JP5732083B2 - エタノール産生 - Google Patents
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Description
E.coli株を形質転換するのに使用することができ、ザイモモナス・モビリスpdcおよびadhを同時発現することができる組換えE.coliの生成をもたらすことを示した。これは、好気性および嫌気性両条件下での増殖中に、E.coliの代謝の中心をピルビン酸からエタノールに再誘導する合成経路の形成をもたらす。同様に、特許文献2は、ザイモモナス・モビリス由来のpdcおよびadhがともに、petオペロンの使用により組み込まれ、グラム陰性組換え宿主を生成することができ、これらの例としてはエルウィニア(Erwina)種、クレブシエラ(Klebsiella)種およびキサントモナス(Xanthomonas)種が挙げられ、その各々がザイモモナス・モビリスの異種遺伝子を発現して、ピルビン酸からエタノールへの合成経路によりエタノールを高収率で産生できることを開示する。
温では、他の微生物が発酵槽中に夾雑する危険性が低減して、非稼動時間が減少し、プラント生産性が増大し、供給原料を滅菌するためのエネルギー必要量が低減しうる。さらに、発酵冷却は必要でなく、作業コストをさらに低減することができる。発酵熱は、エタノールを蒸発させるのに用いることができ、ほとんどの細菌発酵に伴う共通の問題である、高エタノール濃度により増殖が阻害される可能性を低減する。発酵槽ヘッドスペースでのエタノール蒸発は生成物の回収も容易にする。
ピーがバシラス菌種LLD−Rの染色体上に存在することが明らかになった。挿入配列は3.2kb長であり、潜在的にタンパク質に翻訳可能である3つのDNAオープンリーディングフレーム配列(ORF)を含む。ORF1は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/)中のいかなるタンパク質とも相同性を示さないが、istAおよびistBは既知のトランスポゼース酵素のファミリーと有位の相同性を示す。バシラス属株TNを、化学突然変異誘発により得られるLLD−Rから開発し(図9Aおよび図9B)、挿入配列の1つのコピーが構造ldh遺伝子内に見出され、ldh遺伝子の不活性化および乳酸陰性表現型を生じ、それにより発酵の主要代謝産物が乳酸からエタノールに変わった。ldh遺伝子のDNA配列およびバシラス属株TNからのIE配列(下線)を、図1に示す。L−LDHのアミノ酸配列を図11に示す。
らに本発明者等は、染色体中へのプラスミドDNAの組込み、および組換えバシラスエスピーを選択するための技法を開発し、細菌発酵によるエタノール産生のための一組の最適化条件を開発した。
遺伝子)でもよい。遺伝子は、同一転写制御下で1のオペロン中に配列され得る。遺伝子発現は、遺伝子のコピー数を操作することにより、かつ異なる転写プロモーター配列を用いることにより調節することができる。
供する。
プラスミドpUBUCの構築
プラスミドpUC18およびpUB110を融合することにより、E.coli、および本発明に係る好熱性バシラス属株の間でDNAを転移することができるシャトルベクターを開発した。プラスミドpUB110は、カナマイシンに対する耐性を付与し、54℃までの温度で、バシラス・ステアロサーモフィルス中で複製することができ、黄色ブドウ球菌(Staphyloccocus aureus)から単離された、広範に用いられるベクターである(Narumi et al., 1992, Biotechnology Techniques 6, No.1)。プラスミドpUB110およびpUC18を、EcoR1およびBamH1を用いて線状化し、次に一緒に連結して、pUBUC(6.4kb)を作製した。プラスミドpUBUCは温度感受性レプリコンを有し、54℃より高い温度では複製することができず、このことがプラスミドpUBUCを、高温での相同的組換えによる遺伝子組込みのための理想的宿主にしている。
PCRにより、エジプトヘモフィルス(Haemophilus aeygptius)染色体DNAから、met遺伝子を含む1.1kb断片を増幅した。DNAシーケンシングにより遺伝子を確認した。met遺伝子をBamHIおよびXbaIを用いてトリミングし、次に、あらかじめBamHIおよびXbaIで線状化しておいた発現プラスミドpCL1920中でサブクローニングした。その結果生じたプラスミドpMETHを、E.coli TOP10中に形質転換させた。Tang et al(1994) Nuc. Acid Res. 22(14)に記載された方法を用いて、pMETHを保持するE.coli TOP10細胞を増殖させ、その後の形質転換およびin vivoメチル化するために培養を収集した。形質転換する前に、コンピテント細胞を−70℃で適宜に、アリコート中に保存した。
プライマーLDH7およびLDH8を用いて、PCRにより、TN染色体DNAからIE配列を増幅した。使用した反応体の濃度、およびPCR手法は、Expand(登録商標) High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics)で推奨されたものであった。凍結乾燥細胞からのPCR増幅は、Geniusサーモサイクラー(Techne, Ltd., Cambridge)で、30サイクルした後に達成された。上流プライマーLDH7の配列は、5’−AAGCTT GAT GAA ATC CGG ATT TGA TGG−3’であり、下流プライマーLDH8の配列は、5’−TCTAGAGCT AAA TTT CCA AGT AGC−3’であった。これらのプライマーは、挿入配列と隣接するldh遺伝子配列から選択した。HindIII制限部位を上流プライマー中に導入し、XbaI制限部位を下流プライマーに導入して、その後のクローニングに都合のよい制限部位を作製した(導入部位に下線を付した)。
標準手法(Maniatis)を用いて、E.coliにおけるプラスミドDNAの操作、形質転換および単離を実施した。挿入配列を含む3.2kbPCR断片を、HindIIIおよびXbaIでトリミングし、次にプラスミドpUBUC中にクローニングした。その結果生じたpUBUC−IEと称するシャトルプラスミド(図5)は、54℃までの温度でE.coliおよびバシラス属株中で複製することができ、アンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性を付与し、バシラス属株TN由来のIE配列を保持し得る
バシラス属株TNは、PFLまたはPDH経路を介して、細胞内代謝物質であるピルビン酸をアセチル−CoAに変換する。次にアセチル−CoAは、AcDHによる触媒反応によってアセトアルデヒドに、さらにADHによる触媒反応によって、エタノールに還元される。外来PDC酵素を導入することによって、PDCによるピルビン酸の脱カルボキ
シル化が起こり、アセトアルデヒドが生成し、さらにアセトアルデヒドが天然ADH酵素によりエタノールに還元されることを含む、エタノール産生のための代替的経路を細胞に提供する。PDCおよびADHはともに、ピルビン酸のエタノールへの変換に含まれる。
TNの形質転換
プラスミドpMETHを保有するE.coli TOP10細胞での形質転換、増殖、および該細胞からの精製後に、プラスミドpUBUC−IEをin vivoでメチル化した。次にメチル化したpUBUC−IEを用いて、バシラス属株TNを形質転換した。600nmでの吸光度(A600)が0.5〜0.6に達するまで、バシラス属株TN細胞を50mlのTGP培地中、65℃で増殖させた。培養を氷上で15〜30分間冷却させた。遠心分離により細胞を収集し、10mlの冷TH緩衝液(272mMのトレハロースおよび8mMのHEPES;KOHを用いてpH7.5)中で1回、5mlの冷TH緩衝液中で2回洗浄した。細胞ペレットを400μlのTH緩衝液中に再懸濁して、電気穿孔する前に4℃で保存した。Narumi et al.(1992) Biotechnology Techniques 6(1)による上記の方法に基づいた電気穿孔により、メチル化プラスミドDNAを用いてTN株を形質転換した。コンピテント細胞を90μlのアリコート中に分配し、2μlのメチル化プラスミドDNA(250ng/μl)と混合した。混合物を冷電気穿孔キュベット(0.2cm電極ギャップ)に移して、氷上で5分間インキュベートした。次に懸濁液に25μFコンデンサからの2.5kV放電を施して、EquiBio EasyJect電気穿孔機を用いてパルス制御を201オームに設定した(時間定数、τ=5ms)。細胞を直ちに5mlの予熱TGPに移して、52℃で1時間インキュベートし、TGP寒天(10μg/mlカナマイシン)上で平板培養した。プレートを52℃で24〜48時間インキュベートした。
以下の方法を用いて、相同的組換えによる温度感受性プラスミドpUBUC−IEの染色体組込みに関して選択した。
1.52℃で24時間、5mlのTGP(カナマイシン)培地中で、形質転換体を増殖させた。
2.50mlの新鮮なTGP(カナマイシン)培地に、O/N培養からの1mlを接種して、OD600が〜0.5に達するまで、52℃の振盪水浴中でインキュベートした。
3.15mlの上記培養を、4100rpmで5℃で5分間遠心分離し、ペレットを15
0μlのTGP(10:g/mlカナマイシン)培地中に再懸濁して、TGP(カナマイシン)プレート上に展着させた。
4.プレートを68℃で16時間インキュベートした。
5.単離コロニーを採取して、PCRにより挿入配列部位中へのプラスミド組込みに関
して分析した。
TN組込み体を68℃で単離した。TN組込み体中のLDHプライマーを用いてPCR産物を増幅できなかったことは、プラスミドpUBUC−IEの少なくとも1つのコピーが染色体中に組み込まれたことを示す。組込まれた結果、親菌株TNより、ldh復帰および「乗っ取り」に関して安定である新規の菌株TN−T9が見出された。
残留糖が培地中に存在するよう、復帰を容易にする条件である、最適下限の条件下において発酵を実行した。残留糖、ピルビン酸排出、ならびに設定条件からの多くの逸脱にもかかわらず、乳酸産生のいかなる痕跡も伴わずに、発酵が750時間続いた。エタノールは発酵を通して比較的大量に産生された。全発酵を通して、組込み体を選択するためにカナマイシンを用いなかった。これらの結果は、TN−T9におけるldh遺伝子突然変異が、実験条件(pH7.0、65℃、2%糖供給)下における連続培養において安定であることを示す。
グルコース、キシロースおよびグルコース/キシロースベースの原料からのエタノール産生のために、発酵条件を最適化した。
培養型: 連続
温度: 65℃
pH: 6.8
供給する糖濃度: 2〜10%
散布気体: 空気
酸化還元: >−350mV(空気流量により制御)
希釈速度: 0.36〜0.6h-1
これらの条件下において達成されたエタノール収率は、糖1g当たり0.4〜0.5gであった。エタノール産生性は、0.5h-1の希釈速度を用いた場合、2%および4%糖供給に関して、それぞれ約4gおよび8gエタノール/リットル/時間であった。
カナマイシン感受性株−TN−TKの選択
バシラス属TN−TKは、TN−T9のカナマイシン感受性誘導体である。この菌株は、ldh突然変異に関して完全に安定しており、選択マーカーとしてカナマイシンを含むプラスミド産生発現のための理想的宿主である。
より増幅し、TN−T9(親菌株)由来の崩壊ldh遺伝子とサイズが匹敵することを明らかにした。PCRを用いて、その菌株はカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を失っていたことを実証した。TN−TKと称する一誘導体をさらなる増殖実験のために選択した。これらの実験は、カナマイシン感受性およびldh突然変異が完全に安定しているということを確証した。
Claims (33)
- プラスミドおよび天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内の挿入因子(IE)配列の相同的組換えに基づくプラスミド組込み方法を用いた乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子突然変異の安定化により、エタノール産生特性が強化されたグラム陽性細菌であって、
前記挿入因子(IE)配列は、配列番号1の652番目の塩基から3,800番目の塩基までの部分ヌクレオチドで表されるものであり、
前記グラム陽性細菌は、バシラス・サーモグルコシダシウス(B. thermoglucosidasius)である、細菌。 - 前記IE配列を含むシャトルベクターで形質転換されている、請求項1に記載のグラム陽性細菌。
- 前記IE配列は、相同的組換えにより組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれている、請求項1又は2に記載のグラム陽性細菌。
- 前記天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、相同的組換えにより不活性化されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌。
- 胞子形成欠陥性である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌。
- 前記天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は不活性化されており、かつ異種ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を発現する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌。
- 前記天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、不可逆的に不活性化されている、請求項4または6に記載のグラム陽性細菌。
- バシラス属細菌を用いる、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子中の挿入因子(IE)配列と、ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子および前記挿入因子配列を含むプラスミドとの間の相同的組換えを含み、
前記挿入因子配列は、配列番号1の652番目の塩基から3,800番目の塩基までの
部分ヌクレオチドで表されるものである、天然乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を不活性化して、発現可能遺伝子を乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に挿入する方法。 - 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子および前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、前記IE配列に作動可能なように連結されたPDCオペロンの一部を形成する、請求項8に記載の方法。
- 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ザイモモナス(Zymomonas)エスピー由来である、請求項8または9に記載の方法。
- 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)由来である、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、バシラスLN株由来である、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記挿入因子配列、及びPDCオペロンは、前記組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれる、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- E.coliおよびバシラス属株中で複製することができる、以下の開裂地図により表されるシャトルベクターを用いることを含む、請求項8に記載の方法。
- 配列番号1の652番目の塩基から3,800番目の塩基までの部分ヌクレオチドで表されるIE配列を含有するシャトルベクター。
- 前記IE配列に作動可能なように連結されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含有する、請求項15に記載のシャトルベクター。
- 前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、PDCオペロンの一部を形成する、請求項16に記載のシャトルベクター。
- 挿入因子(IE)配列を含むプラスミドDNAが相同的組換えによりバシラス属細菌の
染色体中の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子中に安定的に組み込まれた乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する組換え細菌を選択する方法であって、
前記挿入因子(IE)配列は、配列番号1の652番目の塩基から3,800番目の塩基までの部分ヌクレオチドで表されるものであり、
前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増幅するためにPCRを使用することを含む方法。 - 前記組換え細菌の前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からPCR産物を増幅できないことは、前記組換え細菌の前記染色体中に、前記IE配列が組込まれたこと示す、請求項18に記載の方法。
- トランスポゼースの生物学的活性を有する1つまたは複数のポリペプチドをコードし、かつ挿入配列として分類されている、配列番号1の652番目の塩基から3,800番目の塩基までの部分ヌクレオチドで表される単離されたDNA分子。
- 好熱性バシラス属株TN由来である、請求項20に記載の単離されたDNA分子。
- 配列番号1の652番目の塩基から3,800番目の塩基までの部分ヌクレオチドで表される配列によりコードされる1つまたは複数のポリペプチドであって、トランスポゼースの生物学的活性を有するポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、発酵培地のpHがpH5.5〜7.5の範囲内である最適化発酵条件を用いることを含む製造方法。
- 前記発酵培地のpHは、pH6.0〜7.0である、請求項23に記載の製造方法。
- 前記発酵培地のpHは、pH6.4〜6.9である、請求項23または24に記載の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、発酵培地の温度が40〜75℃の範囲内である最適化発酵条件を用いることを含む製造方法。
- 前記発酵培地の温度は、52〜70℃である、請求項26に記載の製造方法。
- 前記発酵培地の温度は、60〜68℃である、請求項26または27に記載の製造方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、培養内空気散布を用いて酸化還元電位が−360〜−400mVであるようにすることを含む製造方法。
- 前記酸化還元電位は、−370〜−380mVである、請求項29に記載の製造方法。
- 供給希釈速度が0.3〜0.8h-1である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの連続製造方法。
- 前記供給希釈速度は、0.4〜0.6h-1である、請求項31に記載の製造方法。
- 用いられる細菌がバシラス属株TNである、請求項23〜32のいずれか1項に記載の
製造方法。
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