JPS59173087A - クロストリジウム・テルモアセチクムの新規な突然変異株および酢酸の製造におけるその用途 - Google Patents

クロストリジウム・テルモアセチクムの新規な突然変異株および酢酸の製造におけるその用途

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JPS59173087A
JPS59173087A JP59044135A JP4413584A JPS59173087A JP S59173087 A JPS59173087 A JP S59173087A JP 59044135 A JP59044135 A JP 59044135A JP 4413584 A JP4413584 A JP 4413584A JP S59173087 A JPS59173087 A JP S59173087A
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grown
fermentation
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carbon source
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ジエフエリ−・エス・ガナング
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54Acetic acid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、クロストリジウム・テルモアセチ突然変異株
に関しそして更に酢酸の製造におけるその使用に関する
発明の背景 微生物による有機化学薬品の製造は、発酵技術に熟達し
た技術者にとってよく知られている。
そのような発酵反応は、しばしば希薄水溶液中で各種の
生成物をもたらす。化学薬品をそれら相互から首だ多量
の水から分離する費用が非常に多額となるので、発酵に
よる化学薬品の製造は、化石燃料源からの同様な化学品
の製造に匹敵し得なかった。しかしながら、石油化石燃
料が次第に枯渇するに伴なって石油化学の供給原料の価
格が次第に高騰したために、復活しうる原料を単純な有
機化学品に変換しうる発酵反応に興味がよみかえpつつ
ある。
単一の生成物を生成する発酵は、そのような反応からの
生成物の単離が単純化されているので特に望ましい。単
一酸産生菌(homoaciaogen )として知ら
れるある種の微生物は、各種のヘキソース、ペントース
および乳酸上で生長した場合に単一の酸をもたらすよう
な手法において使スのようなヘキソースの発酵は、この
糖1モルから理論上酢酸3モルを生成しうるので特に魅
力的である。
C,テルモアセチクムは、フオンテーヌ(Fontai
ne )  らによって最初に単離された(J。
Bacteriol、  43  701−715 (
1942)参照)。
野生菌株は、約7のpHにおいて最もよく増殖する嫌気
性菌である。その増殖は、低いpH1酢酸およびアセテ
ートによって抑制される。これらの理由で、この菌株は
、高濃度においては酢酸を産生じない。
発酵反応においてより高い濃度の酢酸を産生りうるC、
テルモアセチクムの突然変異株を得ようとする試みが多
くの研究者によってなされた。ウォング(Wang)ら
(AIChE Symp、  Ser。
1s174 105−110(1978)参照)は、酢
酸す) IJウムに対するより高い許容性を有する微生
物の改善された菌株を記載した。シュヴアルツ(Sch
wart”! )およびケラ−(Ke11θr)は、パ
アブライド・アンド・エンヴアイアロンメンタルーミク
ロハイオロジ−(Appliecl andEnvir
onmental MicrobioloF!y) ’
、  43. 117−123 (1982)において
4.5のpHにおいて生長しそして酢酸を産生しうるニ
テルモアセチクムの菌株の単離を報告した。この研究は
、米国特許第4,371,619号においても開示され
ている。
本発明者らは、この度、5以下のpHにおいて生長しう
るC、テルモアセチクムの新規な突然変異株を単離した
。この変異株は、従来報告されたいかなる菌株よシも一
層効果的な酢酸の産生菌である。
本発明の概要 本発明に従えば、同化しうる炭素源、窒素および無機物
質を含有する水性培地中で生長した場合に酢酸を産生ず
るのに有用な、微生物C。
テルモアセチクムの突然変異株の生物学的に純粋な培養
菌が提供される。この培養菌は、50℃ないし65℃の
温度および5.0以下のp[(において生長しうる。そ
れは貰だpH7および58℃において連続的培地中で生
長した場合に、少くとも約0.50 hr”  の比増
殖速度を有する。
この菌株は、アメリカ/・タイプ・カルチュア・コレク
ションにATCC’ H1139,289の寄託番号の
もとに寄託されている。
本発明に従えば、また嫌気性発酵槽中で、同化しうる炭
素源、窒素および無機物質を含有する水性培地上で、−
ラー テルモアセチクム、ATCCNfL39,289
の菌株を使用して、約5ないし約8のpH、約50℃な
いし約65℃の温度でそして毎時約肌01ないし約0.
40の希釈率におけるpl(を制御された連続的発酵に
おいて一〇、−テルモアセチクムを生長させることによ
って、炭水化物を酢酸に転化させる方法もまた提供され
る。
本発明の突然変異菌株の発育に使用される親培養株は、
上テルモアセチクムの野生型、DSM 521であった
。使用された培養株は、マサチューセッツ工科大学(M
assachusettsInstitute of 
Technology )から得られたものであり、そ
の研究者らは、ケース・ウェスターン・リザーブ大学(
Ca5e Western Re5erveUnive
rsity、 C1eveland、  0hio、 
USA)のウッド博士(Dr、 H,G、 Wood 
)から入手したものである。
生長は、540 nmにおける吸光度を測定することに
よって監視された。スペクトロニック(5pectro
nic )  20分光測定器〔パラシュ・アンド―ロ
ンブ社(Bausch & Lomb、  Inc、 
Rochester、  New York )製造〕
が測定に使用された。試料は、0.1ないし0.7の吸
光度において測定するために蒸留水で希釈され、そして
測定は、外径16簡の調整されたノ・ンゲート(Hun
gate )管中で蒸留水のブランクと対比して行なわ
れた。無色の状態を維持するためにレサズリン指示薬か
使用された場合は、読取りの前に2〜3粒のナトリウム
ジチオナイトを希釈された試料に添加した。
酢酸およびグリコースの濃度は、高性能液体クロマトグ
ラフィー(HPLC)  を用いて測定された。細胞を
ベレット化するために、発酵混合物の試料を約10.O
OOXgの達成で遠心分離機にかけた。水素形の陽イオ
ン交換樹脂から0.06NのH2804を用いて溶離す
ることによって、上澄みの成分なりロマトグラフイーに
かけた。溶離をれた成分は、示差屈折計によって検出さ
れ、記録計上にプロット烙れそして電子積分器を使用し
て定量された。各成分の濃度を嵌わす曲線の下方の面積
は、全面積の百分率として報告された。一般的手続は、
“液体クロマトグラフィーによる炭水化物混合物の分析
(八nalyses  of  Carbohyara
te  Mixtures  byLikid Chr
omatography )”、  (Am、 8oc
、 Brew、HChem、  Proc、、 197
3.  pp 45−46参服)に記載されている。分
離は、バイオ−ラッド研究所 、5(Bio −Rad
 Laboratories、  R1chmo’V&
、 Ca11fornia)から入手しうる水素形の1
フイートのHPX−87カラム上でなされた。
本発明の記載においてこの明細書中で使用される「希釈
率」なる用語は、/ hr  (hr−” )の−’R
L、 、+→峠4有する。この率は、毎時容積単位中の
培地の流量を反応器の操作容積で割ることによって得ら
九る。
本明細書中で使用される「比増殖速度」なる用語は、発
酵反応器中の生物体量の単位童画りの増殖の速度を弐わ
す。それもまた時間の逆数(hr”” )の次元を有す
る。連続的発酵容器が定常状態において操作される場合
には、培養菌中の生物体量は、一定でありそして比増殖
速度は、希釈率に等しい。
最大比増殖速度は、パート(S、 J、 Pirt )
  により゛微生物および細胞培養の原理(Pr1nc
i、plesof Microbe  and Ce1
l Cu1tivation”、 JohnWiley
 &  5ons、  New  York、  19
75.  p 33 参照)に記載さねた方法によって
決定された。これは、ケモスタット中の流量を細胞の流
出が起る速度より上に増加させることによって達成され
る。
吸光度の示度は、細口も測定され、そして光学密度の読
みの自然対数が時間に対してプロットされた。この線の
傾斜およそ流出が起る希釈率は、その微生物の最大比増
殖速度を表わす。これらの細胞についてのマスが2倍に
なる時間は、また世代時間とも呼ばれ、ノn 2を最大
比増殖速度で割ることによって計算される。
親機生物は、pHがある期間に亘って次第に低くなる培
地中で連続的培養の条件を用いるケモスタット中で増殖
された。そのようなケモスタットの操作およびその中で
増殖する細菌の自然突然変異株を得るだめの使用法は、
ノヴイツク(A、Novick )  およびスジラー
ド(L、 5ziDaztl)によって記載された( 
5cience、 112. 715−716(195
0)参照)。ケモスタットの操作では、増殖しつつある
培養菌に供給される栄養素の量が培地のpHによって制
御される生物体量フィードバックの原理が用いられた。
この技術は、遺伝的に異なった微生物、すなわちこの場
合ではより低いpHでより急速に増殖するものを選択す
るために試みられる。この技術を使用することにより、
5.0またはそれ以下のpHを有する培地中で増殖する
突然変異株が得られた。この突然変異株は、約6.4以
下のpHを有する培地中では僅かな生長しか示さないC
,テルモアセチクムの親株とは明らかに異なっている。
本明細書中に記載する微生物の突然変異株は、新規であ
る。そわ、は、米国メリーランド州ロックヴイル所在の
アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクショ7 (A
merican Type Cu1tureColle
ction )に寄託されておシ、この特許の存在期間
中寄託され続けるであろう。それはATCCNa39,
289として入手されうる。
本発明の突然変異株は、培地中でまた酸素が排除された
芽囲気下で生長する高温性嫌気性菌である。それは、5
.0以下のpH値において同化しうる炭素源、9素およ
び無機物質を含有する水性培地中で生長して酢酸を産生
しうる。打首しい炭素源は、グルコースおよびフタルド
ースである。生長および酢酸の産生け、5.0以下のp
Hにおいては徐々に起るけれども、それらは、より高い
pHにおいては、より急速に起る。
好ましいpHは、約6,9〜7.4の間である。この微
生物の生長は、約50℃ないし約65℃の温度において
起り、好ましい温度は、約56℃ないし約60℃の範囲
内である。この突然変異株は、pH7および58℃にお
いて少くとも約0、30 hr”  の比増殖速度で増
殖しうる。
本発明の突然変異株は、pl(を制御された連続的発酵
において嫌気性発酵槽内で生長する場合に、炭水化物を
酢酸に変換するのに有用である。そのような発酵は、p
Hが5ないし8の範囲内で調整さね−そして温度が50
℃ないし65℃の範囲内に保たれた場合に、毎時0.0
1ないし0.4の希釈率で実施されうる。
本発明による突然変異株は、pH5の培地中で生長する
能力において親株とけ異なっている。
更に、それは、両者がpH7の培地中で生長する場合に
、親株のそれよシも約50チ大なる最大比増殖速度を示
す。
本発明による突然変異株および方法を以下の例によって
更に例示する: 例  1 微生物、土 テルモアセチクムの親株(DSM521)
は、マサチューセッツエ科太学(Massachuse
tts In5titute of Technolo
gy )の研究者によって提供されたが、これらの研究
者は、それをケース・ウェスターン・リザーブ大学(C
a5e Western Re5erve Unive
rsity、 C1eve−1ana、 0hio、 
USA )のウッド博士(Dr−H,G。
Wooa )から入手したものである。それは、西独ゲ
ッチンゲン市(G5ttingen )  所在のトイ
チェ・ザムルング・フォノ・ミクロオルガニズメン(D
eutsche Sammlungvon Mikro
organismen )からDSM 521の寄託番
号で入手されうる。
培地の調製および試料の培養は、ノリス(J。
R,Norris )  およびリボンス(D、W、 
Rlbbons )によって編集された「メソツズ・ア
ンド・W(クロバイオロジー(Methods and
 Microbiology)においてノ・ンゲート(
R,E、 Hungate )の論文“厳密な嫌気性菌
の培養のためのロール・チューブ法(A Roll  
Tube Method  for Cu1tivat
ionof 5trict Anaerobes ) 
”  (voh 3B、 AcademicPress
、  New York、 1969.  pp、 1
17−132参照)およびミラー(Mi’ler )と
ウオリン(Wolin )によυ「応用微生物学J (
Appl、 Microbiol、。
27、985 (1974)  参照)に記載された標
準的な嫌気的技術を使用して行なわれた。
微生物の生育のために使用された培地は、下記の組成を
有するものであった: 増殖培地 A、グルコース          30+OB、 N
aHCO316,B K、2 HPO7,0 KH2PO45,5 C1酵母エキス          5.0ト リ フ
′ ト ン                    
          5.0(NH4)2 SO41・
0 MgSO4・ 7H200,25 Fe (NH4)2  (SO4)2  ・ 6 H2
O0,04Co (NO3)2  ・ 6H200,O
3NaMoO4・ 2H200,0024レサズリン(
0,20r/100Tnl溶液)      1.0 
ml/を規定された組成の培地をつくるために一緒にす
る前に、組成グループ八、BおよびCの溶液を別々に滅
菌した。次に、培地1を当りナトリウムチオグリコレー
ト0.55’、ニコチン酸5.6〜および痕跡塩溶液を
添加した。この痕跡塩溶液は、下記の組成を有していた
: エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム塩    5.0
0二水化物 MnC42・4 H2O5,0O Na25e03                  
b、20H2BO30,100 ZnC420,050 AA K (SO4)2・12H200,100NiC
t2・6 H2O0,020 CuC42−2H2O0,010 容量1tのべA、 ニア (Be1lco )発酵槽(
Be1lc。
Glass Inc、、 Vineland、 New
 Jersey、 USA+より市販)において連続的
発酵を行なった。この発酵槽は、培地添加のための流入
管、溢流出口管、電磁式攪拌機およびインゴールド(I
 ngoM )pH検出管(Ingold Elect
rodss Inc、、 Andover。
Massachusetts、 USAよυ市販)を備
えていた。
このpI(検出管は、ケムトリックス(Chemtri
x )タイプ45ARpH調節器(C’hemtrix
 Inc、 。
Hlllsboro、  Oregon、  USA 
 J: 、jl)市販)に結合されていた。このpH調
節器は、培地を添加し、そしてpHが下部調節設定点に
達したときにいつも発酵槽から流出液を除去する嬬動ポ
ンプを作動せしめた。この配置は、pH値を調節点以上
に再び上昇せしめるために新たな培地が発酵槽に添加さ
れる前に、pH値を調整点まで低下させるのに十分な酢
酸を培養菌が産生ずるのにこのような装置が必要であっ
た。発酵槽内の培地の液面は、溢流流出液ポンプ系によ
って一定に保たれ、そして発酵槽ば、絶えず混合されか
つ僅かに正圧に保たれた(2ないし5 cm H2O)
純CQ2か吹込まれた。温度は、発酵槽のジャケットを
通って循環する加熱されたプロピレングリコールによっ
て58±1℃に維持された。
元の培養菌は、pH値を6.3に設定された培地中で培
養された。この微生物が生長するにつれて、より速やか
に生長する微生物への選択が起りそして培地の供給速度
が増大した。一度安定なほとんど平衡に近い状態に達す
ると、pH調整点は、約0.1pH単位低下した。次い
で選択は、新たな平衡状態に達するまでこのより低いp
H値において継続された。この手法に従って、5.0ま
たはそれ以下のpH値において生長する旦テルモアセチ
クムの培養株を得ること、 ができた。この新規な突然
変異株の個別的なコロニーを単離し、複製しそして新鮮
な培地中で生長せしめた。この細胞をグリセリン中に凍
結することによりまたは凍結乾燥によって貯蔵した。こ
の菌株は、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ
ョン(American Type Cu1turec
ollection )からATCCNl139.’2
89として人において生長し、このpH値における比増
殖速度は極めて低い。pH5において最大と観察された
比増殖速度は、0.025 hr”  であシ、これば
30時間の世代時間に相当した。これらの条件下で操作
された連続的反応器中の生成物濃度は、平均的1ay/
l であった。しかしながら、この菌株がケモスタット
中で中性のpH値において生長した場合には、次の例に
おいて記載されているように、はるかに改善された増殖
速度が観察をれた。
例  2 例1において単離されたC、テルモアセチク土の低pH
に耐えられる菌株が7.0のpHおよび58±1℃の温
度に保たれたケモスタット中で生育された。発酵槽に培
地を供給するためのpH調整ポンプの代シに定量供給ポ
ンプが使用されたことを除いては、装置およびケモスタ
ットの操作は、例1におけると同様であった。発酵槽の
容量は、所望の高さに位置せしめられた流出管を使用す
ることによって一定に維持された。0.25 hr−1
ないし0.31 hr−”  の定常状態における増殖
速度が観察された。最大比増殖速度は、0.33 hr
”  と測定され、コレU2.1時間の生物体量培増時
間(mass doubling time)に相当す
る。これは、ウオン(Wang)らによって報告された
(AIChE Symp、 Ser、  181. 7
4゜1os−11o (197B)参照)親株について
の0.22hr−”  の最大比増殖速度に匹敵する。
例  3 例1において単離されたニ テルモアセチク土の低pH
に耐えられる菌株が以下の実験において親株と比較され
た。1811IIl+のアルミニウムでシールされたベ
ルコ(Be11CO)管(B1311COGlass、
 Inc、、 Vineland、 New Jers
ey、 USAより市販)において10−の増殖培地に
接種するために0.3−の試料が使用される前に、両方
の菌株は、対数期まで発育した。増殖培地は、グルコー
スの濃度が2%で緩衝塩(培地の成分群B)の濃度か半
分にすぎなかったことを除いては、例1において使用さ
れた濃度と同じ濃度を有するものであった。培地のpH
は、酢酸で調整された。頂部空間にCO2を満たされた
前記試験管を58℃に保温した。培地の最初のpHが5
.5であったときには、本発明の突然変異株のみが、吸
光度の読みの増加によって測定されるような発育のみを
示した。約40時間の初期対数期の後では、それは0.
063 hr−1の比増殖速度で生長した。対照的に親
株は、120時間の培養の後においてさえ生長を示さな
かった。
培地の最初のpHが6.1であった場合には、本発明の
突然変異株は、対数期をほとんど経過することな(0,
099hr−1の比増殖速度を示した。親株は、約10
時間の初期対数期の後に、0、069 hr”  の比
増殖速度で生長した。
すなわち、本発明に従えば、従来技術による菌株よりも
すぐれた、酢酸の製造にとって有用なC,テルモアセチ
クムの菌株が提供きれたことけ明らかである。本発明を
その特定の具体例に関連して記述したが、以上の記載に
微して当業者にとって多くの選択、修正および改変が可
能であることは明白である。従って、そのような選択、
修正および改変は、本発明の範囲内に包含されるもので
ある。
第1頁の続き ■発 明 者 スザン・ジエイ・ルエンザーアメリカ合
衆国イリノイ州ラグ ランシュ・パーク・カマン・ア ベニュー1519 499−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、 同化しうる炭素源、窒素および無機物質を含有す
    る水性培地中で生長した場合に酢酸を製造するのに有用
    な微生物であるC、テルモアセチクム(C,therm
    oaceticum )の突然変異株の生物学的に純粋
    な培養株であって、上記突然変異株が5.0以下のpH
    で50℃ないし65℃の温度において生長することがで
    き、pH7および58℃における連続的培養で生長した
    場合に少くとも約0.30 hr−”  の比増殖速度
    を有しそして更にATCCNa S 9,289の寄託
    番号を有することを特徴とする前記企テルモアセチクム
    の突然変異株の生物学的に純粋な培養株。 2、 同化しうる炭素源、窒素および無機物質を含有す
    る水性培地上で嫌気性発酵器中で、約50℃ないし約6
    5℃の温度および毎時約0.01ないし約0.40の希
    釈率において約5させることによって炭水化物を酢酸に
    変換する方法において、この方法において使用されるC
    、テルモアセチクムの菌株が、5.0以下のpHで50
    ℃ないし65℃の温度において生長することができ、I
    )H7および58℃における連続的培養で生長した場合
    に少くとも約0.30 hr−”  の比増殖速度を有
    しそして更にATCCN1139,289の寄託番号を
    有するものである、同化しうる炭素源、窒素および無機
    物質を含有する水性培地中で生長した場合に酢酸を製造
    するのに有用な旦 テルモアセチクムの突然変異株の生
    物学的に純粋な培養株であることを特徴とする前記炭水
    化物を酢酸に変換する方法。 3、同化しうる炭素源がグルコース、フルクト−スおよ
    びグルコースとフルクト−スとの混合物からなる群から
    選択される特許請求の範囲第2項に記載の方法。 4、発酵が約6.9ないし7.4のpHにおいて行なわ
    れる特許請求の範囲第2項に記載の方法。 5、 発酵のpH値が約7のpH値に調節される特許請
    求の範囲第4項に記載の方法。 6、発酵が約56℃ないし約60℃の温度において行な
    われる特許請求の範囲第2項に記載の方法。 7、温度が58±1℃に調節される特許請求の範囲第6
    項に記載の方法。 8、 発酵のpHが約7のpHK調節される特許請求の
    範囲第7項に記載の方法。 9、 同化しうる炭素源がグルコース、フルクトースお
    よびグルコースとフルクトースとの混合物からなる群か
    ら選択されたものである特許請求の範囲第8項に記載の
    方法。
JP59044135A 1983-03-11 1984-03-09 クロストリジウム・テルモアセチクムの新規な突然変異株および酢酸の製造におけるその用途 Pending JPS59173087A (ja)

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