JP2009509520A

JP2009509520A - 微生物の培養方法

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Publication number: JP2009509520A
Application number: JP2008532880A
Authority: JP
Inventors: アトキンソン，アンソニー; クリップス，ロジャー; エリー，カースティン
Original assignee: ティーエムオーリニューアブルズリミティド
Priority date: 2005-10-06
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2009-03-12
Also published as: AU2006298543B2; CN101283101A; ZA200802933B; BRPI0616908A2; US20080305536A1; EP1931793A1; EA013467B1; AU2006298543A1; WO2007039753A1; EP1931793B1; NO20082062L; EA200800711A1; NZ566781A; CA2623364A1; KR20080056180A; GB0520344D0

Abstract

本発明は、エタノールの製造に好適な好熱性微生物の生産方法であって、以下のステップ：（ｉ）好適な培養基中、好気又は嫌気条件下で好熱性微生物を培養し、そして（ii）上記培養基中に一定量のエタノールを取り込んでエタノール耐性を誘導する、を含む前記生産方法である。

Description

本発明の分野
本発明は、細菌発酵の産物としてのエタノールの製造に好適な微生物の生産に関する。

本発明の背景
細菌の代謝は、細菌の種及び環境条件に従ってさまざまな異なるメカニズムを通じて生じうる。全ての病原体を含む有機従属栄養細菌は、有機化合物の酸化からエネルギーを獲得し、ここで、炭水化物（特にグルコース）、脂質、及びタンパク質は、最も一般的な酸化される化合物である。細菌によるこれらの有機化合物の生物学的酸化は、化学的エネルギー源としてＡＴＰの合成をもたらす。このプロセスは、生合成反応のために細菌細胞により要求されるより単純な有機化合物（前駆体分子）の生成をも許容する。細菌が好適な基質を代謝するところの一般的なプロセスは解糖であり、これは、ＡＴＰの生成を伴ってグルコースをピルビン酸（ピルベート）に変換する一連の反応である。代謝エネルギーの生成におけるピルビン酸（ピルベート）の運命は、微生物及び環境条件に依存して変化する。３つの基本的なピルベートの反応が在る。

第１に、好気条件下、多くの微生物は、クエン酸回路、及びピルベート・デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）により触媒される、ピルベートからアセチル・コエンザイムＡへの変換を用いてエネルギーを生成するであろう。

第２に、嫌気条件下、特定のエタノール産生生物は、ピルベート・デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）により触媒される、ピルベートからアセトアルデヒドへの脱炭酸、及びその後の、アルコール・デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により触媒される、ＮＡＤＨによる、アセトアルデヒドからエタノールへの反応により、アルコール発酵を行うことができる。

第３のプロセスは、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）による触媒を通じて生じる、ピルベートからラクテートへの変換である。

天然に嫌気発酵を経験する微生物の使用によるか又はエタノールの製造に関係する遺伝子を取り込んだ組換え微生物の使用を通じてのいずれかによる、エタノールの製造のための微生物の使用は高い関心を集めている。これらの微生物を使用することによるエタノールの製造におけるいくつかの成功があるけれども、特に、微生物が低いレベルのエタノール耐性を有する場合には、エタノールの濃度が上昇することにより、発酵はしばしば傷つけられる。

好熱性細菌は、エタノールの製造のために提案されており、そしてそれらの使用は、５０℃を超える温度で蒸気として製造されたエタノールが除去されることを可能にする高温で発酵が実施されうるという利点を有し；これは、高い糖濃度を用いて発酵が実施されることをも可能にする。しかしながら、エタノールを効率的に製造しうる好適な好熱性細菌を発見することはやっかいである。

ＷＯ０１／４９８６５は、エタノールの製造のための、ピルベート・デカルボキシラーゼをコードする外来遺伝子で形質転換されており、そして天然のアルコール・デヒドロゲナーゼ機能を有しているグラム陽性バクテリアを開示する。この細菌は、好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）であり、そしてこの細菌は、トランスポゾン挿入を用いた乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化により、修飾されうる。ＷＯ０１／４９８６５中に開示される細菌は全て、バチルス株ＬＬＤ−Ｒ、すなわち、培養から自然に生じる胞子形成欠陥株であって、ｌｄｈ遺伝子が、自然突然変異又は化学的突然変異誘発により失活されているものに由来する。株ＬＮ及びＴＮは、株ＬＬＤ−Ｒの改良された誘導体として開示されている。しかしながら、全ての株が、プラスミドの形質転換を妨げるＨａｅIIIタイプの制限酵素系を含み、そしてそれゆえ、非メチル化ＤＮＡ内の形質転換を妨害する。

ＷＯ０１／８５９６６は、上記の制限問題を克服するためにインビボにおけるメチルにより調製される微生物を開示する。これは、ヘモフィラス・エージプティアス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓａｅｇｙｐｔｉｕｓ）からのＨａｅIIIメチルトランスフェラーゼを用いた、株ＬＬＤ−Ｒ、ＬＮ、及びＴＮへの形質転換を要求する。しかしながら、株ＬＬＤ−Ｒ、ＬＮ、及びＴＮは、不安定な突然変異体であり、そして特に、低いpHで、及び高い糖濃度で、乳酸を生産する野生型の株へ自然に戻ってしまう。これは、エタノールからラクテートへの発酵産物の変化をもたらし、エタノール生産に適していない株を作り出してしまう。

ＷＯ０２／２９０３０は、株ＬＬＤ−Ｒ及びその誘導体が、ｌｄｈ遺伝子のコーディング領域内に天然の挿入要素（ＩＥ）を含むことを開示している。これのｌｄｈ遺伝子内への（及びｌｄｈ遺伝子からのこれの）トランスポジション、並びにその後の遺伝子の不活性化は不安定であり、リバーションをもたらしてしまう。これに対する提案された解決策は、プラスミドＤＮＡをＩＥ配列内に組み込むことであった。

それゆえ、エタノール製造のための微生物の生産は、実験室で生産された化学的に突然変異されたバチルス微生物を修飾すること、これらを、インビボにおけるメチル化手順で処理すること、そしてさらに、プラスミドＤＮＡをＩＥ配列内に組み込むように、当該微生物をさらに修飾することに頼っている。この手順は、複雑、かつ、確実ではなく、そして当該株がどのように使用されうるかについての調節上の問題もある。
それゆえ、エタノール製造のための改良された微生物の必要性が在る。

本発明の概要
本発明の第１の局面によれば、エタノールの製造に好適な好熱性微生物の生産方法であって、以下のステップ：
（ｉ）好適な培養基中で好気又は嫌気条件下で好熱性微生物を培養し；そして
（ii）エタノールの上昇する量を上記培養基中に取り込んで、エタノール耐性を誘導する、
を含む前記生産方法が提供される。

本発明の説明
本発明は、エタノールに対してより抵抗（耐）性であり、そしてそれゆえ、エタノールをより良好に製造しうる微生物を作り出すための好熱性微生物の処理に基づく。微生物のエタノール耐性を高めることは、それらの発酵の間に製造されたエタノールに対して、当該微生物がより耐性になることを可能にする。これは、発酵の改良につながる。

上記好熱性微生物の生産方法は、好適な培養基中、好気又は嫌気条件下、当該好熱性微生物を培養し、そして上記培養基中にエタノールの一定量を取り込んでエタノール耐性を誘導することを含む。１の態様においては、培養基中のエタノールを高めることは、時間の経過に従って、そして通常、増分（段階的増加）において実施されて、当該微生物は、当該培地中の高められたエタノールに馴れるようになる。３％ｗ／ｖの最終濃度までエタノールを取り込み、そしてその後、培地中のエタノールの濃度が少なくとも６％ｗ／ｖ、より好ましくは少なくとも７．５％ｗ／ｖになるまで、０．５％ｗ／ｖ以下毎にエタノール濃度を上昇させることが好ましい。１の態様においては、開始時の培養基は３％ｗ／ｖのエタノールを含み、そしてこれは、その後０．５％増分で６％ｗ／ｖまで、そしてその後、０．２５％増分で７．５％ｗ／ｖまで高められる。

この手順の間（最中）、細胞密度はモニターされて、細胞（成長）増殖が継続していることが保証される。好ましくは、（ＯＤ６００nmにより測定される）細胞密度が、エタノール濃度が上昇するに従って、２５％超で低下し、そして低下し続ける場合、エタノールの濃度は、以前の最も高いレベルまで低下するように放置され、そして培養は、エタノール処理を続ける前に、再樹立される。

より高いエタノール耐性をもつ好熱性生物の生産のための代替方法は、適当な培養基中、好気又は嫌気条件下、好熱性微生物を連続的に培養することを含む。一旦、培養基が、定常状態、すなわち、当該生物の成長が、（ＯＤ６００nmにより測定されるとき）一定速度に達したら、エタノールの一定量が、１回の添加で、培養基に添加されて、特定の所望濃度まで、例えば、培養の設定作業容量の１０又は２０％ｗ／ｖまで、エタノールをもっていく。連続培養は、低い希釈率、好ましくは０．０８〜０．１５ｈ^-1で続けられ、好熱生物の元の成長率が（ＯＤ６００nmにより測定したとき）回復されるまで、エタノール濃度のゆっくりとした低下を許容する。この時点で、エタノールの２回目の量が、１回目の量と同じで、かつ、１回の添加で、培養基に添加されて、再び、エタノールが、特定の所望濃度にもっていかれる。培養を、元の成長率まで回復せしめるプロセスは、繰り返され、そしてさらに、培養が、速く回復することが見つかるまで、エタノールのさらなるバッチが添加され、これは、２４時間未満として行われる。この時点で、２つの結果の内の１つが生じるであろう。エタノール耐性株が、所望のエタノール濃度、好ましくは、７．５％ｗ／ｖ超でサブ培養することにより、この培養から選択されるか、又はより多量のエタノールが培養に添加され、そしてエタノールの添加、そしてその後の成長率の回復というプロセスが繰り返される。

微生物は、０．０８〜０．５の希釈率で、炭素制限基質とともに５５〜６５℃で、かつ、６．０〜７．５（好ましくは６．３〜７．２）のpHで、所定の培地中で、培養されうる。

バッチ培養においては、前記したプロセスに類似するプロセスが、行われ、過剰の炭素を含む好適な培地中で培養され、そしてエタノールが初期対数増殖期に添加される。次いで、この初期培養からの細胞が、対数増殖期の終わりに、新鮮フラスコを接種するために使用されることができ、ここで、増分量のエタノールが再び初期対数増殖期に添加される。この手順が繰り返されて、エタノールの増分量が、初期対数増殖期に培養基に添加される。

本発明において使用される好熱性微生物は、エタノール生合成のための関連の生化学経路に関連する遺伝子の発現を破壊し又は強化するように、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊するように、修飾されうる。これは、ラクテート生産から遠ざかり、かつ、エタノール生産に向かってピルベート代謝が攻撃されることをもたらし、ラクテート陰性突然変異体において強化されたエタノール・レベルが観察される。

乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化は、ピルベートからラクテートへの分解を防止するのを助け、そしてそれゆえ、ピルベート・デカルボキシラーゼ及びアルコール・デヒドロゲナーゼを用いたピルベートからエタノールへの分解を（適当な条件下で）促進する。

野生型微生物は、いずれかの好熱性微生物でありうるが、微生物がバチルス種である場合が、好ましい。特に、微生物が、ゲオバチルス種（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃｉｅｓ）、特に、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）である場合が好ましい。

微生物は、「野生型」であることができ、すなわち、それらは、実験室で作られた突然変異体ではない。微生物は、好熱菌を含むことが疑われる環境サンプルから単離されうる。単離された野生型微生物は、エタノールを作り出す能力を有するであろうが、修飾されていない場合には、ラクテートが、主要な発酵産物であろう。単離物は、好熱温度においてヘキソース及び／又はペントース上で成長しうる能力についても選択される。非野生型の、突然変異体の、微生物も使用されうる。

本発明に係る微生物は、発酵プロセスにおいて微生物が使用されることを可能にする一定の所望の特性を有する。微生物は、好ましくは、制限系を有するべきではなく、それにより、インビボにおけるメチル化の必要性を回避すべきである。さらに、微生物は、セルビオース及びデンプンを含む、基質としてＣ５及びＣ６糖を利用する能力を有すべきである。微生物は高頻度で形質転換されうる場合が好ましい。さらに、微生物は、０．３hr^-1超の、連続培養における成長率を有すべきである。

微生物は、好熱性であり、そして４０〜８５℃の温度範囲で成長するであろう。好ましくは、微生物は、５０〜７０℃の温度範囲内で成長（増殖）するであろう。さらに、微生物は、pH６．５以下の、特にpH６．５〜pH４．５の条件で成長することが望ましい。

乳酸デヒドロゲナーゼの核酸配列は、現在、知られている。この配列を用いて、当業者は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を標的として、様々なメカニズムを通して当該遺伝子の不活性化を達成することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、トランスポゾンの挿入、又は好ましくは、当該遺伝子配列又はその部分の欠失により、不活性化される。欠失が好ましい。なぜなら、これは、トランスポゾンによる不活性化が使用されるときにしばしば経験される遺伝子配列の再活性化の困難さを回避するからである。好ましい態様においては、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、温度感受性プラスミド（プラスミドｐＵＢ１９０−ｌｄｈ）の組み込みにより不活性され、これにより、プラスミドと微生物の染色体の間の天然の相同的組換え又は組み込みが達成される。染色体の組み込み物は、抗菌剤（カナマイシン）に対する耐性に基づき、選択されうる。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子内への組み込みは、単一の交差組換え事件により、又は２重（それ以上の）交差組換え事件により、生じうる。

好ましい態様においては、微生物は、外来（異種）アルコール・デヒドロゲナーゼ遺伝子と異種ピルベート・デカルボキシラーゼ遺伝子を含む。これらの異種遺伝子の発現は、エタノールが主要な発酵産物であるような代謝を指令する（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）酵素の製造をもたらす。これらの遺伝子は、ザイモモナス（ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）種、例えば、ザイモモナス・モビリス（ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）を含む、好気発酵を典型的に経験する微生物から取得されうる。

上記遺伝子の調製及び上記遺伝子の微生物内への取り込みのための方法は、例えば、Ｉｎｇｒａｍｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ＆ＢｉｏＥｎｇ，１９９８；５８（２＋３）：２０４−２１４、及び米国特許第５，９１６，７８７号（これらの各々の内容を、本明細書中に援用する）中に知られている。当業者により理解されるように、遺伝子は、プラスミド内に導入され又は染色体内に組み込まれうる。

本発明に係る微生物は、選択される好熱性微生物に依存して、慣用の培養条件下で培養されうる。基質、温度、pH、その他の培養条件の選択は、知られた培養の要求に基づき選択されうる。例えば、ＷＯ０１／４９８６５及びＷＯ０１／８５９６６を参照のこと。好適な培養及び発酵条件を以下の表１，２、及び３に示す。

本発明を、添付図面を参照して、以下の実施例中に説明する。

実施例
以下の培地を調製した：
ＳＡＭ２−Ｌ当り
酵母エキス１．０ｇ
トリプトン０．５ｇ
ＮＨ₄Ｃｌ１．０ｇ
ＮａＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２ｇ
ＫＣｌ０．２ｇ
ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ３mg（３０mg／mLストックの１００μＬを添加）
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ５mg（５０mg／mLストックの１００μＬを添加）
ＰＩＰＥＳバッファー１２．０９６ｇ

希釈水中の合計体積：９５０mL、ＮａＯＨ又はＨ₂ＳＯ₄でpH７．０に調整し、オートクレーブ処理した。
冷却後、２．５mLのスルフェート微量元素保存溶液を、５０mLの２０％濾過滅菌糖溶液とともに、添加した（表２参照）。

修正ＵＳ（尿素塩）培地（ＵＳＭ）
グルコース１０．０ｇ／Ｌ
酵母エキス０．８ｇ／Ｌ
クエン酸０．４２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ₄ ０．３１ｇ／Ｌ
ＮａＨ₂ＰＯ₄ ３．１ｇ／Ｌ
Ｋ₂ＳＯ₄ ３．５ｇ／Ｌ
尿素３．０ｇ／Ｌ
ＣａＣｌ₂ ２mg／Ｌ
Ｎａ₂ＭｏＯ₄ ４mg／Ｌ
微量元素溶液（表２）５．０ml／Ｌ

固体培地のためには、２０．０ｇ／Ｌのバクト−アガーを添加した。３ＭＮａＯＨで、滅菌前にpH７．０に調整した。

ＴＧＰ培地
バクト・トリプトン１７．０ｇ／Ｌ
大豆ペプトン３．０ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ５．０ｇ／Ｌ
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２．５ｇ／Ｌ
ピルビン酸ナトリウム４．０ｇ／Ｌ
グリセロール４．０mL／Ｌ

固体培地のためには、２０．０ｇ／Ｌのバクト−アガーを添加した。培地を、３ＭＮａＯＨで、滅菌前にpH７に調整した。
野生型生物（ＮＣＩＭＢ１１９５５）のエタノール耐性を、出発点を決定するために、試験した。この生物を、一夜培養し（ＬＢ寒天プレート、６０℃）、そしてコロニーを、一夜培養物（１００mL ＵＳＭ、１％グルコース、６０℃、２５０rpm）を接種するために使用した。次いで、この培養物を、０，１，２，３、又は４％エタノールを含む３連の、１シリーズのフラスコを接種するために使用し、そしてこれらをその後、成長が計測されるまで３６時間培養した（５０mL ＵＳＭ、１％グルコース、６０℃、２５０rpm）。結果を図１に示す。図１は、ＮＣＩＭＢ１１９５５が４％超のエタノールに耐性でないことを示唆する。

比較のための基準として上記結果を用いて、突然変異体ＴＭ８９のエタノール耐性を、８％ｖ／ｖエタノールまで高めるための実験を行った。

発酵方法
微生物：ＧｔＴＭ−８９
接種物：５０ml ２×ＹＴ培養物（７％ｖ／ｖ）
装置：ＬＨガラス発酵槽（７００ml実効容量）
Ａｎｇｌｉｃｏｎ制御システムにより温度pH制御マグ
ネチック・スターラーで混合
設定値：温度：６０℃
pH：６．８０
空気：０．２〜０．４vvm
撹拌速度：２２５rpm
ＷａｔｓｏｎＭａｒｌｏｗＰｕｍｐによりフロー
レート制御（０〜１００ml／hr）
培地：ＳＡＭ２２％グルコース、０．０５％有機消泡剤（
培地シート参照）１０％ＮａＯＨを用いてpH制御
エタノール・スパイク（添加）７５ml又は１５０mlエタノール（１０〜２０％スパイ
ク）

採用した戦略を以下に示す：
１）一定状態を達成し、そして生成物の収率／糖の利用を計測すること；及び
２）エタノールで培養物をスパイクし、培養を回復せしめ（時間の経過とともにエタノールを消失させ）、サンプルを取り出し、そしてグリセロール・ストックを調製し、必要なとき、ステップ（２）を繰り返すこと。

エタノール耐性を評価するために、以下のプロトコールを開発した。
１．２つの滅菌ユニバーサルにＴＧＰブロス５mlを添加する。
２．各管に、ＴＭ−８９とＴＭ８９−１グリセロール・ストック１００μｌをそれぞれ添加する。
３．振とうしながら６０℃で５〜６時間培養する（それゆえ、活性細胞であり、それらは対数増殖期にあるべきである）。
４．各ブロスのＯＤ₆₀₀を計測する（それゆえ、０Ｄ₆₀₀の出発点を知る）。
５．０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％（ｖ／ｖ）を含有する１０ml ＴＧＰブロスの最終容量を含む１１本の滅菌ユニバーサル管を調製する。
６．ステージ１＋２からの対応の５ml ＴＧＰブロスからの細胞１００μｌを各管に接種する。
７．振とうしながら６０℃で一夜培養する。
８．各管から１ml取り出し、１：５に希釈し、そしてＨ₂Ｏブランクに対してＯＤ⁶⁰⁰を計測する。

結果を以下のように分析した：
（１）ＪｅｎｏｎｓＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて培養物の光学密度（吸光度）を計測した〔細胞濃度（ｇ／Ｌ）はＡ₆₀₀×０．３から計算された〕。
（２）グルコース濃度を、血液グルコース・メーター（Ｒｏｃｈｅ）を用いて計測した。
（３）エタノール濃度を、（Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍにより供給された）酵素ベースのアッセイ・キットを用いて計測した。

結果を図２に示す。発酵の終りに単離された株は、ＴＧＰ中、及び一定範囲のエタノールの濃度のＴＧＰ中で、出発ＴＭ８９株よりも、一貫して高いＯＤ値を示した。５％エタノールでの成長において有意差が存在し、これは、改良されたエタノール耐性を示すものである。

原文に記載なし。

Claims

エタノールの製造に好適な好熱性微生物の生産方法であって、以下のステップ：
（ｉ）好適な培養基中、好気又は嫌気条件下で好熱性微生物を培養し；及び
（ii）一定量のエタノールを上記培養基中に取り込んで、エタノール耐性を誘導する、
を含む前記生産方法。
増加量のエタノールが前記培養基中に添加され、ここで、当該微生物が、エタノールの次の増分添加に先立って、上記添加されたエタノールに馴される、請求項１に記載の方法。
前記エタノールが、少なくとも３％ｗ／ｖの最終濃度まで取り込まれる、請求項１又は２に記載の方法。
前記エタノールが、少なくとも６％ｗ／ｖの最終濃度まで取り込まれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記エタノールが、少なくとも７．５％ｗ／ｖの最終濃度まで取り込まれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記エタノールが、０．５％ｗ／ｖ以下の増加で取り込まれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
前記エタノールが、初期対数増殖期に前記培養基に取り込まれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物が、失活した乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物が制限系を含まない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物が、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物が非天然ｐｄｃ遺伝子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記微生物が、非天然ａｄｈ遺伝子を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。