JP2004510435A - エタノール産生 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細菌発酵の産物としてのエタノールの産生に関する。特に本発明は、相同的組換えに基づいた遺伝子不活性化および遺伝子発現の新規の方法に関する。
【0002】
多くの細菌は、解糖の過程を介して単一糖を酸性および中性発酵産物の混合物に代謝する自然能力を有する。解糖は、六炭素であるグルコース分子が、多数の中間体を経て、2分子の三炭素化合物であるピルビン酸に分解する一連の酵素系である。多数の細菌の解糖経路は、共通の中間体としてピルビン酸を生成する。ピルビン酸がさらに代謝されると、発酵産物として一般的に既知である最終産生物NADHおよびATP、ならびに老廃物を生じる。好気性条件下では、解糖から産生されたピルビン酸の約95%が、酸化代謝を介してNAD+を再生するよう作用する多数の短い代謝経路において消費されるが、この場合、NADHは典型的には酸化され、酸素への一連の段階を経て水素等価物を供与し、それにより、連続解糖およびATP産生のための必須要件である水を生成する。
【0003】
嫌気性条件下では、ほとんどのATPが解糖により生成される。その他のATPも、有機酸、例えば酢酸の産生中に再生され得る。NAD+は、有機基質、例えばピルビン酸またはアセチルCoAの還元中にNADHから再生される。したがって解糖およびピルビン酸代謝の発酵産物としては、有機酸、例えば乳酸、ギ酸および酢酸、ならびに中性産物、例えばエタノールが挙げられる。
【0004】
大多数の通性嫌気性細菌は、好気性または嫌気性条件下のいずれにおいてもエタノールを高収率で産生しない。ほとんどの通性嫌気性生物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)およびトリカルボン酸回路(TCA)を経て好気的にピルビン酸を代謝する。嫌気性条件下では、ピルビン酸を代謝するための主エネルギー経路は、ピルビン酸−ギ酸−リアーゼ(PFL)経路を介して、ギ酸およびアセチル−CoAを生じる。次にアセチル−CoAは、ホスホトランスアセチラーゼ(PTA)および酢酸キナーゼ(AK)により酢酸に変換されるとともに、ATPを同時産生し、あるいはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(AcDH)およびアルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)によりエタノールに還元される。還元等価物の平衡を維持するために、ピルビン酸の乳酸への還元中に、解糖から産生される余分量のNADHがNAD+に、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)により再酸化される。NADHは、アセチル−CoAのエタノールへの還元中に、AcDHおよびADHによっても再酸化され得るが、これは機能性LDHを有する細胞中では重要でない反応である。したがって、ほとんどのアセチルCoAが酢酸に変換されてATPを再生し、解糖中に産生される余分量のNADHはLDHにより酸化されるため、エタノールの理論的収率は達成されない。
【0005】
エタノール産生性微生物、例えばザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)および酵母は、一般的にアルコール発酵と呼ばれる第二の種類の嫌気性発酵をし得るが、この場合、ピルビン酸は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC)によりアセトアルデヒドとCO2に代謝される。アセトアルデヒドは次に、ADHによりエタノールに還元されて、NAD+を再生する。アルコール発酵は、1分子のグルコースを2分子のエタノールおよび2分子のCO2へ代謝させる。ザイモモナス・モビリスにおいてこれらの酵素の両方をコードするDNAが単離され、該DNAは上記の合成経路によりエタノールを高収率で産生することができる宿主中にクローニングされ、組換え的に発現される。例えば米国特許第5,000,000号およびIngram et al (1997) Biotechnology and Bioengineering 58, Nos. 2 and 3は、ザイモモナス・モビリス由来のPDC(pdc)およびADH(adh)の両方をコードする遺伝子が「pet」オペロン中に組み込まれ、これは、E.coli株を形質転換するのに使用することができ、ザイモモナス・モビリスpdcおよびadhを同時発現することができる組換えE.coliの生成をもたらすことを示した。これは、好気性および嫌気性両条件下での増殖中に、E.coliの代謝の中心をピルビン酸からエタノールに再誘導する合成経路の形成をもたらす。同様に、米国特許第5,554,520号は、ザイモモナス・モビリス由来のpdcおよびadhがともに、petオペロンの使用により組み込まれ、グラム陰性組換え宿主を生成することができ、これらの例としてはエルウィニア(Erwina)種、クレブシエラ(Klebsiella)種およびキサントモナス(Xanthomonas)種が挙げられ、その各々がザイモモナス・モビリスの異種遺伝子を発現して、ピルビン酸からエタノールへの合成経路によりエタノールを高収率で産生できることを開示する。
【0006】
米国特許第5482846号は、PDC酵素およびADH酵素の両方をコードする異種遺伝子を用いて中温性グラム陽性バシラスエスピーを同時形質転換し、該形質転換した細菌が一次発酵産物としてエタノールを産生することを開示する。pdc遺伝子単独で形質転換された細菌がエタノールを産生するという示唆はない。
【0007】
欧州特許第A−0761815号は、胞子形成遺伝子をバシラス・ツレンギエンシス(Bacillus thurengiensis)中に挿入する相同的組換え方法を記載する。
【0008】
欧州特許第A−0603416号は、任意の遺伝子をデルブリュック乳酸桿菌(Lactobacillus delbrueckii)中に挿入する相同的組換え方法を開示する。
【0009】
欧州特許第A−0415297号は、突然変異プロテアーゼを発現するバシラス属株の産生方法を記載する。
【0010】
Biwas等(J. Bacteriol., 175, 3628−3635, 1993)は、相同的組換え方法により、プラスミドを保持する改変コピーにより置換された染色体遺伝子を有するラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)を記載する。本方法は熱感受性プラスミドを使用するため、好熱性細菌を形質転換するために用いることはできない。
【0011】
生物触媒を用いたエタノールの産生における重要な改良は、高温で機能する好熱性微生物を用いることにより達成され得る。炭水化物のエタノールへの変換速度は、より速くなる。例えば好熱性バシラス属におけるエタノール産生性は、30℃で機能する従来の酵母発酵プロセスより10倍まで速くなる。したがって、所定の容量の生産性に必要な製造プラントはより小規模であり、それによりプラント構築コストを低減することができる。高温では、他の微生物が発酵槽中に夾雑する危険性が低減して、非稼動時間が減少し、プラント生産性が増大し、供給原料を滅菌するためのエネルギー必要量が低減しうる。さらに、発酵冷却は必要でなく、作業コストをさらに低減することができる。発酵熱は、エタノールを蒸発させるのに用いることができ、ほとんどの細菌発酵に伴う共通の問題である、高エタノール濃度により増殖が阻害される可能性を低減する。発酵槽ヘッドスペースでのエタノール蒸発は生成物の回収も容易にする。
【0012】
本発明者等の菌株は、天然コンポスト(composting)生物体である天然型単離物から生じ、伝統的中温性微生物よりも、農業的原料中に見出される糖をエタノールに変換することに、はるかに適している。基礎となる菌株は、ヘキソースおよびペントース糖ならびにセロビオースをエタノールに変換するためのすべての遺伝子機構を保持する。本発明者等は、エタノール収率を増大するために、単にLDH経路を遮断した。このプロセスは自己クローニングと呼ばれ、外来性DNAの発現を含まない。したがってその結果生じる生物体は、遺伝的改変生物体(GMO)の使用に課せられる安全性のための規制を受けない。
【0013】
対照的に、慣用的生物触媒は、ペントース糖を利用することはできないがエタノール産生性は良好である株、またはペントース糖を利用することができるがエタノール産生性は悪い株である。これらの生物体を、複雑な遺伝子技法を用いて遺伝的に改変し、ヘキソースおよびペントース糖の両方をエタノールに変換できるようにした。しかしながら、これらの組換え生物体の安定性については疑いがあり、かつこのような生物体はGMO安全性規制を受けるため、安全性に関する懸念がある。さらに、組換え中温菌は高価な栄養要求性を有し、高塩濃度および原料阻害剤に対して感受性である。
【0014】
乳酸生成をもたらす代謝反応(LDH経路)は化学的突然変異誘発により遮断され、その結果生じるTN株は乳酸陰性であり、高収率でエタノールを産生する。しかしながら突然変異株は不安定で、自発的に乳酸産生天然型に復帰する。復帰体は、低pHかつ高糖濃度の条件下において突然変異体より速く増殖するため、連続培養をしている間に、急速に「乗っ取り(take−over)」をする。「乗っ取り」が起こると、主発酵産物はエタノールから乳酸に変わる。
【0015】
本発明者等は、安定性の問題に取り組み、エタノール産生に関与する遺伝子系へのより良好な洞察を得るために、分子生物学プログラムを用いた。本発明者等はまず、生物体を特定的に操作するための遺伝子技法、さらに連続培養で選択された遺伝子操作を受け入れる胞子形成欠陥性突然変異体を開発した。本発明者等は次に、いくつかの重要な代謝遺伝子、即ち乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)、乳酸パーミアーゼ(lp)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)およびldh遺伝子内に位置する新規の挿入配列をシーケンシングした。化学的に突然変異した菌株由来のldh遺伝子のDNA配列分析は、遺伝子のコード領域において天然に存在する挿入配列因子(IE)(IS因子とも称する)を挿入することにより遺伝子が不活性化されていたことを明らかにした。ldh遺伝子への(からの)転位およびそれに続く遺伝子不活性化は、それ自体不安定であり、復帰する。
【0016】
ldh遺伝子内のIE配列は相同的組換えのための大領域を提供することを本発明者等は確定した。したがって、ldh突然変異の安定性は、TN株のldh遺伝子内の既存のIE配列中にプラスミドDNAを組込むことにより改良され得ることが提唱された。
【0017】
ldh遺伝子の安定性は、ldh遺伝子内のプラスミドおよび挿入配列の間における特定の相同的組換えにより改良された。その結果生じた菌株は、連続培養においてエタノール産生特性の改良を示す胞子形成欠陥性株であって、通性嫌気性のグラム陽性バシラス属である。結果として、この新規の種類の突然変異体は完全に安定であり、化学的突然変異誘発により生成される一次突然変異体より優れた増殖特性およびエタノール産生性を有することを示す。
【0018】
菌株の改良は、相同的組換えに基づいた新規の遺伝子組込み方法により達成された。組込みの部位および組換えのためのプラスミドは、天然遺伝子または異種遺伝子を組込みかつ過剰発現するためにも用いられ得る。
【0019】
サザンハイブリダイゼーション試験によって、転位性挿入配列因子(IE)の3つのコピーがバシラス菌種LLD−Rの染色体上に存在することが明らかになった。挿入配列は3.2kb長であり、潜在的にタンパク質に翻訳可能である3つのDNAオープンリーディングフレーム配列(ORF)を含む。ORF1は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/)中のいかなるタンパク質とも相同性を示さないが、istAおよびistBは既知のトランスポゼース酵素のファミリーと有位の相同性を示す。バシラス属株TNを、化学突然変異誘発により得られるLLD−Rから開発し(図9Aおよび図9B)、挿入配列の1つのコピーが構造ldh遺伝子内に見出され、ldh遺伝子の不活性化および乳酸陰性表現型を生じ、それにより発酵の主要代謝産物が乳酸からエタノールに変わった。ldh遺伝子のDNA配列およびバシラス属株TNからのIE配列(下線)を、図1に示す。L−LDHのアミノ酸配列を図11に示す。
【0020】
しかしながらこの挿入は比較的不安定であることが明らかであり、突然変異株TNは機能的ldh遺伝子を保持する菌株TN−Rに自発的に復帰する。図2に示すようにバシラス属突然変異株TNは遺伝的不安定性を有するため、発酵の主要代謝産物はエタノールから乳酸に変わる。
【0021】
PCRにより、TN染色体DNAからIE配列を増幅した。挿入配列と隣接したldh遺伝子配列からプライマーを選択し、HindIII制限部位を上流プライマー中に導入し、かつXbaI制限部位を下流プライマー中に導入して、プラスミドpUBUC中へのその後のクローニングにとって都合のよい制限部位を作製した。HindIIIおよびXbaI制限エンドヌクレアーゼを用いて、挿入配列を含む3.2kbのPCR断片をトリミングし、その後、プラスミドpUBUC中にクローニングして、プラスミドpUBUC−IEを得た(図5)。
【0022】
バシラスエスピーを形質転換した後のプラスミドDNAの制限を妨げるためのプラスミドDNAのin vivoメチル化は、プラスミドpMETHを保有するE.coli TOP10細胞中での形質転換及び増殖、ならびにそれからの精製をした後に行った。次にメチル化したpUBUC−IEを用いて、バシラス属株TNを形質転換した。52℃でTGP寒天プレート(カナマイシン)上で、形質転換体をまず単離した。次に、ldh遺伝子のPCR増幅を用いて、形質転換体をスクリーニングした。LDHプライマーを用いたPCR産物(設定PCR条件を用いた場合10kbより大きい)の増幅ができないことは、プラスミドの少なくとも1つのコピーが染色体中に組み込まれたことを示唆した。
【0023】
菌株安定性に関して検査するために、カナマイシン選択を伴わない連続培養において、pH制御条件下で、新規の菌株TN−T9を増殖した。残留糖が発酵培地内に存在するような、復帰を促進する条件である最適下限の発酵条件下で、菌株TN−T9の安定性を確証した。発酵培地内の残留糖の存在、ピルビン酸排出ならびに設定条件からの多くの逸脱にもかかわらず、乳酸産生のいかなる痕跡もなく、発酵が750時間続いた。エタノールは発酵を通して比較的大量に産生された(図4)が、これは、菌株TN−T9におけるldh遺伝子突然変異が提供された実験条件下での連続培養において安定であることを示す。
【0024】
本発明者等は、バシラス属株TN−9に関する細胞増殖およびエタノール産生のための発酵条件も最適化した。
【0025】
要約すると、任意にpdc/adhオペロンを用いてpdcおよびadh遺伝子を発現しながら、ldh突然変異体の安定性を改良するための二重系を、本発明者等は開発した。さらに本発明者等は、新規のldh遺伝子および挿入配列因子、ならびに新規の乳酸パーミアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、シーケンシングした。さらに本発明者等は、染色体中へのプラスミドDNAの組込み、および組換えバシラスエスピーを選択するための技法を開発し、細菌発酵によるエタノール産生のための一組の最適化条件を開発した。
【0026】
したがって、本発明の第1の態様は、遺伝子突然変異を安定化し、かつ発現可能遺伝子を挿入するための相同的組換え方法を用いて形質転換された、組換え好熱性グラム陽性細菌に関する。
【0027】
本発明は、プラスミドおよび細菌の染色体DNAとの間の相同的組換えにより、ldh突然変異の安定性が高められている組換え好熱性グラム陽性細菌であって、細菌発酵の産物としてエタノールを産生する菌株を生じさせる組換え好熱性グラム陽性細菌も提供する。
【0028】
好ましくは、グラム陽性細菌はバシラス・サーモグルコシダシウスの菌株である。
【0029】
好ましくはグラム陽性細菌は、図1に記述されたようなIE配列、またはその機能的部分もしくは変異体を保持するプラスミドによって形質転換されている。好適には、図1のIE配列、またはその機能的変異体もしくは一部分は、相同的組換えにより、組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれる。
【0030】
好ましくは、組換え細菌の染色体中へのIE配列の組込みは、天然ldh遺伝子の不活性化を生じる。
【0031】
好ましくはグラム陽性細菌は、バシラス属株TN−T9(NCIMB受託番号NCIMB41075(ブダペスト条約の約定に従って2000年9月8日に寄託された))である。
【0032】
あるいは、グラム陽性細菌は、バシラス属株TN−TK(NCIMB受託番号NCIMB41115(ブダペスト条約の約定に従って2001年9月27日に寄託された))であるのが好ましい。
【0033】
本発明は、カナマイシン感受性であるTN−T9の突然変異体を選択することにより得られるグラム陽性細菌にも関する。このような菌株を得るための適切な方法は、併記の実施例に記載されている。
【0034】
好ましくは、グラム陽性細菌は胞子形成欠陥性である。
【0035】
本発明の第2の態様によれば、天然ldh遺伝子が相同的組換えにより不活性化され、かつ1つまたは複数の発現可能遺伝子が細菌の染色体DNA中に挿入されたグラム陽性細菌が提供される。さらに、遺伝子発現は、1回または反復回の組込みの結果として、挿入配列中にプラスミドを多重挿入した後、遺伝子コピー数を増大することにより増大され得る。
【0036】
1つまたは複数の発現可能遺伝子は、細菌の染色体DNA中に存在する1つまたは複数のIE配列中に挿入することができる。例えば、菌株TN−T9およびTN−TKの染色体上には3つのIE配列が存在する。
【0037】
発現される遺伝子は、アルコールデヒドロゲナーゼのようにバシラスにとって天然遺伝子でも、あるいは外来性遺伝子(即ちザイモモナス・モビリス由来のピルビン酸デカルボキシラーゼおよびバシラス・ステアロサーモフィルスからのα−アミラーゼのような異種遺伝子)でもよい。遺伝子は、同一転写制御下で1のオペロン中に配列され得る。遺伝子発現は、遺伝子のコピー数を操作することにより、かつ異なる転写プロモーター配列を用いることにより調節することができる。
【0038】
好ましくは、1つまたは複数の遺伝子はpdcおよび/またはadhである。
【0039】
adhのアミノ酸配列は、図12に示されている。
【0040】
本発明の第3の態様によれば、相同的組換えにより、天然ldh遺伝子を不活性化し、かつ1つまたは複数の発現可能遺伝子を細菌の染色体中に挿入する方法が提供される。
【0041】
好ましくは、細菌は好熱性グラム陽性細菌である。
【0042】
好ましくは、不活性化される遺伝子は天然ldh遺伝子であり、1つまたは複数の発現可能遺伝子はpdc遺伝子およびadh遺伝子である。
【0043】
好ましくは、pdc遺伝子およびadh遺伝子は、同一プラスミド上で、図1のIE配列に作動的に連結されたPDCオペロンの一部を形成する。
【0044】
好ましくは、pdc遺伝子は、細胞に対して異種である。
【0045】
好ましくは、図1のIE配列、およびPDCオペロンまたはその一部分はともに、細菌の染色体中に安定的に組み込まれる。
【0046】
好適には、遺伝子の不活性化および発現の方法は、54℃までの温度でE.coliおよびバシラス属株中で複製することができる、図5に記載されるようなシャトルベクターの使用を含む。
【0047】
本発明の第4の態様によれば、バシラス属株TN由来のシャトルベクターであって、54℃までの温度でE.coliおよびバシラスエスピーの両方において複製することができ、アンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性を付与し、図1に記載されたIE配列またはその一部分を保持するシャトルベクターが提供される。
【0048】
好ましくは、シャトルベクターは、図5に記載されたpUBUC−IEである。
【0049】
好ましくは、シャトルベクターは、ldhプロモーターの制御下にあるpdc遺伝子およびadh遺伝子を含み、かつ図1に記載されたIE配列に作動可能に連結されたPDCオペロンを含む。
【0050】
本発明の第5の態様によれば、相同的組換えによりプラスミドDNAが組換え細菌のldh遺伝子中に安定的に組み込まれた組換えバシラスエスピーを高温にて選択する方法であって、PCRを用いて天然ldh遺伝子およびIE配列を含まない組換え体を選択するための選択方法が提供される。
【0051】
好ましくは、ldh遺伝子中に挿入配列が組込まれたことが、組換え細菌のldh遺伝子からPCR産物を増幅できないことにより明らかにされる。
【0052】
本発明は、図1に示されたヌクレオチド652〜ヌクレオチド3800までの配列、またはその機能的変異体もしくは一部分によりコードされる1つまたは複数のポリペプチドであって、トランスポゼースの生物学的活性を有する1つまたは複数のポリペプチドも提供する。
【0053】
1つまたは複数のポリペプチドは、単独でまたは他のポリペプチドと組み合わされた場合に、トランスポゼースの生物学的活性を有し得る。
【0054】
好ましくは、1つまたは複数のポリペプチドは、図13、図14または図15に示されるアミノ酸配列、あるいはその機能的部分または変異体を有する。
【0055】
機能的部分または変異体は、図13、図14または図15に示されるポリペプチドのトランスポゼース機能の少なくとも一部分を保持する。好ましくは、その部分は少なくとも20アミノ酸長、より好ましくは少なくとも50アミノ酸長である。さらに、変異体は、図13、図14または図15に示されるポリペプチドと少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、もっとも好ましくは少なくとも95%の配列相同性を有するのが好ましい。相同性は、好ましくはBLASTプログラムを用いて測定される。
【0056】
本発明の第6の態様によれば、酵素乳酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図6に記載されたDNA配列またはその機能的変異体が提供される。
【0057】
本発明の第7の態様によれば、酵素乳酸パーミアーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図7Bに記載されたDNA配列またはその機能的変異体が提供される。
【0058】
本発明の第8の態様によれば、酵素アルコールデヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図8に記載されたDNA配列またはその機能的変異体が提供される。
【0059】
本明細書中では、機能的変異体とは、配列付加、欠失もしくは置換の結果として、または遺伝暗号の縮重によって、乳酸デヒドロゲナーゼ、乳酸パーミアーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドとハイブリダイズするDNA配列および/または該ポリペプチドをコードするDNA配列を含む。好ましくは変異体は、図に示される配列と少なくとも80%、さらに好ましくは90%、最も好ましくは95%の配列相同性を有する。相同性は、好ましくはBLASTプログラムを用いて測定される。
【0060】
本発明の第9の態様は、ldh突然変異体の安定性を改良する方法であって、pdc/adhオペロンを用いて遺伝子を発現することを含む改良方法も提供する。
【0061】
本発明の第10の態様は、本発明による組換えバシラスエスピーの組込み、および選択のための技法に関する。
【0062】
本発明の最後の第11の態様によれば、本発明に係るグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの産生方法であって、細胞増殖およびエタノール産生のためのpH、温度、酸化還元値および特定希釈速度の最適化発酵条件を含む産生方法が提供される。好ましくは発酵条件は、pH5.5〜7.5のpH範囲、40〜75℃の温度範囲、−360〜−400mVである酸化還元値、ならびに0.3〜0.8h−1の希釈速度を包含する。
【0063】
ここで、本発明による組換え細菌の産生を、図面を参照しながら、例示のみの目的で記載する。
【0064】
実施例
材料および方法
プラスミドpUBUCの構築
プラスミドpUC18およびpUB110を融合することにより、E.coli、および本発明に係る好熱性バシラス属株の間でDNAを転移することができるシャトルベクターを開発した。プラスミドpUB110は、カナマイシンに対する耐性を付与し、54℃までの温度で、バシラス・ステアロサーモフィルス中で複製することができ、黄色ブドウ球菌(Staphyloccocus aureus)から単離された、広範に用いられるベクターである(Narumi et al., 1992, Biotechnology Techniques 6, No.1)。プラスミドpUB110およびpUC18を、EcoR1およびBamH1を用いて線状化し、次に一緒に連結して、pUBUC(6.4kb)を作製した。プラスミドpUBUCは温度感受性レプリコンを有し、54℃より高い温度では複製することができず、このことがプラスミドpUBUCを、高温での相同的組換えによる遺伝子組込みのための理想的宿主にしている。
【0065】
プラスミドpMETHの構築
PCRにより、エジプトヘモフィルス(Haemophilus aeygptius)染色体DNAから、met遺伝子を含む1.1kb断片を増幅した。DNAシーケンシングにより遺伝子を確認した。met遺伝子をBamHIおよびXbaIを用いてトリミングし、次に、あらかじめBamHIおよびXbaIで線状化しておいた発現プラスミドpCL1920中でサブクローニングした。その結果生じたプラスミドpMETHを、E.coli TOP10中に形質転換させた。Tang et al(1994) Nuc. Acid Res. 22(14)に記載された方法を用いて、pMETHを保持するE.coli TOP10細胞を増殖させ、その後の形質転換およびin vivoメチル化するために培養を収集した。形質転換する前に、コンピテント細胞を−70℃で適宜に、アリコート中に保存した。
【0066】
PCR増幅
プライマーLDH7およびLDH8を用いて、PCRにより、TN染色体DNAからIE配列を増幅した。使用した反応体の濃度、およびPCR手法は、Expand(登録商標) High Fidelity PCR System(Roche Diagnostics)で推奨されたものであった。凍結乾燥細胞からのPCR増幅は、Geniusサーモサイクラー(Techne, Ltd., Cambridge)で、30サイクルした後に達成された。上流プライマーLDH7の配列は、5’−AAGCTT GAT GAA ATC CGG ATT TGA TGG−3’であり、下流プライマーLDH8の配列は、5’−TCTAGA GCT AAA TTT CCA AGT AGC−3’であった。これらのプライマーは、挿入配列と隣接するldh遺伝子配列から選択した。HindIII制限部位を上流プライマー中に導入し、XbaI制限部位を下流プライマーに導入して、その後のクローニングに都合のよい制限部位を作製した(導入部位に下線を付した)。
【0067】
プラスミドpUBUC−IEの構築
標準手法(Maniatis)を用いて、E.coliにおけるプラスミドDNAの操作、形質転換および単離を実施した。挿入配列を含む3.2kbPCR断片を、HindIIIおよびXbaIでトリミングし、次にプラスミドpUBUC中にクローニングした。その結果生じたpUBUC−IEと称するシャトルプラスミド(図5)は、54℃までの温度でE.coliおよびバシラス属株中で複製することができ、アンピシリンおよびカナマイシンに対する耐性を付与し、バシラス属株TN由来のIE配列を保持し得る
【0068】
PDCオペロンの構築
バシラス属株TNは、PFLまたはPDH経路を介して、細胞内代謝物質であるピルビン酸をアセチル−CoAに変換する。次にアセチル−CoAは、AcDHによる触媒反応によってアセトアルデヒドに、さらにADHによる触媒反応によって、エタノールに還元される。外来PDC酵素を導入することによって、PDCによるピルビン酸の脱カルボキシル化が起こり、アセトアルデヒドが生成し、さらにアセトアルデヒドが天然ADH酵素によりエタノールに還元されることを含む、エタノール産生のための代替的経路を細胞に提供する。PDCおよびADHはともに、ピルビン酸のエタノールへの変換に含まれる。
【0069】
プラスミドpZP−1由来のザイモモナス・モビリスpdcの発現が、突然変異株TNの細胞増殖、および安定性を改良することを、本発明者らは明らかにした。しかしながらエタノール産生の有意の増大は全く観察されなかった。そこで、pdc遺伝子の発現を増大させ、かつバシラス属TN由来の天然adh遺伝子を同時発現させることを本発明者らは決定した。
【0070】
プラスミドpZP−1においては、pdc遺伝子を、バシラス・ステアロテルモフィルスNCA1503由来のldhプロモーター配列の制御下に置いていたが、プロモーターをバシラスLN由来のldhプロモーターに変更することを決定した(構築物1)。本発明者らは次に、バシラスLN株由来のadh遺伝子をldhプロモーターの制御下に置いた(構築物2)。最後にpdc(ザイモモナス・モビリス由来)およびadh(バシラスLN由来)の両方を、ldhプロモーター配列の制御下に置いた(構築物3)。遺伝子はすべて、ザイモモナス・モビリス(pdc)およびバシラスLN株(ldhプロモーターおよびpdc)からPCRにより増幅し、適切な制限酵素でトリミングして、一緒に連結し、E.coliプラスミドベクター中にクローニングした。この3つの構築物を、複製可能シャトルベクターpUBUC、pFC1、または染色体組込みのための組込みシャトルベクターpUBUC−IE中にクローニングした。
【0071】
実施例1
TNの形質転換
プラスミドpMETHを保有するE.coli TOP10細胞での形質転換、増殖、および該細胞からの精製後に、プラスミドpUBUC−IEをin vivoでメチル化した。次にメチル化したpUBUC−IEを用いて、バシラス属株TNを形質転換した。600nmでの吸光度(A600)が0.5〜0.6に達するまで、バシラス属株TN細胞を50mlのTGP培地中、65℃で増殖させた。培養を氷上で15〜30分間冷却させた。遠心分離により細胞を収集し、10mlの冷TH緩衝液(272mMのトレハロースおよび8mMのHEPES;KOHを用いてpH7.5)中で1回、5mlの冷TH緩衝液中で2回洗浄した。細胞ペレットを400μlのTH緩衝液中に再懸濁して、電気穿孔する前に4℃で保存した。Narumi et al.(1992) Biotechnology Techniques 6(1)による上記の方法に基づいた電気穿孔により、メチル化プラスミドDNAを用いてTN株を形質転換した。コンピテント細胞を90μlのアリコート中に分配し、2μlのメチル化プラスミドDNA(250ng/μl)と混合した。混合物を冷電気穿孔キュベット(0.2cm電極ギャップ)に移して、氷上で5分間インキュベートした。次に懸濁液に25μFコンデンサからの2.5kV放電を施して、EquiBio EasyJect電気穿孔機を用いてパルス制御を201オームに設定した(時間定数、τ=5ms)。細胞を直ちに5mlの予熱TGPに移して、52℃で1時間インキュベートし、TGP寒天(10μg/mlカナマイシン)上で平板培養した。プレートを52℃で24〜48時間インキュベートした。
【0072】
組換え体の選択
以下の方法を用いて、相同的組換えによる温度感受性プラスミドpUBUC−IEの染色体組込みに関して選択した。
1.52℃で24時間、5mlのTGP(カナマイシン)培地中で、形質転換体を増殖させた。
2.50mlの新鮮なTGP(カナマイシン)培地に、O/N培養からの1mlを接種して、OD600が〜0.5に達するまで、52℃の振盪水浴中でインキュベートした。
3.15mlの上記培養を、4100rpmで5℃で5分間遠心分離し、ペレットを150μlのTGP(10:g/mlカナマイシン)培地中に再懸濁して、TGP(カナマイシン)プレート上に展着させた。
4.プレートを68℃で16時間インキュベートした。
5.単離コロニーを採取して、PCRにより挿入配列部位中へのプラスミド組込みに関して分析した。
【0073】
TN組込み体のスクリーニング
TN組込み体を68℃で単離した。TN組込み体中のLDHプライマーを用いてPCR産物を増幅できなかったことは、プラスミドpUBUC−IEの少なくとも1つのコピーが染色体中に組み込まれたことを示す。組込まれた結果、親菌株TNより、ldh復帰および「乗っ取り」に関して安定である新規の菌株TN−T9が見出された。
【0074】
菌株TN−T9の安定性
残留糖が培地中に存在するよう、復帰を容易にする条件である、最適下限の条件下において発酵を実行した。残留糖、ピルビン酸排出、ならびに設定条件からの多くの逸脱にもかかわらず、乳酸産生のいかなる痕跡も伴わずに、発酵が750時間続いた。エタノールは発酵を通して比較的大量に産生された。全発酵を通して、組込み体を選択するためにカナマイシンを用いなかった。これらの結果は、TN−T9におけるldh遺伝子突然変異が、実験条件(pH7.0、65℃、2%糖供給)下における連続培養において安定であることを示す。
【0075】
エタノール収率および産生性
グルコース、キシロースおよびグルコース/キシロースベースの原料からのエタノール産生のために、発酵条件を最適化した。
培養型: 連続
温度: 65℃
pH: 6.8
供給する糖濃度: 2〜10%
散布気体: 空気
酸化還元: >−350mV(空気流量により制御)
希釈速度: 0.36〜0.6h−1
これらの条件下において達成されたエタノール収率は、糖1g当たり0.4〜0.5gであった。エタノール産生性は、0.5h−1の希釈速度を用いた場合、2%および4%糖供給に関して、それぞれ約4gおよび8gエタノール/リットル/時間であった。
【0076】
実施例2
カナマイシン感受性株−TN−TKの選択
バシラス属TN−TKは、TN−T9のカナマイシン感受性誘導体である。この菌株は、ldh突然変異に関して完全に安定しており、選択マーカーとしてカナマイシンを含むプラスミド産生発現のための理想的宿主である。
【0077】
TN−T9をまず、カナマイシン(10μg/ml)を補充したTGP 5ml中、68℃で24時間増殖させた。約100mlの培養を2つのTGP(Km)寒天プレート上で展着させて、68℃で終夜インキュベートした。数百個のコロニーを得て、滅菌した爪楊枝を用いて100個のコロニーを新鮮なTGP(Km)プレートに移した。68℃で終夜増殖後、コロニーを新鮮なTGPプレートおよびTGP(Km)プレートに移して(レプリカ平板法により)、68℃で終夜増殖させた。
【0078】
2個のカナマイシン感受性コロニーがTGP上では得られたが、対応するTGP(Km)プレート上では得られなかった。これらのコロニー由来のldh遺伝子領域をPCRにより増幅し、TN−T9(親菌株)由来の崩壊ldh遺伝子とサイズが匹敵することを明らかにした。PCRを用いて、その菌株はカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を失っていたことを実証した。TN−TKと称する一誘導体をさらなる増殖実験のために選択した。これらの実験は、カナマイシン感受性およびldh突然変異が完全に安定しているということを確証した。
【図面の簡単な説明】
【図1】
挿入因子(IE)を含むDNA配列のヌクレオチド配列を示す図である。ここで、IE配列には下線を付してある。
【図2】
菌株TNの遺伝子的不安定性を示す模式図である。
【図3】
バシラス属突然変異株TNにおける単一交差組換えによる、LDH遺伝子不活性化のための方法を示す模式図である。
【図4】
750時間に及ぶ連続培養におけるバシラス属突然変異株TN−T9の安定性を示すグラフである。
【図5】
シャトルベクターpUBUC−IEの模式図である。
【図6】
バシラス属株LN由来の新規の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のDNA配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。
【図7】
(A)バシラス属株LN由来の新規の乳酸パーミアーゼ遺伝子の部分DNA配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。
(B)バシラス属株LN由来の新規の乳酸パーミアーゼ遺伝子の全DNA配列および翻訳アミノ酸配列を示す図である。
【図8】
バシラス属株LN由来の新規のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(下線)のDNA配列を示す図である。
【図9】
(A)バシラス属株TN−T9の開発および(B)バシラス属株TN−T9およびTN−TKの開発を示す模式図である。
【図10】
人工PDCオペロンの構築を示す図である。
【図11】
TN株由来のL−乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)のアミノ酸配列を示す図である。
【図12】
TN株由来のアルコールデヒドロゲナーゼ(adh)のアミノ酸配列を示す図である。
【図13】
IE配列によりコードされるトランスポゼースのアミノ酸配列を示す図である。
【図14】
IE配列によりコードされるトランスポゼースのアミノ酸配列を示す図である。
【図15】
IE配列によりコードされるトランスポゼースのアミノ酸配列を示す図である。
Claims (46)
- プラスミドおよび天然ldh遺伝子内の挿入因子(IE)配列の相同的組換えに基づくプラスミド組込み方法を用いたldh突然変異の安定化により、エタノール産生特性が強化されたグラム陽性細菌。
- 遺伝子突然変異を安定化するため、および発現可能遺伝子を挿入するための相同的組換えの方法を用いて形質転換された、好熱性グラム陽性細菌。
- 好熱性である、請求項1に記載のグラム陽性細菌。
- バシラス・ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)、バシラス・カルボデロックス(B. calvodelox)、バシラス・カルドテナックス(B. caldotenax)、バシラス・サーモグルコシダシウス(B. thermoglucosidasius)、バシラス・コアグランス(B. coagulans)、バシラス・リケニホルミス(B. licheniformis)、バシラス・サーモデニトリフィカンス(B. thermodenitrificans)およびバシラス・カルドリティクス(B. caldolyticus)から選択されるバシラスエスピーである、請求項1、2または3に記載のグラム陽性細菌。
- 前記バシラスエスピーは、バシラス・サーモグルコシダシウス株TN−T9(NCIMB受託番号NCIMB41075)である、請求項1〜4のいずれかに記載のグラム陽性細菌。
- 前記バシラスエスピーは、バシラス・サーモグルコシダシウス株TN−TK(NCIMB受託番号NCIMB41115)である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌。
- 図1に記載されたIE配列またはその機能的部分もしくは変異体を含むシャトルベクターで形質転換されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌。
- 前記IE配列またはその機能的部分もしくは変異体が、相同的組換えにより組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれている、請求項7に記載のグラム陽性細菌。
- 天然ldh遺伝子は、相同的組換えにより不活性化されている、請求項1〜8のいずれかに記載のグラム陽性細菌。
- 胞子形成欠陥性である、請求項1〜9のいずれかに記載のグラム陽性細菌。
- 前記天然ldh遺伝子は不活性化されており、かつ異種pdc遺伝子を発現する、請求項1〜10のいずれかに記載のグラム陽性細菌。
- 前記天然ldh遺伝子は、不可逆的に不活性化されている、請求項9、10または11に記載のグラム陽性細菌。
- 相同的組換えを含む方法であって、天然ldh遺伝子を不活性化し、かつ1つまたは複数の発現可能遺伝子を挿入する方法。
- 前記1つまたは複数の発現可能遺伝子は、pdc遺伝子およびadh遺伝子である、請求項13に記載の方法。
- 前記pdc遺伝子および前記adh遺伝子は、図1のIE配列に作動的に連結されたPDCオペロンの一部を形成する、請求項14に記載の方法。
- 前記異種pdc遺伝子は、ザイモモナス(Zymomonas)エスピー由来である、請求項13、14または15に記載の方法。
- 前記異種pdc遺伝子は、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)由来である、請求項13〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記adh遺伝子は、バシラスLN株由来である、請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 挿入配列およびPDCオペロンまたはその一部分は、前記組換え細菌の染色体中に安定的に組み込まれる、請求項13〜18のいずれか1項に記載の方法。
- E.coliおよびバシラス属株中で複製することができる、図5に記載されたシャトルベクターを用いることを含む,請求項13〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 図1に記載されたIE配列またはその一部分を保持するシャトルベクター。
- 図1のIE配列に作動的に連結されたpdc遺伝子を保持する、請求項21に記載のシャトルベクター。
- 前記pdc遺伝子は、PDCオペロンの一部を形成する、請求項22に記載のシャトルベクター。
- プラスミドDNAが相同的組換えにより細菌のldh遺伝子中に安定的に組み込まれたldh遺伝子を有する組換え細菌を選択する方法であって、前記ldh遺伝子を増幅するためにPCRを使用することを含む方法。
- 前記組換え細菌の前記ldh遺伝子からPCR産物を増幅できないことは、前記組換え細菌の前記染色体中に図1に記載されたIE配列またはその一部分が組込まれたこと示す、請求項23に記載の方法。
- 酵素乳酸デヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図6に記載されたDNA配列またはその機能的変異体。
- ストリンジェントな条件下で図6に記載されたDNA配列とハイブリダイズするか、または図6に記載されたDNA配列に縮重し、かつ酵素乳酸デヒドロゲナーゼの活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列。
- 酵素乳酸パーミアーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図7Bに記載されたDNA配列またはその機能的変異体。
- ストリンジェントな条件下で図7Bに記載されたDNA配列とハイブリダイズするか、または図7Bに記載されたDNA配列に縮重し、かつ酵素乳酸パーミアーゼの活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列。
- 酵素アルコールデヒドロゲナーゼの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、図8に記載されたDNA配列またはその機能的変異体。
- ストリンジェントな条件下で図8に記載されたDNA配列とハイブリダイズするか、または図8に記載されたDNA配列に縮重し、かつ酵素アルコールデヒドロゲナーゼの活性を有するポリペプチドをコードするDNA配列。
- トランスポゼースの生物学的活性を有する1つまたは複数のポリペプチドをコードし、かつ挿入配列として分類されている、図1に記載されたDNA配列またはその一部分もしくは機能的変異体。
- 好熱性バシラス属株TN由来である、請求項32に記載のDNA配列。
- 図1における残基652〜残基3800に示される配列またはその機能的変異体もしくは一部によりコードされる1つまたは複数のポリペプチドであって、トランスポゼースの生物学的活性を有する、1つまたは複数のポリペプチド。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、発酵培地のpHがpH5.5〜7.5の範囲内である最適化発酵条件を用いることを含む製造方法。
- 前記発酵培地のpHは、好ましくはpH6.0〜7.0である、請求項35に記載の製造方法。
- 前記発酵培地のpHは、好ましくはpH6.4〜6.9である、請求項35または36に記載の製造方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、発酵培地の温度が40〜75℃の範囲内である最適化発酵条件を用いることを含む製造方法。
- 前記発酵培地の温度は、好ましくは52〜70℃である、請求項38に記載の製造方法。
- 前記発酵培地の温度は、好ましくは60〜68℃である、請求項38または39に記載の製造方法。
- 細菌発酵によるエタノールの製造方法であって、培養内空気散布を用いて酸化還元電位が−360〜−400mVであるようにすることを含むプロセス。
- 前記酸化還元値は、好ましくは−370〜−380mVである、請求項41に記載の製造方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌における請求項40または41に記載の製造方法。
- 供給希釈速度が0.3〜0.8h−1である、請求項1〜12のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の細菌発酵によるエタノールの連続製造方法。
- 前記供給希釈速度は好ましくは0.4〜0.6h−1である、請求項43に記載の製造方法。
- 用いられる細菌がバシラス属株TNである、請求項35〜44のいずれかに一項に記載の製造方法。
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