FI80718C - Foerfarande foer framstaellning av aettiksyra av kolhydrater med hjaelp av en clostridium thermoaceticum stamm. - Google Patents

Description

1 80718

Menetelmä etikkahapon valmistamiseksi hiilihydraateista Clostridium thermoaceticum-kannalla Tämä keksintö koskee etikkahapon valmistusta uudella 5 Clostridium thermoaceticum-mutanttikannalla.

Orgaanisten kemikaalien valmistus mikro-organismeilla on hyvin tunnettua fermentaatioalaan perehtyneille. Tällaiset fermentaatioreaktiot tuottavat usein joukon tuotteita laimeissa vesiliuoksissa. Kemikaalien erottaminen 10 toisistaan ja suurista vesitilavuuksista on ollut niin kallista, että kemikaalien valmistus fermentaatiolla ei ole voinut kilpailla samojen kemikaalien valmistuksen kanssa fossiilisista polttoaine-lähtöaineista. Kuitenkin raakaöljypohjaisten fossiilisten polttoaineiden asteit-15 täinen loppuminen ja siitä johtuva öljypohjaisten raaka- aineiden hintojen nousu on elvyttänyt mielenkiintoa fer-mentaatioreaktioihin, jotka voivat muuttaa uusiutuvia raaka-aineita yksinkertaisiksi orgaanisiksi kemikaaleiksi.

Fermentaatiot, joista saadaan yksi tuote, ovat 20 erityisen toivottuja, koska tuotteiden eristys sellaisista reaktioista on yksinkertaista. Tiettyjä mikro-organismeja, jotka tunnetaan nimellä homoasidogeenit, voidaan käyttää sellaisessa menetelmässä, jolloin saadaan yksi happo kasvatettaessa erilaisissa heksooseissa, pentooseissa ja mai-25 tohapossa. Heksoosin, kuten glukoosin fermentaatio Clostri dium thermoaceticumilla, joka tässä jäljempänä lyhennetään C. thermoaceticum, on erityisen houkuttelevaa, koska 1 moolista sokeria voidaan teoriassa valmistaa 3 moolia etik-kahappoa.

30 C. thermoacetiumin eristivät ensin Fontaine, et.

ai., J. Bacteriol., 43, 710-715 (1942). Villi laji on anaerobi, joka kasvaa parhaiten noin pH:ssa 7. Sen kasvu estyy alhaisella pH:11a, etikkahapolla, ja asetaatilla. Näistä syistä johtuen tämä laji ei tuota etikkahappoa 35 suuria määriä.

2 80718

Eri tutkijat ovat yrittäneet saada C. thermoaceti-cum-mutanttikantoja, jotka tuottaisivat suurempia määriä etikkahappoa fermentaatioreaktiossa. Wang, et ai., AIChE Symp. Ser. 181, 74, 105-110 (1978), kuvaavat parennetun 5 mikro-organismikannan, joka kestää paremmin natriumasetaat- tia. Schwartz ja Keller, Applied and Environmental Microbiology, 43, 117-123 (1982), kuvaavat C. thermoaceticum-kannan, joka pystyy kasvamaan ja tuottamaan etikkahappoa pH:ssa 4,5. Tämä tutkimus on myös kuvattu US-patentissa 10 4 371 619.

Nyt on eristetty uusi C. thermoaceticum-mutantti, joka pystyy kasvamaan pH:ssa alle 5, ja joka on tehokkaampi etikkahapon tuottaja kuin mikään muu aikaisemmin kuvattu laji.

15 Keksinnön kohteena on menetelmä hiilihydraattien muuttamiseksi etikkahapoksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään mikro-organismikantaa Clostridium thermoaceticum ATCC 39 289 anaerobisessa fermen-torissa vesipitoisessa alustassa, joka sisältää assimi-20 loitavia hiilen, typen ja epäorgaanisten aineiden lähtei- tä, pH-kontrolloidulla jatkuvalla fermentaatiolla pH:ssa **. noin 5 - noin 8, lämpötilassa noin 50 - noin 65 °C ja laimennusnopeudella noin 0,01 - noin 0,40 tuntia kohti.

]·_ Menetelmässä käytetty uusi kanta pystyy kasvamaan 25 pH:n 5,0 alapuolella lämpötilassa 50 -65 °C. Sillä on myös ominaiskasvunopeus, joka on vähintään noin 0,30 h"1, kasvatettuna jatkuvassa viljelmässä pH:ssa 7 ja 58 °C:ssa. Kanta on tallennettu ATCC-talletuslaitokseen numerolla ATCC nro 39 289.

30 Alkuperäinen viljelmä, jota käytettiin keksinnön mu kaisen mutanttikannan kehittämiseen, oli villi C. thermo-aceticum-tyyppi, DSM 521. Viljelmät saatiin Massachusettsin teknologiainstituutista, jotka tutkijat puolestaan olivat saaneet sen tri H.G. Woodilta, Case Wastern Reserve Univer-35 sity, Cleveland, Ohio.

3 80718

Kasvua seurattiin mittaamalla absorbanssi 540 nm:ssä. Spetronic 20-spektrofotometriä (Bausch & Lomb, Inc., Rechester, New York) käytettiin mittauksiin. Näyte laimennettiin tislatulla vedellä absorbanssilukemien saa-5 miseksi välille 0,1 ja 0,7 ja mittaukset tehtiin yhteensopivissa Hungate-putkissa, joiden ulkohalkaisija oli 16 mm, vertaamalla tislattuun veteen nollanäytteenä. Kaksi tai kolme raetta natriumditioniittia lisättiin laimennettuun näytteeseen ennen lukeman ottoa, kun käytettiin resat-10 suriini-indikaattoria värittömän tilan säilyttämiseksi.

Etikkahapon ja glukoosin konsentraatiot määritettiin korkean erotuskyvyn omaavalla nestekromatograf iällä (HPLC). Näyte fermentaatioseosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella noin 10 000 x g 10 minuutin ajan solujen pelletoimiseksi. 15 Supernatantin komponentit kromatografoitiin eluoimalla 0,06 N H2S04:llä kationinvaihtohartsista vetymuodossa. Eluoidut komponentit mitattiin dif ferentiaalirefraktometrillä, piirrettiin graafisesti rekisteröi jään ja määrä mitattiin käyttäen elektronista integraattoria. Käyrän alapuolella oleva 20 pinta-ala, joka esittää kunkin komponentin konsentraatiota, esitettiin prosentteina kokonaispinta-alasta. Yleinen menetelmä on esitetty julkaisussa "Analyses of Carbohydrate Mixtures by Liquid Cromatography", Am Soc. Brew. Chem. Proc., 1973, ss. 43-46. Erotukset tehtiin 1 ft (n. 0,3 m) 25 pituisella HPX-87 -pylväällä vetymuodossa, joka on saatavana Bio-Rad laboratorioista, Richmondista Kaliforniasta.

Tämän keksinnön kuvauksessa sanalla "laimennus-nopeus", kuten sitä tässä hakemuksessa on käytetty, on laatu tuntia kohti (h-1). Tämä nopeus saadaan jakamalla v-30 äliaineen virtausnopeus tilavuusyksikköinä tuntia kohti reaktorin toimintatilavuudella.

Termi "ominaiskasvunopeus" tässä käytettynä edustaa kasvun nopeutta fermentaatioreaktorissa olevan biomassan määrän yksikköä kohti. Sillä on myös ajan käänteisarvo 35 laatuna (h"1). Kun jatkuvatoiminen fermentaatioastia toimii 4 80718 "steady state"-tilassa, biomassan määrä viljelmässä on vakio ja ominaiskasvunopeus on sama kuin laimennusnopeus.

Maksimaalinen ominaiskasvunopeus määritettiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Pirt, S.J., 5 "Principles of Microbe and Cell Cultivation", John Wiley & Sons, New York, 1975, s. 33. Tämä suoritettiin nostamalla virtausnopeutta kemostaatissa sen nopeuden yläpuolelle, jossa solujen huuhtoutumista ilmenee. Absorbanssilukemat mitattiin eri ajoilla ja optisen tiheyden lukemien luonnol-10 liset logaritmit piirrettiin ajan suhteen. Summa, joka saadaan laskemalla yhteen tämän suoran kaltevuus ja laimennusnopeus, jossa huuhtoutumista ilmeni, edustaa maksimaalista ominaiskasvunopeutta tälle mikro-organismille. Massan kaksinkertaistumisaika soluille, myös sukupolviajak-15 si kutsuttu, lasketaan jakamalla In 2 maksimaalisella omi-naiskasvunopeudella.

Alkuperäinen organismi kasvatettiin kemostaatissa jatkuvissa viljelyolosuhteissa väliaineessa, jossa pH:ta laskettiin asteittain ajan kuluessa. Tällaisen kemostaatin 20 toiminta ja sen käyttö spontaanien mutaatioiden saamiseksi kasvatetuista bakteereista on kuvattu julkaisussa Novick, A. ja Szillard, L., Science, 122, 715,716 (1950). Kemostaatin toiminnassa käytettiin biomassan takaisinsyöttöperi-aatetta, jossa kasvavaan viljelmään syötettyjen ravinteiden 25 määrää seurattiin väliaineen pH:n avulla. Tämä menetelmä on kehitetty valikoimaan geneettisesti erilaiset organismit, tässä tapauksessa ne, jotka kasvavat nopeammin alhaisemmassa PH :ssa. Tätä menetelmää käyttäen saatiin mutantti-kanta, joka kasvaisi väliaineessa, jonka pH on 5,0 tai sen alle. 30 Tämä mutanttikanta eroaa selvästi alkuperäisestä C. ther-moacetium-lajista, joka osoittaa vähäistä kasvua väliaineessa, jonka pH on alle noin 6,4.

Tässä kuvattu mikro-organismimutanttikanta on uusi se on talletettu ATCC-talletuslaitokseen, Rockville, Ma-35 ryland ja sitä tullaan säilyttämään kyseisessä talletus- 5 80718 laitoksessa tämän patentin olemassaolon ajan. Se on saatavissa numerolla ATCC 39 289.

Keksinnön mukainen mutanttikanta on termofiilinen anaerobi, jota on kasvatettu sellaisessa väliaineessa ja 5 ilmakehässä, josta happi on poistettu. Se voi kasvaa vesipitoisessa väliaineessa, joka sisältää assimiloitavia hiilen, typen ja epäorgaanisten aineiden lähteitä pH:ssa 5,0:n alapuolella, tuottaen etikkahappoa. Edullisia hii-lilähteitä ovat glukoosi ja fruktoosi. Vaikka kasvu ja 10 etikkahapon tuotanto tapahtuu hitaasti pH:n 5,0 alapuolella, ne tapahtuvat nopeammin korkeammassa pH:ssa edullisen pH:n ollessa välillä noin 6,9 ja 7,4. Mikro-organismi kasvaa lämpötilassa noin 50- noin 65 °C edullisen lämpötilan ollessa alueella noin 56 - noin 60 °C. Mutanttikanta 15 voi kasvaa ominaiskasvunopeudella, joka on vähintään noin 0,30 h'1 pH:ssa 7 ja 59 °C:ssa.

Keksinnön mukainen mutanttikanta on käyttökelpoinen muutettaessa hiilihydraatteja etikkahapoksi kasvatettaessa sitä anaerobisessa fermentorissa pH-kontrolloidussa jat-20 kuvassa fermentaatiossa. Tällainen fermentaatio voidaan suorittaa laimennusnopeudella 0,01-0,4 tuntia kohti, kun pH:ta seurataan alueella 5-8 ja lämpötila pidetään alueella 50 - 65 °C.

Tämä mutanttikanta eroaa alkuperäisestä kannasta 25 siinä, että se pystyy kasvamaan väliaineessa, jonka pH on 5. Lisäksi sen maksimaalinen ominaiskasvunopeus on noin 50 % suurempi kuin alkuperäisellä, kun molempia kasvatetaan pH:ssa 7.

Tämän keksinnön mukaista mutanttikantaa ja mene-30 telmää valaistaan lisäksi seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1

Mikro-organismin alkuperäisen kannan, C. ther-moaceticum (DSM 521), luovuttavat ystävällisesti Massachusettsin teknologiainstituutin tutkijat, jotka puolestaan 35 olivat saaneet sen tri H.G. Woodilta, Case Western Reserve 6 80718

University, Cleveland, Ohio. Se on saatavissa laitoksesta Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Länsi-Saksa, numerolla DSM 521.

Väliaineen valmistus ja näytteiden viljely suori-5 tettiin käyttäen anaerobista standardimenetelmää, kuten Hungate, R.E. on kuvannut julkaisussa "A Roll Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes", Methods and Microbiology, toimittaneet J.R. Norris ja D.W. Ribbons, Vol. 3B, Academic Press, New York 1969, ss. 117-132, ja Miller 10 ja Wolin kuvaavat julkaisussa Appi. Microbiol. 27, 985 (1974).

Organismin kasvatukseen käytetyllä väliaineella oli seuraava koostumus: 15 Kasvatusväliaine

Komponentti Konsentraatio (g/litra) A. glukoosi 30,0 B. NaHC03 16,8 20 K2HPO 7,0 KH2P04 5,5 C. Hiivauute 5,0

Tryptoni 5,0 (NH4)2S04 1,0 25 MgS04 · 7H20 0,25

Fe(NH4)2(S04)2 · 6H20 0,04

Co( NOj )2· 6H20 0,03

NaMo04 · 2H20 0,0024

Resatsuriinin (0,20 g/100 ml 1,0 ml/1 30 liuos)

Sitten lisättiin 0,5 g natriumtioglykolaattia, 5,6 mg nikotiinihappoa ja 1 ml pieniä määriä suoloja sisältävää liuosta litraa kohti väliainetta. Pieniä määriä 35 suoloja sisältävällä liuoksella oli seuraava koostumus: 7 80718

Liuos, joka sisältää pieniä määriä suoloja

Komponentti Konsentraatio (g/litra

Etyleenidiamiinitetra-5 etikkahapon dinatrium- suolan dihydraatti 5,00

MnCl2 · 4H20 5,00

Na2Se03 0 , 20 H2B03 0,100 10 ZnCl2 0,050 A1K( S04 )2 · 12H20 0,100

NiCl2 ♦ 6H20 0,20

CuCl2 · 2H20 0,10 15 Jatkuva fermentaatio suoritettiin 1 litran Bellco- fermentorissa (Bellco Glass Inc. Vineland, New Jersey). Tämä fermentori oli varustettu sisään menevällä putkella väliaineen lisäämistä varten, ylivirtauksen ulostuloput-kella, magneettisekoittajalla ja Ingold-pH-mittarilla 20 (Ingold Electrodes Inc., Andover, Massachusetts). pH-mit- tari oli liitetty Chemtrix 45 Ar-tyyppiseen pH:n seuran-talaitteeseen (Chemtrix Inc., Hillsboro, Oregon). pH:n seurantalaite vaikutti peristalttisiin pumppuihin, jotka lisäsivät väliainetta ja poistivat effluenttia fermentoris-25 ta aina, kun pH saavutti alimman seuranta-laitteeseen ohjelmoidun pisteen. Tämä järjestely vaati sen, että viljelmässä muodostui riittävästi etikkahappoa alentamaan pH:n tarkkailupisteeseen ennen kuin tuoretta väliainetta lisättiin fermentoriin nostamaan pH takaisin tarkkailupisteen 30 yläpuolelle. Väliaineen määrä pidettiin vakiona ylivir- tausef fluenttipumppujärjestelmällä ja fermentoria sekoitettiin vakionopeudella ja sinne johdettiin puhdasta C02 pienellä ylipaineella (2-3 cm H20). Lämpötila pidettiin 58 ± 1 °C:ssa kuumennetun propyleeniglykolin avulla, joka kiersi 35 fermentorin vaipan ympärillä.

8 80718

Alkuperäinen viljelmä kasvatettiin väliaineessa, jonka pH oli säädetty 6,3:een. Kun organismi kasvoi, ilmeni nopeammin kasvavien organismien valikoitumista ja väliaineen lisäysnopeutta nostettiin. Kun saavutettiin stabiili 5 lähellä tasapainoa oleva tila, pH:n tarkkailupistettä alennettiin noin 0,1 pH-yksikköä. Valikointi jatkui sitten tällä alemmalla pH: 11a, kunnes uusi tasapainoehto saavutettiin. Tätä menetelmää seuraamalla oli mahdollista saada C. thermoaceticum- viljelmä, joka kasvaa pH:ssa 5,0 tai sen 10 alapuolella. Erillinen pesäke tätä uutta mutanttia eristettiin, replikoitiin ja kasvatettiin tuoreessa väliaineessa. Solut säilöttiin pakastamalla glyserolissa tai lyofilisoin-nilla. Tämä kanta on saatavana ATCC-talletuslaitoksesta numerolla ATCC 39 289.

15 Vaikka laji kasvaa pH:ssa 5 tai hiukan alapuolella, ominaiskasvunopeus tässä pH:ssa on melko pieni. Maksimaalinen havaittu ominaiskasvunopeus pH:ssa 5 oli 0,023 h-1, vastaten sukupolviaikaa 30 tuntia. Tuotteen konsentraatio jatkuvassa, näillä ehdoilla toimivassa reaktorissa oli kes-20 kimäärin noin 10 g/1. Kuitenkin, kun tätä lajia kasvatettiin kemostaatissa neutraalissa pH:ssa, saatiin paljon parempi kasvunopeus, kuten seuraavasta esimerkistä huomataan.

Esimerkki 2 25 Alhaista pH:ta sietävä C. thermoaceticum- laji, joka eristettiin esimerkissä 1, kasvatettiin kemostaatissa, joka pidettiin pH:ssa 7,0 ja lämpötilassa 58 ± 1 eC. Laite ja kemostaatin toiminta oli samanlainen kuin esimerkissä 1 on kuvattu, paitsi että vakionopeuksista syöttöpumppua käytet-30 tiin pH-tarkkailupumpun sijasta syöttämään väliainetta fermentoriin. Fermentorin tilavuus pidettiin vakiona käyttämällä halutulle tasolle sijoitettua effluenttiputkea. Vakiotilan kasvunopeudet 0,25 h'1 - 0,31 h'1 havaittiin. Maksimaalinen ominaiskasvunopeus havaittiin. Maksimaalinen 35 ominaiskasvunopeus määritettiin 0,33 h'1:n suuruiseksi, joka 9 80718 vastaa massan kaksinkertaistumisaikaa 2,1 tuntia. Tämä on verrannollinen maksimaalisen ominaiskasvunopueden 0,22 h'1 kanssa alkuperäiselle viljelmälle, kuten esittävät Wang, et ai, AIChE Symp. Ser. 181, 74, 105-110 (1978).

5 Esimerkki 3

Alhaista pH:ta sietävää C. thermoaceticum-kantaa, joka eristettiin esimerkissä 1, verrattiin alkuperäiseen kantaan näissä lisäkokeissa. Molemmat lajit oli kasvatettu lepovaiheeseen, ennen kuin käytettiin 0,3 ml:n näytteitä 10 ymppäämään 10 ml kasvuväliainetta 18 mm:n alumiinilla suljetuissa Bellco-putkissa (Bellco Glass, Inc. Vineland, New Jersey). Kasvuväliaineella oli sama konsentraatio kuin sillä, jota käytettiin esimerkissä 1, paitsi että glukoosin konsentraatio oli 2 % ja puskurisuoloja (väliaineen ryhmä 15 B) oli vain puolet konsentraatiosta. Väliaineen pH säädettiin etikkahapolla. Putkia inkuboitiin 58 °C:ssa käyttäen C02:a kaasutilassa. Kun väliaineen alku-pH oli 5,5, vain tämän keksinnön mukainen mutanttikanta osoitti kasvua mitattuina absorbanssilukemien kasvuna. Kun alkulepovaihe 20 oli kestänyt noin 40 tuntia, se kasvoi ominaiskas-vunopeudella 0,063 h*1. Vertailun vuoksi, alkuperäinen laji ei kasvanut edes 120 tunnin inkuboinnin jälkeen.

Kun alku-pH väliaineessa oli 6,1, keksinön mukainen mutanttikanta osoitti ominaiskasvunopeutta 0,099 h-1 melkein 25 ilman lepovaihetta. Alkuperäinen laji kasvoi noin 10 tunnin alkulepovaiheen jälkeen ominaiskasvunopeudella 0,069 h-1.

Keksinnön mukaan on täten tarjottu käyttöön C. thermoaceticum-laji, joka on käyttökelpoinen valmistettaessa etikkahappoa ja joka on aikaisemmin tunnettuja la-30 jeja parempi. Keksintöä on edellä kuvattu sen spesifisten suoritusmuotojen valossa, mutta on ilmeistä, että monet vaihtoehdot, muunnokset ja variaatiot tulevat olemaan selviä alaan perehtyneille edlelä eistetyn kuvauksen valossa. Täten kaikki tällaiset vaihtoehdot, muunnokset ja 35 variaatiot on tarkoitettu kuuluvaksi hakemuksen patenttivaatimusten piiriin.

Claims (8)

10 8071 8

1. Menetelmä hiilihydraattien muuttamiseksi etik-kahapoksi, tunnettu siitä, että viljellään mikro- 5 organismikantaa Clostridium thermoaceticum ATCC 39 289 anaerobisessa fermentorissa vesipitoisessa alustassa, joka sisältää assimiloitavia hiilen, typen ja epäorgaanisten aineiden lähteitä, pH-kontrolloidulla jatkuvalla fermen-taatiolla pH:ssa noin 5 - noin 8, lämpötilassa noin 50 - 10 noin 65 °C ja laimennusnopeudella noin 0,01 - noin 0,40 tuntia kohti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että assimiloitava hiilen lähde on glukoosi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentaatio suoritetaan • pH:ssa noin 6,9 - 7,4.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentaation pH:ta kontrol- 20 loidaan pitäen pH arvossa noin 7.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentaatio suoritetaan lämpötilassa välillä noin 56 - 60 °C.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että lämpötilaa kontrolloidaan pitäen se 58 ± 1 °C:ssa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentaation pH:ta kontrolloidaan pitäen pH arvossa noin 7.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että assimiloitavan hiilen lähde on glukoosi. 11 8071 8