CN101981184B

CN101981184B - 高表达发酵单胞菌属启动子

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Publication number: CN101981184B
Application number: CN2009801106369A
Authority: CN
Inventors: P·V·维塔宁; L·陶; Y·张; P·G·凯米; C·麦卡钦; L·麦科尔; M·张; Y·仇; M·A·弗兰登
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co; Alliance for Sustainable Energy LLC
Current assignee: Alliance for Sustainable Energy LLC; EIDP Inc
Priority date: 2008-03-27
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2029-03-25
Also published as: CN101981184A; AU2009228322B2; WO2009120730A3; BRPI0906241B1; JP5444323B2; JP2011515106A; PL2271755T3; BRPI0906241A2; CA2716590C; AU2009228322A1; US20090246876A1; EP2271755B1; EP2271755A2; ES2627671T3; CA2716590A1; US7989206B2; WO2009120730A2; BRPI0906241B8

Abstract

鉴定了运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的突变体，所述启动子引导可操作地连接的异源核酸的表达改善。这些启动子是高表达启动子，它们用于在发酵单胞菌属、发酵细菌属、和其他相关细菌中表达嵌合基因。

Description

高表达发酵单胞菌属启动子

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2008年3月27日的美国临时申请61/039871的优先权，该申请以引用方式并入本文。

政府权利声明

本发明由美国政府支持，受与能源部签署的合同号04-03-CA-70224和DE-FC36-03GO13146的约束。美国政府拥有本发明的必然权利。此外美国政府拥有本发明的权利，受美国能源部与美国国家可再生能源实验室(美国中西部研究所的分支机构)签署的合同号DE-AC36-99GO10337的约束。

发明领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地讲，鉴定了引导细菌中的嵌合基因表达的新启动子。

发明背景

通过微生物来生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。希望微生物能够利用木糖作为碳源生产乙醇以及其他有用的产物，因为木糖是水解的木质纤维质材料的主要戊糖，因此能提供丰富可用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和其他乙醇细菌天然不利用木糖，可通过导入基因将它们遗传工程化以利用木糖，导入的基因编码1)木糖异构酶，该酶催化木糖转化成木酮糖；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶。

已经成功地工程化了运动发酵单胞菌菌株用于木糖代谢(US5514583、US 5712133、US 6566107、WO 95/28476，Feldmann等人(1992)Appl Microbiol Biotechnol 38：354-361，Zhang等人(1995)Science267：240-243)，以及工程化了棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)菌株用于木糖代谢(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。然而工程化菌株通常在木糖上生长和生产乙醇不如在葡萄糖上一样好。就这种工程化而言，编码用于木糖代谢的异源蛋白的基因已经从在运动发酵单胞菌细胞中有活性的启动子上表达，通常是运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子或运动发酵单胞菌烯醇酶基因的启动子。工程化以利用木糖的菌株已经适应在木糖培养基上连续传代，所得菌株具有改善的木糖利用率，如美国专利7,223,575以及共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870所描述。然而仍未确定该改善的遗传基础。

需要具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属的遗传工程化菌株和其他乙醇细菌。申请人已经发现突变体启动子具有提高的活性，这可用于表达木糖利用基因，其活性赋予包含这些启动子的工程化菌株改善的木糖利用率。该启动子也可用于表达其他基因。

发明内容

本发明涉及分离的突变型启动子，所述启动子用于表达基因，即在发酵单胞菌属、发酵细菌属、以及相关细菌中的嵌合基因，它们引导的基因表达水平比由运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Pgap)的天然启动子引导的基因表达水平更高。该突变型启动子是运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的衍生物，并且由于特定突变的存在而具有提高的活性。该启动子可用于基因工程以表达编码区或表达调控RNA。由这些启动子引导的木糖异构酶的编码区表达导致利用木糖的运动发酵单胞菌在包含木糖的培养基中的生长改善。

本文所述的是包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子，所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有核苷酸取代；其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子。

本文还描述了以下内容：包含上述分离的核酸分子并可操作地连接至异源核酸分子的嵌合基因；包含上述核酸分子的载体以及对包含导入到细胞中的上述核酸分子的细菌细胞进行基因工程化的方法。

附图简述和序列描述

可通过下列发明详述、附图、以及结合作为本专利申请一部分的序列描述，能更全面地理解本发明的多个实施方案。

图1示出转酮醇酶(A)、转醛醇酶(B)、木糖异构酶(C)、和木酮糖激酶(D)的酶检测分析方法。

图2是在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)的活性示意图。

图3是在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的转醛醇酶(TAL)和转酮醇酶(TKT)的活性示意图。

图4是选择的适合利用木糖菌落的理论乙醇产率％和木糖利用率％示意图。

图5是适合利用木糖的菌株在具有5％葡萄糖(RMG)的RM中生长50代之前和之后，在具有5％木糖(RMX5％)的RM(丰富培养基)上生长70小时时的生长示意图。

图6示出以下质粒的图谱：(A)pZB 188；(B)pZB 188/aadA；和(C)pZB188/aadA-GapXylA；以及(D)大肠杆菌木糖异构酶表达盒PgapXylA的示意图。

图7示出以下质粒的图谱：(A)pMOD^TM-2-<MCS>；(B)pMOD-Linker；和(C)pMOD-Linker-Spec。

图8示出质粒pLDHSp-9WW的图谱。

图9示出质粒pMOD-Linker-Spec-801GapXylA的图谱。

图10示出以下质粒的图谱：(A)pMOD-Linker-Spec-801GapXylA；(B)pZB188/aadA-GapXylA；和(C)pZB188/aadA-801GapXylA。

图11示出包含Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达质粒(X1、X2和X2)的三个菌株和包含对照质粒(C1、C2和C3)的三个菌株在包含木糖的培养基中的生长曲线(OD600对时间)。

图12示出ZW641、ZW658、X1和C1菌株在包含木糖的无奇放线菌素培养基中的生长曲线(OD600对时间)，(A)对线性尺度作图，而(B)对对数尺度作图。

图13示出具有整合801Pgap-XylA(#8-2、#8-4、#8-5)的三个菌株和具有整合641Pgap-XylA(#6-1、#6-3、#6-5)的三个菌株与菌株ZW658相比较的生长曲线(OD600对时间)，(A)对线性尺度作图，而(B)对对数尺度作图。

图14示出pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL的质粒图谱。

图15示出(A)pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL；(B)pZB188aadA-641GapRPI；和(C)pZB188aadA-801GapRPI的质粒图谱。

图16示出来自具有表达RPI的不同启动子的菌株的全细胞蛋白的染色蛋白凝胶。

根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”(对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则))，并且符合WorldIntellectual Property Organization(世界知识产权组织，WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列清单要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及Administrative Instructions(行政指令)的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的规则。

SEQ ID NO：1是来自运动发酵单胞菌的CP4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是来自运动发酵单胞菌的ZM4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是来自pZB4的ZmPgap的核苷酸序列，它也位于菌株ZW641和8XL4的PgapxylAB操纵子中。

SEQ ID NO：4是来自菌株ZW658的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是来自菌株8b的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是在Pgap的pZB4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7是在Pgap的CP4突变体中的具有来自ZW658的-190突变的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是在Pgap的CP4突变体中的具有来自8b的-89突变的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是在Pgap的CP4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是在Pgap的ZM4突变体中的具有来自ZW658的-190突变的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11是在Pgap的ZM4突变体中的具有来自8b的-89突变的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是在Pgap的ZM4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善Pgap的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13和14是用于扩增包含来自pZB4的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)的DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：15和16是用于扩增包含来自pZB4的tal编码区的DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：17和18是用于扩增包含来自Pgap和tal片段的Pgaptal的DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：19和20是用于扩增包含来自pZB 186的loxP::Cm的DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：21是pMODPgaptaltktCm质粒的全长核苷酸序列。

SEQ ID NO：22和23是用于扩增在接纳pMODPgaptaltktCm的转化体中包含tal和tkt编码区的3kb DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是pMODPgapxylABCm质粒的全长核苷酸序列。

SEQ ID NO：25和26是用于扩增来自具有pMODPgapxylABCm的T2C、T3C、T4C和T5C整合子的1.6kb PgapxylA DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：27和28是用于扩增包含来自ZW641和ZW658的Pgap编码区的DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：29-31是用于对来自ZW641和ZW658的Pgap测序的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：32和33是用于扩增包含Spec^r-盒的DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是木糖异构酶表达盒PgapXylA的全长核苷酸序列。

SEQ ID NO：35和36是用于替代pMOD2-<MCS>中的不同多克隆位点的寡核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NO：37和38是用于扩增来自菌株ZW801-4和ZW641的PgapxylA区域的引物核苷酸序列，该序列用于插入pMOD-Linker-Spec以分别生成质粒pMOD-Linker-Spec-801GapXylA和pMOD-Linker-Spec-641GapXylA。

SEQ ID NO：39和40是用于扩增来自pZB188/aadA-641GapXylA的Pgap的引物核苷酸序列，并且包括运动发酵单胞菌RPI开放阅读框的前15bp。

SEQ ID NO：41和42是用于扩增运动发酵单胞菌RPI开放阅读框的引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：43是RPI表达盒的全核苷酸序列，该表达盒位于质粒pZB 188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL中。

SEQ ID NO：44和45用于扩增包含来自8XL4和8b的Pgap的DNA片段的引物核苷酸序列。

SEQ ID NO：46是用于对来自8XL4和8b的Pgap测序的引物全长核苷酸序列。

SEQ ID NO：47是分别以SEQ ID Nos：1、2和3表示的CP4、ZM4和pZB4的ZmPgap的一部分的核苷酸序列，所述部分含有-190位。

SEQ ID NO：48是分别以SEQ ID Nos：1、2和3表示的CP4、ZM4和pZB4的ZmPgap的一部分的核苷酸序列，所述部分含有-89位。

发明详述

本文所述的是可用于表达细菌细胞中的嵌合基因的新启动子。申请人已经发现，运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的两个不同突变每个均分别提高由该启动子引导的表达水平。一个突变在-190位，第二个突变在-89位，两个位置都相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子。运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子包含这些突变中的任何一个或两者均有，所述启动子可用于在细菌细胞中表达异源的、可操作地连接的DNA序列。

以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的解释。

如本文所用，术语“包含”、“由...组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他的包含物。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。

同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。

“基因”指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5′非编码区)和之后的调节序列(3′非编码区)。“天然基因”或“野生型基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。

术语“遗传构建体”指编码表达一种或多种特定蛋白或功能RNA分子的核酸片段。在基因构建体中u基因可以是天然的、嵌合的、或外来的。通常基因构建体将包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。

如本文所用，术语“表达”指转录和衍生自基因的编码RNA(mRNA)或功能RNA的稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。“超表达”指在转基因生物中产生的基因产物超出在正常生物或未转化生物中产生的基因产物的水平。“共抑制”指产生能够抑制相同的或基本上类似的外源或内源性基因表达的正义RNA转录物或片段(美国专利5,231,020)。

如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。

如本文所用，术语“转化”指将核酸片段转移至宿主生物体内，导致在基因上稳定遗传。转化的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整合进宿主细胞基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。

术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性基因，该因子能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其中所述效应用于追踪遗传的受关注核酸和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的细胞或生物。

术语“异源的”指不天然存在于受关注的位点。例如“异源基因”是指不天然存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。例如存在于嵌合基因中的异源核酸分子是不与嵌合基因中的其他片段一起天然存在的核酸分子，如具有彼此不天然相关联存在的编码区和启动子片段的核酸分子。

如本文所用，“分离的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。

术语“运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子”和“ZmPgap”指具有启动子活性的核酸分子，它具有天然存在于运动发酵单胞菌基因组中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码区上游的核苷酸序列。这些术语指运动发酵单胞菌菌株如CP4和ZM4菌株(分别是SEQ IDNO：1和2)的启动子以及引导表达的序列和/或长度上的变异体，如pZB4(SEQ ID NO：3)的ZmPgap，所述变异体引导的表达水平无显著不同。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，New York，1989(下文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.Experiments with GeneFusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，New York，1984；以及Ausubel，F.M.等人，In Current Protocols in MolecularBiology，由Greene Publishing和Wiley-Interscience公布于1987年。

改善的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的发现

运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ZmPgap或Pgap)的启动子已经被用于在运动发酵单胞菌和棕榈发酵细菌中表达嵌合基因。当已经使用ZmPgap表达木糖代谢基因时，所得木糖利用率通常不如期望的那样有效。经工程化以表达四个木糖代谢酶(木糖异构酶、木酮糖激酶、转酮醇酶、和转醛醇酶)的重组运动发酵单胞菌菌株具有有限的木糖利用能力，进一步适应木糖培养基，具有改善的木糖利用率(描述于共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870)。

如本文实施例3所述，申请人已经发现称为ZW658(ATCC#PTA-7858)的改善木糖利用率的菌株具有提高的木糖异构酶和木酮糖激酶表达，所述酶以操纵子形式被整合进基因组中，从ZmPgap(PgapxylAB操纵子)中开始表达。申请人已经进一步发现，在PgapxylAB操纵子的启动子中有单个的新核苷酸改变，它负责引导可操作地连接的编码区的表达增加的启动子。与ZW658前体菌株中的PgapxylAB操纵子的ZmPgap序列相比，该核苷酸改变是相对于菌株ZW658的PgapxylAB操纵子的Pgap序列的新改变，所述前体菌株不具有提高的木糖异构酶和木酮糖激酶活性。因此具有该单个核苷酸改变的Pgap是改善的启动子。

此外申请人已经发现，运动发酵单胞菌菌株经过用编码四个木糖利用酶的基因分别工程化并且分别经改造以具有改善的木糖利用率(菌株8b，描述于美国专利7,223,575)，该菌株也具有提高的木糖异构酶和木酮糖激酶表达，所述酶以PgapxylAB操纵子形式被整合进基因组。申请人已经进一步发现，在8b菌株的PgapxylAB操纵子的Pgap中有单个的新核苷酸改变，所述改变位于与ZW658Pgap的核苷酸改变不同的位置。基于由PgapxylAB操纵子编码的木糖异构酶和木酮糖激酶的表达提高，PgapxylAB操纵子的突变型Pgap也提供改善的启动子。

在ZW658的Pgap和8b菌株PgapxylAB操纵子中鉴定的新核苷酸改变分别在-190位和-89位，其相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶天然ATG翻译起始密码子。发现的核苷酸改变在-190位是从G变成T，在-89位是从C变成T。

改变碱基的序列上下游区域是重要的因素，因为位置编号可由于序列变异而改变。

-190位在以下序列中：

AACGGTATACTGAATAAATGGTCTTCGTTATGGTATTGATGTTTTT(SEQ ID NO：47)，其是分别以SEQ ID Nos：1、2和3表示的CP4、ZM4和pZB4的ZmPgap的一部分，其中粗体并且用下划线标示的G突变成T。该-190位在CP4和ZM4菌株的ZmPgap序列中，但是-189位在pZB4中，因为在pZB4的启动子序列中的-21位置上缺失了T。

-89位在以下序列中：

CGGCATCACGAAAAGGTGTTGGCCGCGATCGCCGGTAAGTCGGC(SEQ ID NO：47)，其是分别以SEQ ID Nos：1、2和3表示的CP4、ZM4和pZB4的ZmPgap的一部分，其中粗体并且用下划线标示的C突变成T。该-89位在CP4和ZM4菌株的ZmPgap序列中，但是-88位在pZB4中，因为在pZB4的启动子序列中的-21位置上缺失了T。本发明的启动子在ZmPgap中的-190位、-89位、或者这两个位置上都具有核苷酸改变。优选地改变是在-190位上从G变成T，并且在-89位上从C变成T。包含这些突变的本发明启动子是改善的Pgap。

在-190和-89位的其他核苷酸改变可提供活性改善的ZmPgap。此外在启动子中其他位置的核苷酸改变可提供活性改善的ZmPgap。

ZmPgap的天然存在的序列不是单独序列，但是序列中可具有一些变异，所述变异对启动子功能无显著影响。对启动子功能无显著效应意味着该启动子序列引导的表达水平基本上类似于存在于天然运动发酵单胞菌菌株中的ZmPgap引导的表达水平。序列变异可天然发生在不同分离蛋白或运动发酵单胞菌菌株之间，如CP4和ZM4菌株之间在相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(分别是SEQ ID NO：1和2)的天然ATG翻译起始密码子的-29位上的差异，其中在CP4中是A，而在ZM4中是G。

除天然存在的序列变异外，不显著影响功能的核苷酸改变还可在常规操纵程序期间发生，包括PCR、克隆、转化、以及菌株生长，这是本领域技术人员已知的。一个实例是pZB4的ZmPgap，它在-21位置上缺失T。

发生在不同天然或工程化菌株中的ZmPgap序列中的、不显著影响启动子功能的任何核苷酸改变可存在于运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子序列中，例如在pZB4(SEQ ID NO：3)的ZmPgap中的-21位置后缺失T。因此在上述-190位和-89位上的突变确实影响启动子功能，即，显著改善启动子功能的、在上述-190位和-89位上的突变可在任何具有基本上类似活性(天然水平)的ZmPgap序列中发生，并且可与不影响功能的突变共发生。

具有在-189位和/或-88位上的所述突变的改善Pgap序列的实例包括来自菌株ZW658(SEQ ID NO：4)、菌株8b(SEQ ID NO：5)、和来自pZB4(SEQ ID NO：6)的双重突变相同ZmPgap变异体的启动子序列。附加的改善Pgap序列的实例是在来自CP4(分别是SEQ ID NO：7、8、和9)的ZmPgap变异体中的-190、-89或双重突变以及在来自ZM4(分别是SEQ ID NO：10、11、和12)的ZmPgap变异体中的-190、-89或双重突变。

此外在ZmPgap序列中发生的长度变异基本上不影响启动子功能。本发明包括改善的Pgap，它在-190位和/或-89位(相对于运动发酵单胞菌CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子)具有所述的突变，所述位置在添加-190和/或-89突变之前无显著活性改变的不同长度ZmPgap中。

制备改善的Pgap

可通过本领域技术人员已知的任何方法将-190位和/或-89位上的所述突变导入ZmPgap核酸分子中。例如可合成具有突变和围绕DNA序列的寡核苷酸并将其克隆到较大的启动子DNA片段中以取代无突变的片段。可合成包含该突变和一些邻近启动子序列的引物并用于PCR中以制备启动子片段。可合成全长启动子DNA片段使之成为连接到一起的多个寡核苷酸。可使用定点诱变导入突变。此外可使用来自ZW658或8b菌株的DNA作模板制备突变启动子，作为PCR扩增的DNA片段。

在嵌合基因和载体中改善的Pgap，导入细菌细胞

可将本发明的启动子可操作地连接至意欲在细菌细胞中表达异源核酸分子，形成嵌合核酸分子或本发明的嵌合基因。嵌合基因的设计和构建是为本领域技术人员熟知的。嵌合基因通常包括一个启动子、一个意欲表达的异源核酸分子、以及3’终止控制区。终止控制区可来源于不同基因，并且常来自靶宿主细胞天然具有的基因。可操作地连接的异源核酸分子可为期望在细菌细胞中表达的任何核酸分子，包括例如蛋白或肽的编码区，或者用于功能RNA表达的核酸。功能RNA包括例如反义RNA、核酶、和干扰RNA。此外可构建一个操纵子，该操纵子包含本文所述的启动子和多个从该启动子表达的编码区。

本文所述的启动子可在嵌合基因中使用以在属于发酵单胞菌属或发酵细菌属的细菌中表达嵌合基因。嵌合基因可用于表达涉及发酵单胞菌属或发酵细菌属产物生产的任何蛋白。例如一种或多种涉及氨基酸如丙氨酸或山梨醇或木糖醇合成的酶可从具有这些启动子的嵌合基因开始表达。嵌合基因可在不利用木糖的天然发酵单胞菌属或发酵细菌属菌株中表达，或者在利用木糖的菌株中表达。本文所述的启动子还可用于表达与木糖代谢或另一种代谢途径有关的酶。

本文所述的嵌合基因通常在载体中构建或者转移到载体中以进行进一步的操纵。载体为人们所熟知。某些载体能够在广泛的宿主细菌中复制并可通过接合进行转移。pRK404和三个相关载体：pRK437、pRK442、和pRK442(H)的完全注解序列是可用的。这些衍生物已被证明是在革兰氏阴性菌中进行遗传操纵的有用工具(Scott等人，Plasmid 50(1)：74-79(2003))。

可在不同靶宿主细胞中使用其他熟知的载体。用于不同宿主的载体实例描述于共有的和共同未决的美国专利申请公布#US20070092957A1，pp11-13中，该文献以引用方式并入本文。尤其可用于在发酵单胞菌属中表达的载体能够在大肠杆菌和发酵单胞菌属中复制，如pZB 188，它在US 5,514,583中进行了描述。载体可包括用于在细胞中自主复制的质粒，以及用于运送构建体以将其整合进细菌基因组的质粒。用于DNA整合的质粒可包括转座子、与靶细菌基因组同源的核酸序列区域、或者参与整合的其他序列。一种其他类型的载体可为使用例如可从

商购获得的系统生产的转座体。如何选择合适的载体用于期望的靶宿主和期望的功能是熟知的。

本文所述的启动子也可在无可操作地连接的核酸分子的载体中构建用于表达，并且将其整合进内源编码区附近以置换细菌基因组中的内源启动子或者添加一个启动子至例如操纵子内的编码区。染色体启动子置换可使用如Yuan等人(Metab.Eng.(2006)8：79-90)和White等人(Can.J.Microbiol.(2007)53：56-62)描述的方法完成。

可通过熟知的方法，例如使用冻-融转化、钙介导转化、电穿孔、或接合，将包含本文所述的启动子的载体导入细菌细胞中。

使用改善Pgap的异源核酸分子的表达

水平提高的嵌合基因表达可使用本文所述的改善Pgap获得。用改善Pgap和整合进基因组中的木糖异构酶编码区构建的嵌合基因如本文实施例8所示，使得运动发酵单胞菌细胞在木糖培养基上生长改善，所述菌株进行了工程化以表达编码木糖代谢蛋白的基因。在木糖上的改善生长如本文实施例3和10所示，与较高水平的木糖异构酶活性和木酮糖激酶活性有关。利用木糖的运动发酵单胞菌菌株适应在木糖上的较好生长开具有引导木糖异构酶和木酮糖激酶表达的改善Pgap，具有改善的木糖利用率。木糖异构酶和木酮糖激酶活性比无引导木糖异构酶和木酮糖激酶表达的改善Pgap的菌株高约4至5倍。

本文实施例9中显示了包含本发明改善Pgap并位于稳定质粒上的嵌合基因的提高的表达水平。具有可操作地连接至编码核糖5-磷酸异构酶(RPI)的异源序列的改善Pgap的嵌合基因产生的RPI蛋白的量比由包含ZmPgap的嵌合基因产生的RPI蛋白的量更高。

实施例

实施例示出了本文所述的发明。

一般方法

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；以及Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

缩写的含义如下：“kb”指千碱基，“bp”指碱基对，“nt”指核苷酸，“hr”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒钟，“d”指day(s)，“L”指升，“mL”指毫升，“μL”指微升，“μg”指微克，“ng”指纳克，“mM”指毫摩尔，“μM”指微摩尔，“nm”指纳米，“μmol”指微摩尔，“pmol”指皮摩尔，“Cm”指氯霉素，“Cm^r”指氯霉素抗性，“Cm^s”指氯霉素敏感，“Sp^r”指奇放线菌素抗性，“Sp^s”指奇放线菌素敏感，“XI”为木糖异构酶，“XK”为木酮糖激酶，“TAL”为转醛醇酶，“TKT”为转酮醇酶，“EFT”指流逝的发酵时间，“RM”指包含10g/L酵母提取物加2g/L KH₂PO₄的丰富培养基，“MM”指包含10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH₄)₂SO₄和0.2g/L KH₂PO₄的配合培养基。

制备发酵单胞菌属的细胞游离提取物用于酶分析法

细胞在50mL RM+2％葡萄糖中，在30℃下过夜生长至OD₆₀₀为1.0-1.2。在4℃、4500rpm下离心10分钟收获细胞。弃去上清液，用25mL冰冻超声波降解缓冲液(10mM Tris，pH7.6，10mM MgCl₂)洗涤细胞沉淀物，随后在4500rpm离心10分钟。将沉淀物重悬在2.0-2.5mL超声波降解缓冲液加1mM二硫苏糖醇的溶液中。将500μL等分试样在4℃下，在eppendorf离心机中离心1分钟。弃去大多数上清液，留下约10-20μL以防止沉淀物变干。冷冻细胞并贮存在约80℃直至进行分析。在分析前，解冻细胞并用500μL的超声波降解缓冲液，加1mM二硫苏糖醇的重悬。以62％的占空比超声处理混合物2x45秒钟，使用Branson超声波细胞破碎仪450输出对照2，使样本在两次超声波降解之间冷却约3-5分钟。样本在Beckman离心机中，在4℃、14,000rpm下离心60分钟。将上清液转移到新管中并保存在4℃。使用Pierce BCA检测分析法测定蛋白浓度。

转酮醇酶(TKT)测定通常首先进行，因为该酶比其他酶更不稳定。TKT测定的图表如图1A中所示。

在微板测定中，在30℃下将20μL的细胞游离提取物加到每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.37mM NADP，50mM TrisHCl pH7.5，8.4mM MgCl₂，0.1mM TPP((焦磷酸硫胺素)，0.6mM E4P(赤藓糖-4-磷酸)，4mM BHP(β-羟基丙酮酸)，4U/mL PGI(磷酸葡糖异构酶)，和4U/mL G6PD(6-磷酸葡萄糖脱氢酶)。在平板阅读器上读数A₃₄₀3-5分钟。如下计算TKT活性：

1单位对应于形成1微摩尔D-果糖6-磷酸/分钟，温度为30℃。U(微摩尔/分钟)＝比降(dA₃₄₀/分钟)×反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADP→NADPH摩尔数是6220A₃₄₀每摩尔每L，在1cm比色杯中)

(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)

比活性(微摩尔/分钟-毫克)＝微摩尔/分钟/蛋白浓度(mg)

转醛醇酶(TAL)测定的基础如图1B所示。在微板测定中，在30℃下将20μL的细胞游离提取物加到每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.38mM NADH，87mM三乙醇胺，17mMEDTA，33mM F6P(果糖-6-磷酸盐)，1.2mM E4P(赤藓糖-4-磷酸)，2.0U/mL GDH(甘油3-磷酸脱氢酶)，和20U/mL TPI(磷酸丙糖异构酶)。将平板培养5分钟，然后读数A₃₄₀3-5分钟。如下计算TAL活性：

1单位对应于形成1微摩尔D-甘油醛每分钟，温度为30℃。U(微摩尔/分钟)＝比降(dA₃₄₀/分钟)×反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADH→NAD摩尔数是6220A₃₄₀每摩尔每L，在1cm比色杯中)

(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)

比活性(微摩尔/分钟-毫克)＝微摩尔/分钟/蛋白

木糖异构酶(XI)测定的基础如图1C所示。在微板测定中，在30℃下将20μL的细胞游离提取物加到每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.256mM NADH，50mM木糖，10mMMgSO₄，10mM三乙醇胺，和1U/mL SDH(山梨醇脱氢酶)。在平板阅读器上读数A₃₄₀3-5分钟。如下计算XI活性：

1单位XI对应于形成1微摩尔D-木酮糖每分钟，温度为30℃。U(微摩尔/分钟)＝比降(dA₃₄₀/分钟)×反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADHP→NAD摩尔数是6220A₃₄₀每摩尔每L，在1cm比色杯中)

(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)

比活性(微摩尔/分钟-毫克)＝微摩尔/分钟/蛋白浓度(mg)

木酮糖激酶(XK)测定的基础如图1D所示。

在微板测定中，在30℃下将20μL细胞游离提取物每个孔的反应混合物中，该混合物包括以下终浓度的组分：0.2mM NADH，50mM TrisHCl pH7.5，2.0mM MgCl₂-6H₂O，2.0M ATP，0.2M PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)，8.5mM D-木酮糖，5U/mL PK(丙酮酸激酶)，和5U/mL LDH(乳酸脱氢酶)。在平板阅读器上读数A₃₄₀3-5分钟。如下计算XI活性：

1单位对应于每分钟形成1微摩尔D-木酮糖至D-5-磷酸木酮糖，温度为30℃。

U(微摩尔/分钟)＝比降(dA₃₄₀/分钟)×反应体积(μL)/6220/0.55cm

(NADH→NAD摩尔数是6220A₃₄₀每摩尔每L，在1cm比色杯中)

(微板中的路径长度200μL每孔＝0.55cm)

比活性(微摩尔/分钟-毫克)＝微摩尔/分钟/蛋白浓度(mg)

HPLC方法

用Agilent 1100系列HPLC和LC 3D的Agilent ChemStation软件进行分析。柱子为BioRad Aminex HPX-87H(HPLC Organic AnalysisColumn 125-0140)，具有BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125-0129)。操作条件为：

实施例1

构建木糖发酵的运动发酵单胞菌菌株

如共有的和共同未决的美国专利公布US20080286870所述，木糖发酵运动发酵单胞菌菌株经由连续转座事件将两个操纵子，PgapxylAB和Pgaptaltkt整合进ZW1(ATCC#31821)的基因组进行构建，随后在包含木糖的选择性培养基上使该菌株适应，它包含四个木糖利用基因，编码木糖异构酶、木酮糖激酶、转醛醇酶和转酮醇酶。先前构建了称为8b的木糖发酵运动发酵单胞菌菌株，如美国专利申请公布20030162271所述，经由组合使用同源重组和转座方法将两个操纵子PgapxylAxylB和Penotaltkt与选择性抗生素标记一起整合进运动发酵单胞菌5C的基因组中进行构建，随后进行适应和NTG诱变。在制备新菌株的过程中，使用与位点特异性同源重组相反的转座(Epicentre’sEZ::Tn体外转座系统)，因为该方法具有提供多个可选择整合位点和相对高的插入频率的优点。将编码木糖利用酶的四个基因排列并克隆成两个分开的操纵子：用于整合的PgapxylAB和Pgaptaltkt。将一个抗生素抗性标记、一个侧接两个P1噬菌体Cre-重组酶识别序列(loxP)的氯霉素抗性(Cm^r基因)连接到每个操纵子上用于选择整合子。用一个两步的连续方法完成两个操纵子的整合：Pgaptaltkt，然后是PgapxylAB。在两个整合事件中使用Cm抗性选择，因为它通过在质粒上表达Cre重组酶，随后在每次整合后消除质粒而被移除。该方法允许使用相同抗生素标记进行多次选择。更重要的是，它允许移除导入的抗生素标记以选择整合的操纵子。该方法消除了抗生素抗性基因对商用发酵菌株的负面影响。

构建pMODPgaptaltktCm用于转座

如美国专利申请公布20030162271(实施例9)所述，包含来自大肠杆菌的转酮醇酶(tkt)编码区的2.2kb DNA片段从pUCtaltkt(美国专利申请公布20030162271)中通过BglII/XbaI消化进行分离并被克隆到用BamHI/XbaI消化的pMOD(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)载体中，产生pMODtkt。称为Pgaptal的PCR片段通过如下所述将运动发酵单胞菌gap(Pgap；甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的启动子区域融合到大肠杆菌转醛醇酶(tal)的编码区上生成。从pZB4扩增Pgap片段，该片段的构建如美国专利5514583(实施例3)所述，使用具有SEQ ID NO：13和14的引物。pZB4包含Pgap-xylA/xylB操纵子和P eno-tal/tkt操纵子。使用具有SEQ ID NO：15和16的引物从pZB4扩增tal编码区片段。Pgaptal片段使用Pgap和tal片段作模板，用具有SEQ ID NO：17和18的引物进行扩增。该片段用XbaI消化并克隆到质粒pMODtkt，tkt编码区的上游中。loxP::Cm片段通过PCR，使用Cmlox(F，sfi)和Cmlox(R，sfi)引物(SEQ ID NO：19和20)以及pZB 186作模板生成。pZB 186是天然运动发酵单胞菌质粒和pACYC 184的组合，描述于US514583(实施例3)和Zhang等人((1995)Science267：240-243)。最后，将loxP::Cm PCR片段插入包含Pgaptaltkt的质粒的SfiI位点以形成整合质粒pMODPgaptaltktCm。在该质粒中，将Pgaptaltkt loxP::Cm片段插入pMOD载体中的两个嵌合末端(转座酶结合位点)之间。SEQ ID NO：21是pMODPgaptaltktCm质粒的全长核苷酸序列。

转座和转化ZW1中的pMODPgaptaltktCm

质粒pMOD是基于pUC的载体，因此在发酵单胞菌属中是非复制载体。质粒pMODPgaptaltktCm在室温下，在存在Mg²⁺的情况下用转座酶处理一小时，并用于转化ZW1细胞，转化通过电穿孔(使用BioRadGene Pulser，设为200Ω，25μF和16kV/cm)进行。电穿孔细胞在30℃下，在配合培养基(MM)中培养6小时，该培养基包含10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.2g/L K₂HPO₄)，补充了50g/L葡萄糖和1mM MgSO₄。将转化混合物置于琼脂板上，该琼脂板包含在MM中的15g/L Bacto琼脂，补充了50g/L葡萄糖和120μg/mL氯霉素，并且在30℃下厌氧培养。转化体在约2天后可见。转化/转座频率为约3x10¹/μg DNA。

获得了总计39个Cm^r转化体菌落。挑取了二十一个菌落并通过PCR和酶活性检测分析法进行进一步分析。使用引物SEQ ID NO：22和23的PCR证实存在3kb DNA片段，该片段在转化体中包含tal和tkt编码区。用来自21个整合子菌落的质粒DNA回转化不生成在大肠杆菌中的回转化体，这说明tal和tkt被整合进ZW1的基因组中。使用改进用于微板的规程(一般方法)测试这些整合子的转醛醇酶和转酮醇酶活性。使用Pierce BCA蛋白检测分析法测定蛋白浓度。转化体在30℃下，在50mL锥形离心管中的RM培养基上生长，该培养基包含2％(w/v)的葡萄糖，补充了120μg/mL的氯霉素)。对照菌株8b和ZW1也生长(RM加2％的葡萄糖用于ZW1)用于酶分析法。当OD600达到1.0时收获细胞。洗涤细胞一次并重悬在超声波降解缓冲液(10mMTris-HCl，pH 7.6和10mM MgCl₂)中。酶分析法如美国专利申请公布20030162271所述进行。单位为微摩尔/分钟-毫克。除一个样本外，所有样本具有转醛醇酶和转酮醇酶活性。

选择的整合子的基因组和质粒DNA用PstI消化，使用tkt探针进行Southern杂交。ZW1 DNA不与tkt探针杂交。在所有整合子基因组样本中均有1.5kb的条带是可见的，它是期望的DNA片段，位于tkt中的PstI位点和tal中的PstI位点之间。第二个可见的高分子量(6kb或者更大)条带是唯一的，位于独立品系T2、T3、T4和T5之间，指示每个品系中的个别基因组整合位点。令人感兴趣的是，与tkt探针杂交的T5的质粒和基因组DNA指示Pgaptaltkt也可能在天然质粒上整合进T5中。选择这四个菌株(T2、T3、T4和T5)进行进一步的Cre处理以除去Cm^r标记。

Cre处理以从taltkt整合子中除去Cm ^r 标记

为了从染色体中除去Cm^r标记，用pZB188/Spec-Cre转化T2、T3、T4和T5。该质粒是发酵单胞菌属-大肠杆菌穿梭载体pZB 188[Zhang等人(1995)Science 267：240-243；US 5514583]的衍生物，它包含Cre重组酶的表达盒。pZB188/Spec-Cre与Cre表达载体相同，该载体在实施例10中描述(pZB 188/Kan-Cre)，不同的是它具有抗奇放线菌素基因，而不是抗卡那霉素基因。在补充了2％葡萄糖和200μg/mL奇放线菌素)的MM琼脂板上选择转化体。挑取S p^r抗性菌落置于补充了2％葡萄糖和200μg/mL奇放线菌素的RM琼脂板上和补充了2％葡萄糖和120μg/mL Cm的RM琼脂板上。百分之百的挑取菌落是Cm，指示Cre高效切除Cm^r。Sp^rCm^s转化体在37℃下在加有2％葡萄糖的RM中培养2至5天，每日转移以消除pZB 188aadACreF。在每次转移过程中，稀释细胞并置于加有2％葡萄糖的RM琼脂板上，用于挑取到具有或不具有200μg/mL Sp的相同培养基的附加平板上。通过PCR分析Sp^s菌落以确认消除了pZB188aadACreF。将整合子的消除质粒的后代称为T2C、T3C、T4C和T5C。为了检查这些转座整合子是否稳定，这4个菌株在加有2％葡萄糖的RM中生长，然后转移到10mL相同培养基中并在37℃下在双重测试管中生长。每日转移细胞，持续十天，或者大约100代。稀释菌落并将其置于RMG平板上用于第1次和第10次转移后的菌落分离。来自每个测试菌株的每次转移的十二个菌落对存在的Pgaptaltkt显阳性，测试通过菌落PCR，使用5’Pgap和3’tkt引物(SEQ ID NO；13和23)。也测量在第1次转移和第10次转移后的分离转醛醇酶和转酮醇酶的活性(如一般方法所述)。在100代后，所有4个整合子在非选择性培养基上具有相似水平的TAL和TKT活性，说明这些整合子是遗传稳定的。

构建pMODPgapxylABCm用于转座

下一步骤是进一步将PgapxylAB loxP::Cm操纵子整合进ZW1::Pgaptaltkt整合子中(T2C、T3C、T4C和T5C)。整合质粒pMODPgapxylABCm基于质粒pMODPgaptaltktCm(上文所述)构建。PgaptaltktDNA片段通过SacI/SfiI消化除去。将一个包含SacI、NotI、和SfiI限制性位点的衔接子片段通过连接导入。然后将分离自pZB4(US 5514583)的PgapxylAB的NotI片段克隆进衔接子的NotI位点。木糖异构酶(XI)由xylA编码，而木酮糖激酶(XK)由xylB编码。SEQ ID NO：24是pMODPgapxylABCm质粒的全长核苷酸序列。

转座和转化T2C、T3C、T4C和T5C中的pMODPgapxylABCm

使用相似方法整合PgaptaltktCm，用pMODPgapxylABCm(如上所述)经转座酶处理以转化/转座T2C、T3C、T4C和T5C。在Cm选择后的2个转化/转座实验后获取六个整合子(T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1、T5CCmX2)。通过PCR确认所有转座子存在xylAB，所述PCR使用两组引物：SEQ ID NO：25和26，以及SEQ ID NO：15和16，不同的是T2CcmX1和T2CcmX6使用引物SEQID NO：25和26进行检测，它们无PCR片段。

检测包括2个PCR阴性品系的整合子的XI、XK、TAL和TKT活性(一般方法)。如图2和3所示的结果指示六个xylAB整合子T3CCmX1、T3CCmX2、T3CCmX3、T4CCmX1、T5CCmX1、和T5CCmX2都具有XI、XK、TAL和TKT活性。与阴性亲本对照相比，XI和XK活性是新获得的(图2)。TAL和TKT活性保持与亲本对照一致。所有结果指示制备了蛋白并且具有功能。酶活性水平不同，并且TI和XK活性类似于用相同质粒转化/转座的ZW1整合子的那些活性。XI、XK、TAL和TKT的活性水平低于菌株8b中的那些活性水平。

xylAB操纵子的整合通过Southern杂交确认。6个品系的基因组和质粒DNA用SphI消化并与地高辛标记的xylB探针杂交。共有的条带约3kb，它从xylB的SphI位点和在pMOD载体上的邻近克隆位点上的另一个SphI位点中生成，存在于所有基因组DNA样本中，并且此外在基因组DNA样本中的较高分子量的杂交条带指示有四个用于染色体中的P gapxylAB操纵子的整合位点。T3CCmX1和T3CCmX2看来似乎具有相同的整合位点，T3CCmX3和T4CCmX1可具有相同的整合位点，而T5CCmX1和T5CCmX2各具有分开的整合位点。用PstI消化相同DNA，随后通过用tkt探针进行的Southern杂交证明每个整合子具有与其相应的亲本菌株相同的杂交图像。

ZW1::Pgaptaltkt PgapxylAB Cm整合子适应木糖培养基

尽管存在所有四个木糖利用的酶活性，以前的观察(美国专利申请公布20030162271)指示整合子可能不立即在木糖上生长。在木糖上生长可发生在长时间在木糖培养基上培养之后(或者在测试管中或平板上)，该过程称为适应。

菌株如下进行适应。将ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm整合子菌株接种到包含RMX(包含10g/L酵母提取物，2g/L KH₂PO₄，20g/L或2％(w/v)木糖的测试管中以及MMGX或MMX平板上(10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.2g/L K₂HPO₄，1mM MgSO₄，1.5％(w/v)琼脂，0.025％(w/v)葡萄糖和4％(w/v)木糖或正好4％(w/v)木糖)。低水平的木糖用于支持初始生长以提高适应期间的突变可能性。在培养物和平板中的木糖上进行适应的至少五个尝试的其中一个是成功的。在30℃下厌氧培养10天后，在具有T3CCmX1和T3CCmX2细胞的MMGX上分别有17和19个菌落是可见的。平板上的菌落较小，并且看上去不健康(透明)。将十二个菌落(四个来自T3CCmX1平板：T3CCmX11、T3CCmX12、T3CCmX13和T3CCmX110；或者来自T3CCmX2平板：T3CCmX24、T3CCmX25、T3CCmX26、T3CCmX27、T3CCmX28、T3CCmX29、T3CCmX211和T3CCmX212)接种到RMGCm120中并转移到3mL RMX中用于进一步的适应以获得能够在木糖上生长较快的品系。

在包含3mL RMX的测试管中的整合子的适应在30℃下进行。一直在Spectronic 601分光光度计上监控OD₆₀₀。当生长达到对数中期时，将培养物转移到RMX的新鲜管中。该过程持续7次转移。生长速率和最终的OD(非线性读数)经转移而被改善。

在第6次转移时，将培养物划线接种在RMX平板上以分离单菌落。三个整合子比在RMX划线平板上的其他整合子生长更快：T3CCmX13、T3CCmX26和T3CCmX27，在表中和下文的讨论中将它们称为X13、X26和X27。为了筛选在木糖上生长最好的菌落，选择TX13、X26和X27的四个大(L1-4)菌落和四个小(S1-4)菌落并在RMX测试管中培养以便能监控生长状况、糖利用率、和乙醇产量。菌落在30℃生长过夜，随后当OD₆₀₀＝0.05时接种到在双重测试管中的3mL RMX中。X27在RMG中比其他培养物生长更慢，在6.54、时后再次接种。在69小时(X27为62.5小时)后，采集样本进行HPLC分析(一般方法)。图4图示了在69小时时(所有X27培养物为62.5小时)培养物的平均乙醇产率(％理论产量)和木糖利用率(％)。在大菌落和小菌落之间无显著差异。尽管X27在木糖上的性能比X26更好，但它在葡萄糖上显示生长更慢。因此选择性能最佳的大菌落X13(X13L3)和X26(X26L1)在pH控制发酵中进行进一步的评估。菌株X13L3和X26L1以及对照菌株8b的发酵在37℃下在RMG(6％葡萄糖)、RMX(6％木糖)和RMGX(8％/4％；葡萄糖/木糖)中进行。在RMG(6％)和RMGX(8％/4％)中生长的X13L3和X26L1的葡萄糖发酵进行得相当迅速。X13L3和X26L1在RMGX(8％/4％)中的木糖发酵比菌株8b的木糖发酵更慢。此外X13L3和X26L1在37℃下在RMX(6％)上的生长发生在长时间的延迟之后。从RMX(6％)发酵液中回收若干种分离蛋白，X13b、X13c和X13FL。这些分离蛋白与初始菌株X13a(X13L3的分离蛋白)和X26如该实施例前文所述一起经受Cre处理以从ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm菌株中除去Cm^r标记。所得经Cre处理的无Cm^r整合子称为：X13aC、X13bC、X13cC、X13FLC和X26C。

实施例2

菌株ZW658的适应和选择

如前文所述，初始ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm菌株在30℃下在RMX上的适应极大地改善了在这些条件下菌株的生长。然而适应的菌株在37℃下在RMX(6％)中的生长和发酵期间经历长时间的延迟。为了在优选的过程条件下(包括较高的糖浓度和温度)进一步改善用于木糖发酵的整合子，进化或适应过程继续在37℃下在RMX(5％)中进行。进行连续转移并且选择生长最好的菌株。该过程中使用的整合子包括X13aC、X13bC、X13cC、X26C和X13FLC。这5个菌株在30℃下在RMX中生长，在被转移到37℃下的RMX(5％)之前进行了6次转移，随后另外转移5至16次。在所有转移期间和之后将培养物划线接种在RMX平板上并在37℃下培养以分离单菌落。将大菌落进一步划线接种在RMX平板上并在37℃下培养3至4次以纯化菌落。选择最终的大菌落用于在37℃下在RMX(5％)中的生长测试。

评估在37℃下在RMX(5％)培养基中适应的菌株

在经连续转移适应后的十八个菌落最初在37℃下在RMX(5％)测试管中进行测试。选择十二个菌株进行第2次测试管评估。所有的评估中包括菌株8b用于比较。18个菌落在37℃下在RMG中生长过夜，离心并将细胞在37℃下接种到4mL的RMX(5％)中，在测试管中静态进行第1次评估。基于生长状况(OD₆₀₀，非线性)和终点HPLC结果(低残余木糖和高乙醇)，选择12个菌株用于第2次评估。

第2次评估的其中一个目的是为了测试在木糖上改善生长的稳定性和菌株的木糖利用能力。所有12个菌株经过稳定性研究以检查适应菌株在暴露于非选择性培养基后是否是稳定的，其中将它们在37℃连续转移50代。将在RMG(5％)转移之前和之后的培养物接种到RMX(5％)测试管中并在37℃下生长用于评估。非线性OD通过在Spectronic 601分光光度计中直接对测试管读数进行监控。将在RMG中生长50代之前和之后的、在RMX(5％)中生长至70小时的OD绘制图5中。结果指示大多数菌株在37℃下在RMG中生长50代后是稳定的。终点(稳定期)上清液也通过HPLC对木糖和乙醇浓度进行分析。在这些培养物中的低残余木糖和高乙醇浓度支持该菌株在木糖上生长和发酵良好这一事实。

基于上述测试管评估(低残余木糖、高乙醇浓度和较高的OD)和随后用高浓度葡萄糖和/或木糖(至多20％)以及葡萄糖和木糖及乙酸盐的混合物进行的微滴定板生长筛选的结果，在高糖和存在乙酸盐的情况下选择生长较好的菌株，如菌株#26，命名为ZW658，它表现出最好的总体性能。

实施例3

戊糖磷酸盐途径酶活性的测定

由整合基因(描述于实施例1中)编码的四种木糖利用酶的活性如一般方法所述进行测量，选择三个菌株适应高糖和370℃(实施例1)并比较在进一步适应的菌株ZW658(实施例2)中的相同酶的活性。表1显示了以微摩尔产物/mg蛋白/分钟表示的结果。

表1：在不同木糖利用的适应运动发酵单胞菌菌株中的酶活性

菌株	木糖异构酶	木酮糖激酶	转醛醇酶	转酮醇酶
					X13bC	0.033+/-0.013	1.15+/-0.13	1.66+/-0.5	0.22+/-0.02
ZW658	0.25+/-0.033	4.41+/-0.21	2.67+/-1.0	0.19+/-0.05

在进一步适应的菌株ZW658中，xylAB操纵子的两个成员的活性水平与在部分适应的前体菌株中的活性水平相比提高了约4至8倍。在ZW658和部分适应的前体菌株之间，来自tal/tkt操纵子的酶表达水平变化不大或无变化。

实施例4

在部分适应的菌株和ZW658中的XylAB操纵子的启动子区域的序列比较

因为在驱动xylAB的GAP启动子(Pgap)控制下的两个基因产物的酶活性水平的清楚改变是导致ZW658的适应的显著结果，通过PCR扩增来自部分适应菌株(实施例1；随后给定菌株编号ZW641)和ZW658的操纵子的启动子区域并进行测序。使用来自recG编码区的正向PCR引物(PC11；SEQ ID NO：27)(其中将PgapxylAB操纵子整合)和来自xylA编码区(PC12；SEQ ID NO：28)的反向引物制备PCR片段。所得961bp的PCR产物使用引物LM121、LM 122、和LM123(SEQID NO：29、30、和31)测序。来自ZW641的启动子序列是SEQ ID NO：3，来自ZW658的启动子序列是SEQ ID NO：4。发现这些启动子序列在一个位置上不同于运动发酵单胞菌菌株CP4(SEQ ID NO：1)的Pgap公布序列：在-21位置后缺失1个碱基(T)，朝着GAP编码区的ATG起始密码子的5’末端起始上游计算。该序列变化不导致ZW641的Pgap和ZW658的Pgap之间的任何表达差异，因为它存在于两个菌株中。除了该共有改变外，在ZW641和ZW658的Pgap序列之间还存在单碱基对差异。在针对来自ZW641菌株的序列中的XylA编码区起始ATG的-189位上的G被在来自ZW658的序列中的T置换。发现两个序列之间无其他改变，由于在GAP启动子区域的单碱基变化，表达水平的改变可导致在该启动子控制下由基因编码的两个蛋白的酶活性提高似乎是可能的。

实施例5

构建具有驱动运动发酵单胞菌ZW641中XylA/B操纵子的相同 Pgap的运动发酵单胞菌木糖异构酶表达载体

赋予奇放线菌素抗性并在运动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶(pZB188/aada-GapXylA；其中Gap提供启动子)的质粒构建体如下所述生成，使用大肠杆菌/运动发酵单胞菌穿梭载体(pZB188)作为原料(图6A)。pZB188构建涉及的步骤公开于US 5,514,583中。简而言之，这一7008bp的质粒能够在大肠杆菌和运动发酵单胞菌中复制，因为它具有两个不同的复制起点，分别用于各个细菌菌种。pZB188也包含赋予四环素抗性的DNA片段(即Tc^r-盒)。构建pZB188/aada-GapXylA的第一步是从pZB 188中除去Tc^r-盒并用赋予奇放线菌素抗性的DNA片段置换它(即Spec^r-盒)。为了从pZB188中切除Tc^r-盒，如下文详述用ClaI和BssHII酶切质粒，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得较大载体片段。Spec^r-盒通过使用质粒pHP15578(Cahoon等人，(2003)Nature Biotechnology 21：1082-1087)作模板以及引物1(SEQ ID NO：32)和2(SEQ ID NO：33)进行的PCR生成。质粒pHP15578包含Spec^r-盒的完整核苷酸序列及其启动子，它基于编码3’(9)-O-核苷酸转移酶的Tranposon Tn7 aadA基因(GenBank登录号X03043)的公布序列。

引物1(SEQ ID NO：32

CTACTCATTTatcgatGGAGCACAGGATGACGCCT

引物2(SEQ ID NO：33)

CATCTTACTacgcgtTGGCAGGTCAGCAAGTGCC

引物1(正向引物)的用下划线标示的碱基与Spec^r-盒的启动子上游杂交(GenBank登录号X03043的nts 4-22)，而小写字母对应于加到引物5’末端的ClaI位点。引物2(反向引物)的用下划线标示的碱基与Spec^r盒的终止密码子下游的约130个碱基杂交(GenBank登录号X03043的nts 1002-1020)，而小写字母对应于加到引物5’末端的AflIII位点。1048bp的PCR生成的Spec^r-盒用ClaI和AflIII进行双重消化，所得DNA片段使用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen，目录号28104)，按照制造商推荐的规程进行纯化。在下一步骤中，质粒pZB188(为了获得非甲基化质粒DNA用于ClaI酶切，从大肠杆菌SSC110(dcm^-，dam^-)中分离，该质粒DNA对dam甲基化敏感)用ClaI和BssHII进行双重消化以除去Tc^r-盒，所得较大载体片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将该DNA片段和纯化的PCR产物连接到一起，并且将转化反应混合物导入大肠杆菌JM110中，使用获取自Stratagene的化学感受态细胞(目录号200239)。注意BssHII和AflIII生成相容的“粘性末端”，但是当它们连接到一起时两个位点被破坏。将转化子置于包含奇放线菌素(100μg/mL)的LB培养基上并在37℃下生长。包含具有适宜大小插入序列的质粒的抗奇放线菌素转化体通过NotI限制性消化分析进行鉴定，并且选择用于进一步操纵的质粒下文称为pZB188/aadA。图6B显示该构建体的环状示意图。

在下一步骤中，在用两种酶酶切后者并通过琼脂糖凝胶电泳纯化大载体片段之后将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入pZB188/aadA的NcoI和AclI位点之间。用作大肠杆菌木糖异构酶表达盒的～2Kbp DNA片段通过用NcoI和ClaI酶切后一个构建体并通过琼脂糖凝胶电泳纯化相关的DNA片段从质粒pZB4中分离。质粒pZB4在US 5514583中详述，并且大肠杆菌木糖异构酶表达盒PgapXylA(SEQ ID NO：34)的示意图在图6D中的框图中显示。

包含大肠杆菌木糖异构酶表达盒的片段在其5’和3’末端分别具有NcoI位点和ClaI位点。如US 5514583所详述，该片段包含强组成型运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子(nts 316-619)，该启动子精确稠合到编码木糖异构酶的大肠杆菌xylA开放阅读框(nts620-1942)的完整开放阅读框上。它也包含小茎-环区域，该区域紧接木糖异构酶终止密码子(nts 1965-1999)。在标准连接反应中将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入pZB188/aadA的NcoI和AclI位点之间。注意ClaI和AclI生成相容的“粘性末端”，但是当它们连接到一起时两个位点被破坏。然后将连接反应混合物电穿孔进入大肠杆菌SSC110(dcm^-，dam^-)以获得非甲基化质粒DNA用于随后的运动发酵单胞菌转化，并且将转化细胞置于包含100μg/mL的奇放线菌素的LB培养基上；在37℃下生长。具有带适宜大小插入序列的质粒的抗奇放线菌素转化体通过NotI、NcoI和AclI的限制性消化分析进行鉴定。选择质粒用于在运动发酵单胞菌ZW641菌株中进一步操纵和超表达大肠杆菌木糖异构酶，该质粒下文称为“pZB188/aadA-641GapXylA”；图6C显示该质粒构建体的环状示意图。

重要的是注意到SEQ ID NO：34的核苷酸序列不同于在共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870和US20080187973中的SEQ ID NO：34中描述的核苷酸序列，甚至即使它对应于相同大肠杆菌木糖异构酶表达盒(PgapXylA)。在本工作的SEQ ID NO：34中公开的DNA序列缺失在Pgap中缺失1-bp，它对应于在美国专利申请公布US20080286870和US20080187973中的SEQ ID NO：34的nt 599。在较早的专利申请中报道的核苷酸序列基于运动发酵单胞菌菌株CP4的Pgap的公布DNA序列(Conway等人，J.Bacteriol.169(12)：5653-5662(1987))，并且启动子那时不再进行重新测序。然而最近我们已经发现pZB4中的Pgap也缺失相同核苷酸，并且用于所有三个专利申请的大肠杆菌木糖异构酶表达盒(PgapXylA)来源于上文提到的质粒。

实施例6

生成具有驱动运动发酵单胞菌ZW658和ZW801-4中XylA/B操纵子的相同Pgap的大肠杆菌木糖异构酶表达载体

质粒pZB188/aadA-801GapXylA与pZB188-aada-641GapXylA(图6C)相同，不同的是在Pgap中有一个单bp取代，它对应于存在于驱动ZW658中的大肠杆菌XylA/B操纵子表达的Pgap中的-189位上的G-＞T突变。该相同点突变也存在于菌株ZW800和ZW801-4中，它们如下所述相继来源于ZW658。ZW800和ZW801-4的构建和表征详述于共有的和共同未决的美国专利公布US20080286870。ZW800是ZW658的衍生物，ZW658在编码葡萄糖-果糖氧化还原酶(GFOR)的序列中具有奇放线菌素抗性盒的双交叉插入序列，它灭活该活性。ZW801-4是ZW800的衍生物，其中奇放线菌素抗性盒通过位点特异性重组去除，留下过早截短蛋白的框内终止密码子。这些操纵不改变突变驱动ZW658中的XylA/B操纵子的Pgap启动子核苷酸序列。因此“801GAP启动子”指存在于以下菌株中的启动子序列：ZW658、ZW800、和ZW801-4。

该步骤和用于生成pZB 188/aadA-801GapXylA的质粒中间体在下文中以时间顺序描述，从质粒pMOD-Linker开始。

构建pMOD-linker

质粒pMOD-Linker的前体是pMOD^TM-2<MCS>转座子构建载体(目录号MOD0602)，它可从

商购获得。如图7A所示，pMOD^TM-2<MCS>具有氨苄青霉素抗性基因(ampR)、大肠杆菌复制起点(ori)、和位于Tn5转座酶相互作用的两个嵌合末端(ME)之间的多克隆位点。构建pMOD-Linker的第一步是除去pMOD2-<MCS>中的起始多克隆位点并用新的多克隆位点置换它，新的多克隆位点具有AsiSi、FseI和SbfI的唯一限制性位点。这通过用EcoRI和HindIII酶切质粒并通过琼脂糖凝胶电泳纯化大(约2.5Kbp)载体片段完成。然后将两个合成寡核苷酸一起退火生成新的多克隆位点，这两个寡核苷酸是5’末端均被磷酸化的连接子B(SEQ ID NO：35)和连接子T(SEQID NO：36)。

连接子B(SEQ ID NO：35)：

aattCTACCTGCAGGAGTA

ATGA

A

连接子T(SEQ ID NO：36)：

agctT

TCATTACTCCTGCAGGTAG

这些寡核苷酸是彼此互补的，并且当一起退火形成在两端(小写字母)具有单链突出部分双链连接子时，允许DNA片段在上述大pMOD^TM-2<MCS>载体片段的EcoRI和HindIII位点之间连接。如上所述该合成连接子也包含三个唯一的限制性位点(AsiSi、FseI和SbfI)，它们可用于随后的克隆步骤。SbfI位点用细线进行下划线标示，FseI位点用粗线进行下划线标示，而AsiSI位点用两条细线进行下划线标示。连接子B和连接子T一起进行退火，将所得DNA片段通过标准连接反应插入pMOD^TM-2<MCS>的EcoRI和HindIII位点之间。将连接反应混合物用于转化大肠杆菌DH10B并将转化细胞置于包含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上。然后从包含新的多克隆位点的代表性抗氨苄青霉素菌落中分离质粒DNA。所得质粒构建体(下文称为“pMOD-Linker”)的环状示意图如图7B所示。

构建pMOD-Linker-Spec

将赋予奇放线菌素(Spec^r)抗性并在两个末端具有野生型loxP位点的DNA片段插入上述pMOD-Linker构建体的AsiSI和FseI位点之间。loxP-侧接Spec^r盒的来源是质粒pLDHSp-9WW(图8)，该质粒详述于美国专利申请11/862566中。在第一步骤中，MOD-Linker质粒DNA连续用FseI和AsiSI消化，并且使用DNA Clean & ConcentratorTM-5离心柱试剂盒纯化大载体片段，该试剂盒购自Zymo ResearchCorporation(目录号DO4003)。接下来，质粒pLDHSp-9WW也用相同两种酶进行双重消化，并且包含loxP-侧接Spec^r盒的小(约1.1Kbp)DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将受关注的两个DNA片段连接到一起，并且使用电穿孔将转化反应混合物导入大肠杆菌DH10B中。将转化体置于LB培养基上，该培养基包含氨苄青霉素(100μg/mL)和奇放线菌素(100μg/mL)并在37℃下生长。然后从其中一个抗氨苄青霉素菌落中分离质粒DNA，所述菌落包含具有合适大小的DNA片段并且被用于随后的操纵。该构建体(下文称为“pMOD-Linker-Spec”)的环状示意图如图7C所示。

构建pMOD-Linker-Spec-801GapXylA和pMOD-Linker-Spec- 641GapXylA

包含完整Pgap、XylA编码区、和位于XylA和XylB开放阅读框之间的茎-环区域的DNA片段使用引物3和4(分别是SEQ ID NO：37和38)并用重悬细胞作模板，从ZW801-4通过PCR扩增得到。如上所述，DNA序列分析已经显示ZW801-4在Pgap启动子中的-189位上具有相同G-＞T点突变，该启动子驱动ZW658整合大肠杆菌XylA/B操纵子的表达并且Pgap在两个菌株中是相同的。

引物3(SEQ ID NO：37)

TCACTCATggccggccGTTCGATCAACAACCCGAATCC

引物4(SEQ ID NO：38)

CTACTCATcctgcaggCCGATATACTTATCGATCGTTCC

引物3(正向引物)的用下划线标示的碱基与Pgap的最前面的22个碱基杂交(SEQ ID NO：34的nts 316-337，而小写字母对应于加到引物5’末端的FseI位点。引物4(反向引物)的用下划线标示的碱基与在XylA终止密码子之后的茎-环区域下游杂交(SEQ ID NO：34的最后12个nts)，而小写字母对应于加到引物5’末端的SbfI位点。

PCR产物用FseI和SbfI进行双重消化，并且用DNA Clean &ConcentratorTM-5离心柱试剂盒纯化，该试剂盒购自Zymo ResearchCorporation(目录号DO4003)。接下来，用相同的两种酶酶切质粒pMOD-Linker-Spec并用相同方法纯化所得大载体片段。然后将受关注的两个DNA片段连接到一起，并且使用电穿孔将转化反应混合物导入大肠杆菌DH 10B中。将细胞置于LB培养基上，该培养基包含氨苄青霉素(100μg/mL)和奇放线菌素(100μg/mL)并在37℃下生长。包含具有合适大小插入序列的质粒的转化体通过PCR进行鉴定，使用引物3和4并用重悬菌落作模板(“菌落PCR”)。下文把选择用于进一步操纵的质粒称为pMOD-Linker-Spec-801GapXylA，并且该构建体的环状示意图如图9所示。

使用上述相同步骤生成称为“pMOD-Linker-Spec-641GapXylA”的另一个质粒，不同的是用于PCR-扩增Pgap-XylA基因DNA片段的模板是ZW641的细胞悬浮液。pMOD-Linker-Spec-641GapXylA和pMOD-Linker-Spec-801GapXylA是相同的，不同的是在区别ZW658(以及ZW801-4)与ZW641的Pgap中的G-＞T取代。

构建pZB188-aadA-801GapXylA

如实施例6第一段所述，pZB188-aadA-801GapXylA是运动发酵单胞菌的大肠杆菌木糖异构酶表达载体，它与pZB188-aadA-641GapXylA相同，但是它在驱动ZW658(和ZW801-4)中整合Pgap-XylA/B操纵子表达的Pgap中具有相同的G-＞T取代。为了构建该质粒，pMOD-Linker-Spec-801GapXylA(图10A)用MluI和SalI进行双重消化，并且用琼脂糖凝胶电泳和Zymoclean Gel DNA Recovery试剂盒(catalog #D4001，Zymo Research)纯化较小的DNA片段(约1100bp)。该片段包含Pgap G-＞T取代和部分XylA ORF，并且在用相同两种酶酶切后一个构建体并用琼脂糖凝胶电泳纯化大载体片段后，被用于置换pZB188-aadA-641GapXylA(图10B)中的对应片段。然后将受关注的两个片段连接到一起，并且使用电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B中。将转化子置于包含奇放线菌素(100μg/mL)的LB培养基上并在37℃下生长。从抗奇放线菌素菌落中分离质粒DNA，并且通过DNA序列分析确认存在Pgap启动子的G-＞T取代。用于随后的操纵的质粒(“pZB188-aadA-801GapXylA”)如图10C所示。

实施例7

超表达ZW641中的大肠杆菌木糖异构酶

表I中的酶活性测量显示木糖异构酶和木酮糖激酶活性在从ZW641转变成ZW658期间显著提高。为了验证木糖异构酶是ZW641中用于在木糖上生长的限速酶这一假设，该酶使用多拷贝质粒pZB188/aadA-641GapXylA(图6C)在这一菌株中过表达。该实验的对照是用多拷贝质粒pZB188/aadA转化的ZW641，它缺失Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达盒(图6B)。这两个质粒的构建如实施例5所述，并且转化规程基本上如共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080187973的实施例5所述。简而言之，使用电穿孔将非甲基化质粒DNA(从大肠杆菌SSC110中分离，它是dcm^-和dam^-菌株)导入ZW641，并且将转化细胞置于包含200μg/mL奇放线菌素的LB培养基上。在30℃的厌氧条件下生长48小时后，随机选择每个质粒的三个初级转化体，并且将这些转化体斑片接种(转移)到包含相同生长培养基的琼脂平板上进行进一步表征。

图11示出包含641Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达质粒(X1、X2和X2)的三个菌株和包含对照质粒(C1、C2和C3)的三个菌株在包含木糖的培养基中的生长曲线(OD600对时间)。该实验在30℃下在摇瓶(在15mL管中的5mL培养物，转速150rpm)中进行，并且生长培养基是mRM3-X10(10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO₄，1g/L MgSO₄和100g/L木糖)，它也包含奇放线菌素(200μg/mL)。培养物以来自上文段落所述的斑片平板的一接种环细胞开始，并且在各种情况下的初始OD600为约0.13。类似于ZW641，具有对照质粒的三个菌株几乎不能在木糖上生长。在标记的对照中，当ZW641用641Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达质粒pZB188/aadA-641GapXylA转化时，在木糖上的生长速率和生长程度(最终OD600值)都发生了显著改善。因为在实验中具有该质粒的所有三个菌株表现相同，如图11所示，仅仅X1菌株和C1菌株进行进一步表征。

图12示出在包含无奇放线菌素的生长培养基的相同木糖上的ZW641、ZW658、X1和C1并列型比较。该实验的条件与那些上述条件相同，不同的是20mL培养物在50mL管中生长，并且初始OD600低约4-倍(0.035)。为了比较指数生长速率，图12A中显示的生长曲线以线性标度作图(OD600对时间)，而图12B示出以对数标度(logOD600对时间)作图的相同实验数据。从该实验中明显的看出X1的指数生长速率几乎与木糖适应菌株ZW658一样快，并且该菌株在木糖上比具有或不具有对照质粒的亲本菌株ZW641生长地好得多。因此，木糖异构酶在ZW641中的高表达(由来自多拷贝质粒的641Pgap启动子驱动)对在木糖上生长具有的效应与木糖异构酶活性提高对ZW658(如表1所示)具有的效应相似。尽管X1的最终生物质产量比用ZW658获取的生物质产量低约2倍，从该数据中清楚地看出ZW641中的木糖生长限速酶是木糖异构酶。在图11和12中显示的该实验进一步说明两个其他的令人感兴趣的可能性：(1)发生在ZW641转变成ZW658(表I)期间的木糖异构酶活性的较大提高很大程度上是发生在“木糖适应”过程中的较好的木糖上生长的原因；和(2)木糖异构酶活性的提高可能已经由Pgap启动子中的G-＞T取代产生，该启动子驱动存在于ZW658中的染色体整合的Pgap-XylA/B操纵子的表达。

实施例8

转座子介导的ZW641中的大肠杆菌木糖异构酶整合

ZW641和两个质粒构建体(pMOD-Linker-Spec-801GapXylA和pMOD-Linker-Spec-641GapXylA)用于验证以下假设：具有G-＞T取代并且驱动ZW658中整合XylA/B操纵子表达的Pgap启动子(下文称为“801GAP启动子”)强于ZW641中对应启动子(下文称为“641GAP启动子”)。选择ZW641用于这些实验是因为其几乎不能在木糖上生长，并且因为在该菌株中木糖异构酶的超表达导致在木糖上的较快生长(实施例7、图11和12)。基本的想法是将一拷贝的大肠杆菌木糖异构酶基因(由641GAP启动子或801GAP启动子驱动)额外导入ZW641的染色体并检验那个构建体将导致在木糖上的较快生长。使用Epicentre转座体技术完成两个嵌合基因的染色体整合。

已经指出的是：pMOD-Linker-Spec-641GapXylA和pMOD-Linker-Spec-801GapXylA是相同的质粒，不同的是在后一个构建体中的Pgap启动子中存在G-＞T点突变。在两种情况下用于随机插入DNA的转座元件由两个19-bp的嵌合末端(ME)和位于它们之间的完整DNA片段组成。如图9所示，该元件称为转座子，它包含奇放线菌素抗性盒(Spec^r)和下游的Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达盒。用于形成转座体的规程基本上与Epicentre说明书手册中描述的用于EZ::TN^TMpMOD^TM-2<MCS>Transposn Construction Vector(目录号MOD0602)的规程相同。8-μL反应液包含1.5μL不含Mg⁺⁺离子的、5’-磷酸化的、钝化末端转座子DNA(约250ng/μL)、4μL的EpicentreEZ::TN转座酶和2.5μL 80％(v/v)甘油。对照转座体反应混合物是相同的，不同的是4μL无菌水取代了转座酶。该反应在室温下孵育30分钟，然后转移到4℃孵育2-至7-天，这段时间是慢速异构化步骤所需的，该异构化步骤导致形成活性转座体；使用该程序转座体在-20℃下稳定至少3个月。

基本上使用与US 5,514,583所述的转化规程相同的转化规程使转座体通过电穿孔进入ZW641。简而言之，40-μL转化反应物包含在10％(v/v)甘油中的约10¹⁰个细胞/mL，1μL Epicentre TypeOne^TMRestrictionInhibitor(目录号TYO261H)和1μL对照或转座体反应混合物。电穿孔仪的设置是1.6kv/cm，200Ω，25μF，比色杯的间隙宽度为0.1cm。在电穿孔之后，转化反应用1.0mL的MMG培养基稀释(50g/l的葡萄糖，10g/l酵母的提取物，5g/l的蛋白胨，2.5g/l的(NH₄)₂SO₄，0.2g/lK₂HPO4，和1mM MgSO₄)，并且允许细胞在30℃下恢复约3小时。然后在室温下，在无菌的1.5mL微量离心管中离心收获细胞(13,000Xg，5分钟)，小心地移除上清液。将细胞沉淀物重悬于200μL的液体MMG培养基中，并且将每个细胞悬浮液的100-μL等分试样置于MMG培养基上，该培养基包含1.5％的琼脂和200μg/mL奇放线菌素。在30℃厌氧条件下孵育72小时后，3个菌落位于对照平板上，13个菌落位于641GapXylA转座体平板上并且18个菌落位于801GapXylA转座体平板上。随机选择来自转座体平板的六个菌落进行进一步表征，并且将这些菌落斑片接种到琼脂平板上，该平板包含MMX培养基和200μg/mL奇放线菌素；生长条件如上所述。MMX培养基与MMG培养基相同，不同的是它包含50g/L的木糖而不是葡萄糖。在加上奇放线菌素的新鲜MMX平板上生长两轮后，在木糖上生长最好的六个菌株(每个转座体三个)用于下文所述的实验。

图13A示出三个ZW641菌株的线性生长曲线，所述菌株在包含木糖的培养基中具有641Gap-XylA转座体(#6-1、#6-3和#6-5)并且三个接受801Gap XylA转座体(#8-2、#8-4和#8-5)。相同数据以对数标度绘制在图13B中。该实验在30℃下在摇瓶(在15mL管中的7mL培养物，转速150rpm)中进行，并且生长培养基是mRM3-X10(10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO₄，1g/L MgSO₄和100g/L木糖)。培养物以来自上文所述的斑片平板的一接种环细胞开始，并且初始OD非常相似(约0.02-0.03)。该实验的对照是木糖适应菌株ZW658，它在Pgap中具有G-＞T取代，该启动子驱动染色体整合大肠杆菌XylA/B操纵子。

类似于亲本菌株(ZW641)，具有额外染色体整合拷贝的641GapXylA表达盒的三个菌株在包含木糖的培养基中生长非常差，尽管显然有一些生长速率和生物量(OD600)的微小改善，尤其是菌株#6-5(比较图12A和图13A)。与之相反，获取的具有801GapXylA转座子的所有三个菌株比亲本菌株在木糖上生长好得多(图13A和13B)。事实上，两个转化体(#8-4和#8-5)与包含多拷贝质粒pZB188/aadA-GapXylA的ZW658和ZW641转化体在糖上生长几乎一样好，所述质粒包含641GapXylA表达盒(比较图12和图13)。因为转座是随机事件并且所有六个菌株具有插入染色体不同位置的641GapXylA或801GapXylA表达盒，在使用相同转座体的实验中观察到的外源基因表达的差异可能是由于位置效应。例如位置效应可说明为什么#6-5比#6-1和#6-3生长地更好，以及为什么#8-2比#8-4和#8-5生长地更差。然而尽管分析了较小的种群，图13中显示的结果强烈支持这一观点：存在于驱动ZW658和ZW801-4中XylA/B操纵子的大肠杆菌Pgap启动子中的G-＞T突变是与亲本菌株ZW641相比，在这些菌株中观察到的更高木糖异构酶活性和更好的木糖上生长状况的原因。

实施例9

801GAP启动子在运动发酵单胞菌中引导的核糖5-磷酸异构酶表达水平比641GAP启动子更高

如果801GAP启动子确实是比641GAP启动子更强的启动子，它对表达的刺激效应应该不受大肠杆菌木糖异构酶基因的限制，并且还将期望具有这一启动子的其他蛋白的表达增加。为了证实这一重要的论点，将编码核糖5-磷酸异构酶(RPI)的运动发酵单胞菌基因与两个启动子稠合，并且将该嵌合基因插入在运动发酵单胞菌中复制的多拷贝质粒中。将所得Pgap-RPI表达质粒(pZB188/aadA-641GapRPI和pZB188/aadA-801GapRPI)导入运动发酵单胞菌并且通过SDS-PAGE如下所述分析RPI表达水平。

构建pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL

质粒pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL是在两个Pgap-RPI表达质粒的构建中重要的中间体，所述质粒被用于本发明。如图14所示，这一质粒包含运动发酵单胞菌核糖5-磷酸异构酶(RPI)基因的表达盒，所述基因位于唯一的NcoI和XhoI位点之间。使用下述的重叠PCR技术生成RPI表达盒，该表达盒是包含全长641GAP启动子序列(SEQ IDNO：34的nts 316-619)和运动发酵单胞菌RPI基因的完整开放阅读框的嵌合基因。RPI ORF对应于运动发酵单胞菌基因组(GenBank登录号AE008692)的nts 1224730-1225203，并且将RPI的起始密码子直接稠合到641GAP启动子的3’-末端。

641Gap启动子的模板是pZB188/aadA-641GapXylA，并且使用引物5和6(分别是SEQ ID NO：39和40)在PCR反应中从该质粒扩增320-bp的DNA片段。所得PCR产物包含641GAP启动子和连接到其以GTG起始密码子开始的3’-末端上的运动发酵单胞菌RPI ORF的前15bp。该片段在其5’-末端(小写字母)还具有唯一的NcoI位点，该位点被加到引物5的5’-末端上用于克隆目的。

引物5(SEQ ID NO：39)

CATGccatggGAGCTCGTTCGATCAACAACCCGAATCCTA

引物6(SEQ ID NO：40)

CACAGCAGAGGTCACGTTTATTCTCCTAACTTATTAAGTAGC

在单独的PCR反应中，使用引物7和8(分别是SEQ ID NO：41和42)生成473-bp的片段，该片段包含天然运动发酵单胞菌RPI基因的完整ORF。用于扩增的模板是从运动发酵单胞菌菌株ZW801-4中分离的基因组DNA。注意引物7的5’-末端具有15bp的重叠序列，它能够杂交到320-bp的641GAP启动子片段的3’-末端，并且将XhoI位点(小写字母)加到引物8的5’-末端用于克隆目的。

引物7(SEQ ID NO：41)

GTTAGGAGAATAAACGTGACCTCTGCTGTGCCATCAAA

引物8(SEQ ID NO：42)

CCGctcgagCTAGATATTGAACTGAGGATTCGAAA

然后使用引物5和8(分别是SEQ ID NO：39和42)使得上述两个片段经受重叠PCR反应，并且这一操纵导致产生RPI表达盒。后者是一个778-bp的片段，它包含直接稠合到运动发酵单胞菌RPI ORF的起始密码子上的641GAP启动子。然后用NcoI和XhoI酶切PCR产物，并将所得片段插入最终来源于pZB 188/aada-641GapXylA(图6C)的质粒的NcoI和XhoI位点以产生最终产物pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL(图14)。重要的是注意到该质粒是运动发酵单胞菌的RPI表达载体，它也包含存在于大肠杆菌XylA/B操纵子基因间区域中的茎-环区域，并且该稳定元件正好位于RPI终止密码子下游的XhoI和NotI位点之间。在质粒pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL(包括XylA茎-环结构)中的RPI表达盒的核苷酸序列在SEQ ID NO：43在公开。显示的核苷酸序列对应于位于NcoI和NotI位点间的DNA片段，并且包括两个限制性位点。

pZB188/aadA-641GapRPI和pZB188/aadA-801GapRPI的构建

pZB188/aadA-641GapRPI和pZB188/aadA-801GapRPI是运动发酵单胞菌的Pgap-RPI表达质粒，它们是相同的，不同的是后一个构建体具有区分801GAP启动子和641GAP启动子的G-＞T取代。使用来源于pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL的1240-bp的DNA片段将pZB188/aadA-641GapXylA(图6C)转化成pZB188/aadA-641GapRPI(图15B)并将pZB188/aadA-801GapXylA(图10C)转化成pZB188/aadA-801GapRPI(图15C)。通过用AsiSI和NheI酶切pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL生成这一条DNA，并且通过琼脂糖凝胶电泳纯化较小的片段。如图15A所示，pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL具有唯一的AsiSI和NheI限制性位点，并且在pZB188/aadA-641GapXylA和pZB188/aadA-801GapXylA中也存在相同位点。注意AsiSI在Pgap下游从区分801GAP启动子和641GAP启动子的G-＞T取代开始裂解全部这三个质粒，而NheI从XylA或RPI终止密码子下游约700bp酶切质粒主链。因此从pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL中获取的1240-bp的DNA片段包含小的DNA片段，641Gap启动子和801Gap启动子共有整个RPI开放阅读框和稳定XylA茎-环区域。

在构建pZB188/aadA-641GapRPI和pZB 188/aadA-801GapRPI的下一步骤中，在用AsiSI和NheI酶切这两个质粒并纯化较大的载体片段后，在两个单独的连接反应中将上述1240-bp DNA片段插入在pZB188/aadA-641GapXylA和pZB188/aadA-801GapXylA中的AsiSI和NheI位点之间。使用电穿孔将两个连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B中，并且将转化体置于包含奇放线菌素(100μg/mL)的LB培养基上；在37℃下生长。最后从菌落中分离pZB 188/aadA-641GapRPI(图15B)和pZB188/aadA-801GapRPI(图15C)质粒DNA，所述菌落包含正确的构建体(通过DNA序列分析确认)，然后将两个质粒导入大肠杆菌SCS110(dam-，dcm-)以生成非甲基化质粒DNA用于转化运动发酵单胞菌。

具有641GAP启动子和801GAP启动子的RPI的表达

使用电穿孔和非甲基化质粒DNA将上述两个Pgap-RPI表达载体(pZB188/aadA-641GapRPI和pZB188/aadA-801GapRPI)导入野生型运动发酵单胞菌菌株ZW1。转化过的细胞在30℃下，在1.5％琼脂平板上厌氧生长，所述琼脂平板包含MMG培养基(50g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，5g/L蛋白胨，2.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.2g/L K₂HPO₄，和1mM MgSO₄)和200μg/mL奇放线菌素。将两个包含641GAP-RPI质粒(641gapRpi#1和641gapRpi#2)的随机选择的菌落和两个包含801GAP-RPI质粒(801gapRpi#1和801gapRpi#2)的随机选择的菌落斑片接种到包含相同生长培养基的1.5％琼脂平板上，并且在厌氧条件下，在30℃培养所述平板约24小时。该平板用于启动用于RPI表达实验的种子培养物。

种子培养物开始于一接种环细胞并且在30℃(150rpm)，在包含5mL MMG培养基和奇放线菌素(200μg/mL)的15mL加帽管中生长。该实验的对照物(亲本菌株ZW1)在相同条件下生长，但是生长培养基缺少奇放线菌素。允许种子培养物达到饱和，然后使用上述相同生长培养基和条件，在50mL加帽管中开始培养20mL培养物。在所有情况下初始OD600值为约0.12。在指数生长期(OD600约1.1)通过离心(15,000×g，10分钟)收获培养物的等分试样(500-μL)，并且将细胞沉淀物重悬在250μL 1X SDS-PAGE样本缓冲液中。电穿孔的所有试剂从Invitrogen获取。一毫升1X SDS-PAGE样本缓冲液包含250μLNuPAGE^TM LDS 4X样本缓冲液(目录号N0007)、100μL NuPAGE^TM样本还原剂(Cat.No.NP0004)和650μL蒸馏水。将样本在80℃加热10分钟，通过离心除去颗粒碎片(15,000×g，10分钟)。然后澄清样本(20μL)的等分试样进行SDS-PAGE，使用NuPAGE^TM12％Bis-Tris凝胶(目录号NP0341)和NuPAGE^TMMES SDS Running Buffer(目录号NP0002)，按照制造商推荐的规程处理还原样本。凝胶在室温下，在恒定电压(180V)下电泳约1小时，并且按照制造商推荐的规程用Invitrogen SimplyBlue SafeStain(目录号LC6060)染色。

按开放阅读框的DNA序列计，运动发酵单胞菌RPI蛋白的分子量是16927.37Da。如图16所示，亲本菌株ZW1(泳道2和7)的若干个轻度染色的蛋白条带在聚丙烯酰胺凝胶中迁移到这个区域(即介于17kDa和19kDa分子量标准品之间)。凝胶的视觉检查揭示当将641GAP-RPI表达质粒导入ZW1(泳道3和5)时，其中一个染色条带(用箭头指示)的强度提高了至少2倍，指示这是RPI蛋白。此外在图12中非常明显的是，就具有801GAP-RPI表达质粒(泳道4和6)的两个菌株而言，运动发酵单胞菌RPI条带的强度显著提高。这些结果提供了801GAP启动子是比648GAP启动子更强的启动子的有力证据，并且后者是以非常高的水平表达外源基因的有用工具。

实施例10

木糖利用运动发酵单胞菌的独立适应木糖菌株的转基因GAP启动子区的酶活性和序列比较

因为菌株8b(实施例1和美国专利申请公布20030162271)使用与ZW658相似的基因导入和菌株适应过程获取，戊糖磷酸途径的转基因活性和PgapxylAB操纵子的序列也与该独立菌株生产的较充分适应菌株进行部分比较。在部分适应菌株8XL4和最终适应菌株8b中的PgapxylAB操纵子的产物酶活性使用如一般方法所述的技术进行测量，并且结果以微摩尔产物/mg蛋白/分钟表示，如表2所示。

表2：在不同木糖利用的适应运动发酵单胞菌菌株中的酶活性

菌株	木糖异构酶	木酮糖激酶
			8XL4	0.027+/-0.004	1.10+/-0.41
8B	0.142+/-0.057	5.76+/-0.43

正如当前述ZW658菌株发生促进在木糖上生长的突变时发生的适应一样，菌株8b在xylAB操纵子中的两个基因的产物具有比其前体菌株8XL4的产物更高的活性。测量的酶活性的再一次提高与不适应菌株相比提高了约5倍。

引导xylAB操纵子表达的Pgap在8b和8XL4菌株中测序。使用来自启动子5’末端的正向PCR引物(GAP-F8；SEQ ID NO：44)和来自xylA编码区(XylAB851R；SEQ ID NO：5)的反向引物制备PCR片段。所得PCR产物使用引物GAP-F8、XylAB449R、和XylAB851R(SEQID NO：44、46、和45)进行测序。来自ZW8XL4的启动子序列是SEQID NO：3，来自8b的启动子序列是SEQ ID NO：5。这些启动子序列也都与菌株CP4的Pgap公布序列具有一个差异，如同在ZW641和ZW658中的xylAB操纵子的Pgap一样。除了这些共有改变外，在ZW641和ZW658的Pgap序列之间还存在单碱基对差异。当在相对于起始ATG的-189位上的G变成T的改变不存在于8XL4和8b的比较中时，在相对于起始ATG的-89位上不发生C变成T的改变。

正如在菌株ZW658中的PgapxylAB操纵子的启动子序列一样，在菌株8b中的PgapxylAB操纵子的启动子序列在适应新序列期间改变，所述新序列允许在其控制下比在来自部分适应菌株的相同启动子的序列控制下从编码区产生更多的蛋白。