JP4510355B2 - 安定なチモモナスモビリスのキシロースおよびアラビノース醗酵株 - Google Patents
安定なチモモナスモビリスのキシロースおよびアラビノース醗酵株 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4510355B2 JP4510355B2 JP2001580393A JP2001580393A JP4510355B2 JP 4510355 B2 JP4510355 B2 JP 4510355B2 JP 2001580393 A JP2001580393 A JP 2001580393A JP 2001580393 A JP2001580393 A JP 2001580393A JP 4510355 B2 JP4510355 B2 JP 4510355B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mobilis
- plasmid
- xylose
- transformed
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
米国政府は、米国エネルギー省とミッドウエスト リサーチ インスティチュートとのあいだの契約番号DE−AC36−99GO10337に基づいて、本発明に対して権利を有している。
【0002】
[本発明の分野]
本発明は、セルロース基質の燃料および薬物への生物学的変換、および詳細には、キシロースおよびアラビノースまたは双方を醗酵してエタノールにする組換え体チモモナス モビリス(Zymomonas mobilis)株に関する。
【0003】
[本発明の背景]
醗酵技術は、再生バイオマスセルロース基質をエタノールなどの燃料および薬物に変換するために有用である。典型的な基質は、35〜45%セルロース、30〜40%ヘミセルロースおよび15%リグニンからなる。加水分解画分はグルコースポリマーを含有し、ヘミセルロース画分は主にキシロースを含有する。アラビノースもまた、スイッチグラス草(switchgrass grass)および穀物繊維(corn fiber)などのバイオマス材料において見出された重要な醗酵基質である。このように、ペントース糖の醗酵において高率の特異的な産物形成および変換効率を達成することは、再生基質から燃料および薬物の商業的産生に不可欠である。
【0004】
Z.モビリスは、低いpH、嫌気培養で、かつ通常はリグノセルロースヒドロライセート(lignocellulose-hydrolysate)に結合する阻害化合物を含有する培地において、速くかつ効率的にグルコース基質をエタノールに変換するその能力に関して、広く報告されている。しかしながら、Z.モビリスの使用において明らかに不利な点は、ペントース糖を醗酵しないことである。この不利な点を解消するために、先行技術は、キシロースおよびアラビノースの代謝を触媒する外因性遺伝子を用いることによるグルコース、ならびにキシロースもしくはアラビノース、または双方の混合物を醗酵する組換え体Z.モビリス株に集中している。それらの株、およびクローニングベクターは、抗生物質耐性マーカーを有する複数コピープラスミド(multiple-copy plasmids)の使用に基づく。
【0005】
米国特許第5,514,583号明細書は、外因性遺伝子を有する形質転換したZ.モビリスキシロース醗酵株(CP4/pZB4およびpZB5)、ならびにキシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ(xylulokinase)、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードし、チモモナスにより認識され該遺伝子の少なくとも1つの発現を制御する少なくとも1つのプロモーター(PgapおよびPeno)をさらに含むプラスミドベクター(pZB4およびpZB5)を開示する。その微生物は、唯一の炭素源としてのキシロースで増殖することができ、約88%の最大理論収率で、キシロースを醗酵してエタノールにすることができる。その特許は、組み込まれた株を特許請求の範囲とする。
【0006】
米国特許第5,712,133号明細書および同第5,726,053号明細書は、とりわけ、アラビノースからエタノールへの醗酵能を与えるL−アラビノースイソメラーゼ、L−リブロキナーゼ(L-ribulokinase)およびL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼならびにトランスケトラーゼをコードする外因性遺伝子を含有するZ.モビリスアラビノース醗酵形質転換体(39676/pZB206)を開示する。プラスミドベクター(pZB206)、ならびに、グルコースおよびアラビノースを含有する基質の醗酵のための形質転換体の使用方法もまた開示されている。その特許は、宿主ゲノムへの外因性遺伝子の組込みを特許請求の範囲とする。
【0007】
米国特許第5,843,760号明細書は、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、L−アラビノースイソメラーゼ、L−リブロキナーゼ、L−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードする外因性遺伝子を含有し、該遺伝子の少なくとも1つの発現を制御しチモモナスに認識される少なくとも1つのプロモーターをさらに含むZ.モビリスのキシロースおよびアラビノース醗酵形質転換体(206C/pZB301)を開示する。該微生物は、アラビノースおよび/またはキシロースの単独または組み合わせを炭素源として増殖することができ、該アラビノースおよびキシロースを醗酵してエタノールにすることができる。その形質転換体をプラスミドベクター(pZB301、pZB401、pZB402およびpZB403)とともに使用する方法もまた、開示される。その特許は、宿主ゲノムへのそれらの外因性遺伝子の組込みを特許請求の範囲とする。
【0008】
ハイブリッドプラスミドは、制御された条件下の単一培養において(in mono-culture)培養するとZ.モビリス中で容易に維持されるが、宿主生物をプラスミド維持のための選択圧力(selection pressure)がないときに、すなわち抗生物質の存在下で増殖させると、ハイブリッドプラスミドはしばしば不安定になる。たとえば、前に引用した株の外因性遺伝子は、約40世代のあいだ安定な発現が可能である。セルロース同時糖化醗酵方法(a cellulose simultaneous-saccharification-fermentation process)などの混合培養においてZ.モビリスがほかの生物と競合しなければならない場合、不安定性は悪化し得る。さらに、抗生物質耐性マーカーは、一般に、エタノールの大量生産などの産業上の利用に不適当であるとされている。したがって、クローン化した遺伝子は、Z.モビリスゲノムに挿入することが好ましく、低い天然のコピー数で維持され、したがって過剰発現されずに、少なくとも理論上は、ゲノムDNAのように安定であるべきである。
【0009】
大腸菌において、外来遺伝子のゲノム挿入をもたらす古典的方法は、溶原化状態で安定に存在し得る特殊化したλファージクローニングベクターの使用を伴う。あるいは、遺伝子は、大腸菌の染色体配列に囲まれると、または遺伝子がトランスポゾンの許容部位にクローン化され得る場合は転位により、相同組換えを介して挿入され得る。転位はZ.モビリスで説明されているが(Pappas, K. M., et al., (1997)チモモナス モビリスでのトランスポゾン突然変異誘発および菌株構築、Journal of Applied Microbiology, Vol. 82, p.p.379-388)、それは、遺伝子解析でランダムな栄養要求性または抗生物質耐性の表現型となるmini−MμまたはTn5多発性転位(multiple transposition)に限定されており、報告によると、Tn5誘導体の場合には挿入が5〜15世代のあいだのみ安定である。Pappas, K. M., et seq. P.383, FIG.1。さらには、Z.モビリスにおける相同組換えを介した部位特異的挿入は説明されておらず、いかなるバクテリオファージもチモモナスから単離されていない。
【0010】
トランスポゾンTn5およびTn10は公知であり、突然変異誘発および様々なグラム陰性細菌へのクローン化DNAの挿入に広く使用されている。Herrero, M. et al.(1990)クローニング用の非抗生物質耐性選択マーカーを含有するトランスポゾンベクターおよびグラム陰性細菌における外来遺伝子の安定な染色体挿入、J. Bacteriol. 172:6557-6567には、2組のプラスミド、(i)Tn10およびTn5の転位特質、(ii)ある種の化合物に対する耐性および(iii)R6KベースのプラスミドpGP704の自殺(suicide)送達特性、を組み合わせることによるクローニングおよびグラム陰性真正細菌染色体への外来遺伝子の安定な挿入のための手法が開示されている。その結果得られる構築物は、Tn10逆方向反復配列またはTn5逆方向反復配列のいずれかの内部に1つのNotIまたはSfiI部位を含有する。それらの部位は、2つのさらなる特殊化したクローニングプラスミドpUC18NotおよびpUC18Sfiの助けをかりて、DNA断片をクローニングするために使用される。その新規に誘導された構築物は、R6KおよびR6K由来のプラスミドにとって必須の複製タンパク質であるR6K特異的πタンパク質(R6K-specified π protein)を産生する供与宿主株においてのみ維持される。ハイブリッドトランスポゾンを含有する供与プラスミドは、染色体に組み込まれた、広い宿主範囲の接合転移機能(conjugal transfer functions)を提供するRP4により、大腸菌Sm10(λpir)などの特殊化したλpri溶原化大腸菌株に形質転換される。選択された宿主細菌への供与プラスミドの送達は、標的株と交配することにより達成される。送達された自殺プラスミドから標的のレプリコンへのハイブリッドトランスポゾンの転位は、トランスポゾンの外側の部位でプラスミドにコードされる同族トランスポザーゼによって実現される。トランスポザーゼ機能は標的細胞において維持されないので、そのような細胞はさらなる転位過程に影響されない。したがって、同一の株における複数の挿入は、異なる選択マーカーの利用可能性によって制限されるにすぎない。
【0011】
Herrero, M. et al. 1990、挿入突然変異誘発プロモータープロービング(Insertion Mutagenesis Promoter Probing)およびグラム陰性真正細菌におけるクローン化DNAのゲノム挿入のためのMini−Tn5トランスポゾン誘導体, Journal of Bacteriol. Vol 172, No.11, p.6568-6572には、様々なグラム陰性細菌の染色体への外来DNA断片の導入を可能とする、Tn5Tcなどの収集したTn5由来ミニトランスポゾンからなる構築物が、さらに開示されている。ミニトランスポゾンは、選択マーカーとしてカナマイシンおよびテトラサイクリン耐性を示す遺伝子、ならびに、Tn5の19塩基対の末端反復配列が両側に隣接する1つのNotIクローニング部位からなる。そのトランスポゾンは、IS50Rトランスポザーゼtnp遺伝子をシスで(in cis)可動性因子の外側に提供するR6Kベースの自殺送達プラスミド上に設けられ、その受容株への接合転移は供与側のRP4可動特性により仲介される。したがって、トランスポザーゼに仲介される第2の転位、欠失および逆位が存在しないために、それらの因子により生じる挿入は、一般に、より安定である。D.E. Berg, Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington, DCのBerg et al.(1989)転位性因子および細菌の遺伝子工学、p.p. 879-926も参照のこと。このように、極めて安定な挿入は、たとえばまた、Tn10由来の因子により達成される。Way, J. C. et al.,(1984)トランスポゾン突然変異誘導用および転位によるlacZオペロン融合の構築用新規Tn10誘導体, Gene 32:369-379。
【0012】
mini−Tn5Tcの構造(Herrero,et seq., p.6569)は、挿入突然変異誘発用の使用のために、またはNotI部位に側面を接するDNA断片(まず、DNA断片をpUC18誘導体pUC18NotおよびpUC18Notにクローニングすることにより容易に単離される)のクローニングのためのトランスポゾンベクターとして、開示されている。Mini−Tn5Tc因子は、通常の組み換えDNA技術を用いてインビトロで構築される。Maniatis, T., et al.,(1989)Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.。テトラサイクリン(Tc)耐性の決定要素は、インターポゾンとしてそれらを保持するプラスミドから、EcoRI断片として得られる(Fellay, R., et al.(1987)土壌および水細菌(soil and water bacteria)のインターポゾン突然変異誘発:グラム陰性細菌のインビトロ挿入突然変異誘発のために設計されたDNA断片群、Gene 52:147-154)。つづいてその断片は、pUC18Sfiの唯一のEcoRI部位にクローン化され、SfiI断片として切り出され、そして可動性単位が全ての場合において送達プラスミドのXbaI−EcoRI(不完全(partial))部として存在するようにpUTのTn5の19塩基対末端のあいだに挿入される。得られた因子がmini−Tn5Tcである。
【0013】
Tn10ベースのトランスポゾンベクター送達系は、Herrero, M., et seq. 172: 6557-6567に記載されている。誘導体λRP167であるファージλは、mini−Tn10Km因子を含有する5.1kbのEcoRI挿入断片を運搬し、トランスポザーゼ遺伝子IS10Rは、可動性因子の逆方向反復配列の外側かつpTacプロモーターの下流に設けられる。転位を宿主非依存的に制御するトランスポゾン送達プラスミドを得るために、EcoRI挿入断片は、プラスミドpMJR1560由来のlacIqを含有するpGP704誘導体であるpBOR8にライゲーションされる。そのプラスミドは、pir遺伝子のR6K特異的πタンパク質産物を欠くために宿主株において複製することができない。pGP704は、RP4プラスミドの接合転移起点(conjugal transfer origin)(oriT配列)を含有し、それゆえに、可動(Mob)特性によりトランスで(in trans)提供されるとグラム陰性細菌に転移され得る。逆方向反復配列の内側にあり、mini−Tn10の原型のカナマイシン耐性遺伝子の原型の特異的πタンパク質産物を含有するMluI断片は、NotI部位およびMluIアダプターの付加により適当に修飾されたSfiI−Pttカセットを含有しpLODPttを産出する断片に置換される。その構築物は、mini−Tn10逆方向反復配列のあいだに、唯一のSfiI、NotIおよびXbaIクローニング部位を有する。pLOFPttのPtt耐性マーカー(Pttr)は、プラスミドpLOFKmを産生するためにカナマイシン耐性に交換される。
【0014】
前述の観点から、キシロースおよびアラビノース異化作用に必要な酵素をコードする安定なゲノム挿入断片の産出により、キシロースおよびアラビノースまたは双方を醗酵してエタノールにすることができる安定な組み換え体Z.モビリス株の構築の必要がある。その株は、抗生物質耐性であるべきではなく、非選択培地において40世代以上のあいだ安定であるべきである。また、その株は、最大の理論上の産物収率に近い、高い特定の産物形成率を示すことが望ましい。
【0015】
[本発明の開示]
本発明の目的は、外来構造遺伝子の安定な組込みのために有用な転位因子ならびにプラスミドベクターであって、xylAxylB、tal/tktおよびaraBADからなる群より選択される酵素およびZ.モビリスゲノムへの構造遺伝子導入のための少なくとも1つの制御遺伝子をコードする転位因子ならびにプラスミドベクターを提供することである。
【0016】
本発明のさらなる目的は、非選択培地において構造遺伝子を安定に発現することができる極めて様々なZ.モビリス株を提供することである。
【0017】
本発明のさらなるほかの目的は、構造遺伝子の安定な発現をするが、セルロース加水分解反応混合物における生触媒として使用された場合に高率の特異的産物形成および変換効率により特徴付けられる、極めて様々なZ.モビリス株を提供することである。
【0018】
関連技術に関する問題を解消するために、および本発明の目的にしたがい、本明細書において具体化され広く記載されているとおり、要するに本発明は:細菌ゲノムへの外来遺伝子の安定な挿入用トランスポゾンであって、xylAxylB、araBADおよびtal/tktからなる群より選択される酵素をコードする構造遺伝子を有する少なくとも1つのオペロン、および該構造遺伝子を細菌において発現するための少なくとも1つのプロモーター、一対の逆方向挿入配列、該挿入配列の内側に含有される該オペロン、ならびに該挿入配列の外側に設けられるトランスポザーゼ遺伝子を含むトランスポゾン;細菌ゲノムへの外来遺伝子の形質転換用プラスミドシャトルベクターであって、xylAxylB、araBADおよびtal/tktからなる群より選択される酵素をコードする構造遺伝子を有する少なくとも1つのオペロン、該構造遺伝子を細菌において発現するための少なくとも1つのプロモーター、ならびに形質転換される細菌ゲノムの遺伝子に相同性を有する少なくとも2つのDNA断片を含むプラスミドシャトルベクターを包含する。
【0019】
トランスポゾンおよびシャトルベクターは、本発明にしたがい、極めて様々なチモモナス モビリス株を構築する際に有用であり、それらは非選択培地における発現が安定であるため、従来の醗酵技術を用いることによるセルロース由来ペントース糖の燃料および薬物への変換の際に有用である。
【0020】
本発明のさらなる利点は、以下の記載に一部説明されるであろうし一部はその記載のために明らかであり、または本発明の実施により知ることができる。本発明の利点は、特許請求の範囲にとくに指摘される方法により実現され達成され得る。
【0021】
[発明の詳細な説明]
とくに別段の断りのない限り、本明細書において用いられるすべての技術的または科学的用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験の際は、本明細書に記載されるものと同類または同等のあらゆる方法および材料を使用し得るが、好ましい方法および材料をここに記載する。すべての米国特許は、引用することによって、本明細書において完全に説明されているかのように組み込まれる。
【0022】
ここで、本発明の現在の好ましい実施態様に関する言及を詳細におこない、その例は添付の図面に示されている。下記実施例に関して、「プラスミド運搬株(plasmid-bearing strains)」は、関連技術の説明に示された米国特許記載のそれらの株およびベクターを意味する、またはそれらの株およびベクターに関連する。「Z.モビリスゲノム、またはゲノムの」は、全体として、既定のZ.モビリスに関する発現特性および潜在的に発現し得る特性すべてを指定する遺伝子を意味する。C25はチモモナス モビリス特許寄託表示PTA−1799を意味し、AXはチモモナス モビリス特許寄託表示PTA−1797を意味し、G8はチモモナス モビリス特許寄託表示PTA−1796を意味し、mini−Tn5−tal/tkt−xylAxylBは大腸菌DH5α(pZb1862−IdhL−ara)特許寄託表示PTA−1798を意味し、そしてC25はチモモナス モビリス特許寄託表示PTA−1799を意味する。前記のものすべては、20110−2209 バージニア州、マナサス、ユニバーシティ ブールバード 10801に所在のアメリカン タイプ カルチャー コレクションに寄託され、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約にしたがって、2000年5月1日に受け取られ、受託されている。
【0023】
[実施例]
株、プラスミドおよび培地
大腸菌細菌株CC118λ(pir)、CC118λ(pir)(mini−tn5Tc)、SM10λ(pir)ならびにプラスミドpUC19、pLOF/Km、pUC18sfi、ミニトランスポゾンTn5、Tn10およびpUC18Notを含有するpUT/Tcは、ドイツ連邦共和国、デー−38124 ブラウンシュバイク、マシェロデル ベク 1所在のゲーベーエフ−ゲゼルシャフト ファー バイオテクノロジッシェ フォーシュング ミット ベシュレンクテル ハフツング(GBF-Gesellschaft Fur Biotechnololgische Forschung mbH, Mascheroder weg 1 D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany)のK.ティミス博士(Dr. K. Timmis)より入手した。大腸菌DH5αは、プラスミド構築用宿主として使用した。大腸菌SM10λpirは、交配実験の際に供与株として使用した。Z.モビリスATCC39676株およびその誘導体206C株(米国特許第5,843,760号明細書)は、本発明にしたがい、受容株として使用した。Tn10ベースのプラスミドは、大腸菌CC118において構築され、そして維持された。
【0024】
大腸菌株は、37℃でLB培地で培養された。Z.モビリス株は、特段の定めのない限り、20g/Lグルコース、D−キシロースまたはL−アラビノースで補完したRM(10g/L酵母エキス、2g/L KH2PO4)において嫌気的に維持された。プラスミドを含有するすべての株は、テトラサイクリン(Tc)((Z.モビリスおよび大腸菌の液体に10μg/ml;Z.モビリスに関しては寒天に20μg/ml;および大腸菌に関しては、寒天に15μg/ml、またはアンピシリン(Ap)100μg/ml)の存在下で増殖された。
【0025】
Z.モビリス形質転換体またはトランス接合体の再生および選択のために、テトラサイクリンまたはナリジキシン酸(20μg/ml)で補完した交配プレート((10g/L酵母エキス、5g/Lトリプトン、2.5g/L (NH4)2SO4、0.2g/L K2HPO4および50g/L糖))を使用した。すべての寒天プレートは、15g/L寒天で作製された。
【0026】
組換えDNA技術
発表されたプロトコルSambrook et al.,(1989)Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y. または各試薬の製品の指示にしたがって、プラスミドDNA単離、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーションおよび形質転換、アガロース電気泳動法ならびにほかの組換えDNA技術は実施され、明記され、本技術分野において公知である。Z.モビリスのゲノムDNAは、250mlの50mM トリス−50mM EDTA緩衝液に再懸濁された3ミリリットルの一晩培養細胞を用いて抽出された。細胞は、37℃で30分間リゾチームで処理し、ついで、100mlの5%SDS溶液およびリボヌクレアーゼ(最終濃度は20ng/ml)を添加し、その混合液をさらに30分間インキュベーションした。タンパク質を除去するために、フェノール/クロロフォルム抽出を2回実施した。ゲノムDNAをエタノール沈殿法により回収した。
【0027】
接合および形質転換
プラスミドは、フィルター交配技術(Conway et al., 1987)による接合によって、供与株大腸菌SM10λpirまたはS17−1からZ.モビリス株に転移された。エレクトロポレーション(Zhang et al., 1995)により、プラスミドDNAで、Z.モビリスまたは大腸菌細胞のいずれかを形質転換した。
【0028】
サザンブロット分析
DNAは、ストラタジーン ポジ ブロット プレッシャー ブロッター(Stratagene Posi Blot pressure blotter)を用いてナイロン膜上に移された。DNAプローブTc、xylB、TnpおよびTalは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、ジゴキシゲニン−UTP標識された。以下のプライマーはDNA標識に使用された。
【0029】
プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、ベーリンガー マンハイム ハイブリダイゼーション キットに記載された既定のプロトコルにしたがって実施した。
【0030】
実施例1
以下の実施例は、キシロース同化酵素をコードする遺伝子を含有するMini−Tn5Tcの構築、ならびに、その構築物のZ.モビリス206およびATCC39676への接合転移(conjugal transfer)を示す。キシロース同化酵素をコードする遺伝子を含有するMini−Tn5Tcは、プラスミドpGP704に含有されるMini−Tn5Tcの唯一のNotI部位にPgap−xylAxylBオペロンを挿入することにより構築された。図1を参照のこと。Pgap−xylAxylBオペロンは、米国特許第5,712,133号明細書および同第5,726,053号明細書のプラスミドpZB4またはpZB5から得られた。得られたプラスミドは、Mini−Tn5TcxylA/xylB(X4)およびMini−Tn5TcxylAxylB(X5)と命名され、エレクトロポレーションによって供与株大腸菌SM10λpirを形質転換し、そしてZ.モビリスATCC39676および206C株のいずれかと交配した。Z.モビリス206Cは、引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第5,843,760号明細書に開示されている。9つのチモモナスTcrトランス接合体は、Tcおよびナリジキシン酸を含有する培地上での選択によって、Mini−Tn5TcxylAxylB(X4)およびMini−Tn5TcxylAxylB(X5)を含有するSM10λpir供与株双方から得られた。図2(b)を参照のこと。
【0031】
ついで、9つのZ.モビリスTcrトランス接合体由来のゲノムプラスミドDNA(genomic and plasmid DNA)で、サザンブロット分析を行った。トランス接合体由来のゲノムプラスミドDNAは、ハイブリッドトランスポゾンおよびキシロースオペロンに切り分けるSphIで消化され、ついでそのブロットは、Tcプローブ、XylBプローブまたはトランスポザーゼTnpプローブのいずれかにハイブリダイズされた。(1)キシロースオペロンPgap−xylAxylBはTcr遺伝子とともにチモモナスゲノムに挿入されたこと;(2)各接合体に1つの挿入のみが生じたこと;(3)挿入はゲノム内の異なる位置であったこと;(4)Tcr遺伝子およびXylBはプラスミド画分に存在しないこと;および(5)tnpトランスポザーゼ遺伝子はトランス接合体に存在しないことが、オートラジオグラフから明らかにされた。
【0032】
チモモナスTcrPgap−xylAxylBトランス接合体におけるキシロースイソメラーゼ(XI)およびキシルロキナーゼ(XK)の発現を確認するために、チモモナスTcrPgap−xylAxylBトランス接合体の酵素分析を行った。この分析により、すべてのトランス接合体に関するキシロースイソメラーゼの酵素レベルは、それらのプラスミド対応物(plasmid counterparts)の約半分の酵素レベルであることが明らかになった。同様に、プラスミド運搬株のキシルロキナーゼ活性の約半分が、組込み体(integrant)において観察された。XIおよびXK活性の双方は、チモモナスゲノム上の遺伝子の単コピーから発現され、プラスミド運搬株にみられる1細胞当たり10コピーのものと比較して、予想されるよりもはるかに高いものであった。
【0033】
実施例2(C25)
本実施例は、組換え体Z.モビリスの遺伝子安定性を高めるために、抗生物質選択の非存在下で、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードするキシロース同化遺伝子xylAおよびxylB、ならびにトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼをコードするペントースリン酸経路遺伝子talBおよびtktAは、mini−Tn5を用いてZ.モビリスゲノムに導入された。Pgap−xylA/xylBおよびPeno−talB/tktAを含有する2つのオペロンは、mini−Tn5に組み入れられ、得られたプラスミドはZ.モビリスに接合された。mini−Tn5カセットの外側に設けられたトランスポザーゼの助力で、Pgap−xylAxylBおよびPeno−talB/tktAの単コピーは、サザンハイブリダイゼーションによって示されるように、Z.モビリスゲノムに挿入された。キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスアルドラーゼの酵素分析により、それらすべての遺伝子が調和して発現されたこと、および組込みを行った株はプラスミド運搬株の酵素活性の約30〜70%を生産したことが示された。それらの酵素レベルは、微生物が増殖し、そしてキシロースを醗酵してエタノールにするために充分であった。
【0034】
クローニング過程を容易にするために、オペロンPeno−talB/tktA含有BglII断片を、図3に示す新たに構築した補助プラスミドpUSCfiMCSのBamHI部位に挿入した。補助プラスミドpUSCfiMCSは、pUC19由来のマルチクローニングサイトを含有するEcoRI−HindIII断片をpUCSfiに挿入することにより構築された。ついで、pUCtaltktを、図に示すように、pUCpfiMCSおよびpUCtaltktSfiから構築した。
【0035】
ここで図2を引用すると、ついでPeno−talB/tktAをpUCtaltktSfiからSfiI断片として切りだし、mini−tn5−Tc−xylAxylBにクローン化するために用いた。図に示すように、Tcr遺伝子は、Tn5−Tc−xylAxylBカセットのSfiI部位に側面を接する。Mini−tn5−Tc−xylAxylBをSfiIで部分的におよび完全に消化し、図2(c)に示すように、Peno−talB/tktASfi断片にライゲーションした。その部分的な消化によりTcr遺伝子含有プラスミドを産出し、mini−tn5−Tctal/tkt−xylAxylBと命名し((図2))、一方、完全な消化により、Tcr遺伝子を含有しない本明細書における発明のプラスミドを産出し、miniTn5−tal/tkt−xylAxylBと命名した。図2(d)参照のこと。
【0036】
双方のプラスミドで供与株大腸菌S17−1を形質転換し、そしてZ.モビリス206Cと交配させた。得られたトランス接合体は、グルコース、Tcおよびナリジキシン酸を含有する交配培地で、miniTn5−tal/tkt−xylAxylB−Tcに関して選択した。mini−tn5−tal/tkt−xylAxylBに関しては、トランス接合体は、キシロースおよびナリジキシン酸を含有する交配培地で直接、選択された。mini−tn5tal/tkt−xylAxylB−Tcに関し、多数のTcrトランス接合体(グルコース増殖)が得られた。いくつかのキシロース増殖トランス接合体が、mini−tn5−tal/tkt−xylAxylBに関して得られた。
【0037】
予備的なバッチ培養物を、30℃でpH調整をせずに2%キシロース含有RM80mlのボトル中で、醗酵ダイナミクスに関して静置的に試験した。コロニーは、RM+2%キシロースプレートから得られ、定常増殖期(光学密度600=0.1、500nm)に達するまで、RM2%キシロース培地において一晩20℃で培養され、そして播種材料として使用した。キシロースおよびエタノールは、HP1047A屈折率検出器およびバイオラッドHPX−87H有機酸分析カラムを備えるヒューレット−パッカード1090L HPLCを用い、65℃、0.6ml/minの0.01N硫酸移動相流速で作動させることにより、分析された。エタノール収率は、醗酵された糖の重量または培地中の利用可能な糖全体のいずれかを用いて計算された。最大の理論的収量は、0.51gエタノール/gキシロースに基づいた。
【0038】
mini−tn5tal/tkt−xylAxylBカセットの転位が生じたかどうかを検討するために、Z.モビリストランス接合体由来のゲノムプラスミドDNA試料のサザンブロット分析を行った。mini−tn5tal/tkt−xylAxylBの4つのトランス接合体から製造したゲノムプラスミドDNAは、カセット内で2回切断するSphIにより消化されることにより、Talプローブ相同性を有する1つの断片を生じた。ブロットは、ついで、TalプローブまたはTnpプローブのいずれかにハイブリダイズされた。図4のオートラジオグラフは、Talプローブでハイブリダイズした場合に、Z.モビリスDNAに隣接する、4kb(Peno−talB/tktAのサイズ)より大きなただ1つのバンドが、すべてのゲノムDNA標本から検出されたことを示す。また、試料のうち3つ(番号22、23および24、おそらく姉妹株)はプラスミド画分においてバンドを示し、本来備わっているプラスミドに組込みが生じたことを示唆した。試料番号21に関しては、明らかに、組込みはZ.モビリスゲノムに生じており、単コピーのみが挿入されていた。それらトランス接合体由来のゲノムプラスミドDNA試料の、Tnpプローブを用いるハイブリダイゼーション(図5)により、試料DNAとTnpプローブとのあいだには相同性がないことが明らかになった。その結果により、キシロース同化遺伝子およびペントースリン酸経路遺伝子がTcr遺伝子とともにZ.モビリスゲノムに転位されたこと、ならびに、ただ1つの挿入が各トランス接合体に生じ、かつその挿入はゲノム上の異なる位置にあることが示唆された。
【0039】
Z.モビリストランス接合体に関して、キシロースイソメラーゼ、キシルロキナーゼ、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼ活性は、以前に記載されたように(Zhang et al., 1995)測定した。前に説明したように、ゲノム上のPgap−xylAxylB単コピーの発現は、プラスミド運搬株に関して生じるXIおよびXK酵素の約半分の発現であった。しかしながら、トランスアルドラーゼ(TAL)およびトランスケトラーゼ(TKT)が、チモモナスtal/tkt−xylAxylB−Tcおよびtal/tkt−xylAxylBトランス接合体において発現したかどうかを確認するために酵素分析を行うと、図6に示されるように、すべてのトランス接合体(番号4、5、17、18、21、23および24)に関するTALの酵素レベルは、プラスミド対応物の約50〜70%酵素レベルであった。プラスミド運搬株のTKT活性の約30〜70%が、組込み体において観察された。プラスミド組込み体はTALおよびTKT活性がわずかに上昇したが、チモモナスゲノム内の遺伝子の単コピーから発現したTALおよびTKT双方の活性は、プラスミド運搬株でみられる1細胞あたり10コピーの活性と比較して、予想される以上にかなり高いものであった。
【0040】
tal/tkt−xylAxylBチモモナス組込み体(番号21、22、5および11)の4つすべては、キシロースで増殖することができた。ついで、30℃で2%キシロース基質を用いることにより、それらの組込み体に関する予備的な醗酵研究を行なった。それらの組込み体に関する醗酵プロフィールは、図7に示される。図において、Z.モビリス組込み体番号21の増殖および糖利用率は、プラスミド運搬株39676/pZB4よりも遅いものであった。しかしながら、Z.モビリス組込み体の大半(番号22、5および11)は、プラスミド運搬株と同様であった。すべての組込み体は、92%の最大理論産生率で、キシロースからエタノールを産生した。
【0041】
ゲノムに組込まれたそれらの株および3つのプラスミド運搬株の安定性は、非選択培地において測定された。すべての株をRMG培地で培養し、そして順次、毎日約10世代毎に移し換えた。キシロースを醗酵してエタノールにする能力を測定するために、細胞は、40世代ごとに、1%グルコースおよび5%キシロースを含有するRM培地のフラスコに播種するために用いられた。エタノール生産率およびキシロース利用率は、安定性に関するマイルストーンとして用いられた。ゲノムに組込まれた2つの株は、90(C25およびD95)世代よりも長いあいだ安定を示し、一方プラスミド運搬株(206/pZB4、206/pZB4LおよびBC1pZB4L)は、約40世代のあいだ安定であった。図8を参照のこと。
【0042】
C25およびD95株の醗酵能は、pH調整された条件のもとで、様々な濃度の全グルコースおよびキシロース(1%グルコースおよび5%キシロース;3%グルコースおよび3%キシロース;ならびに4.5%グルコースおよび4.5%キシロース)を含有するRM培地において分析された。図に示したように、C25株は、pH5およびpH5.5の双方で、4.5%グルコースおよび4.5%キシロースを含有するRMにおいて、D95よりも優れたキシロース利用率およびエタノール生産率を示した。その結果、続く実施例において、3つのアラビノース同化遺伝子(araBAD)をC25ゲノムに組み込んだ。
【0043】
実施例3(AX)
以下の実施例は、mini−トランスポゾンTn10を用いることによる、ldhを介する相同組み換えおよび転位によるアラビノース同化酵素のC25ゲノムへの導入を説明する。下記プラスミドpZB1862−ldhL−araは、エレクトロポレーションによってZ.モビリスまたは大腸菌を形質転換するために使用された。形質転換体は、グルコースおよびテトラサイクリンで補完した交配プレートで選択された。Tcrコロニーは、キシロースまたはアラビノースで補完したRM(RMSおよびRMA)における増殖によって、Ara+Xyl+であることをさらに確認された。同じく下記プラスミドTn10Gは、フィルター交配技術(Conway et al., 1987)を用いる接合により、大腸菌SM10λpir供与株からZ.モビリスC25に移された。得られたトランス接合体は、アラビノース含有交配プレートにおいて選択された。
【0044】
A. pZB1862−ldhL−araの構築および相同組換えを用いるC25における組込み
相同領域として1kbのldh断片を用いることによってチモモナスゲノムにaraBADを組み込むという以前の試みは、成功しなかった。組換え頻度を上げるために、より広い相同領域が用いられた。ldhおよびフランキング領域を含む2.5kbのDNA断片は、PfuPCRおよび鋳型として米国特許第5,726,053号明細書のZ.モビリスATCC39676由来のDNAを用いて増幅された。プライマーは、Yamano I.,(1993)Journal of Bacteriology, Vol.175, 3926-3933に公表された、Z.モビリスCP4のDNA配列に基づき設計された。公表された配列により、PCRから2.5kbの断片が予想されたが、そうではなく3.4kbの断片が得られた。3.4kbの断片をBamHIで消化したのち、2つの断片(2.5および0.9kb)が得られた。双方の断片は、ldhのみにアニーリングするように設計されたプライマーを用いて、PCRにより試験された。2.5kbの断片は正しいサイズのPCR産物を産出したのに対して、0.9kbの断片は産出せず、前者がldh配列を含有することを示した。したがって、2.5kbのBamHI断片(ldhLと命名)はクローン化され、そしてC25への遺伝子組込みのための相同領域として使用された。
【0045】
ldhL断片ならびにジゴキシゲニン(DIG)標識したldh、araおよびtnpプローブを、Pfu(ストラタジーン社(Stratagene)製、ラ ジョラ(La Jolla)、CA)またはTaqDNAポリメラ−ゼ(キアゲン社(Qiagen)製、バレンシア、CA)のいずれかを用いるPCRにより増幅した。DIG−UTPは、ベーリンガー マンハイム、インディアナポリス、INより購入した。AIプローブは、Tn10のトランスポザーゼ遺伝子であるIS10Rを調べるために使用された。ldhL、ldh、araおよびtnpに対するPCR産物はそれぞれ、2.5、1、1.4および0.8kbである。以下のプライマー配列が用いられた。
【0046】
クローニングの目的で、ldh遺伝子の中央に位置するNcoI部位にオリゴヌクレオチド5'−CATGCGCGGCCGCC−3'を挿入することにより、NotI部位をldhLに導入した。その新たなNotI部位は、ldhLの各末端から約1.4および1.1kbであった。NotI部位を含有するldhLのBamHI断片(2.5kb)を、BclI部位でpZB1862にライゲーションした。最終的に、4.4kbのPgap−araBADは、pZB206(米国特許第5,712,133号明細書および同第5,726,053号明細書)から単離され、組込みプラスミドpZB1862−ldhL−araを形成するために、ldhLのNotI部位にクローン化された。図10を参照のこと。
【0047】
3つのアラビノース同化遺伝子を含有するPgap−araBADオペロンは、相同組換えにより、C25ゲノムのldh部位に組み込まれた。C25のゲノムにaraBAD遺伝子を組み込むために、pZB1862−ldhL−araは大腸菌DH5αにおいて構築された。プラスミドpZB1862−ldhL−araはエレクトロポレーションによりC25に転移された。Tc耐性形質転換体は、アラビノースにおける増殖に関して選択および試験された。形質転換体の増殖のあいだ、Pgap−ara−BADは、相同組換えによるldhLのldhL'−araBAD−ldhL′カセット(プラスミド由来)との置換によって、C25のゲノムに組み込まれることができた。
【0048】
組換え体を質的に高めて単離するために、形質転換体にプラスミドキュアリングを実施した。プラスミドpZB1862−ldhL−araは、Z.モビリスにおいて複製するであろう。しかしながら、Z.モビリスは、最適以下の増殖条件(たとえば37℃)で外来プラスミドを失う傾向がある。その特性を用いて、いくつかの転移体(transfers)に関し、Tc非存在下で37℃でC25形質転換体をサブカルチャーすることによって、pZB1862−ldhL−araのキュアリングを成し遂げた。各転移体由来の培養物は、プラスミドの脱落について定期的に監視された。第3の転移体までに100%の細胞がTcsになり、プラスミドの脱落が示された。潜在的なPgap−araBAD組込み体の増殖を質的に高めるために、第3、第4、第5および第6の転移体由来の培養物を30℃でアラビノース含有RM(RMA)に播種した。質的に高められた細胞は、RMGプレートに移されて、RMA、RMXおよびRMGTcプレート上にレプリカをとられた。以下に記載するように、Xyl+Ara+Tcsの表現型を有するいくつかの組込み体(AX)をさらに分析した。それらの組込み体は、唯一の炭素源として、キシロースまたはアラビノースのいずれかを使用することができた。
【0049】
B. Tn10Gの構築およびC25への接合
Mini−Tn5は、Peno−tal/tktおよびPgap−xylABオペロンを有するC25を構築するために使用された。トランスポザーゼ遺伝子はC25に存在しなかったが、mini−Tn10は、同じトランスポゾン間で生じ得る不一致を避けるため、続くPgap−araBADの組込みのために使用された。プラスミドTn10G(図11)は、Tn10ベースの送達プラスミドpLOFKmに基づき構築された。Kmr遺伝子は、pZB206から単離された、Pgap−araBADのNotI断片に置換された。Tn10Gは、大腸菌C118中で構築されて維持された。ついで、プラスミドは、Z.モビリスとの接合のために、交配供与株大腸菌SM10λpirに転移された。Tn10Gは、Z.モビリスにおいては自殺プラスミドであるため、araBAD組込みによるトランス接合体のみが、アラビノースで補完した交配プレート上で増殖することができる。そのプレートにおいて、大腸菌SM10λpir供与株はナリジキシン酸の存在により阻害された。トランス接合体は、交配/araプレート上で7日で出現した。コロニーは、その表現型を確認するために、RMAおよびRMX上にレプリカをとられた。選択されたコロニーの86%がXyl+Ara+であった。選択プレートから得た20コロニーを、異なるプレートに交差転移した(キシロースプレートからアラビノースプレートに、またはその逆)。それらのコロニーの60%が、Xyl+Ara+のままであった。20コロニーは、予備的なサザンハイブリダイゼーションにおいて分析された(データは示さない)。tnpプローブを用いることにより、約50%の株が、ゲノム中にトランスポザーゼ遺伝子を含有した。8つの組換え体は、ついで、サザンハイブリダイゼーションによって詳細に分析された。
【0050】
C25のldhへのPgap−araBADの組込みは、pZB1862−ldhL−ara組込み体DNAに関して、DIG標識化araおよびldhプローブを用いることにより、サザンハイブリダイゼーションによって確認された。図12(a)および(b)を参照のこと。pZB1862−ldhL−ara上にはただ1つのPstI部位が存在し、Pgap−araBADに位置する。したがって、araプローブを用いることにより、PstI消化したプラスミド由来の1つのハイブリダイゼーションバンド(12.9kb)が予想された。ゲノムに組み込まれたPgap−araBADに関しては、Pgap−araBADにおけるPstI部位およびPgap−araBADの外側に位置するゲノム上の付属のPstI部位により生じる2つのバンドが予想された。図13(a)から、結果は明らかに、全DNA標本由来の2つのバンドがaraプローブにハイブリダイズすることを示し、そしてPgap−araBADの組込みを証明した。組込み体のプラスミドDNA由来のハイブリダイゼーションバンドの欠如は、組込みが、本来備わっているプラスミド上ではなくゲノム上で生じたことを意味した。ldhがPgap−araBAD組込みによって破壊されたことを示すために、同じDNAを転移させ、ldhプローブにハイブリダイズした。予想したとおり、図12(b)に示すように、組込み体に関するハイブリダイゼーションのパターンは、C25を除いて、両ブロットにおいて正確に同一であった。完全なldhを有し、Pgap−araBAD組込みのために使用された宿主株C25由来の全DNAは、ただ1つのバンドを示した。その結果により、araBADがC25のldhに組み込まれたことが確認された。
【0051】
図13(a)および(b)は、Tn10転位により生じた8つのPgap−araBADトランスポゾン組換え体に関して、DIG標識化Tnpおよびaraプローブそれぞれを用いたサザンハイブリダイゼーション結果を示す。DNAはPstI制限酵素で消化した。PstIはTn10Gを2つの断片(7.7および5.9kb)に切断し、5.9kbの断片のみがトランスポザーゼ遺伝子(IS10R)を保持する。双方の断片は、araプローブにハイブリダイズした。そのブロットによると、G8、G11、G15およびGH17のみが、ara陽性かつtnp陰性であった。様々なバンドのパターンは、Pgap−araBADがゲノム中の異なる位置に組み込まれたことを示す。トランスポザーゼ遺伝子が組込み体のゲノムに維持されることは予想されなかったが、8つのうち4つの株(G5、G6、G14およびG19)は、トランスポザーゼ遺伝子を含有した。さらに、G14およびG19は、プラスミド上にトランスポザーゼを含有した。araプローブに関しては、組込み体由来の2つのバンドが予想された。しかしながら、ただ1つのバンドが観察された。この不明確さを解決するために、組換え体に対し、araプライマーを用いてPCRを実施し、8つすべての組換え体がゲノム中にPgap−araBADを含有することを確認した(データは示さない)。
【0052】
重要でない改変をしたZhang, et al., 1995およびDeanda et al., 1996にしたがい、Z.モビリス組換え体およびコントロール株の無細胞抽出液を用いることにより、キシロースイソメラーゼ(XI)、キシルロキナーゼ(XK)、L−アラビノースイソメラーゼ(L−AI)、L−リブロキナーゼ(L−RK)、L−リブロース−5−P−4−エピメラーゼ(L−Repi)、トランスケトラーゼ(TKT)およびトランスアルドラーゼ(TAL)を分析した。無細胞抽出液は、後期対数期(30℃、OD600約1.2)に培養物を回収し、音波処理緩衝液(10mMトリス−HCl、pH7.6、10mM MgCl2)で1回洗い、ついで音波処理することによって調製した。細胞屑を遠心分離(14000rpm、45分間、4℃)により除去した。L−AI分析において、定期試料の容量は、半分(50μl)、70%H2SO4(1.5ml)および0.12%カルバゾール(50μl)に減少した。すべてのチューブは、70%H2SO4の添加前後、吸光度を読むまで、25℃の水槽で維持した。試料は、反応のあいだ、0、5、10および20分時に調べられた。
【0053】
相同組換えおよびトランスポゾン組込みで得られた組換え体は、D−キシロースおよびL−アラビノース上で増殖することができたが、組込まれた遺伝子の発現レベルは、酵素活性を測定することによって決定した。単離体C25/AX1、C25/AX101およびC25/G8は、下記の安定性研究で決定されるように最も安定な組込み体であったので、酵素分析のために選択された。酵素分析の結果を図14および図15に要約する。すべての分析に関し(キシルロキナーゼとともに、およびキシルロキナーゼを除いて)、コントロール(C25および/または206C)と比較して、組込み体は顕著な活性を示した。現時点では、組込み体に関するXKの低い活性は、実験上の過失、分析の性質または双方が原因であると思われる。たいていの分析において(L−リブロキナーゼおよびキシロースイソメラーゼを除く)、組込み体は、プラスミド運搬株(206C/pZB301)よりも低い活性を示した。これは、遺伝子のコピー数に関連すると思われる。
【0054】
安定性研究のために、培養物は、RMGを含有する試験管に播種され、30℃で一晩インキュベーションされ、そして毎日、RMG管に移された。播種材料は、10世代毎に移されるよう管理された。pH調整せずに30℃で糖に対する醗酵能を試験するために、細胞は、40世代毎に、糖の混合液を含有するフラスコに播種するために使用された。バッチ醗酵研究は、操作容量として500mlを用い、Bio−StatQケモスタット(B,ブラウン社(B, Braun)、アレンタウン、PAの登録商標)において30℃でpH調整して実施した。pHは、2N KOHにより自動的に調整された。開始の糖濃度およびpHは、培養条件により、各バッチで様々であった。使用された糖すべてが試薬級であった。醗酵の間中、試料は定期的に採取され、糖、エタノールおよび副産物に関して、以前に記載されたように(Zhang 1995)HPLCで分析された。細胞増殖を監視するために、600nm(OD600)での光学密度が測定された。エタノール収率は、利用可能な全糖の量に基づいた。
【0055】
相同組換えおよび転位の双方により開発された、ゲノム組み込みを行ったキシロースおよびアラビノース醗酵Z.モビリス株のいくつかは、非選択培地(RMG)における安定性に関して検討された。それらの株をRMG培地で培養し、そして毎日、約10世代ののち、順次移した。キシロースおよびアラビノースを醗酵してエタノールにする能力を試験するため、細胞は、40世代毎に、1%グルコースおよび2%キシロースおよび2%アラビノースを含有するフラスコに播種するために使用された。エタノール生産率、ならびにキシロースおよびアラビノース利用率は、安定特性として使用した。2つの単離体は160世代のあいだ安定であった。図16および図17を参照のこと。3つの組込み株および1つのプラスミド運搬株は、pH5.5および30℃で、4%グルコース、4%キシロースおよび2%アラビノースの混合物を含有する培地において、醗酵能に関してさらに試験された。図18に示すように、3つの株すべては、グルコース、キシロースおよびアラビノースを72時間で利用したが、プラスミド運搬株では6g/Lのアラビノースが残留した。しかしながら、組込み株はキシリトールをプラスミド運搬株(1g/L)よりも多く(4g/L)産生した。2つの相同組換え体AX1株およびAX101株は、乳酸脱水素酵素遺伝子が遺伝子組込みにより不活性化されたので、乳酸を産生しなかった。組込み株の生産率(理論上約83%)は、プラスミド運搬株と極めて類似した。さらには、組込み株は、より高い細胞密度まで増殖した。おそらく原因は、7つの遺伝子を単コピーのみ有することと関連する、より少ない代謝負担である。
【0056】
例示の実施態様に関して本発明を説明したが、本発明の真の精神および範囲を逸脱することなく改変がなされ得ることが、認識および理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
本明細書に組み込まれ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の少なくとも1つの実施の態様を示しており、詳細な説明とともに本発明の原則を説明する。
【図1】 図1は、本発明のキシロース同化オペロンを含有するpGP704におけるMini−Tn5のプラスミドマップである。
【図2】 図2は、本発明のmini−Tn5の一連の構築を説明する一連のプラスミドマップである。
【図3】 図3は、pUCtaltktSfiのプラスミドマップを生じる一連の構築の説明図である。
【図4】 図4は、Talプローブを用いるtal/tkt−xylAxylB Z.モビリストランス接合体のサザン分析の結果である。Cは、コントロールプラスミドmini−Tn5tal/tkt−xylAxylBである。λHは、DNAサイズマーカーである。
【図5】 図5は、Tnpプローブを用いるtal/tkt−xylAxylB Z.モビリストランス接合体のサザン分析の結果である。Cは、コントロールプラスミドmini−Tn5tal/tkt−xylAxylBである。λHは、DNAサイズマーカーである。
【図6】 図6は、本発明の安定なキシロース醗酵Z.モビリス株の数種の単離体に関する酵素活性のグラフである。
【図7】 図7は、図6の4つの単離体(番号21、22および5)に関する醗酵プロフィールならびにプラスミド運搬株39673/pZB4およびBC1/pZB4Lに関するそれらの性能のグラフを示す。
【図8】 図8は、本発明の安定なキシロース醗酵Z.モビリス株C25およびD95の安定性を示すグラフ表示である。グラフは、エタノール生産率およびキシロース利用率パラメーターを指標として用いることにより、プラスミドを運搬し、かつゲノムに組み込んだキシロース醗酵株の安定性を示す。本発明のC25株およびD95株は、90世代より長いあいだ安定であった。醗酵培地は、1%グルコースおよび5%キシロースを含有するRMからなり、温度は30℃で一定であった。
【図9】 図9は、本発明にしたがい、pH5.0およびpH5.5、30℃で、4.5%グルコースおよび4.5%キシロース含有RM培地において、ゲノム組込みを行なったキシロース醗酵株C25およびD95のバッチ醗酵(batch fermentation)に関するパーセントのキシロース利用率を比較した場合の、光学密度(OD600)でのバイオマス濃度、時間関数としてのキシロース利用率、時間関数としてのエタノール生産量および生産率を示す。
【図10】 図10は、組み込みプラスミドpZB1862−ldhL−araのマップである。araBADはldhLのNotI部位に挿入され、ldhを分離する。構築は、Z.モビリスの複製プラスミドpZB1862をベースとする。
【図11】 図11は、Tn10Gのプラスミドマップである。IS10Rはトランスポザーゼ遺伝子である。IRは、トランスポゾンの逆方向反復配列である。araBADは、NotI部位で2つの逆方向反復配列のあいだに挿入された。
【図12】 図12は、DIG−araおよびDIG−ldhプローブを用いた、相同組換えで得られたゲノム組込みを行なったキシロース/アラビノース醗酵Z.モビリス株のサザン分析を示す。AX1、13、23、101、104および107はaraBAD組込み体である。C25は宿主コントロールである。pZB1862−ldhL−araは、DH5αから単離されたプラスミドコントロールである。λ/Hは、23、9.4、6.6、4.3、2.3および2.0kbの分子量マーカーである。
【図13】 図13は、DIG−tnpおよびDIG−araプローブを用いた、トランスポゾン組み込みで得られたゲノム組込みを行ったキシロース/アラビノース醗酵チモモナス株のサザン分析を示す。G5、6、11、15、17、14および19はaraBAD組込み体である。C25は宿主コントロールである。Tn10Gは、プラスミドコントロールである。λHは、23、9.4、6.6、4.3、2.3および2.0kbの分子量マーカーである。図13(a)はtnpのPstI消化であり、図13(b)はプローブがPstI消化である。
【図14】 図14は、ゲノム組み込み体株のトランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼの酵素活性の棒グラフを示す。206C/pZB301はプラスミドコントロールである。206Cは宿主コントロールである。C25は、キシロース醗酵組込み体である。G8は、Tn10転位で得られたキシロース/アラビノース醗酵組込み体である。AX1およびAX101は、相同組換えで得られたキシロース/アラビノース醗酵組換え体である。
【図15】 図15は、ゲノム組込みを行なった株のL−アラビノースイソメラーゼ、L−リブロキナーゼおよびL−リブロース−5−リン酸−4−エピメラーゼの酵素活性の棒グラフ結果を示す。206C/pZB301はプラスミドコントロールである。206Cは宿主コントロールである。C25は、キシロース醗酵組込み体である。G8は、Tn10転位で得られたキシロース/アラビノース醗酵組込み体である。AX1およびAX101は、相同組換えで得られたキシロース/アラビノース醗酵組込み体である。
【図16】 図16は、T=30℃でpH調整なしのRMGXA(1:2:2%)における、ゲノム組込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株のエタノール生産率の棒グラフ結果を示す。それらの株は、非選択培地において、様々な世代の培養物から播種された。
【図17】 図17は、30℃でpH調整した、1%グルコース、2%キシロースおよび2%アラビノースを含有するRMにおける、ゲノム組込みを行ったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株のキシロースおよびアラビノースの利用率の棒グラフ結果を示す。それらの株は、非選択培地において、様々な世代の培養物から播種された。
【図18】 図18は、pH5.5および30℃で、4%グルコース、4%キシロースおよび2%アラビノースを含有するRMにおける、ゲノム組込みを行なったキシロースおよびアラビノース醗酵チモモナス株の醗酵能の折れ線グラフ表示である。
【配列表】
Claims (21)
- Z.モビリスゲノムへの外来遺伝子の安定な挿入用トランスポゾンであって、xylAxylB、araBADおよびtal/tktからなる群より選択される酵素をコードする構造遺伝子を有する少なくとも1つのオペロン、および該構造遺伝子をZ.モビリスにおいて発現するための少なくとも1つのプロモーター、一対の逆方向挿入配列、該挿入配列の内側に含有される該オペロン、ならびに該挿入配列の外側に位置するトランスポザーゼ遺伝子を含有し、Z.モビリスゲノムへの挿入において、該構造遺伝子が非選択培地において40世代以上のあいだ安定であるトランスポゾン。
- 請求項1記載のトランスポゾンを含有するプラスミドベクター。
- 請求項2記載のプラスミドで形質転換されたZ.モビリス。
- 前記トランスポゾンがTn5またはTn10の誘導体である請求項3記載のZ.モビリス。
- 前記オペロンが前記xylAxylBおよびtal/tkt構造遺伝子を含む請求項3記載のZ.モビリス。
- 前記オペロンが前記araBADおよびtal/tkt構造遺伝子を含む請求項3記載のZ.モビリス。
- 前記プロモーターがPenoおよびPgapからなる群より選択される請求項3記載のZ.モビリス。
- 細菌ゲノムへの外来遺伝子の形質転換用プラスミドベクターであって、xylAxylB、araBADおよびtal/tktからなる群より選択される酵素をコードする構造遺伝子を有する少なくとも1つのオペロン、該構造遺伝子を細菌において発現するための少なくとも1つのプロモーター、および形質転換される細菌ゲノムのDNA配列に相同性を有する少なくとも2つのDNA断片を含有し、相同性を有する該少なくとも2つのDNA断片が、ATCC39676Z.モビリス株から鋳型として得られる、乳酸脱水素酵素遺伝子(ldh)およびフランキング領域を含むZ.モビリスDNAの2.5Kb領域(ldhL)への該オペロンおよびプロモーターの組込みにより生じるプラスミドベクター。
- 請求項8記載のベクターで形質転換された細菌。
- 本質的にaraBADからなる酵素をコードする構造遺伝子を有する第2のオペロン、該構造遺伝子を細菌において発現するための少なくとも1つのプロモーター、および形質転換される細菌ゲノムのDNA配列に相同性を有する少なくとも2つのDNA断片を含むプラスミドベクターにより、さらに形質転換された請求項5記載のZ.モビリス。
- 本質的にxylAxylBからなる酵素をコードする構造遺伝子を有する第2のオペロン、該構造遺伝子を細菌において発現するための少なくとも1つのプロモーター、および形質転換される細菌ゲノムのDNA配列に相同性を有する少なくとも2つのDNA断片を含むプラスミドベクターにより、さらに形質転換された請求項6記載のZ.モビリス。
- 前記細菌がZ.モビリスである請求項9記載の細菌。
- 前記構造遺伝子の産物の発現が、少なくとも45世代のあいだ安定である請求項5記載のZ.モビリス。
- 前記構造遺伝子の産物の発現が、少なくとも45世代のあいだ安定である請求項10記載のZ.モビリス。
- 請求項16記載の転位因子mini−Tn5−tal/tkt−xylAxylBによって形質転換された大腸菌とZ.モビリスとを交配させて得られるトランス接合体であって、ATCC登録番号PTA−1799である細菌株C25。
- Xyl+Ara+Tcsの表現型を有する、請求項15記載のベクターpZB1862−ldhL−araによって形質転換された請求項17記載の細菌株C25の相同組換え体であって、ATCC登録番号PTA−1797である細菌株AX1。
- Xyl+Ara+Tcsの表現型を有する、請求項15記載のベクターpZB1862−ldhL−araによって形質転換された請求項17記載の細菌株C25の相同組換え体であって、ATCC登録番号PTA−4072である細菌株AX101。
- キシロースもしくはアラビノースならびに請求項3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19または20記載の細菌を含む醗酵性培地からなる反応混合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/565,233 US7354755B2 (en) | 2000-05-01 | 2000-05-01 | Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains |
CA002304929A CA2304929C (en) | 2000-05-02 | 2000-05-02 | Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains |
PCT/US2001/011334 WO2001083786A2 (en) | 2000-05-01 | 2001-04-06 | Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004512819A JP2004512819A (ja) | 2004-04-30 |
JP4510355B2 true JP4510355B2 (ja) | 2010-07-21 |
Family
ID=25681717
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001580393A Expired - Fee Related JP4510355B2 (ja) | 2000-05-01 | 2001-04-06 | 安定なチモモナスモビリスのキシロースおよびアラビノース醗酵株 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1278876A2 (ja) |
JP (1) | JP4510355B2 (ja) |
AU (2) | AU4992601A (ja) |
BR (1) | BR0110987B1 (ja) |
WO (1) | WO2001083786A2 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7223575B2 (en) * | 2000-05-01 | 2007-05-29 | Midwest Research Institute | Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof |
AU2003299464B2 (en) * | 2000-05-01 | 2007-09-06 | Alliance For Sustainable Energy, Llc | Zymomonas pentose-sugar fermentating strains and uses thereof |
US7374939B1 (en) | 2000-05-01 | 2008-05-20 | Midwest Research Institute | Method of inactivation of an end product of energy metabolism in Zymomonas mobilis |
EP1539785B1 (en) * | 2002-06-26 | 2009-05-06 | Transgenrx, Inc. | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector |
CN100374570C (zh) * | 2004-07-07 | 2008-03-12 | 新疆农业科学院微生物应用研究所 | 一种将穿梭质粒导入黄色短杆菌的电转化方法 |
EP1752532A1 (en) | 2005-08-09 | 2007-02-14 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | Extracellular polyhydroxyalkanoates produced by genetically engineered microorganisms |
US7741119B2 (en) * | 2006-09-28 | 2010-06-22 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Xylitol synthesis mutant of xylose-utilizing zymomonas for ethanol production |
DE102007048134A1 (de) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | Evocatal Gmbh | Verfahren und Gen-Kassetten zur Klonierung, Integration und Expression mehrerer Gene eines Genclusters |
WO2009058927A1 (en) * | 2007-10-30 | 2009-05-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Zymomonas with improved ethanol production in medium containing concentrated sugars and acetate |
EP2205753B1 (en) * | 2007-10-30 | 2011-04-20 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Process for the production of ethanol in a medium comprising xylose employing a recombinant zymomonas strain with reduced hima expression |
US7998722B2 (en) * | 2008-03-27 | 2011-08-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Zymomonas with improved xylose utilization |
US9150880B2 (en) | 2008-09-25 | 2015-10-06 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of antibodies |
WO2010036978A2 (en) | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Transgenrx, Inc. | Novel vectors for production of growth hormone |
WO2010118360A1 (en) | 2009-04-09 | 2010-10-14 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Production of proteins using transposon-based vectors |
US20130157332A1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-20 | E I Du Pont De Nemours And Company | Gene inactivation allowing immediate growth on xylose medium by engineered zymomonas |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5843760A (en) * | 1994-04-15 | 1998-12-01 | Midwest Research Institute | Single zymomonas mobilis strain for xylose and arabinose fermentation |
IN191596B (ja) * | 1996-05-06 | 2003-12-06 | Purdue Research Foundation | |
US7374939B1 (en) * | 2000-05-01 | 2008-05-20 | Midwest Research Institute | Method of inactivation of an end product of energy metabolism in Zymomonas mobilis |
-
2001
- 2001-04-06 WO PCT/US2001/011334 patent/WO2001083786A2/en active IP Right Grant
- 2001-04-06 BR BRPI0110987-1A patent/BR0110987B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-04-06 AU AU4992601A patent/AU4992601A/xx active Pending
- 2001-04-06 AU AU2001249926A patent/AU2001249926B2/en not_active Ceased
- 2001-04-06 JP JP2001580393A patent/JP4510355B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-06 EP EP01923213A patent/EP1278876A2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001083786A3 (en) | 2002-06-20 |
JP2004512819A (ja) | 2004-04-30 |
BR0110987B1 (pt) | 2014-07-15 |
WO2001083786A2 (en) | 2001-11-08 |
AU4992601A (en) | 2001-11-12 |
AU2001249926B2 (en) | 2006-07-20 |
EP1278876A2 (en) | 2003-01-29 |
BR0110987A (pt) | 2006-02-07 |
WO2001083786B1 (en) | 2002-07-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7223575B2 (en) | Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof | |
US7354755B2 (en) | Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains | |
JP5732083B2 (ja) | エタノール産生 | |
JP4510355B2 (ja) | 安定なチモモナスモビリスのキシロースおよびアラビノース醗酵株 | |
EP2287293A2 (en) | Thermophillic Bacterial Strains for the Production of Ethanol | |
JP4309612B2 (ja) | チモモナスモビリスにおける部位特異的挿入方法 | |
AU2001249926A1 (en) | Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains | |
US8097460B2 (en) | Ethanol production in bacillus | |
AU2001251397A1 (en) | Method of site-specific insertion in zymomonas mobilis | |
CA2304929C (en) | Stable zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains | |
AU2003299464B8 (en) | Zymomonas pentose-sugar fermentating strains and uses thereof | |
Zhang et al. | Stable Zymomonas mobilis xylose and arabinose fermenting strains | |
AU2007231884A1 (en) | Ethanol production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060426 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090127 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090427 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090427 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090427 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091215 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100312 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100420 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100430 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130514 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130514 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140514 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |