NO159289B - Fremgangsmaate for kontinuerlig fremstilling av en organisk syre ved fermentering. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av eddiksyre eller melkesyre ved en kontinuerlig fermenterings-prosess.

Fremstillingen av organiske kjemikalier ved hjelp av mikro-organismer er vel kjent for de som er fortrolig med fermente-ringsteknikken. Slike fermenteringsreaksjoner gir ofte mange forskjellige produkter i fortynnede vandige oppløsninger. Utgif-ten ved å atskille kjemikaliene fra hverandre og fra de store vannmengdene er blitt så stor at fremstilling av kjemikalier ved fermentering ikke har vært i stand til å konkurrere med fremstilling av de samme kjemikalier ut fra fossile brennstoffkilder.

Den gradvise uttømming av fossilt petroleumsbrennstoff med den derav følgende økning i priser på petrokjemiske råstoffer har imidlertid gjenopplivet interessen for slike fermenteringsreaksjoner som kan omdanne karbohydrater som er fornybare råmateri-aler, til enkle organiske kjemikalier.

Homoacidogene fermenteringsreaksjoner er av særlig interesse fordi de gir en enkel sur forbindelse ved fermenteringen. Produkter som kan fås ved hjelp av disse fermenteringene omfatter de industrielt viktige syrene eddiksyre og melkesyre. Fermenteringen ved hjelp av glukose av Clostridium thermoaceticum (heretter skrevet C. thermoaceticum) er særlig attraktiv, ettersom den teoretisk kan gi 3 mol acetat fra 1 mol glukose.

Undersøkelser av disse fermenteringsreaksjonene er blitt gjennomgått av J. G. Zeikus; Ann. Rev. Microbiol., 2[4» 423-464

(1980). Han har klassifisert mikroorganismene som er anvendbare til å utføre kjemikalie-produserende fermenteringer. Disse er blitt oppdelt i tre klasser: acidogenene, solventogenene og metanogenene, som produserer henholdsvis syrer, oppløsningsmid-ler og metan. Blant acidogenene beskrives de homosyredannende artene som produserer enten eddik-, melke- eller smørsyre som de mest interessante når det gjelder produktutbytter. Det ville derfor være av betydelig kommersiell interesse der-som det kunne utvikles en fremgangsmåte for fremstillingen av syrer ved å bruke disse fermenteringsreaksjonene på en kontinuerlig måte. I en nyere redegjørelse, G. Y. Wang og D.I.C. Wang; 178 National A.C.S. Meeting, Las Vegas, Nevada, august 1980, beskrives en fremgangsmåte for å immobilisere den termofile anaerobe homoacidogene bakterien C. thermoaceticum i agar og carrageenan-gel. For å prøve stabiliteten av denne gel ved kontinuerlig eddiksyreproduksjon, ble det utført et gjentatt satsvis eksperiment ved anvendelse av gelen. Det ble oppnådd eddiksyre-produktivitet med verdien 2,2 gram pr. liter-time (g/l-hr). Selv om dette er en klar forbedring i forhold til de 0,5 g/l-time produsert av cellene i en satsvis fermentering, er den fremdeles uakseptabelt lav. For at en kontinuerlig fermenteringsfremgangsmåte skal være akseptabel til kommersiell bruk, må den kjøres med en høy fortynningshastighet. Fortynningshastighet er en verdi som fås ved å dividere strømningshastigheten for fermenteringsmediet gjennom reaktoren med reaktorvolumet. Volumproduktiviteten, dvs. meng-den produkt dannet pr. enhet volum av reaktor i løpet av en gitt tid, må videre være høy når fermenteringen utføres med en høy fortynningshastighet. Det er nå oppdaget en kontinuerlig fermen-teringsf remgangsmåte som kan utføres ved en høy fortynningshastighet og som gir en volumproduktivitet som er mye større enn for den beste fremgangsmåten som tidligere er beskrevet. Den kontinuerlige fremgangsmåte i henhold til foreliggende oppfinnelse foregår ved fermentering av en karbohydratløsning ved å føre karbohydratløsningen over celler av en homoacidogen mikroorganisme, som er en eddiksyreproduserende stamme av Clostridium thermoaceticum eller en melkesyreproduserende stamme av Lactobacillus acidophilus, og det karakteristiske ved fremgangsmåten er at mikroorganismene vokser på overflaten av et bærermateriale valgt fra gruppen som består av aktivkull og maiskolbegranulat. Ved fremgangsmåten benyttes betingelser med hensyn til pH-verdi, temperatur og fortynningshastighet som bevirker produksjon av syren ved en volum-produktivitet på minst ca. 5 g/l-h. Ved en slik fermentering som beskrevet ovenfor, er det eneste organiske produkt en enkelt syre. Dette står i kontrast til de øvrige acidogene og solventogene fermenteringene som gir mer enn én organisk forbindelse. Enhver mikroorganisme som fermenterer karbohydrater til en syre som hovedproduktet,er egnet for anvendelse ved utøvelsen av oppfinnelsen. Eksempler på egnede organismer er Clostridium formicoaceticum, Acetobacterium woodii, Lactobacillus casei, Clostridium thermoautotrophicum, Acetogenium kiwui og Lactobacillus delbrueckii. En spesielt egnet organisme er C.thermoaceticum som er i stand til å omdanne glukose til eddiksyre i tilnærmet kvantitative utbytter. Fermenteringsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres i et fermenteringsmedium som omfatter en vandig oppløsning innehol-dende oppløste karbohydrater, næringsstoffer og vekstfaktorer som trenges for veksten til mikroorganismen. Mediet sterilise-res før bruk ved oppvarmning eller andre midler som er vel kjent innen teknikken. Karbohydratet som anvendes ved utøvelsen av oppfinnelsen, kan være ethvert karbohydrat som omdannes til den ønskede syre ved hjelp av den anvendte mikroorganisme. For de fleste mikro-organismer er glukose et passende karbohydrat. I tilfellet med C. thermoaceticum kan fermenteringen utføres også med fruktose eller xylose i stedet for glukose. Små konsentrasjoner av metallioner og andre vekstfaktorer som kreves av den bestemte mikroorganisme som anvendes, tilset-tes til fermenteringsmediet. Videre holdes pH i mediet i et område som er egnet for mikroorganismens vekst. Dette kan opp-nås ved tilsetning av buffersalter til mediet. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres som nevnt ved kontinuerlig fermentering idet det anvendes celler av en mikroorganisme som vokser på overflaten av en fast bærer plassert i en reaktor. Bæreren er et inert materiale som har god adsorpsjonskapasitet for cellene og som tillater passende strømning av mediet gjennom reaktoren. Som nevnt anvendes aktivt kull eller maiskolbegranulat. Ethvert aktivt kull som viser god adsorberende kapasitet for cellene og som gir passende strømning av fermenteringsmediet gjennom reaktoren, er egnet for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. "CPG Pittsburgh"-ak'tivkull er et eksempel på et slikt egnet kull. Maiskolbe-partikler på ca. 14-20 mesh ("US Standard Screen"-størrelser med siktåpninger på 1,41 mm til 0,84 mm) eller større er også en egnet bærer for fermenteringer med fastholdte celler, og tillater forønsket strømning av mediet. Produktiviteten under anvendelse av maiskolbe-partikler som bærer var vel så god som under anvendelse av aktivt kull som bærer, og langt bedre enn produktiviteten under anvendelse av andre bærere. Ettersom maiskolbe-partikler er mye mindre kostbare enn aktivt kull, gir de en viktig fordel når det trengs store mengder bærermateriale. Ennvidere er brukte maiskolbe-partikler egnet som dyref6r. Dette gir en økonomisk måte å bli kvitt den oppbrukte cellebæreren etter fullførelsen av en fermentering. Reaktoren som brukes for å utføre den kontinuerlige fermenteringen ifølge oppfinnelsen, fylles først med det faste materi-alet som brukes til å bære mikroorganismecellene. Deretter til-settes sterilt medium. Til slutt inokuleres mediet med en voks-ende kultur av mikroorganismen. Reaktoren som inneholder bærer-materialet, mediet og inokulumet, inkuberes i en tilstrekkelig lang tid til å gi en god cellevekst i reaktoren. Slik cellevekst indikeres ved en øket turbiditet i mediet. Når cellevekst er sikkert fastslått, utføres en kontinuerlig fermentering ved å sende medium gjennom reaktoren. Strøm-ningshastigheten justeres slik at man får den ønskede syreproduk-tivitet. Selv om retningen for mediumstrømmen ikke er avgjøren-de, hjelper strømning opp gjennom reaktoren til å forhindre over-skuddsoppbygging av celle-biomasse og til å fremme strømningen av væsken. Reaktortemperaturen under inkubering og produksjon av syren ved kontinuerlig fermentering holdes ved en temperatur mellom ca. 45 og ca. 70°C. pH i tilførselsmediet holdes mellom 4,0 og 7,5 ved tilsetning av passende buffersalter til mediet. Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen brukes til å fremstille eddiksyre ved fermentering av et karbohydrat med C. thermoaceticum, er den foretrukne pH i fødemediet mellom ca. 6,7 og ca. 7,4, og den foretrukne temperatur er mellom ca. 55°C og ca. 60°C. Strøm-ningshastigheten til mediet gjennom reaktoren justeres slik at man får en fortynningshastighet fra ca. 0,04 til ca, 3 pr. time. Ved en tilfredsstillende kontinuerlig fermentering danner cellene produkt i en konstant hastighet. Når det fremstilles en syre, indikeres "steady state"-tilstanden ved en konstant pH. Videre vil hastigheten hvorved nye celler dannes være lik med hastigheten hvorved celler tapes fra reaktoren, hvilket gir et konstant antall celler i reaktoren. En slik "steady state"-tilstand kan indikeres ved hjelp av en konstant optisk tetthet i avløpsvæsken målt ved 540 nm. I beskrivelsen av oppfinnelsen har uttrykket "fortynningshastighet ", slik det her brukes, størrelsen pr. tifrte uttrykt som /h. Som tidligere påpekt fås dette forhold ved å dividere strømningshastigheten til mediet med det totale volumet av reaktoren. Uttrykket "volum-produktivitet", slik det her er brukt, bestemmes ved å multiplisere konsentrasjonen av syren i avløps-væsken fra reaktoren, angitt i gram pr. liter, med fortynningshastigheten. Enheten for volum-produktiviteten angis som g/i-h. Eddiksyre- og glukosekonsentrasjoner ble bestemt ved å bruke "high-performance liquid chromatography" (HPLCJ. Bestanddeler ble kromatografert ved eluering med 0,006 N H2S04 fra en kation-bytterharpiks i hydrogenformen. Eluerte bestanddeler ble påvist ved hjelp av et differensial-refraktometer, plottet på en skriver og kvantifisert ved å bruke en elektronisk integrator. Arealet under kurven som representerer konsentrasjonen av hver bestanddel, angis som en prosent av det totale arealet. Den generelle fremgangsmåten er den som er angitt i "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromatography", A. Soc. Brew. Chem.Proc, 1973, s.43-46 . Separasjonene ble gjort på en 1-fots HPX-87 kolonne i hydrogenformen, tilgjengelig fra Bio-Rad Laboratories, Richmond, California.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen illustreres ytterligere ved hjelp av de følgende eksempler:

EKSEMPEL 1

En stamme av C. thermoaceticum, C5-2, ATCC nr. 3 9 289,

ble brukt til å fremstille eddiksyre. Denne syre-tolerante stamme ble erholdt ved å dyrke "Wood"-stammen, DSM 521, i medi-er med gradvis lavere pH inntil den ville vokse i et medium med en pH under 5,8. Den er inngående beskrevet i norsk patentsøknad nr. 84.0908, hvis beskrivelse i sin helhet her inntas som referanse.

Mediet som ble brukt til dyrking av organismen, hadde følgende sammensetning:

Oppløsninger av bestanddeler fra gruppene A, B og C ble. sterilisert hver for seg før de ble blandet til et medium med den angitte sammensetning. Deretter ble 0,5 g natrium-tiogly-kolat, 5,6 mg nikotinsyre og 1 ml av en sporsaltoppløsning til-satt pr. liter medium. Sporsaltoppløsningen hadde den følgende sammensetning:

Fremstilling av medium og dyrking av prøver ble utført ved å bruke standard anaerobe teknikker slik som beskrevet av R. E. Hungate; "A Roll Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes" i Methods in Microbiology, utgitt av J. R. Norris og D. W. Ribbons, vol. 3B, Academic Press, New York, 1969, s.117-132, og av Miller og Wolin; Appl. Microbiol., 22, 985 (1974).

En kontinuerlig fermentering ble utført ved å bruke en kultur

av C. thermoaceticum adsorbert på aktivt kull. Det avgassede fermenteringsmediet ble kontinuerlig sendt over en blanding av celler av mikroorganismen og kull, plassert i en kolonne med totalvolum 38 ml som var forsynt med en kappe.

Bæreren for bakteriecellene var "CPG Pittsburgh"-aktivt kull, 12-40 mesh ("US Standard Screen"-størrelse med siktåpninger på 1,68 mm til 0,42 mm), tilgjengelig fra Calgon Corporation, Pittsburgh, Pennsylvania. Reaktoren ble fylt med 11 g av kullet, kullet ble fuktet med destillert vann og reaktoren ble så sterilisert ved oppvarmning i 2 timer ved 121°C og 1 kg/cm^ i en autoklav. Sterilt anaerobt medium ble sendt oppover gjennom kolonnen for å mette kullet med mediet. Alle væsker ble oppbe-vart under en atmosfære med karbondioksyd. Omtrent 4 5 lag-volum-deler medium ble sendt gjennom kolonnen før den ble mettet med alle bestanddelene i mediet.

Inokulum for kull-laget ble fremstilt ved 3 daglige, på hverandre følgende underkulturer av stammen av C. thermoaceticum i medium inkubert ved 56°C. Deretter ble 12 ml av den tredje underkulturen som var blitt inkubert i 24 timer, injisert i bunnen av laget. Kolonnen som inneholdt kulturen ble inkubert ved 58°C ved hjelp av varmt vann som sirkulerte gjennom kolonne-kappen. Etter 12 timer med inkubering, indikerte turbiditet i mediet i den øvre delen av kolonnen at«vekst hadde oppstått. Sterilt medium ble deretter sendt oppover gjennom kolonnen med en strømningshastighet ved starten på 2,5 ml/h . Det ble obser-vert at cellene som var i kontakt med bæreren, festet seg til den og derved forhindret hurtig utvasking. Optisk densitet (O.D.) ved 540 nm, pH, glukosekonsentrasjon og eddiksyrekonsen-trasjon i avløpsvæsken ble kontrollert. Strømningshastighet til mediet ble variert under eksperimentet for å oppnå forskjellige fortynningshastigheter.

Volumproduktiviteten ved forskjellige strømningshastigheter er oppsummert i tabell I. Den maksimale volum-produktivitet på 6,0 g/l-h, funnet ved en fortynningshastighet på 0,5/h, var nesten tre ganger mer enn den beste tidligere rapporterte volum-produktivitet for en reaktor med bundne celler av C. thermoaceticum. I den fremgangsmåten (Wang og Wang) var cellene blitt bundet i en agar eller carrageenan-gel.

EKSEMPEL 2

Den generelle fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble fulgt med unntak av at bæreren av aktivt kull var erstatte med maiskolbepartikler. Maiskolbepartiklene som ble brukt var 14-20 mesh ("US Standard Screen"-størrelse) tilgjengelig fra The Anderson's, Maumee, Ohio, som Grit-0'Cobs, Grade 14 20. Resultatene for kjøringen er gjengitt i tabell II. Når det ble anvendt maiskolbepartikler som en bærer for denne fermenteringen med bundne celler, ble det erholdt en volumproduktivitet på over 14 g/l-h ved en fortynningshastighet på 2,l/h . En slik volumproduktivitet overskrider langt enhver volumproduktivitet som tidligere er blitt funnet for noen homoacidogen fer-menteringsreaks jon med bundne celler.

Sammenligningsprøve 1

For sammenlignings!ormål ble det utført en kontinuerlig fermentering i en reaktor med omrøring som inneholdt bare medium og celler uten noe annet materiale som kunne virke som en bærer. Fermenteringen ble utført ved 58°C og strømningshastigheten ble variert i løpet av eksperimentet slik som i eksempel 1. Den maksimale volumproduktivtet på 1,76 g/l-h ble funnet ved en fortynningshastighet på 0,23/h . Fortynningshastigheter over ca. 0,3 er ikke mulig i et slikt system ettersom cellene vaskes ut av reaktoren ved høyere fortynningshastigheter. Resultater av prøvene som er gjengitt i tabell III, viser at en fremgangsmåte hvor det anvendes en kontinuerlig reaktor uten cellebærer gir mye lavere volumproduktivitet enn fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Sammenligningsprøve 2

Den generelle fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble fulgt med unntak av at bæreren av aktivt kull ble erstattet med skum av kryssbundet polyuretan oppkuttet for å passe i kolonnen. Skummet som ble brukt var "Scott Filter Foam" som inneholdt

8 porer pr. cm. Det er tilgjengelig fra Scott Paper Company, Foam Division, Chester, Pennsylvania. Resultatene fra kjøringen er gjengitt i tabell IV. Når C. thermoaceticum-celler adsorberes på denne bærer, gir de betydelig lavere volumproduktivitet for eddiksyre enn når de adsorberes på bærere anvendt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Følgelig er det åpenbart at det er tilveiebragt, i henhold til oppfinnelsen, en forbedret fremgangsmåte for den kontinuerlige fremstilling av en organisk syre ved en homoacidogen reak-sjon som er overlegen fremgangsmåten ifølge den tidligere kjen-te teknikk. Mens oppfinnelsen er blitt beskrevet i tilknytning til bestemte utførelsesformer, er det klart at mange alternati-ver, modifikasjoner og variasjoner vil være åpenbare for fagmenn innen teknikken i lys av beskrivelsen ovenfor.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for kontinuerlig fremstilling av eddiksyre eller melkesyre ved fermentering av en karbohydratløsning ved å føre karbohydratløsningen over celler av en homoacidogen mikroorganisme, som er en eddiksyreproduserende stamme av Clostridium thermoaceticum eller en melkesyreproduserende stamme av Lactobacillus acidophilus, karakterisert ved at mikroorganismene vokser på overflaten av et bærermateriale valgt fra gruppen som består av aktivkull og maiskolbegranulat.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som eddiksyreproduserende stamme anvendes Clostridium thermoaceticum C5-2, ATCC nr. 39.289.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som melkesyreproduserende stamme anvendes Lactobacillus acidophilus, IAM 3532.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at pH-verdien holdes mellom 5,25 og 6,9, temperaturen holdes mellom 4 0 og 58°C, og fortynningshastigheten mellom 0,1/h og 2,l/h.