BRPI0616908A2

BRPI0616908A2 - método para cultivar microorganismos

Info

Publication number: BRPI0616908A2
Application number: BRPI0616908-2A
Authority: BR
Inventors: Anthony Atkinson; Roger Cripps; Kirstin Eley
Original assignee: Tmo Renewables Ltd
Priority date: 2005-10-06
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2011-07-05
Also published as: JP2009509520A; AU2006298543B2; CN101283101A; ZA200802933B; US20080305536A1; EP1931793A1; EA013467B1; AU2006298543A1; WO2007039753A1; EP1931793B1; NO20082062L; EA200800711A1; NZ566781A; CA2623364A1; KR20080056180A; GB0520344D0

Abstract

MéTODO PARA CULTIVAR MICROORGANISMOS. A presente invenção é um método para a produção de microorganismos termofílicos adequados para a produção de etanol, que compreende: (i) cultivar um microorganismo termofílico em condições aeróbicas ou anaeróbicas em um meio de cultura adequado; e (ii) incorporar quantidades de etanol ao meio de cultura para induzir tolerância ao etanol.

Description

MÉTODO PARA CULTIVAR MICROORGANISMOS

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se à produção demicroorganismos adequados para a produção de etanol como umproduto da fermentação bacteriana.Fundamentos da Invenção

0 metabolismo bacteriano pode ocorrer através devários mecanismos diferentes, dependendo da espéciebacteriana e das condições ambientais. As bactériashetrotróficas, que incluem todos os patógenos, obtêmenergia da oxidação de compostos orgânicos, com oscarboidratos (particularmente a glicose), os lipidios e aproteína sendo os compostos mais comumente oxidados. Aoxidação biológica destes compostos orgânicos por bactériasresulta na síntese do ATP como a fonte de energia química.O processo também permite a geração de compostos orgânicosmais simples (moléculas precursoras), que são exigidos pelacélula bacteriana para reações biossintéticas. O processogeral pelo qual as bactérias metabolizam substratosadequados é a glicólise, que é uma seqüência de reações queconverte a glicose em piruvato com a geração de ATP. Odestino do piruvato na geração de energia metabólica variade acordo com o microorganismo e as condições ambientais.Há três reações principais do piruvato.

Em primeiro lugar, em condições aeróbicas, muitosmicroorganismos gerarão energia utilizando o ciclo do ácidocítricô e a conversão do piruvato na acetil coenzima A,catalisada pela piruvato desidrogenase (PDH).

Em segundo lugar, em condições anaeróbicas,determinados organismos etanologênicos podem efetuar afermentação alcoólica pela descarboxilação do piruvato emacetaldeído, catalisada pela piruvato descarboxilase (PDC)e a subseqüente redução do acetaldeído em etanol pela NADH,catalisada pela álcool desidrogenase (ADH).

Um terceiro processo é a conversão do piruvato emlactato, que ocorre por meio da catálise pela lactatodesidrogenase (LDH).

Tem havido muito interesse na utilização demicroorganismos para a produção de etanol com a utilizaçãoou de microorganismos que passam por fermentação anaeróbicanaturalmente ou com a utilização de microorganismosrecombinantes que incorporam genes envolvidos na produçãode etanol. Embora tenha havido algum sucesso na produção deetanol com a utilização destes microorganismos, afermentação é freqüentemente comprometida pelo aumento daconcentração do etanol, especialmente no caso de omicroorganismo ter um nivel baixo de tolerância ao etanol.

Bactérias termofilicas foram propostas para aprodução de etanol, e sua utilização tem a vantagem de afermentação poder ser efetuada a temperaturas elevadas, oque permite que o etanol produzido seja removido como vapora temperaturas acima de 50°C; isto permite também que afermentação seja efetuada com a utilização de concentraçõesde açúcar elevadas. Entretanto, é problemático encontrarbactérias termofilicas adequadas que possam produzir etanolde maneira eficaz.

O documento WOOl/49865 revela uma bactéria Grampositiva que foi transformada com um gene heterólogo quecodifica a piruvato descarboxilase e que tem a função daálcool desidrogenase nativa, para a produção de etanol. Abactéria é um Bacillus termofilico, e a bactéria pode sermodificada pela inativação do gene da lactato desidrogenasecom a utilização da inserção de transpossono. As bactériasreveladas em WOOl/49865 são todas derivadas da Cepa LLD-Rdo Bacillus, uma cepa deficiente em esporulação que surgiuespontaneamente da cultura, e na qual o gene Idh foiinativado por mutação espontânea ou por mutagênese química.As cepas LN e TN são reveladas como derivados aperfeiçoadosda cepa LLD-R. Entretanto, todas as cepas contêm um sistemade restrição do tipo Hae III, que impede a transformação doplasmídio e impede, portanto, a transformação dentro do DNAdesmetilado.

O documento WOOl/85966 revela microorganismos quesão preparados por metilação in vivo para superar osproblemas de restrição. Isto requer a transformação com ametiltransferase de Hae III do Haemophilus aegyptius nascepas LLD-R, LN e TN. Entretanto, as cepas LLD-R, LN e TNsão mutantes instáveis e revertem espontaneamente paracepas do tipo selvagem produtoras de lactato,particularmente a um pH baixo em concentrações de açúcarelevadas. Isto resulta em alterações no produto defermentação do etanol para o lactato, tornando as cepasinadequadas para produção de etanol.

O documento W002/29030 revela que a cepa LLD-R eseus derivados incluem um elemento de inserção (IE) queocorre naturalmente na região de codificação do gene Idh. Atransposição deste para dentro (e para fora) do gene Idh ea subseqüente 1 inativação do gene são instáveis, o queresulta em reversão. A solução proposta para isto foi a deintegrar o DNA do plasmidio na seqüência de IE.

Portanto, na técnica, a produção demicroorganismos para produção de etanol conta com amodificação de microorganismos do Bacillus quimicamentemodificados produzidos em laboratório, com o tratamentodestes com procedimentos de metilação in vivo e também coma modificação dos microorganismos para integrar o DNA doplasmídio na seqüência de ΙΕ. 0 procedimento é complexo,incerto, e há problemas de regulação sobre como as cepaspodem ser utilizadas.

Há, portanto, necessidade de microorganismosaperfeiçoados para produção de etanol.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da presenteinvenção, um método para a produção de microorganismostermofilicos adequados para a produção de etanolcompreende:

(i) cultivar um microorganismo termofilico emcondições aeróbicas ou anaeróbicas em ummeio de cultura adequado; e

(ii) incorporar quantidades crescentes deetanol ao meio de cultura para induzirtolerância ao etanol.

Descrição da Invenção

A presente invenção é baseada em um tratamento deum microorganismo termofilico para tornar o microorganismomais tolerante ao etanol e, portanto, mais capaz deproduzir etanol. O aumento da tolerância dosmicroorganismos ao etanol permite que os microorganismossejam mais resistentes ao etanol produzido durante suafermentação. Isto permite o aperfeiçoamento na fermentação.

0 método para a produção dos microorganismostermofilicos envolve cultivar os microorganismostermofilicos em condições aeróbicas ou anaeróbicas em ummeio de cultura adequado e incorpora quantidades de etanolao meio de cultura de modo a se induzir tolerância aoetanol. Em uma modalidade, o aumento do etanol no meio decultura é efetuado ao longo do tempo e usualmente emincrementos, de modo a permitir que os microorganismos seadaptem ao aümento de etanol no meio. É preferívelincorporar etanol até uma concentração final de 3% p/v e emseguida aumentar a concentração de etanol em 0,5% p/v, oumenos, até que a concentração de etanol no meio seja depelo menos 6% p/v, mais preferivelmente de pelo menos 7,5%p/v. Em uma modalidade, o meio de cultura inicialcompreende 3% p/v de etanol, e isto é então aumentado emincrementos de 0,5% a 6% p/v e, em seguida, em incrementosde 0,25% a 7,5% p/v.

Durante este procedimento, a densidade celularpode ser monitorada de modo a assegurar que o crescimentodas células esteja continuando. De preferência, se adensidade celular (determinada por um diâmetro externo (OD)de 600 nm) cai em mais de 25% e continua a declinar àmedida que a concentração de etanol é aumentada, em seguidadeixa-se que a concentração de etanol caia até o nivel maiselevado anterior e a cultura restabelecida antes de secontinuar com o tratamento do etanol.

Um método alternativo para a produção deorganismos termofílicos com uma tolerância ao etanol maiselevada envolve o cultivo continuo dos microorganismostermofílicos em condições aeróbicas ou anaeróbicas em ummeio de cultura apropriado. Uma vez que a cultura tenhaatingido um estado estável, no qual o crescimento doorganismos atingiu uma taxa constante (determinada pelo ODde 600 nm) , uma quantidade de etano é adicionada, em umaadição, à cultura de modo a se levar o etanol a umaconcentração desejada específica, como, por exemplo, de 10ou 20% p/v do volume operacional estabelecido da cultura. Acultura contínua é continuada a uma taxa de diluição baixa,de preferência 0,08-0,15 h"1, permitindo a lenta redução daconcentração de etanol, até que a taxa de crescimentooriginal do organismo termofílico seja restaurada (conformedeterminado pelo OD de 600 nm) . Neste ponto, uma segundaquantidade de etanol é adicionada, a mesma quantidade daprimeira e em uma adição, à cultura, mais uma vez de modo ase levar o etanol a uma concentração desejada especifica. 0processo de permitir que a cultura recupere a taxa decrescimento original, e outras bateladas de etanol sãoadicionadas até se verificar que a cultura se recuperarapidamente, isto sendo considerado como menos de vinte equatro horas. Neste ponto, um dos dois resultados ocorrerá.

Ou cepas tolerantes ao etanol são selecionadas destacultura por sub-cultivo à concentração desejada de etanol,de preferência acima de 7,5% p/v, ou quantidades maiores deetanol são adicionadas à cultura e o processo de adição deetanol seguido da recuperação da taxa de crescimento érepetido.

Os microorganismos podem crescer em meiosdefinidos a 55°G-65°C com um substrato limitado de carbonoe um pH de 6,0 a 7,5 (de preferência de 6.3 a 7,2) à taxade diluição de 0,08 a 0,5.

Na cultura por bateladas, pode ser executado umprocesso semelhante ao processo descrito acima, com ocrescimento em qualquer meio adequado, com o carbonoexcedente e o etanol sendo adicionados na fase Iog inicialde crescimento. As células desta cultura inicial podem serentão utilizadas no final da fase Iog de crescimento demodo a se inocular um frasco novo, com uma quantidadeincrementai de etanol sendo adicionada ao meio de culturana fase Iog inicial.

Os microorganismos termofilicos a seremutilizados na presente invenção podem ser modificados paraquebrar ou aperfeiçoar a expressão dos genes envolvidos nasvias bioquímicas relevantes para a biossíntese do etanol,como, por exemplo, a ruptura do gene da lactatodesidrogenase. Isto resulta na canalização do metabolismodo piruvato para longe da produção de lactato e na direçãoda produção de etanol, com níveis aumentados de etanolobservados em mutantes negativos de lactato.

A inativação do gene da lactato desidrogenaseajuda a prevenir a decomposição do piruvato em lactato e,portanto, promove (em condições apropriadas) a decomposiçãodo piruvato em etanol com a utilização da piruvatodescarboxilase e da álcool desidrogenase.

O microorganismo do tipo selvagem pode serqualquer microorganismo termofílico, mas é preferível que omicroorganismo seja do Bacillus spp. Em particular, épreferível que o microorganismo seja da espécieGeobacillusr em particular Geobacillus thermoglucosidasius.

Os microorganismos podem ser do "tipo selvagem",isto é, eles não são mutantes produzidos em laboratório. Osmicroorganismos podem ser isolados das amostras ambientaisdas quais se espera que contenham termófilos. Osmicroorganismos do tipo selvagem isolados terão acapacidade de produzir etanol, mas, não modificados, éprovável que o lactato seja o produto de fermentaçãoprincipal. Os isolados são também selecionados por suacapacidade de crescer em açúcares de hexose e/ou pentose atemperatura termofílicas. Microorganismos do tipo nãoselvagem, mutantes, podem ser também utilizados.

É preferível que o microorganismo da invençãotenha determinadas características desejáveis que permitama utilização · do microorganismo em um processo defermentação. O microorganismo de preferência não deve tersistema de restrição, evitando-se assim a necessidade demetilação in vivo. Além disto, o microorganismo deve ter acapacidade de utilizar os açúcares C5 e C6 como umsubstrato, inclusive a celubiose e o amido. É preferívelque o microorganismo seja transformável a uma freqüênciaelevada. Além do mais, o microorganismo deve ter uma taxade crescimento em cultura continua acima de 0,3 hr-1.

Os microorganismos serão um termófilo e crescerãona faixa de temperatura de 40°C-85°C. De preferência, omicroorganismo crescerá dentro da faixa de temperatura de50°C-70°C. Além disto, é desejável que o microorganismocresça em condições de pH 6,5 ou menos, em particular pH6,5-pH 4,5.

A seqüência de ácidos nucléicos para adesidrogenase é agora conhecida. Com a utilização destaseqüência é possível aos versados na técnica visar o geneda lactato desidrogenase para obter a inativação do genepor meio de diferentes mecanismos. É preferível que o geneda lactato desidrogenase seja inativado ou pela inserção deum transpossono ou, de preferência, pela deleção daseqüência de genes ou de uma parte da seqüência de genes. Adeleção é preferível, uma vez que ela evita a dificuldadede reativação da seqüência de genes que é freqüentementeexperimentada quando é utilizada a inativação dotranspossono. Em uma modalidade preferida, o gene dalactato desidrogenase é inativado pela integração de umplasmídio sensível à temperatura (o plasmídio pUB190-Idh),que obtém a recombinação ou integração homóloga naturalentre o plasmídio e o cromossomo do microorganismo.Integrantes cromossômicos podem ser selecionados com baseem sua resistência a um agente anti-bacteriano(canamicina) . A integração ao gene da lactato desidrogenasepode ocorrer por um evento de recombinação por cruzamentoúnico ou por um evento de recombinação por cruzamento duplo(ou mais) .

Em uma modalidade preferida, o microorganismocompreende um gene heterólogo da álcool desidrogenase e umgene heterólogo da piruvato descarboxilase. A expressãodestes genes heterólogos resulta na produção de enzimas quereorientam o metabolismo de modo que o etanol seja oproduto de fermentação básico. Estes genes podem serobtidos a partir de microorganismos que passam tipicamentepor uma fermentação aeróbica, inclusive a espéciezymomonas, que inclui o zymomonas mobilis.

São conhecidos métodos para a preparação eincorporação destes genes a microorganismos, como porexemplo, em Ingram et alii, Biotech & BioEng, 1998; 58(2 + 3) : 204-214 e no documento US 5916787, o conteúdo decada um sendo aqui incorporado à titulo de referência. Osgenes podem ser introduzidos em um plasmidio ou integradosao cromossomo, conforme será entendido pelos versados natécnica.

Os microorganismos da invenção podem sercultivados em condições de cultura convencionais,dependendo do microorganismo termofilico escolhido. Aescolha dos substratos, da temperatura, do pH e de outrascondições de crescimento pode ser selecionada com base nosrequisitos de cultura conhecidos, veja-se, por exemplo,WOOl/4 98 65 e W001/85966. As condições de cultura efermentação adequadas são indicadas nas Tabelas 1, 2 e 3.

Tabela 1

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Tabela 2

Solução Estoque de Elementos com Traço de Sulfato

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Tabela 3

Condições de Fermentação

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A invenção é ilustrada no Exemplo seguinte,referência aos desenhos anexos.

Exemplo

Foram preparados os seguintes meios:

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Volume total em água destilada: 950mL, ajustar para o PH7,0 com NaOH ou H2SO4. Autoclave.

Após o resfriamento, 2,5 mL de solução de estoque deElementos com Traços de Sulfato foram adicionados (ver aTabela 2), juntamente com 50 mL de solução de açúcaresterilizada a 20% p/v por filtragem.

Meios de US (Sais de Uréia) Modificados (USM)Glicose 1Q Q

Extrato de Levedura q/q g/L<table>table see original document page 13</column></row><table>

Para meios sólidos, foram adicionados 20,0 g/L de bacto-ágar.

Corrigido para pH 7 antes da esterilização com NaOH 3M.

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Para meios sólidos, foram adicionados 20,0 g/L de bacto-ágar. O meio foi corrigido para pH 7 antes da esterilizaçãocom 3M NaOH.

A tolerância ao etanol de um organismo do tiposelvagem (NCIMB 11955) foi testada para determinar o pontode partida. O organismo foi deixado crescer da noite para odia (placa de agar LB, 60°C) e uma colônia utilizada parainocular uma cultura de pernoite (100 mL USM, 1% deglicose, 60°C, 250 rpm) . Esta cultura foi então utilizadapara inocular uma série triplicada de frascos contendo 0,35 1, 2, 3 ou 4% de etanol, que foram em seguida desenvolvidosdurante 36 horas antes que o crescimento fosse medido (50mL USM, 1% de glicose, 60°C, 250 rpm) . Os resultados sãomostrados na Figura 1 e sugerem que o NCIMB 11955 nãotolerará mais que 4% de etanol.

Com a utilização deste resultado como uma basepara comparação, foram feitas experiências para aumentar atolerância ao etanol do mutante TM89 até 8% v/v de etanol.

Método de Fermentação

Microorganismo:Inóculo:Equipamento:

Valores estabelecidos:

Meio:

Reforço de etanol

GT TM-8950 ml 2xYT cultura (7% v/v)fermentador de vidro LH (700 mlde volume operacional)Temperatura e controle de pH como sistema de controle AngliconMisturado com um agitadormagnético.Temperatura: 60°CpH: 6,80ar: 0,2-0,4 vvm

velocidade do agitador: 225 rpmtaxa de fluxo

controlada com Bomba WatsonMarlow (0-100 ml/hr)SAM2 2% de glicose, 0,05% deanti-espuma orgânica (ver folhado meio).

pH controlado utilizando-se 10%de NaOH

75 ml ou 150 ml de etanol (10-20%de reforço)

A estratégia adotada foi:

1) Obter estados estáveis e medir os rendimentos doproduto/utilização de açúcar; e

2) Reforçar a cultura com etanol, permitir que acultura se recupere (o etanol será eliminado porlavagem ao longo do tempo), remover amostra e prepararestoques de glicerol, repetindo-se a etapa (2) conformenecessário.De modo a se avaliar a tolerância ao etanol, foidesenvolvido o procedimento seguinte.

1. Adicionar 5 ml de caldo de TGP a dois estéreisuniversais.

2. Adicionar 100 μΐ de estoque de glicerol TM-89 e TM89-1 acada tubo, respectivamente.

3. Cultivar durante 5-6 horas (portanto, células ativas,como devem ser na fase log) a 60°C com agitação.

4. Medir o OD6oo de cada caldo (de modo que se saiba oinicio do OD60o) ·

5. Preparar 11 tubos estéreis universais com um volumefinal de 10 ml de caldo de TGP contendo concentraçõesde etanol de 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% e10% (v/v), em duplicata para cada cepa TM-89 (isto é,44 tubos) .

6. Inocular cada tubo com 100 ul de células dos 5 ml decaldos de TGP correspondentes dos estágios 1+2.

7. Cultivar da noite para o dia a 60°C com agitação.

8. Remover 1 ml de cada tubo, diluir 1:5 e medir o OD600contra um branco de H2O.

Os resultados foram analisados da seguinte maneira:

(1) A densidade óptica da cultura medida utilizando-se umEspectrofotômetro de Jencons [a concentração celular

(g/L) foi calculada a partir de A60O x 0,3].

(2) A concentração de glicose foi medida utilizando-se ummedidor de glicose no sangue (Roche).

(3) A concentração de etanol foi medida utilizando-se umkit .de análise baseada em enzima (fornecida pela R-Biopharm).Os resultados são mostrados na Figura 2. A cepa isolada aotérmino da fermentação apresentou valores de ODconsistentemente mais elevados que os da cepa TM89 inicialem TGP e em TGP com uma faixa de concentrações de etanol.

Houve uma diferença significativa no crescimento a 5% deetanol, indicando maior tolerância ao etanol.

Claims

1. Método para a produção de microorganismostermofílicos adequados para a produção de etanol, quecompreende:i. cultivar um microorganismo termofilico emcondições aeróbicas ou anaeróbicas em um meiode cultura adequado; eii. incorporar quantidades de etanol ao meio decultura para induzir tolerância ao etanol;em que o microorganismo termofilico do tipo selvagem émodificado pela inativação do gene nativo da lactatodesidrogenase, e em que o gene . nativo da lactatodesidrogenase, ou uma parte do mesmo, tenha sido deletado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, emque uma quantidade crescente de etanol é adicionada ao meiode cultura, deixando-se que os microorganismos se adaptemao etanol adicionado antes da próxima adição incrementai deetanol.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,em que o etanol é incorporado a uma concentração final depelo menos 3% p/v.

4. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o etanol é incorporado a umaconcentração final de pelo menos 6% p/v.

5. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o etanol é incorporado a umaconcentração final de pelo menos 7,5% p/v.

6. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o etanol é incorporado em incrementos de-0,5% p/v ou menos.

7. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o etanol é incorporado ao meio decultura na fase Iog inicial.

8. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o microorganismo não compreende umsistema de restrição.

9. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o microorganismo é o Geobacillusthermoglucosidasius.

10. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o microorganismo compreende um gene pdcheterólogo.

11. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o microorganismo compreende um gene adhheterólogo.

12. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o microorganismo pode metabolizar acelobiose e/ou o amido, ou oligômeros dos mesmos.

13. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o microorganismo é transformável em umafreqüência elevada.

14. Método, de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, em que o microorganismo cresce a umatemperatura de 40°C-85°C, de preferência de 50°C-70°C.