NO159290B - Fremgangsmaate for fremstilling av eddiksyre ved fermentering av mutantstammen clostridium thermoaceticum c 5-2. - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av eddiksyre ved fermentering av mutantstammen clostridium thermoaceticum c 5-2. Download PDFInfo
- Publication number
- NO159290B NO159290B NO840908A NO840908A NO159290B NO 159290 B NO159290 B NO 159290B NO 840908 A NO840908 A NO 840908A NO 840908 A NO840908 A NO 840908A NO 159290 B NO159290 B NO 159290B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- fermentation
- acetic acid
- medium
- mutant strain
- thermoaceticum
- Prior art date
Links
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 54
- 241000193459 Moorella thermoacetica Species 0.000 title claims description 20
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims description 19
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011437 continuous method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005789 organism growth Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L sodium dithionite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])=O JVBXVOWTABLYPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/54—Acetic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/145—Clostridium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/813—Continuous fermentation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/842—Clostridium
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av eddiksyre ved fermentering av en ny mutantstamme av Clostridium thermoaceticum.
Fremstillingen av organiske kjemikalier ved hjelp av mikroorganismer er velkjente for de som er fortrolig med fermenter-ingsteknikken. Slike fermenteringsreaksjoner gir ofte mange forskjellige produkter i fortynnede vandige oppløsninger. Omkost-ningen med å adskille kjemikaliene fra hverandre og fra de sto-
re mengdene med vann har vært så store at produksjon av kjemikalier ved fermentering ikke har vært i stand til å konkurrere med produksjonen av de samme kjemikaliene fra fossile brennstoffkil-der. Den gradvise uttømmingen av fossilt jordoljebrennstoff med en resulterende økning i priser på petrokjemiske råstoffer har fornyet interessen for fermenteringsreaksjoner som kan omdanne fornybare råmaterialer til enkle organiske kjemikalier.
Fermenteringer som gir et enkelt produkt er særlig ønskelig ettersom produktisolering fra slike reaksjoner er forenklet.
Visse mikroorganismer, kjent som homoacidogener, kan brukes i
en slik fremgangsmåte hvorved man får en enkelt syre når de dyrkes på forskjellige heksoser, pentoser og melkesyre. Fermente-ringen av en heksose slik som glukose med Clostridium thermoaceticum, heretter forkortet C. thermoaceticum, er særlig attrak-tiv ettersom den teoretisk kan produsere 3 mol eddiksyre fra 1 mol av sukkeret.
C.thermoaceticum ble først isolert av Fontaine et al,
J. Bacteriol., 4_3. 701-715 (1942). Vill-stammen er en anaerob
som vokser best ved en pH på ca. 7. Veksten dens inhiberes av lav pH, eddiksyre og acetat. Av disse grunnene produserer ikke denne stammen eddiksyre i høy konsentrasjon.
Forskjellige forskere har forsøkt å oppnå mutantstammer
av C. thermoaceticum som ville gi høyere konsentrasjoner av eddiksyre i en fermenteringsreaksjon. Wang et al., AIChE Symp. Ser. 181, 74' 105-110 (1978) beskrev en forbedret stamme av mikroorganismen som hadde en høyere toleranse for natriumacetat. Schwartz og Keller, Applied and Environmental Microbiology, 43, 117-123 (1982) rapporterte isolering av en stamme av C. thermoaceticum som var i stand til å vokse og produsere eddiksyre ved en pH-verdi på 4,5. Dette arbeidet er også åpenbart i US-patentskrift nr. 4 371 619.
Vi har nå isolert en ny mutant av C. thermoaceticum, som er i stand til å vokse ved en pH-verdi på mindre enn 5, og som er en mer effektiv produsent av eddiksyre enn noen av stammene som tidligere er blitt omtalt.
Ved foreliggende oppfinnelse benyttes en biologisk ren kultur av en mutantstamme av mikroorganismen C. thermoaceticum,
anvendbar til fremstilling av eddiksyre når den dyrkes i et vandig medium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske stoffer. Denne kultur er i stand til å vokse ved en pH-verdi under 5,0 ved en temperatur fra 50°C til 65°C. Den har også en spesifikk veksthastighet på minst ca. 0,30h-<1> når den dyrkes i en kontinuerlig kultur ved pH 7 og 58'C. Stammen er deponert ved American Type Culture Collection som ATCC nr. 39.289.
Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er således en kontinuerlig fremgangsmåte for fremstilling av eddiksyre ved fermentering av karbohydrater ved hjelp av C. thermoaceticum, og fremgangsmåten er karakterisert ved at den kontinuerlige fermentering utføres ved anvendelse av mutantstammen Clostridium thermoaceticum, C5-2, ATCC 39.289, ved en temperatur mellom 50 og 65°C, fortrinnsvis mellom 56 og 60°C, mest foretrukket ved 58°±1°C, ved en pH-verdi på mellom 5 og 8, fortrinnsvis mellom 6,9 og 7,4, mer foretrukket ved 7,0, og ved en fortynningstakt mellom 0,01 og 0,40 pr. time, fortrinnsvis mellom 0,023 og 0,33 pr. time, mer foretrukket mellom 0,25 og 0,31 pr. time.
Opphavskulturen som ble brukt til utviklingen av mutantstammen for anvendelse ved oppfinnelsen, var en vill-type av C. thermoaceticum, DSM 521. De anvendte kulturer ble oppnådd fra Massachusetts Institute of Technology, hvis forskere igjen hadde oppnådd dem fra Dr. H.G. Wood, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio.
Veksten ble overvåket ved å måle absorbansen ved 54 0 nm. Til målingene ble det brukt et "Spectronic 20"-spektrometer. Prøven ble fortynnet med destillert vann slik at man fikk mellom 0,1 og 0,7 i absorbans og målingene ble utført i like "Hungate"-rør med 16 mm utvendig diameter mot en blindprøve av destillert vann. 2 eller 3 korn med natriumditionitt tilsatt til den fortynnede prøve før avlesningen når resazurin-indikator ble brukt for å holde den i dens fargeløse tilstand.
Eddiksyre- og glukosekonsentrasjoner ble bestemt ved å
bruke "high-performance liquid chromatography" (HPLC). En prøve av fermenteringsblanding ble sentrifugert ved ca. 10 000
x g i 10 minutter for å pelletisere cellene. Bestanddeler i supernatanten ble kromatografert ved eluering med 0,06 N H2S04 fra en kationbytterharpiks i hydrogenformen. De eluerte bestanddelene ble påvist ved hjelp av et differensial-refrakto-meter, plottet på en skriver og kvantifisert ved å bruke en elektronisk integrator. Arealet under kurven, som står for konsentrasjonen av hver bestanddel, ble angitt som en prosent av det totale areal. Den generelle fremgangsmåten er den som er gjen-gitt i "Analyses of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", Am.Soc .Brew.Chem.Proc., 1973, s.43-46 . Separeringene ble gjort på en 1-fots "HPX-87"-kolonne i hydrogenformen, tilgjengelig fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.
I beskrivelsen av denne oppfinnelse har ordene "fortynningshastighet", slik de brukes her, størrelsen pr.
time (h . Denne hastigheten fås ved å dividere strømnings-hastigheten for mediet i volumenheter pr. time med reaktorens driftsvolum.
Uttrykket "spesifikk veksthastighet", slik det brukes her, angir veksthastigheten pr. enhetsmengde biomasse i fermenterings-reaktoren. Det har også størrelsen resiprok tid (h _1).
Når et kontinuerlig fermenteringskar arbeider ved "steady state"-betingelser, er biomassemengden i kulturen konstant og den spesifikke veksthastighet er lik fortynningshastigheten.
Den maksimale spesifikke veksthastighet ble bestemt ved fremgangsmåten beskrevet i S.J. Firt, "Principles of Microbe and Cell Cultivation", John Wiley & Sons, New York, 1975, s. 33. Dette ble utført ved å øke strømningshastigheten i kjemostatet til over hastigheten hvor utvasking av cellene oppstår. Absor-bansutslag ble målt til forskjellige tidspunkter og de naturlige logaritmene for de optiske tetthets-avlesninger ble plottet mot tiden. Hellingen til denne linje pluss fortynningshastigheten hvorved utvasking oppstod utgjør den maksimale spesifikke veksthastigheten for mikroorganismen. Massefordoblingstiden for cellene, også kalt generasjonstiden, beregnes ved å dividere ln 2 ved den maksimale spesifikke veksthastighet.
Opphavsorganismen ble dyrket i en kjemostat ved å bruke betingelser for kontinuerlig dyrking i et medium hvor pH gradvis ble senket i løpet av en viss tid. Driften av en slik kjemostat og dens anvendelse for å oppnå spontane mutasjoner hos bakterier som dyrkes i den, ble beskrevet av A. Novick og L. Szillard, Science, 112, 715-716 (1950). Ved kjemostat-driften ble prinsippet med biomasse-"feedback" hvor mengden av næringsstoff tilført til den voksende kulturen ble kontrollert ved hjelp av pH i mediet, anvendt. Denne teknikk er utformet for å selektere for genetisk forskjellige organismer, i dette tilfelle for de som vokser hurtigere ved lavere pH. Ved å bruke denne teknikken ble det erholdt en mutantstamme som ville vokse i et medium med en pH-verdi på 5,0 eller lavere. Denne mutantstammen er klart forskjellig fra opphavsstammen av C. thermoaceticum, som oppviser liten vekst i et medium med en pH-verdi under ca. 6,4.
Den her beskrevne mutantstamme av mikroorganismen er ny. Den er deponert i American Type Culture Collection i Rockville, Maryland, og vil bli opprettholdt i denne deponeringsstasjon så lenge dette patentet er i kraft. Den er tilgjengelig som ATCC nr. 39.289.
Mutantstammen som her beskrives er en termofil anaerob mikroorganisme. Den er i stand til å vokse i et vandig medium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske stoffer ved en pH under 5,0, hvorved den produserer eddiksyre. Foretrukkede karbonkilder er glukose og fruktose. Selv om vekst og eddiksyreproduksjon foregår saktere ved en pH under 5,0, foregår de hurtigere ved høyere pH, idet en foretrukket pH er mellom 6,9 g 7,4. Mikroorganismens vekst oppstår ved en temperatur fra ca. 50°C til ca. 65°C, idet en foretrukket temperatur er i området fra ca. 56°C til ca. 60°C. Mutantstammen er i stand til å vokse med en spesifikk veksthastighet på minst ca. 0,30h_<1> ved pH 7 og 58°C.
Mutantstammen som her beskrives er anvendelig til å omdanne karbohydrater til eddiksyre når den dyrkes i en anaerob fermentor ved en pH-kontrollert kontinuerlig fermentering. En slik fermentering kan utføres ved en fortynningshastighet fra 0,01 til 0,4 pr. time når pH kontrolleres i et område fra 5 til 8 og temperaturen holdes i området fra 50'C til 65°C.
Den foreliggende mutantstamme adskiller seg fra opphavet ved sin evne til å vokse i et medium ved pH 5. Dertil oppviser den en maksimal spesifikk veksthastighet som er ca. 50% større enn den til opphavsstammen når begge dyrkes i et medium
ved en pH-verdi av 7.
Mutantstammen og fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved hjelp av de følgende eksempler:
EKSEMPEL 1
Opphavsstammen for mikroorganismen, C. thermoaceticum
(DSM 521) , ble vennligst oversendt oss av forskere ved Massachusetts Institute of Technology, som igjen hadde erholdt den fra H. G. Wood, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio. Den er tilgjengelig fra Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i GOttingen, BRD, som DSM 521.
Mediumfremstilling og dyrking av prøver ble utført ved å bruke standard anaerobe teknikker slik som beskrevet av R. E. Hungate, "A Roll Rube Method for Cultivation of Strict Anaerobes" i Methods and Microbiology, utgitt av J. R. Norris og D. W. Ribbons, bind 3B, Academic Press, New York, 1969, s. 117-132 og av Miller og Wolin, Appl. Microbiol., 21_, 985 (1974).
Mediet som ble brukt til organismens vekst, hadde den føl-gende sammensetning:
Oppløsninger av bestanddelene i gruppene A, B og C ble sterilisert hver for seg før de ble slått sammen for å fremstil-le et medium med den gitte sammensetning. Deretter ble 0,5 g natrium-tioglykolat, 5,6 mg nikotinsyre og 1 ml av en sporsalt-oppløsning tilsatt pr. liter medium. Sporsaltoppløsningen hadde den følgende sammensetning:
En kontinuerlig fermentering ble utført i en 1-liter Bellco-fermentor. Denne fermentor var forsynt med et tilførsels-rør for mediumtilsetting, et overløpsrør, et magnetisk drevet røreverk og en "Ingold"-pH-sonde som var tilkoblet et "Chemtrix type 45 AR"-pH-kontrollapparat. pH-kontrollapparatet aktiviserte peristaltiske pumper som tilsatte medium og fjernet avløpsvæske fra fermentoren så snart pH nådde et fastsatt nedre kontroll-punkt. Dette arrangement krevde at kulturen frembragte tilstrekkelig eddiksyre til å senke pH til kontrollpunktet før friskt medium ble tilsatt fermentoren for å øke pH til over kontrollpunktet. Mediumvolumet i fermentoren ble holdt konstant ved hjelp av avløpspumpesystemet med overløp og fermentorinnholdet ble permanent blandet og gjennomboblet med ren C02 ved et lite overtrykk (2-3 cm H20). Temperaturen ble holdt ved 58±1°C ved hjelp av oppvarmet propylenglykol som sirkulerte gjennom fermentorens varmekappe.
Den opprinnelige kulturen ble dyrket i et medium med pH justert til 6,3. Etter hvert som organismen vokste, viste det seg seleksjon for hurtigvoksende organismer, og hastigheten på mediumtilførselen økte. Så snart en tilstand nær likevekt var nådd, ble pH-kontrollpunktet senket ca. 0,1 pH-enhet. Seleksjon ble deretter fortsatt ved denne lavere pH inntil en ny likevekts-tilstand var nådd. Ved å følge denne fremgangsmåte var det mulig å oppnå en kultur av C. thermoaceticum som vokste ved eller under en pH på 5,0. En adskilt koloni av denne nye mutanten ble isolert, replikeirt og dyrket i friskt medium. Cellene ble lag-ret ved nedfrysing i glycerol eller ved lyofilisering. Denne stamme er tilgjengelig fra American Type Culture Collection som ATCC nr. 39 289.
Selv om stammen vokser ved pH 5 eller litt under, er den spesifikke veksthastigheten ved denne pH svært lav. Den maksimale observerte spesifikke veksthastighet ved pH 5 var 0,023 hr ^, svarende til en generasjonstid på 30 timer. Produktkonsentrasjo-nen i en kontinuerlig reaktor som ble kjørt under disse betingel-sene, var i gjennomsnitt ca. 10 g/l. Når denne stammen imidler-tid ble dyrket i en kjemostat ved en nøytral pH, ble det obser-vert en svært forbedret veksthastighet slik det er angitt i ek-semplet nedenunder.
EKSEMPEL 2
Stammen av C. thermoaceticum med toleranse for lav pH som ble isolert ifølge eksempel 1, ble dyrket i en kjemostat holdt ved en pH på 7,0 og ved en temperatur på 58 _+ 1°C. Utstyret og driften av kjemostatet svarte til det som er angitt i eksempel 1 med unntak av at det ble brukt en tilførselspumpe med konstant avlevering istedenfor pH-kontrollpumpen for tilførsel av medium til fermentoren. Fermentor-volumet ble holdt konstant ved bruk av et avløpsrør plassert ved det ønskede nivå. Det ble ob-servert "steady state"-veksthastigheter fra 0,25 h til 0,31 h ^. Den maksimale spesifikke veksthastigheten ble bestemt til å være 0,33 h noe som svarer til en massefordoblingstid på 2,1 timer. Dette er å sammenligne med en maksimal spesifikk veksthastighet på 0,22 h ~^ for opphavskulturen slik det er
rapportert av Wang et al, AIChE Symp. Ser. 181, 7£, 105-110
(1978) .
EKSEMPEL 3
Stammen av C. thermoaceticum med toleranse for lav pH isolert ifølge eksempel 1 ble sammenlignet med opphavsstammen i disse ytterligere eksperimentene. Begge stammene ble dyrket til
log-fase før 0,3 ml prøver ble brukt til å inokulere lo ml dyrk-ingsmedium i 18mm, aluminium-lukkede, "Bellco"-rør. Dyrkingsmediet hadde den samme konsentrasjon som det som ble brukt i eksempel 1, med unntak av at konsentrasjonen av glukose var 2% og at buffer-saltene (gruppe B i mediet) bare forelå i halve konsentrasjonen.
pH i mediet ble justert med eddiksyre. Rørene ble inkubert ved 58"C med C02 i rommet over kulturen. Når start-pH i mediet var 5,5, oppviste bare den her beskrevne mutantstamme vekst målt ved økning i absorbans-avlesninger. Etter en innledende latensperiode på ca. 40 timer vokste den med en spesifikk veksthastighet på 0,063h<-1>. Opphavsstammen viste derimot ingen vekst selv etter inkubering i 120 timer.
Når start-pH i mediet var 6,1, oppviste den her beskrevne mutantstamme en spesifikk veksthastighet på 0,099h-<1> med nesten ingen latensperiode. Opphavsstammen vokste, etter en innledende latensperiode på ca. 10 timer, ved en spesifikk veksthastighet på 0,069h_1.
Det er følgelig åpenbart at den her beskrevne stamme av
C. thermoaceticum er anvendelig til produksjon av eddiksyre, og at den er overlegen i forhold til de stammer som er kjent fra tidligere. Mens oppfinnelsen er blitt beskrevet i tilknytning til bestemte utførelsesformer derav, er det klart at mange alternativer, modifikasjoner og variasjoner vil være åpenbare for fagmenn innen teknikken i lys av beskrivelsen ovenfor.
Claims (1)
- Kontinuerlig fremgangsmåte for fremstilling av eddiksyre ved fermentering av karbohydrater ved hjelp av Clostridium thermoaceticum, karakterisert ved at den kontinuerlige fermentering utføres ved anvendelse av mutantstammen Clostridium thermoaceticum, C5-2, ATCC 39.289, ved en temperatur mellom 50 og 65°C, fortrinnsvis mellom 56 og 60°C, mest foretrukket ved 58°±1°C, ved en pH-verdi på mellom 5 og 8, . fortrinnsvis mellom 6,9 og 7,4, mer foretrukket ved 7,0, og ved en fortynningstakt mellom 0,01 og 0,40 pr. time, fortrinnsvis mellom 0,023 og 0,33 pr. time, mer foretrukket mellom 0,25 og 0,31 pr. time.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/474,608 US4513084A (en) | 1983-03-11 | 1983-03-11 | Mutant strain of Clostridium thermoaceticum useful for the preparation of acetic acid |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO840908L NO840908L (no) | 1984-09-12 |
| NO159290B true NO159290B (no) | 1988-09-05 |
| NO159290C NO159290C (no) | 1988-12-14 |
Family
ID=23884271
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO840908A NO159290C (no) | 1983-03-11 | 1984-03-09 | Fremgangsmaate for fremstilling av eddiksyre ved fermentering av mutantstammen clostridium thermoaceticum c 5-2. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4513084A (no) |
| EP (1) | EP0120370A3 (no) |
| JP (1) | JPS59173087A (no) |
| BR (1) | BR8400960A (no) |
| CA (1) | CA1212056A (no) |
| DK (1) | DK135384A (no) |
| ES (1) | ES8504932A1 (no) |
| FI (1) | FI80718C (no) |
| GR (1) | GR81864B (no) |
| NO (1) | NO159290C (no) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4814273A (en) * | 1985-03-20 | 1989-03-21 | Michigan Biotechnology Institute | Production of organic acids by an improved fermentation process |
| DE3618076A1 (de) * | 1986-06-02 | 1987-12-03 | Kernforschungsanlage Juelich | Verfahren zur mikrobiellen anaeroben gewinnung von essigsaeure |
| US7074603B2 (en) * | 1999-03-11 | 2006-07-11 | Zeachem, Inc. | Process for producing ethanol from corn dry milling |
| PL203207B1 (pl) * | 1999-03-11 | 2009-09-30 | Zeachem Inc | Sposób wytwarzania etanolu |
| JP5013879B2 (ja) * | 2004-01-29 | 2012-08-29 | ズィーケム インコーポレイテッド | 有機酸の回収 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB572762A (en) * | 1941-05-24 | 1945-10-23 | Charles Weizmann | Improvements in and relating to fermentation processes |
| US4282323A (en) * | 1979-10-09 | 1981-08-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Removal and concentration of lower molecular weight organic acids from dilute solutions |
| US4371619A (en) * | 1980-06-23 | 1983-02-01 | Union Carbide Corporation | Acetic acid by fermentation |
| US4425432A (en) * | 1981-07-23 | 1984-01-10 | Wisconsin Alumini Research Foundation | Propagation of microbial cells on single carbon products |
| US4405717A (en) * | 1981-10-26 | 1983-09-20 | Cpc International Inc. | Recovery of acetic acid from a fermentation broth |
-
1983
- 1983-03-11 US US06/474,608 patent/US4513084A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-02-24 CA CA000448199A patent/CA1212056A/en not_active Expired
- 1984-02-29 BR BR8400960A patent/BR8400960A/pt unknown
- 1984-02-29 DK DK135384A patent/DK135384A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-02-29 GR GR73947A patent/GR81864B/el unknown
- 1984-03-07 FI FI840916A patent/FI80718C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-03-08 ES ES530386A patent/ES8504932A1/es not_active Expired
- 1984-03-08 EP EP84102526A patent/EP0120370A3/en not_active Withdrawn
- 1984-03-09 NO NO840908A patent/NO159290C/no unknown
- 1984-03-09 JP JP59044135A patent/JPS59173087A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59173087A (ja) | 1984-09-29 |
| FI80718C (fi) | 1990-07-10 |
| NO840908L (no) | 1984-09-12 |
| ES530386A0 (es) | 1985-05-01 |
| US4513084A (en) | 1985-04-23 |
| FI840916A (fi) | 1984-09-12 |
| NO159290C (no) | 1988-12-14 |
| BR8400960A (pt) | 1984-10-16 |
| DK135384A (da) | 1984-09-12 |
| GR81864B (no) | 1984-12-12 |
| ES8504932A1 (es) | 1985-05-01 |
| CA1212056A (en) | 1986-09-30 |
| DK135384D0 (da) | 1984-02-29 |
| EP0120370A3 (en) | 1985-12-27 |
| FI840916A0 (fi) | 1984-03-07 |
| FI80718B (fi) | 1990-03-30 |
| EP0120370A2 (en) | 1984-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5000000A (en) | Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes | |
| Biebl et al. | Glycerol conversion to 1, 3-propanediol by newly isolated clostridia | |
| Lamed et al. | Effects of stirring and hydrogen on fermentation products of Clostridium thermocellum | |
| Alterthum et al. | Efficient ethanol production from glucose, lactose, and xylose by recombinant Escherichia coli | |
| US5173429A (en) | Clostridiumm ljungdahlii, an anaerobic ethanol and acetate producing microorganism | |
| Tao et al. | Ethanol fermentation by an acid-tolerant Zymomonas mobilis under non-sterilized condition | |
| Dien et al. | Recombinant Escherichia coli engineered for production of L-lactic acid from hexose and pentose sugars | |
| Häggström et al. | Calcium alginate immobilized cells of Clostridium acetobutylicum for solvent production | |
| US5521075A (en) | Method for making succinic acid, anaerobiospirillum succiniciproducens variants for use in process and methods for obtaining variants | |
| Saripan et al. | Biohydrogen production by Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum KKU-ED1: Culture conditions optimization using mixed xylose/arabinose as substrate | |
| JPS6357039B2 (no) | ||
| Lasko et al. | Bacterial response to acetate challenge: a comparison of tolerance among species | |
| Tolan et al. | Fermentation of D-xylose and L-arabinose to ethanol by Erwinia chrysanthemi | |
| US4521516A (en) | Strain of Clostridium acetobutylicum and process for its preparation | |
| Stephens et al. | Studies on the stability of solvent production by Clostridium acetobutylicum in continuous culture | |
| Talabardon et al. | Anaerobic thermophilic fermentation for acetic acid production from milk permeate | |
| NO159289B (no) | Fremgangsmaate for kontinuerlig fremstilling av en organisk syre ved fermentering. | |
| Rogers et al. | Recent developments in the Zymomonas process for ethanol production | |
| NO159290B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av eddiksyre ved fermentering av mutantstammen clostridium thermoaceticum c 5-2. | |
| GB2505638A (en) | Solvent production by continuous microbiological culture | |
| Brumm | Fermentation of single and mixed substrates by the parent and an acid‐tolerant, mutant strain of Clostridium Thermoaceticum | |
| Champluvier et al. | Influence of sugar source (lactose, glucose, galactose) on 2, 3-butanediol production by Klebsiella oxytoca NRRL-B199 | |
| US4742006A (en) | Fermentation process for the production of fructose from aqueous mixtures of fructose and glucose and Zymomonas mobilis mutants which can be used for such fermentation | |
| Tasaki et al. | Propionate formation from alcohols or aldehydes by Desulfobulbus propionicus in the absence of sulfate | |
| Hayashida et al. | Degeneration of solventogenic Clostridium caused by a defect in NADH generation |