸(0.8mm)。
所述秸秆具有0.200g/cm3的松散湿堆积密度和8.0重量％的水分。在装入秸秆之后，向容器施加真空，以达到-0.9barg(-90kPag)，之后引入氢氧化铵溶液，以在容器内部得到相对于干重生物质8重量％的NH3和65重量％固体。在全部的批次中，均将反应器搅拌器设为40Hz(42rpm)并且夹套上的蒸汽压力为3.2barg。一旦加入了氨溶液，即向容器中加入16barg(1600kPag)的蒸汽，以将内部容器温度升高并维持在140℃。将该温度保持30分钟。在预处理结束时，通过排气冷凝器将反应器压力降至大气压。随后，在打开容器的底部阀门并回收预处理的生物质之前，施加真空以达到-0.9barg(-90kPag)，以降低温度并从预处理的秸秆中除去多余的氨和水。对于如所描述制备的预处理的秸秆批次Y018-X、Y018-5和Y018-10，最终的固体重量％分别是55.5％、67.0％和64.4％。
糖化
使用来自以上所述批次的用TRIO处理过的预处理的玉米秸秆的混合物，在1000L发酵罐中生成Y018水解产物。将水底液添加到发酵罐中并将夹套加热至121℃保持20分钟灭菌。将水冷却至47℃，并通过罐顶部的开口添加预处理的秸秆混合物；此时浆液为大约8重量％固体。用5重量％H2SO4将pH调节至5.3，并添加酶。酶剂量为相当于将被添加到反应器的总的秸秆中的每g葡聚糖+木聚糖14mg蛋白质。经过随后的24小时，添加剩余秸秆至25重量％固体的目标，用5重量％H2SO4将pH控制至5.3。将发酵器控制在47℃和pH5.3，持续大约72小时。上述时期结束时，移出20升用于这些实验，容器内剩余的内容物被发酵。分析了水解产物的样品，并冷冻储存剩余的直到使用。样品分析的结果显示在表3中。
表3：糖化结束时Y018的水解产物属性
葡萄糖单体(g/L) 63.45
葡萄糖低聚物(g/L) 18.68
木糖单体(g/L) 38.81
木糖低聚物(g/L) 16.16
阿拉伯糖单体(g/L) 8.02
阿拉伯糖低聚物(g/L) 3.38
乳酸(g/L) 0.41
固体含量(重量％) 25.0％
制备种子培养物
为了制备种子培养物，使菌株C2D的运动发酵单胞菌细胞在包含10g/L酵母提取物、2g/LKH2PO4、5g/LMgSO4.7H2O和150g/L葡萄糖的培养基中在33℃下生长。在150rpm搅拌的同时，在大型厌氧条件下，使运动发酵单胞菌种子培养物在33℃下生长过夜。在种子达到生长的后对数期时收获种子。
发酵
由糖化(如以上所述)生成的水解产物用于发酵。发酵在1L不带导流板的烧瓶中，在275ml的工作体积下，在33℃、初始pH5.8、120rpm搅拌下进行48hr。将上述种子培养物接种到水解产物中，以引发发酵。种菌比率为2％w/v或10％w/v，这取决于实验设计。用橡胶塞盖上烧瓶，该橡胶塞用针刺穿，以排放在发酵期间形成的二氧化碳。在发酵过程中取样。使用HPLC分析测量葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、乙酸、乙酰胺和乙醇特征曲线。
HPLC分析
使用高效液相色谱法(HPLC)，利用BioradAminexHPX-87H柱(Hercules，CA)对发酵培养物中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇的浓度进行分析。柱温维持在60℃并且移动相(10mMH2SO4)保持在0.6mL/min流动速率下。
HPLC分析-2
使用HPLC，在具有离子形式H+/CO3脱灰保护柱和内嵌式预过滤器的BioradAminexHPX-P柱上对糖化和发酵中生成的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖单体的浓度进行分析。柱温保持在80-85℃并且移动相(0.2μm过滤的去离子水)保持在0.6mL/min流动速率下。
使用HPLC在具有Carbo-H保护柱和内嵌式预过滤器的BioradAminexHPX-H柱上对发酵中生成的乙醇的浓度进行分析。柱温保持在55-65℃并且移动相(用0.2μm过滤的去离子水制备的0.01N硫酸)保持在0.6mL/min流动速率下。
实例1
使用恒定曲线预处理在不同固体百分比下的预处理之间的比较
将玉米秸秆研磨并且使其通过1mm筛网。将经研磨的秸秆(52.5g干重当量)与氢氧化铵溶液和蒸馏水混合，以达到8w/w％NH3负载和40.0％固体。然后将混合物装进600mL不锈钢Parr反应器(ParrInstrument，Moline，IL)中并且用螺栓关闭。Parr反应器为非搅拌反应器。将反应器在流化沙浴中加热至140℃，持续40min。在保持时间之后，将反应器在冰浴中冷却至小于50℃。然后将内容物从反应器中移除并且在65℃下的真空干燥器中干燥过夜。单独重复这些步骤，除了使用52.5％固体和65.0％固体。然后如一般方法中所述将所得的干燥的预处理的玉米秸秆样品糖化和发酵。在糖化和发酵期间的不同时间取样并且如一般方法中所述对葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇进行分析。
40％固体、52.5％固体和65％固体实验的结果分别在图1、2和3中给出，其中24hr和48hr为糖化的时间，并且0hr、26hr和第二个48hr的时间是指发酵的时间。结果显示，与使用52.5％和65％固体的预处理相比，在所测试的最低固体百分比(40％)下的预处理产生最高的乙醇收率。
实例2
梯度和非梯度预处理之间的比较
使用生物质固体的梯度(实验1)、65％恒定生物质固体(实验2)和40％恒定生物质固体(实验3)进行三个实验。每个实验具有3个预处理阶段，如表1中所概述。
表1：预处理的实验设计
对于实验1，将55.3g的1mm大小的经研磨的玉米秸秆与14.48g的29％氢氧化铵和10.94g的蒸馏水混合，以产生65w/w％固体的包含14.86w/w％的氨浓度的秸秆混合物。然后将混合物装进用螺栓关闭的600mL不锈钢Parr反应器(非搅拌反应器)中。将反应器在流化沙浴中加热至140℃，持续15分钟的第1阶段保持时间，如表1中所指出的那样。在保持时间之后，将反应器在冰浴中冷却至小于50℃。然后将内容物从反应器中移除并且在65℃下的真空干燥器中干燥过夜。
对于实验1的阶段2，将来自第一阶段预处理的干燥内容物与14.48g的29％氢氧化铵和30.19g蒸馏水混合，以得到52.5％固体的混合物。然后将混合物在沙浴中加热的Parr反应器中在140℃下预处理15min的保持时间。然后将反应器在冰浴中冷却至小于50℃。将内容物从反应器中移除并且在65℃下的真空干燥器中完全干燥过夜。
对于实验1的阶段3，将来自第二阶段的干材料与14.48g的29％氢氧化铵和61.43g蒸馏水混合，以得到40％固体的混合物。然后将混合物在沙浴中加热的Parr反应器中在140℃下预处理15min的保持时间。在保持时间之后，将反应器在冰浴中冷却至小于50℃。将内容物从反应器中移除并且在65℃下的真空干燥器中完全干燥过夜。
对于实验2和3，程序是相同的，只是每个实验中的全部三个阶段的％固体分别保持恒定处于65％和40％固体。表2给出所有3个实验中预处理混合物的组分。
表2：不同固体百分比下的预处理混合物的配方
％固体 65.0％ 52.5％ 40.0％
NH3/(NH3+H2O) 14.86％ 8.84％ 5.33％
干秸秆(g) 52.49 52.49 52.49
秸秆固体％ 95 95 95
按原样秸秆(g) 55.33 55.31 55.31
29％NH3(g) 14.48 14.48 14.48
水(g) 10.94 30.19 61.43
分别在图4A和4B中针对梯度实验1和恒定40％固体实验3对固体百分比和氨浓度作图。在梯度实验中，氨浓度由于添加来减小固体％的水的增加而降低。相对于生物质干重，氨的量在梯度实验期间保持恒定。
在所有3个实验中，在3个阶段中预处理之后，使用一般方法中所述的程序将秸秆糖化和发酵。在糖化和发酵期间的不同时间取样并且如一般方法中所述对葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇进行分析。因此，对预处理中梯度固体％与在2个不同浓度下预处理中恒定固体％进行比较。
固体％的梯度、65％固体和40％固体实验的结果分别在图5、6和7中给出，其中24hr和48hr为糖化的时间，并且0hr、26hr和第二个48hr的时间是指发酵的时间。结果显示，与恒定预处理相比，梯度预处理产生最高的乙醇收率。
实例3
使用直接蒸汽注入或用干热添加水来提供梯度的梯度和非梯度材料之 间的比较
将经锤磨通过1mm筛网的629.3克玉米秸秆装载到6.7L经搅拌且带夹套的水平式反应器中，并且添加氨水和水，以实现如表3中针对每个实验列出的期望的初始固体百分比。
对于实验1、2和3，向反应器夹套施加蒸汽以将温度升高且维持在140℃，其中不向反应器中另外添加材料。将反应物料在该温度下保持40分钟，之后排气至大气压并且施加真空以去除过量的氨。
对于实验4和5，向反应器中添加氨水和水，以初始实现65重量％固体，然后经大约35分钟连续添加水或蒸汽(参见表3)，以实现40重量％固体。在两个实验中，再次向夹套加入蒸汽，以将温度维持在140℃。在该温度的总的40分钟保持时间结束时，将反应器排气至大气压并且施加真空以去除过量的氨。
表3：实验1-5的氨、固体百分比、热和水分参数
将来自每个实验的所得的预处理的生物质如一般方法中所述糖化48hr。通过利用HPLC测定阿拉伯糖、木糖和葡萄糖来估计所得水解产物中的糖收率。图8的结果显示，来自梯度预处理实验的葡萄糖和总糖收率大于恒定预处理实验。梯度预处理样品的总的糖收率比恒定预处理样品大至少约4％。
使用2％v/v种菌或10％v/v种菌，如一般方法中所述将来自实验的所得水解产物发酵。对于2％种菌实验的结果，在图9中对120hr的发酵进行作图，并且示出使用来自梯度预处理的水解产物的发酵比使用来自恒定预处理实验的水解产物更有效，如通过葡萄糖和木糖利用以及乙醇产量所测量的。
来自10％种菌实验的结果示于图11中。图10示出初始糖和乙醇浓度，并且图11示出在48hr的发酵之后的糖和乙醇浓度。与来自恒定曲线预处理的水解产物相比，来自梯度预处理的水解产物的发酵的乙醇收率最高。
实例4(预测)
通过操纵蒸汽质量调节梯度曲线
将锤磨通过1mm筛网的玉米秸秆装载到具有蒸汽注入系统的反应器中，并且添加氨溶液和水以实现期望的初始固体百分比。关闭反应器。将蒸汽直接添加到秸秆/氨溶液/水混合物中，以将温度增加至120-200℃。调节进入蒸汽的温度，以在给定温度范围内实现不同程度的梯度。进入蒸汽压力在3bar表压和16bar表压之间。通过操纵进入蒸汽温度，可操纵维持给定温度所需的蒸汽的量。因此，通过操纵进入蒸汽将各种梯度曲线工程化。
实例5
在不同的第2阶段固体百分比、温度和压力下的2阶段预处理的比较
将玉米秸秆研磨并且使其通过1/8″筛网。将经研磨的秸秆(483kg干重当量)和氢氧化铵溶液(14重量％，313kg)装进经搅拌和热示踪的4800L反应器中。将无水氨(14.3kg)注入到容器中，以达到总的12w/w％NH3负载和55％固体。用直接蒸汽注入将反应器加热至6barg(600kPa表压)压力并且保持30分钟(第1阶段)。然后用直接蒸汽注入将反应器加热至8barg和12barg(800kPa表压和1200kPa表压)之间并且保持10分钟(第2阶段)，之后排气至大气压，然后施加真空以去除过量的氨。
预处理细节在表4中列出。通过直接蒸汽注入增加第2阶段压力产生相应较高的温度和较低的固体百分比，如表4中所给出。
表4：实验1-5的氨负载、压力、温度和固体百分比。
使用一般方法中所述的程序，将来自每个实验的所得的预处理的生物质糖化48hr，固体负载为25重量％并且具有以下修改：每个水解在具有47g总糖化混合物的125ml烧瓶中在200rpm下进行。在糖化结束时通过利用HPLC测定阿拉伯糖、木糖和葡萄糖来估计所得水解产物中的糖收率。
使用10％v/v的菌株R70B1种菌，如一般方法中所述将来自实验的所得水解产物发酵。如针对C2D菌株的一般方法中一样制备R70B1种子培养物，只是培养基包含1g/LMgSO4.7H2O。在48hr的糖化之后和在48hr的发酵之后，通过HPLC，如一般方法HPLC分析-2中所述对样品进行测定。
糖化和发酵结果提供于表5中。来自糖化的48hr总糖和来自发酵的EtOH滴度从实验#1至实验#5单调地增大。这些结果表明，在较高的第2阶段压力以及相应较高的温度和较低的固体百分比下的生物质处理从糖化中产生更多糖并且在发酵中产生更多的EtOH。
表5：糖化和发酵结束时的滴度
实例6
在不同的初始固体百分比下的2阶段预处理的比较
将玉米秸秆研磨并且使其通过1/8″筛网。将经研磨的秸秆(484kg干重当量)和不同量和强度的氢氧化铵溶液(239-508kg和18.2％至8.6％NH3)装进经搅拌和热示踪的4800L反应器中，以达到9w/w％NH3。随后将无水氨注入到容器中，以达到总的12w/w％NH3负载。蒸汽前固体负载在44.3％和57.3％之间变化(45-60％目标)。用直接蒸汽注入将反应器加热至6barg(600kPa表压)压力并且保持30分钟。然后用直接蒸汽注入将反应器加热至12barg(1200kPa表压)并且保持10分钟，之后排气至大气压，然后施加真空以去除过量的氨。
预处理细节在表6中列出。蒸汽前、第1阶段和第2阶段固体百分比从实验#1至实验#4单调降低。
表6：实验1-4的氨负载、压力、温度和固体百分比。
使用一般方法中所述的程序，将来自每个实验的所得的预处理的生物质糖化48hr，固体负载为25重量％并且具有以下修改：每个水解在具有47g总糖化混合物的125ml烧瓶中在200rpm下进行。在糖化结束时通过利用HPLC测定阿拉伯糖、木糖和葡萄糖来估计所得水解产物中的糖收率。
使用10％v/v的R70B1种菌，如一般方法中所述将来自实验的所得水解产物发酵。如针对C2D菌株的一般方法中一样制备R70B1种子培养物，只是培养基包含1g/LMgSO4.7H2O。在48hr的糖化之后和在48hr的发酵之后，通过HPLC，如一般方法中所述HPLC分析-2对样品进行测定。结果给出于表7中。
观察到总糖和EtOH滴度在实验#1中最高，并且在实验#4中最低。这些结果表明，在相同的正常2阶段预处理条件下，较高的固体百分比有利于较高的糖和EtOH收率。
表7：糖化和发酵结束时的滴度

Claims (15)

1.一种由纤维素生物质生产可发酵糖的方法，所述方法包括：
a)在起始时间t0在反应容器中提供包含以下物质的反应混合物：
i)基于重量/重量以干生物质相对于总混合物的百分比测量的固体浓度在约40％和约70％之间的纤维素生物质；以及
ii)氨，其具有相对于所述生物质的干重在约4％和约24％之间的负载浓度；
b)随时间推移至最终时间tn增大所述反应混合物的液体含量，其中所述固体浓度减小约20％和约30％之间，从而产生预处理的生物质；以及
c)使所述预处理的生物质与糖化酶聚生体在合适的条件下接触，以产生可发酵糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物的温度在反应时间内维持在约100℃和约200℃之间的温度下。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述反应时间在约10分钟和约2小时之间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物的液体含量通过向所述反应容器中引入试剂来增加，所述试剂选自蒸汽、水、氨溶液、以及它们的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中生物质固体百分比从t0至tn的降低是线性的，是单调但非线性的，或是逐步的，其中所述固体的浓度在t0和tn之间的一段时间内至少一次保持恒定。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨选自氨溶液、无水氨、氨蒸气、以及它们的混合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨包括可再循环的氨。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述温度在t0和tn之间变化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述温度在t0和tn之间增大或减小。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素生物质包括纤维素、半纤维素和木质素。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述纤维素生物质选自玉米秸秆、玉米棒、玉米粒纤维、草、甜菜浆、小麦秸秆、小麦壳、燕麦秸秆、大麦秸秆、大麦外壳、干草、稻秆、稻壳、柳枝稷、细叶芒、大米草、草芦、废纸、甘蔗渣、高粱渣、高粱秸秆、大豆秸秆、从谷物研磨中获得的组分、树、枝、根、叶、木片、锯末、棕榈废料、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述可发酵糖为用于发酵工艺的生物催化剂提供碳水化合物来源。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述可发酵糖以比使用恒定生物质固体浓度的方法所得的收率大至少约3％的收率产生。
14.根据权利要求1所述的方法，其中使所述可发酵糖与生物催化剂接触，以用于生产目标化合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述目标化合物选自乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、1，3-丙二醇、甘油、木糖醇、甘露糖醇、乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸、谷氨酸、3-羟基丙酸、富马酸、马来酸和丁酸。
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