FI96871C - Termofiilinen etanolin tuotanto - Google Patents

Description

96871

Termofiilinen etanolin tuotanto -Termofil etanolproduktion

Keksintö koskee alkoholin, toisin sanoen etanolin tuottamista fermentaatiolla.

Alkoholin tuottaminen jäte- tai sivusokereista, joko sinällään syntyvistä tai muiden hiilihydraattien muuttumisesta johtuneista, on kauan ollut tunnettua mutta nykyään sen merkitys on lisääntymässä. Tämänhetkinen halpa öljy ja vaikeat ruokapulat tietyillä alueilla eivät voi lieventää sitä tosiasiaa, että on pohjimmiltaan epätervettä käyttää hyväksi uusiutumattomia energialähteitä, kun ohjattu maanviljely voisi taata ruoan ja energian maailmanlaajuisesti.

Olemme tutkineet tunnettuja alkoholin tuotantomenetelmiä, joissa suureksi osaksi käytetään hiivoja, ja tehneet sen johtopäätöksen, että avain parannukseen taloudellisessa toiminnassa, mikäli se on mahdollinen käytännössä, on sellaisten lämpötilojen käyttö, joissa alkoholi voidaan sopivasti poistaa fermentaatiokasvualustasta suoraan höyrynä. Hiivat tietysti ovat kykenemättömiä kasvamaan tällaisissa lämpötiloissa ja olemme tarkastelleet termofiilisia bakteereita.

Hiivat fermentoivat ainoastaan glukoosia, maltoosia ja sak- I karoosia, kun taas eräät bakteerit voivat käyttää myös sei- • · « . " luloosan entsyymisestä hydrolyysistä muodostuvaa sellobioo- • · « ;;; · siä tai hemiselluloosan hydrolyysistä muodostuvaa ksyloosia • · · ja arabinoosia. Viimeksi mainitut (pentoosi) sokerit ovat • · :.V pääkomponentteja jäteliemissä, jotka tulevat paperinvalmis tuksesta tai oljen esikäsittelyistä, kuten höyryräjähdyskä-: sittelystä tai laimeasta happohydrolyysistä. Sokeriruo'osta tapahtuvan etanolituotannon taloudellisuutta voitaisiin esi- merkiksi suuresti parantaa, jos bagassia (sokeriruo'on pu- I · "·. ristusjätettä) voitaisiin käyttää yhtä hyvin kuin mehua.

: On kuvattu eräitä termofiilisiä bakteereita, jotka voivat :*·.· käyttää kaikkia näitä sokereita etanolin tuottamiseksi kor- 2 96871 keillä saannoilla, esim. Clostridium thermosaccharolvticum.

Cl.thermohvdrosulfuricum tai Thermoanaerobacter ethanolicus. Ne ovat kuitenkin ehdottomasti anaerobeja ja niille kuvatut ominaisuudet ovat epäedullisia verrattaessa Bacillus stearo-thermoohilus-kantoihin. jotka kuvataan jäljempänä. Olemme myös havainneet, että fakultatiivisilla anaerobeilla on lisäksi etuna se, että ne mahdollistavat uuden aerobisen-an-aerobisen sekamenetelmän, jolloin on mahdollista, että anaerobisen vaiheen sivutuotteet hyödynnetään aerobisesti kata-lyyttisen biomassan regeneromiseksi.

Useimmat fakultatiiviset anaerobit eivät tuota etanolia korkeilla saannoilla. Aikaisemmissa julkaisuissa kuvasimme "metabolisen ohjaus" -strategian, jonka avulla mutantit, joiden uskottiin johtuvan Bacillus stearothermophilus NCA 1503:sta, voidaan manipuloida tuottamaan korkeita etanolisaantoja ·*' 2. Tässä strategiassa eliminoitiin L-laktaattituotanto valitsemalla mutaatiot L-laktaattidehydrogenaasissa. Muodostuneen mutantin odotettiin valmistavan asetaattia, etanolia ja formiaattia anaerobisesti saannoilla 2:2:4 sakkaroosimoolia kohti. Yllättäen kuitenkin etanolin saannot olivat korkeammat kuin tämä teoreettinen maksimi tietyissä olosuhteissa, varsinkin alhaisessa pH:ssa ja korkeissa lämpötiloissa ja tämän katsottiin olevan seuraus sakkaroosin katalyyttisestä muuttumisesta etanoliksi + C02:ksi panosviljelmien lopulli- . ” sen ei-kasvuvaiheen aikana.

• · · • · · • · · · • « · • · · '·* * Olemme nyt havainneet, että aikaisemmin ilmoitetut tulokset • · V.: ovat siinä mielessä virheellisiä, että kuvattu organismi ei ole B.stearothermophilus NCA 1503:n (NCIB 8924) johdannainen t kuten me oletimme (Payton ja Hartley3) eikä todellakaan mi- :*’* kään spesifinen, tunnettu termofiilinen bacillus. Sen sijaan ilmeni, että se oli johdannainen Bacillus stearothermophi-lus-lajien uudesta kannasta, jolla on ominaisuudet, jotka tekevät siitä paljon ylivoimaisemman verrattuna tunnettuihin kantoihin edellä kuvattuihin tarkoituksiin. Erityisesti sil- tl 3 96871 lä on paljon suurempi kasvunopeus kuin kannalla NCA 1503 sekä aerobisesti että anaerobisesti lämpötiloissa, jotka ovat yli 60 °C, ja se kasvaa anaerobisesti yli 70 °C:ssa, jossa lämpötilassa kannan NCA 1503 kasvu loppuu. Lisäksi se käyttää sekä sellobioosia että pentoosisokereita, joita löytyy vehnänolkien raa'asta laimeasta happohydrolyysistä, joka tapahtuu ICI-menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Ragg ja Fields 4.

Vaikkakaan tämä keksintö ei rajoitu tiettyihin bakteereihin, se koskee fakultatiivisia anaerobeja, kuten B.stearothermo-ohilus-kantaa LLD-R (NCIB-talletustiedot jäljempänä), joka nopeasti fermentoi useita sokereita, mukaan lukien sellobi-oosi ja pentoosit, sekä aerobisesti että anaerobisesti yli 70 °C:ssa. Tällaiset kannat tuottaisivat tavallisesti lak-taattia anaerobisesti mutta tämä reitti eliminoidaan valitsemalla mutaatiot NAD-kytketyssä laktaattidehydrogenaasissa. Lisäksi asetaattituotantoa voidaan vähentää fysiologisilla säädöillä, kuten happamalla pH:11a, korkeammilla lämpötiloilla tai solunulkoisen asetaatin korkeilla pitoisuuksilla tai muilla geneettisillä vaurioilla asetaattireitin entsyymeissä. Tämä johtaa anaerobisen metabolismin suuntautumiseen pyruvaattidehydrogenaasin kautta, jolloin tuloksena on soke-reiden muuttuminen etanoliksi + C02:ksi. Muodostuneet solut « · 1 eivät voi kasvaa anaerobisesti mutta ne voivat katalysoida • · ·; sokereiden muuttumisen etanoliksi ilman kasvua.

• · « • · · ··· · • · · V * Näin ollen tämän keksinnön kohteena on menetelmä, jossa täi- • · V.: laisia soluja käytetään katalyyttisessä, anaerobisessa tuo tantovaiheessa, johon syötetään sokereita mutta kasvu mini-: moidaan. Suurin osa etanolista poistuu automaattisesti höy- :*·*: ryfaasiin yli 70 °C:ssa niin, että tuotantofaasiin voidaan syöttää korkeita sokerikonsentraatioita organismin etanoli-···" toleranssia ylittämättä (noin 4 % paino/til.). Olemme ha vainneet, että nämä ominaisuudet soveltuvat itsessään uudek-: si jatkuvaksi menetelmäksi, jossa optimaalinen käymistuotan- • · · 4 96871 tokyky saavutetaan jatkuvalla solujen kierrättämisellä, sen jälkeen, kun vesipitoisen faasin tuotteet on poistettu sent-rifugoimalla tai suodattamalla. Minimikasvunopeus, joka on tarpeen katalyyttisen elinvoimaisuuden ylläpitämiseksi, voidaan saavuttaa laskemalla pois pieni osa soluista kierrättämisen aikana; tästä on seurauksena influenttisokerin ekviva-lenttisen osan muuttuminen uudeksi biomassaksi. Vaihtoehtoisesti jäljellä olevan vesipitoisen faasin etanoli poistetaan ennen käytettyjen solujen, hydrolysoitumattomien sokereiden, etanolin pienten jäännöserien ja sivutuotteiden, kuten ase-taatin ja formiaatin, palauttamista aerobiseen "biomassa"-vaiheeseen. Sen jälkeen aerobiset solut palautetaan katalyyttiseen "tuotanto”vaiheeseen, tarvittaessa välissä olevan anaerobisen "adaptaatio"vaiheen kautta. Tällaisen reaktori-rakenteen edullinen piirre on se, että automaattinen tuotannonohjaus etanolisaannon optimoimiseksi, voidaan ylläpitää minimoimalla aerobinen C02 ja maksimoimalla anaerobinen C02·

Keksinnön kohteena on siten kaksivaiheinen suljettu menetelmä etanolin tuottamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista , että (i) suoritetaan etanolia tuottava anaerobinen sokereiden fermentaatio anaerobisessa fermentaatiokasvualustassa lämpötilassa ainakin noin 70 °C, sellaisen termofiilisen, fakul- 1 tatiivisesti anaerobisen bakteerin läsnäollessa, joka kyke- ♦ · ♦ · . ” nee fermentoimaan sokereita sekä aerobisesti että anaerobi- • · · · sesti ja tuottamaan etanolia anaerobisessa fermentaatiossa ♦ · · ^ • · · *♦* * lämpötilassa 70 °C tai sen yli, • · *.·.· (ii) poistetaan kohdan (i) mukaisen anaerobisen fermen- taation aikana jatkuvasti etanolia, : (iii) poistetaan kohdan (i) mukaisen anaerobisen fermen- taation aikana jatkuvasti osa fermentaatiokasvualustasta, (iv) erotetaan bakteerit poistetusta fermentaatiokasvualustasta ja kierrätetään erotetut bakteerit kohdan (i) mukaiseen anaerobiseen fermentaatioon, (v) poistetaan etanolia poistetusta fermentaatiokasvu- 5 96871 alustasta ja (vi) lisätään etanolista vapaa fermentaatiokasvualusta aerobiseen reaktoriin ja viljellään bakteereita, palautetaan osa saaduista bakteereista ja kasvualusta kohdan (i) mukaisen anaerobisen fermentaation anaerobiseen kasvualustaan katalyyttisen biomassan ylläpitämiseksi.

Kantojen historia ia tunnusmerkit

Bacillus stearothermophilus-kanta LLD-15 (NCIB-talletustie-dot jäljempänä) nousi esille yritettäessä tuottaa Bacillus stearothermophilus-kannan NCA 1503 mutantteja, joilta puuttuu L-laktaattidehydrogenaasiaktiivisuus, siten että selek-toitiin itsetuhoavan substraatin resistenssin suhteen (Pay-ton ja Hartley3). Sen luonnollisesti oletettiin olevan viimeksi mainitun kannan mutantti, mutta tosiasiassa sen uskotaan johtuvan uudesta, erittäin termofiilisestä Bacillus stearothermophilus-kannasta LLD-R. Kanta LLD-R muodostuu spontaanisti ja toistettavasti kannasta LLD-15 ja se on valittu maljoilla tai jatkuvan viljelyn aikana, jossa se kasvaa paljon nopeammin, esim. alhaisessa pH:ssa kasvualustoissa, jotka sisältävät sokereita + asetaattia + formiaattia. Se tuottaa L-laktaattia anaerobisesti ja sisältää L-laktaatti-dehydrogenaasin korkeat pitoisuudet, joten se on selvästi LLD-15-vian "villityyppiä" oleva revertantti.

• · • · 6 96871 dattaen L.Donki'ia (1920) J.Bacteriol. 5. 373, mutta kasvu-lämpötila-alue on huomattavasti korkeampi kuin mitä on kannalla NCA 1503, josta mutantin ajateltiin johtuneen. Näin ollen molemmat organismit on talletettu uusina tyyppikantoi-na Bacillus stearothermophilus LLD-R (NCIB 12403) ja Bacillus stearothermophilus LLD-15 (NCIB 12428) laitokseen National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Torry Research Station, P.O. Box 31, Aberdeen; AB9 8 DG; Skotlanti. Vastaavat talletuspäivät ovat 10. helmikuuta 1987 ja 9. huhtikuuta 1987.

Kannat LLD-R ja LLD-15 kasvavat hyvin rikkaalla BST-kasvu-alustalla (g/1): tryptoni (Oxoid) 20,0; hiivatuute (Oxoid) 10,0; K2S04 1,3; MgS04.7H20 0,27; MnCl2.4H20 0,015;

FeCl3.6H20 0,007; sitruunahappo 0,32; täydennetty sopivalla hiililähteellä ja säädetty vaadittuun pH-arvoon KOHtlla tai H2S04:llä. Olemme kuitenkin kehittäneet myös täysin määrätyn kasvualustan BST-MM (g/1): hiililähde vaihteleva; K2S04 0,3; Na2HP04 1,0; MgS04 0,4; MnCl2.4H20 0,003; CaCl2 0,005; NH4C1 1,0; sitruunahappo 0,16; metioniini 0,2; (mg/ml): ni-kotiinihappo 10; biotiini 10; tiamiini 10; ZnS04.7H20 0,4; boorihappo 0,01; CoCl2.6H20 0,05; CuS04.5H20 0,2; NiCl3.6H20 V, 0,01; EDTA 0,25.

1 Kannat LLD-15 ja LLD-R eivät ole tulleet tunnetuiksi Biotech • · , , 1 · . ♦ . Ί 83 - viitteestä (Hartley et ai. ), koska siinä ei ole, niin • · · kuin ei keksijän muissakaan aikaisemmissa julkaisuissa, esi- • · · tetty toistettavaa menetelmää LLD-15-kannan valmistamiseksi.

• · **.*.’ Kanta LLD-15 on vahingossa syntynyt kontaminantti alun perin käytetystä NCA 1503 -kannasta. Siten missään ei ole kuvattu |t; : menetelmää oletetun villityyppisen LLD-R-kannan valmistami- seksi, jonka kannan keksijä sai LLD-15-kannan taantumakanta-na (revertant) . Kanta LLD-R ei normaalisti esiinny kannan NCA 1503 yhteydessä, joten se, kuin ei myöskään kanta LLD-15 tai sen johdannaiset ole olleet saatavissa, eikä keksijä | : myöskään ole niitä antanut kenellekään.

* « · έΙ 7 96871

Alan asiantuntija ei siis olisi Biotech 83 -viitteen perusteella kyennyt saamaan aikaan kyseisiä kantoja, eikä siten ilman omaa keksinnöllistä panosta toteuttamaan tämän keksinnön mukaista menetelmää.

* 9 9 · 9 · • · 4 « · • · · ··· · » · · • · « • · · ♦ • 9 9 1 1 • « « • · • · « · · < « 1 • ·· · « · 8 96871

Taulukko l. Uusien kantojen vertailu muihin termofiilisiin bacilluksiin vO #—1

O

* C (N

ιΛ ιΛ ^

g ® w SS SS

.........<ϋ φ 5» cc 0000000001>·~ 1r ® ^ uuuuuv-^-v-IhOOO 3, 2,. ,

cccccccciotjoo S' J S1 A

αιοίΦα,ν^ΦφΓ-.Γ-. - «ς S

in ui w tn m in ui in w o o o O < cQiasQiaoöcaQQQQQ c tärkkelyshydrolyysi R.. + + RR-- + RR·1·- kaseiinihydrolyysi + .. + w + + -- + + + + ~ w liivatehydrolyysi +.. + w- + -w + + + + - hippuraattihydrolyysi + .. -............ + ......

sitraatin hyväksikäyttö - - -............ 1 ......

katalaasi + + __ + + + + -- -- + + oksidaasi --- + + ^ + ^- + + + - kasvu 3 %:isessa _ w-w + +www--- suclaliuaksessa

Sokerifermentaatiot: galaktoosi --w + _- -- w- -- + + glykogeeni + w + + -- + w- tw t manmtoli — — — ^_ _ + + — w + ww 1 raff inoosi -_ + _____ + + w- - . , tärkkelys + - + w-- + -- + w w trehaloosi + _+_ + _ww + w + + + + • · ?,· i ksy loosi + + - + -- -- + -- -^ u • » 0

• » I

• · · • « *.V Testit suoritettiin rinnakkain menetelmän mukaan, jonka esittänyt Sharp, R.J., Bown, K.J. ja Atkinson, R. (1980) ϊ B.stearothermoohilus-kannalle LLD15, LLD-R ja NCA 1503 ja B.caldotenax. Muut arvot ovat mainitusta viitteestä; R = ra- f joitettu, + = positiivinen; w = heikko positiivinen; - = negatiivinen; .. = ei testattu.

« · · « « ·

II

1 % • · 9 96871

Kuviot

Tekstissä viitataan kuvioihin 1-6, jotka ovat seuraavat: kuvio 1 Anaerobiset reitit ja teoreettiset saannot Bacillus stearothermophilus-kannalle LLD-15 kuvio 2 Vakiotila-arvot jatkuvissa viljelmissä pH-arvossa 7, D = 0,2 h-1 sakkaroosia 10 g/1 anaerobisesti tai 5 g/1 aerobisesti (katkoviiva), 0,5 % tryptonia, 0,25 % hiivauutetta a) biomassa: (·) kanta NCA 1503; (a) kanta LLD-R, (O) kanta LLD-15 (b) tuotteet kannalla LLD-15 kuvio 3 Kannan LLD-15 jatkuvat viljelmät vehnänoljen hydroly-saatin erilaisilla konsentraatioilla (Ragg ja Fields, 1986) 70 °C:ssa, D = 0,2 h-1, pH 7 kuvio 4 Jatkuva, kaksivaiheinen reaktorisysteemi etanolin ‘. tuotantoon I > I « * ^ kuvio 5 Jatkuva fermentaatio osittaisella solukierrätyksel- . 'J lä, laite e · · • · · • ·· · • i# 1*1 ‘Y kuvio 6 Jatkuva fermentaatio osittaiselle solukierrätyksel- V.· lä, suhteet • s » · · Anaerobiset reitit uusilla kannoilla »· · t i i • t t %

Alkuperäiset kokeemme suoritimme enimmäkseen 60 °C:ssa pa-

> I

nosviljemässä 2,35 %:lla (paino/til.) sakkaroosia/BST-kas- lii·

, * vualustalla, koska tämä on optimilämpötila kannalle NCA

f < j 1503, joka oli mutanttikannan LLD-15 oletettu esikanta. Kan- 10 96871 nan NCA 1503 tai kannan LLD-R anaerobisissa panosviljemissä lopputuote on pääasiallisesti L-laktaatti, kun taas kannalla LLD-15 saadaan (mooleja/mooli sakkaroosia): etanolia (1,8), asetaattia (1,8) ja formiaattia (3,2) pH:ssa 7,9. Tämä on yhteensopiva metabolian kanssa pyruvaatti-formiaatti-lyaasi (PFL)-reitin kautta (kuvio 1), koska mutaatio poistaa L-laktaattidehydrogenaasiaktiivisuuden. Kuitenkin happamammalla pH-arvolla etanolin suhde asetaattiin kasvaa ollen pH-arvossa 6,2: etanolia (2,9), asetaattia (0,2) ja formiaattia (1,3). Tämä osoittaa, että uusi reitti, jolla saadaan 2 etanolia + 2 C02:ta jokaisesta glukoositähteestä, myös toimii ja uskomme, että tämä tapahtuu palorypälehappodehydrogenaa-sin (PDH) kautta, jonka on yleisesti arvioitu olevan toimintakyvytön anaerobisesti. Lyhyesti tuotteet kuviossa 1 ovat:

tuotteet (moolia/sokerimooli) reitti etanoli asetaatti formiaatti C02 ATP

glukoosi glykolyysi + PDH 2,00 0,00 0,00 2,00 2,00 " + PFL 1,00 1,00 2,00 0,00 3,00 : Entner-Doudoroff + PDH 1,50 0,50 0,00 0,00 3,00 " " + PFL 1,00 1,00 1,00 1,00 2,00 • · · • · • · · • · « * * Ksvloosi pentoosisykli + PDH 1,67 0,00 0,00 1,67 1,67 : " ·. + PFL 0,83 0,83 1,67 0,00 2,50 • · · : fosfoketolaasi + PDH 1,00 1,00 0,00 1,00 1,50 f. " + PFL 0,50 1,50 1,00 0,00 2,50 • · · « i : Muunto PLF-reitiltä PDH-reitille tapahtuu anaerobisten pa- '.'·· nosfermentaatioiden myöhemmissä vaiheissa kannalla LLD-15 ja siihen liittyy kasvunopeuden hidastuminen ja pyruvaatin pie- ti 11 96871 nien määrien ilmaantuminen kasvualustaan. Vaikutus on kaikkein selvin panosfermentaatioiden aikana korkeilla sokeripitoisuuksilla, esim. 5 %:lla (paino/til.) sakkaroosia, jolloin kasvu loppuu paljon ennen kuin kaikki sokeri on käytetty mutta ei-kasvavat solut jatkavat sakkaroosin muuttamista kvantitatiivisesti etanoliksi + C02:ksi. Näin ollen tällaisessa panoskäymisessa etanolisaannot voivat olla 3,64 moo-lia/sakkaroosimooli (91 % teoreettisesta). Korkeampi lämpötila (70 °C) myös suosii PDH-reitin valintaa.

Muutos PFL-reitiltä PDH-reitille johtuu asetaatin ja formi-aatin kerääntymisestä kasvualustaan eikä etanolin kerääntymisestä, kuten osoittaa näiden tuotteiden lisääminen kasvualustaan panosfermentaation varhaisissa vaiheissa. Pyruvaa-tin erittymistä havaitaan aina kun PDH-reitti on merkittävästi toimiva. Tällaisissa olosuhteissa kasvaneilla soluilla on pyruvaattidehydrogenaasiaktiivisuuden pitoisuudet soluva-paissa uutteissa vielä korkeammat kuin täysin aerobisilla soluilla, kun taas villityyppiä olevalla on hyvin alhaiset anaerobiset PDH-pitoisuudet. Ei ole olemassa mitään havait- t « : '.· tavissa olevaa pyruvaattidekarboksylaasi- tai formiaattide- • hydrogenaasiaktiivisuutta, joka saattaisi muodostaa vaihto-ehtoisen reitin etanolin ja C02:n tuottamiseksi. Valinta • reiteissä voi olla esi-itiön muodostumisilmiö biomassan .'j'. vähentyessä panosfermentaatioiden loppua kohti ja itiöiden .·.·. ilmestyessä.

• · · • · . . Luultava syy reittien muutokseen on seuraava. Villityyppiä • » » oleva organismi sopii nopeaan kasvuun sekä aerobisesti että • · « *·] * anaerobisesti, niinpä sillä on nopeasti toimiva sokerin- käyttö- ja glykolyysisysteemit. Se tavallisesti erittää L- • · · ·:··; laktaattia anaerobisissa olosuhteissa, mutta kun tämä reitti . suljetaan, pyruvaattimetabolia kääntyy PFL-reitille. Kuiten- | kin sen jälkeen asetaatin ja formiaatin erittymisnopeus muo- '· ” dostaa nopeutta rajoittavan vaiheen energiametabolialle, erityisesti käytettäessä ulkopuolista asetaattia ja formi- 12 96871 aattia tai happamassa pH:ssa, jossa erittyminen anioni- tai protonigradienttia vastaan alentaa ulosvirtausnopeutta. Näin ollen pyruvaatti kerääntyy solujen sisään ja indusoi pyru-vaattidehydrogenaasiaktiivisuuden pitoisuuksiin, jotka ovat jopa korkeampia kuin täysin aerobisissa soluissa. Virtaus pyruvaattidehydrogenaasin kautta on kuitenkin yhä riittämätön nopean kasvunopeuden ylläpitämiseksi, mikä havaitaan alkalisella pH-arvolla tai alhaisessa sokerikonsentraatiossa asetaatin ja formiaatin puuttuessa, ja solut saavuttavat stationaarisen vaiheen, jossa sokerit muuttuvat kvantitatiivisesti etanoliksi ja C02:ksi kasvamatta.

Yksitilaiset. jatkuvat viljelmät

Esikokeet villityyppiä olevan (LLD-R) kannan ja kannan LLD-15 vertailemiseksi suoritettiin 2-3 %:lla sakkaroosia BST-kasvualustalla 60 °C:ssa (laimennussuhde 0,25 h-1).

Kuten odotettiin, villityyppiä olevat solut tuottivat pääasiassa L-laktaattia, vaihdellen 3,13 moolista/sakkaroosi-mooli käytettynä pH:ssa 8 3,50 mooliin pH:ssa 6,35 ja Y-arvot (grammaa soluja/grammaa sakkaroosia) olivat noin 0,07. Mu-tanttikannalla pH:ssa 7 etanoli oli päätuote (2,3 moolia/ sakkaroosimooli) ja Y-arvo oli korkeampi (0,10). Kuitenkin kanta LLD-15 oli pysymätön jatkuvissa viljelmissä happamalla pH-arvolla ja korkeilla sokerikonsentraatioilla ja oli ta- * . vallista, että revertantit tulivat vallitseviksi tuottamaan • · · 1 • · « L-laktaattia (kanta LLD-R). Tämä kuvaa tällaisten jatkuvien viljelmien osoittamaa voimakasta valintapainetta, joka koh-··· · distuu lisääntyneeseen energiahyötysuhteeseen, ja kuvaa jät- • · t *·' 2 kuvan menetelmän potentiaalista heikkoutta. Kuitenkin tämä :***: reversio on vähemmän yleinen jatkuvissa viljelmissä 70 • · · °C:ssa alhaisilla sokeripitoisuuksilla ja voidaan eliminoida valitsemalla uudelleen ei-revertoivan mutantin kannasta LLD-:·'· j R (Paytonin ja Hartleyn menetelmä 3) .

Kuvassa 2a esitetään vakiotilainen biomassa kantojen NCA 1503, LLD-R ja LLD-15 jatkuvissa viljelmissä, kasvatettuna 2 13 96871 anaerobisesti 1 %:lla (paino/til.) sakkaroosia tai aerobisesti 0,5 %:lla sakkaroosia, 0,5 %:lla tryptonia, 0,25 %:lla hiivauutetta pH:ssa 7,0, laimennusnopeus 0,2 h-1 erilaisissa lämpötiloissa. Molemmat uudet kannat ja kanta NCA 1503 omaavat erinomaisen aerobisen ja anaerobisen metabolismin mutta kanta NCA 1503 kuolee anaerobisesti yli 70 °C:ssa kun taas molemmat villityyppiä olevat (LLD-R) ja mutantti (LLD-15) säilyttävät merkittävän anaerobisen metabolian aina 75 °C:seen saakka. Tämä lämpötila on lähempänä vesipitoisen etanolin kiehumispistettä ja siitä syystä merkittävä tässä kuvatuille menetelmille.

Kannan LLD-15 anaerobisten jatkuvien viljelmien tuotteet on esitetty kuvassa 2b. On selvää, että etanolin tuotantokyky (mmoolia/A600) kohoaa, kun lämpötila nousee ja siihen liittyy pyruvaatin erittyminen.

Kanta NCA 1503 ei kasva ksyloosilla aerobisesti eikä anaerobisesti, mutta.sekä LLD-R että LLD-15 kasvavat. Tuloksia, jotka saadaan sakkaroosilla, voidaan verrata jatkuviin viljelmiin 1 %:lla ksyloosia 70 °C:ssa analogisissa olosuhteissa i (taulukko 2). Vakiotilat voidaan taas ylläpitää ja alkoholi- saannot ovat taas korkeammat happamassa pH:ssa.

• · · • · · • · • · · • · · • · • · • · · • ··· · ··· • · · • · · 1 2 · · • · • · 2 · 14 96871

Taulukko 2. Kannan LLD-15 jatkuvat, anaerobiset viljelmät, joissa ksyloosia (10 g/1), tryptonia (5 g/1), hiivauutetta (2,5 g/1), BST-suoloja, 70 °C:ssa, D = 0,2 h-1 tuotteet: pH soluja ksyloosi- (moolia/mooli ksyloosi g/g soluja/h) (9/1) jäännös etanoli asetaatti formiaatti (9/1) 6,5 0,35 0,9 1,70 (0,13) 1,79 (0,17) 3,48 (0,25) 7.0 0,98 0,9 1,43 (0,04) 2,14 (0,07) 3,84 (0,10) 8.0 0,67 0,9 0,82 (0,03) 1,07 (0,05) 2,20 (0,08)

Vakiotilan biomassaa pH:ssa 7 on vähemmän kuin puolet sakkaroosin konsentraatiosta, niinpä ksyloosimetabolia on vähemmän energiaa vaativa. Sakkaroosin uskotaan metaboloituvan kahdeksi heksoosifosfaatiksi vastaavan kinaasin + fosfory-laasin kautta vaatien yhden ATP:n. Sitä vastoin kahden ATP:n uskotaan olevan tarpeen kahden pentoosifosfaattimolekyylin : tuottamiseksi. Tästä syystä sakkaroosi on sellaisenaan pa- rempi energiasubstraatti.

Jatkuvien ksyloosifermentaatioiden tuotteet osoittavat, että ;’j': tryptoni-hiivauutteen huomattava osa metaboloituu energia- .·.·. tuotantoon. Siitä huolimatta tuotesuhteet pH:ssa 8 osoitta- • · « vat, että metabolia tapahtuu pentoosifosfaattireitin, gly- . . kolyysin ja PFL-reitin kautta. Etanolisaannot ovat alhaisem- • · * *;·.* pia kuin sakkaroosilla, viitaten pieneen etenemiseen PDH- • · · ’·* * reitin kautta. Kuitenkin fermentaatioiden korkeammilla soke- rikonsentraatioilla korkeammissa lämpötiloissa ja alhaisem-·;·*· massa pH:ssa odotetaan lisäävän etenemistä viimeksi mainitun . reitin kautta, mitä tulee sakkaroosiin ja mutaatioiden ase- ; taattikinaasissa tai fosfotransasetylaasissa odotetaan vas- taavasti tuottavan ei-kasvavan kannan, joka muuttaa ksyloosin kvantitatiivisesti etanoliksi ja C02:ksi.

Il 15 96871 Näin ollen uusi kanta ja sen variantit on edullinen organismi etanolin tuottamiseksi lignoselluloosaisten jätelie-mien hydrolysaateista. Jatkuvia viljelmiä on tuotettu veh-nänoljen raaoilla hydrolysaateilla, jotka tuotetaan ICI-hydrolyysimenetelmällä, jonka on kuvannut Ragg ja Fields4. Tämä on itse asiassa jäteliemi, jossa on paljon ksyloosia ja ligniiniä ja joka muodostuu lyhyessä laimeassa happohydro-lyysivaiheessa, joka on suunniteltu hemiselluloosien poistamiseksi, ja sillä tavalla myöhemmin tapahtuvan delignifioin-nin edistämiseksi. Raa'an materiaalin pH säädetään arvoon 7,0 ja testataan jatkuvassa viljelmässä uudella kannalla 70 °C:ssa, D = 0,2 h-1 erilaisilla laimennoksilla, kuten esitetään kuviossa 3. Jäteliemi sisältää kaikki tarvittavat ravintoaineet organismin jatkuvaa viljelmää varten ja kaikkia sokereita käytetään jossain määrin. Etanolisaannot nousevat alhaisemmassa pH:ssa ja tuotesuhteet vastaavat metabolismia pentoosifosfaattireitin, glykolyysin ja PFL:n plus PDH:n kautta (katso kuvio l).

Kaksivaiheinen, aerobinen/anaerobinen fermentaatio

Ominaisuus, jolla sokerit muuttuvat kvantitatiivisesti etanoliksi ilman kasvua, on uuden kannan merkittävä potentiaalinen etu. Se voidaan maksimoida manipuloimalla edelleen fy-: : : siologisia olosuhteita, kuten edellä kuvattiin, tai valitse- f*;'; maila muita mutaatioita. Kuvio 1 osoittaa, että solut, joil- • · ta puuttuu asetaattikinaasi tai asetyyli-KoA-fosfotransase- : tylaasi, eivät pysty tuottamaan asetaattia. Koska asetaatin • · · *1!.' erittyminen on olennaista anaerobisen etenemisen ylläpitämi-

• · I

*. * seksi PFL:n kautta, ainoastaan PDH-reitti jää avoimeksi py- • · · :...: ruvaattimetabolialle, joka johtaa etanoliin + C02:teen. Täl- laiset solut eivät voi kasvaa anaerobisesti, mutta ne voidaan tuottaa aerobisesti ja käyttää anaerobisesti sokereiden muuttamiseksi etanoliksi katalyyttisesti.

Lisäksi olemme havainneet, että mutaatiot, jotka lisäävät solunsisäistä pyruvaattidehydrogenaasiaktiivisuutta, lisää 16 96871 vät etanolin tuotantokykyä, koska PDH näyttää rajoittavan energiavirtausta. Tällaiset mutaatiot valitaan joko spontaanisti tai mutagenaasin jälkeen, kasvattamalla jatkuvassa viljelmässä tai maljoilla olosuhteissa, joissa solunsisäisen asetaatin ja formiaatin kerääntyminen tapahtuu, t.s. sokerilla alhaisessa pH:ssa + lisätty asetaattia ja formiaattia. Vaihtoehtoisesti PDH-geenien lisäkopioita voidaan tuottaa geneettisillä työmenetelmillä.

Koska maksimaaliseen etanolin tuotantokykyyn liittyy kasvun loppuminen, tavalliset, anaerobiset panosviljelmät eivät sovi etanolin tuotantoon tällaisilla kannoilla. Panostuotanto voidaan aikaansaada käyttämällä aerobisesti kasvatettujen solujen suurta ymppiä anaerobisessa reaktorissa, tai suorittamalla panosfermentaatiot osittain anaerobisissa olosuhteissa, joissa kokonaisbiomassa riippuu syötetystä happipitoisuudesta.

Lisäksi loputon jatkuva menetelmä, jota ei-kasvavat solut katalysoivat, on selvästi mahdoton; sokerin minimikäyttö (ylläpitovakio, m3) tarvitaan solun elinvoiman ylläpitämiseksi. Olemme todenneet, että tämä voidaan saavuttaa yksivaiheisessa, anaerobisessa reaktorissa osittaisella solu-kierrätyksellä, kuten kuvataan kuviossa 5 ilman uudelleen-; ; ; kiertoa tai tyhjennystä; systeemi toimii kuten tavanomainen •·. yksivaiheinen, jatkuva viljelmä pitoisuuden ohjaussysteemin • · « kautta. Kun tämä suljetaan ja kierrättäminen alkaa, biomas-. . sapitoisuudet nousevat maksimiin ilmaistuna ylläpitovakiol-

• · I

la. Tämän jälkeen kaikki substraatti muutetaan tuotteiksi.

« · * *·[ * Tämä on selvästi edullinen tuotantotarkoituksiin, mutta käy- tännössä johtaa reaktiokykyisen tuotannon jatkuvaan vähene-miseen (m). Kuitenkin jos tapahtuu pieni poisto reaktorista (Fx), vakiotilakasvu tapahtuu nopeudella μ — Fx/V (jossa V ;· ; = reaktorin tilavuus). Tämä voidaan minimoida heikentyneen reaktorin tuotantokyvyn tasapainottamiseksi. Kuviossa sokerit ja ravintoaineet pumpataan nopeudella F^. Vakiopoisto 17 96871

Fx, (FX«F^) määrittelee solun kasvunopeuden μ = Fx/V (V = fermentorin tilavuus). Jäljelle jäävä kasvuliemi kierrätetään uudestaan onton kuitu-ultrasuodatinmembraanin kautta, työskentelemällä sen maksimikapasiteetilla. Suodatustehoa Ff säätelee pitoisuuden ohjaussysteemi; ylimääräinen suodos pa-lautetetaan fermentoriin.

Kuviossa 6 esitetään mallisysteemin tulokset kannalla LLD-15 l%:isella sakkaroosi/BST AM-alustalla 70 °C:ssa, pH 7. Kuvio osoittaa suhteen volumetrisen etanolituotantokyvyn, solukon-sentraation ja kokonaislaimennossuhteen välillä, D = F^/V.

SQ = 1 %, T 70 °C, 400 kierr./min, pH 7,0, Bacillus stea-rothermophilus LLD-15. Solun kasvunopeus μ = Fx/V = 0,1 h-1. Kasvunopeus pidettiin vakiona 0,1 h-1 muuttamalla pois-tonopeutta Fx. Kokolaimennusmäärä D kasvoi lisättäessä soke-reiden ja ravintoaineiden syöttömäärä F^. Sakkaroosin kulutus (ei esitetty) oli aina yli 97 %, mikä on osoitus systeemin korkeasta stabiliteetista. Volumetriset etanolin tuotantokyvyt olivat merkittävästi korkeammat kuin tavanomaisissa, yksivaiheisissa, jatkuvissa fermentaatioissa (t.s. 0,6 g etanolia/l-*1) . Tämä johtui ensi sijassa solutiheyden suhteellisesta lisääntymisestä, joka saavutetaan korkeilla lai-mennusmäärillä.

. . ; Tällaiset reaktorisysteemit ovat mahdollisia etanolin tuot- j*.\ tamiseksi näillä kannoilla, mutta olemme havainneet, että fakultatiivisen anaerobin erityisominaisuudet voidaan maksi- . moida etanolin tuottamiseksi uudessa reaktorikokoonpanossa, • · · joka on kuvattu kuviossa 4. Lyhyesti sokerit pumpataan anaero- • · i *·] * biseen reaktoriin A nopeudella V2. Höyryfaasissa oleva eta- noli erotetaan C02:sta vesiabsorptiolla. Osa käytetyistä so-*:··· luista poistetaan sentrifugoimalla (C) ja etanoli tislataan , \ effluenttivirrasta. Jäännössokerit jä etanoli täydennetään ravintoaineilla (N) nopeudella Vn ja käytetään katalyyttisen biomassan muodostamiseksi aerobisesti (B). Muodostuneet solut palautetaan reaktoriin A sentrifugoimisen jälkeen. Yksi- 18 96871 tyiskohtaisemmin sokereita, kuten ruokomehua, melassia, ol-kihydrolysaattia, jne. syötetään nopeudella Vg anaerobiseen reaktoriin, jota täytetään soluilla nopeudella VR. Kuvaamista varten reaktori A on yksinkertainen, sekoitustankki (tilavuus VA), jossa lämpötilaa ja pH:ta säädellään etanolin saannon ja tuotantokyvyn maksimoimiseksi. Höyryfaasissa oleva etanoli erotetaan C02:sta absorptiolla veden kanssa ennen jatkuvaa tislausta. Kuitenkin yksi termofiilisen fermentaa-tion pääeduista on, että kun vesipitoisen etanolin kiehumispiste saavutetaan, sitä voidaan poistaa jatkuvasti ja taloudellisesti vesifaasista, jolloin poistuu etanolin kasvua ja/tai tuotantokykyä inhiboiva vaikutus (kannan LLD-15 ollessa kyseessä kasvu loppuu etanolipitoisuuden ollessa yli 4 % (paino/tilavuus) 60 °C:ssa). Tämä mahdollistaa sokereiden korkeampien konsentraatioiden käytön syötettävässä raaka-aineessa, kuten melassissa. Näin ollen anaerobinen reaktori voi edullisesti olla sellainen, joka maksimoi etanolin pois-tonopeuden höyryfaasiin, kuten tyhjöfermentaatio, pirskottaminen kierrätetyllä C02:lla tai jatkuva kierrättäminen tyh-jöpikahaihduttimen läpi.

Jatkuva sentrifugointi ja kierrättäminen konsentroivat suurimman osan soluista effluentissa, joka saadaan A:sta. Sen jälkeen etanoli poistetaan supernatantista jatkuvalla tis-> ; : lauksella. Aerobiseen reaktoriin B tuleva virta sisältää käytetyt solut (tai itiöt), jäännösetanolin, käyttämättömät • · sokerit ja sivutuotteet, kuten asetaatin ja formiaatin.

. . Useimmat näistä voivat toimia aerobisina substraatteina kan- : : : nalle LLD-15. Tästä syystä virta täydennetään tarpeellisilla i » * ·, ravintoaineilla, jotta mahdollistetaan näiden jätehiililäh- '·* ! teiden maksimaalinen muuttuminen biomassaksi.

• « « » I · , Tämä biomassa konsentroidaan sentrifugoimalla ja palautetaan t i · ! anaerobiseen reaktoriin (tilavuus VB) . Ongelmana on, että • ’ voidaan havaita viivevaihe ennen kuin aerobiset solut sopeu tuvat anaerobiseen metaboliaan. Siitä syystä voi olla 19 96871 edullista käyttää reaktoria B antaen happea rajoitetusti tai asettaa väliin väliaikainen "anaerobinen adaptaatio"-reak-tori, johon syötetään vähän sokeria optimikasvu-pH-alueella, ennen solujen palauttamista katalyyttiseen vaiheeseen.

Prosessin muuttujat sellaisessa reaktorikokoonpanossa ovat kompleksisia, mutta systeemillä on hyvät puolensa. Optimaalinen etanolisaanto mille tahansa annetulle reaktioon syötetylle koostumukselle ja määrälle (Vg) saadaan, kun anaerobinen C02 (=etanoli) tuotanto on maksimaalinen ja aerobinen CO2 (olettaen sokerien täydellisesti hapettuvan) on minimaalinen. Optimaalinen tuotantokyky saadaan maksimoimalla Vg. Näin ollen käyttämällä C02~antureita pumppausnopeuksien, pH:n ja lämpötilojen säätelemiseksi jokaisessa astiassa, systeemi on itse-optimoituva. Tämä on merkittävä etu minimoitaessa koetehdaskehitystyötä millä tahansa tietyllä substraatilla ja se on jopa suurempi etu tehdasmittakaavassa käsiteltäessä vaihtelevien koostumuksen omaavia syöttöainei-ta.

• «

Edullisessa muodossaan, jossa esitetään lyhyesti mutta vaa-: timuksia rajoittamatta, tässä keksinnössä käytetään erittäin ; ; termofiilisen, fakultatiivisen anaerobin, kuten uuden Bacil- ; lus stearothermophilus-kannan LLD-R (NCIB 12403), mutantte- *'*'· ja, jotka pystyvät nopeaan aerobiseen ja anaerobiseen kas- 9 vuun ja/tai metaboliaan yli 70 °C:ssa monilla sokereilla, • » mukaan lukien pentoosit ja sellobioosi, jotka muodostuvat . lignoselluloosan hydrolyysistä. Mutantit, kuten kanta Bacil- * · € lus thermophilus LLD-15 (NCIB 12428) , valitaan mieluimmin . · · ·. ' siten, että ne muuttavat anaerobiset reitit vallitsevasti ·* *· etanolin valmistamista varten. Nämä ovat talletetut kannat, :··· joihin tässä viitataan.

i t l * *, Kanta LLD-R kasvaa nopeasti useilla sokereilla aina 75 °C: l » * ’· "· seen asti mutta anaerobinen päätuote on L-laktaatti. Mutant- tikanta LLD-15 kasvaa yhtä nopeasti kahden pääenergiareitin 20 96871 kautta: pyruvaatti-formiaatti-lyaasi (PFL)-reitti, jossa saadaan 1 mooli etanolia, 1 asetaattia ja 2 formiaattia/glu-koositähdemooli, ja aikaisemmin tunnistamaton pyruvaattide-hydrogenaasi (PDH)-reitti, josta saadaan 2 etanolia + 2 C02:ta/ glukoosimooli.

Metabolinen virtaus kannassa LLD-15 voidaan suunnata PDH-reitin kautta manipuloimalla fysiologisia olosuhteita, erityisesti pyruvaatin muodostumista, jonka aikaansaa kasvu happamassa pH:ssa, tai asetaatin ja formiaatin läsnäolo kasvatusalustassa. Korkeammat lämpötilat myös suosivat PDH-reittiä. Solut eivät voi kasvaa tällaisissa olosuhteissa, mutta ne jatkavat sokereiden muuttamista etanoliksi. Vaihtoehtoisesti PDH-virtausta voidaan lisätä muilla mutaatioilla, esimerkiksi mutaatioilla, jotka tukahduttavat asetaatin tuotantoa. Muita tavoiteltuja mutaatioita ovat sellaiset, jotka lisäävät anaaerobista kokonaispyruvaattidehydrogenaasiaktii-visuutta, koska tämä on nopeutta rajoittava etanolin tuotantokyvyn suhteen.

Tällaiset kannat ovat optimaalisia kaksivaiheiseen fermen-taatioon, jossa katalyyttinen biomassa ensin kasvatetaan aerobisessa ymppivaiheessa ja sen jälkeen käytetään anaerobisesta etanolin tuotantovaiheessa ilman kasvua. Tämä voidaan . . saavuttaa yksivaiheisessa panos- tai syöttö-panosreaktorissa, • · · *·*·’ poistamalla jatkuvasti etanolia kaasufaasiin, jolloin voi daan käyttää konsentroituja sokerisyöttöaineita. Tavanomai- • · : siä syöttöaineita, kuten glukoosia, sakkaroosia tai maltoo- v * siä voidaan käyttää, mutta myös sokereita, jotka syntyvät .···, lignoselluloosapitoisten jäteliemien hydrolyysistä, mukaan • · lukien pentoosit ja seliobioosi.

• · ί.ί ! Kannat eivät ole kovin sopivia tavanomaisiin, yksivaihei- V·: siin, jatkuviin viljelmiin, mutta niitä voidaan käyttää hyö dyksi yksivaiheisessa systeemissä, jossa on osittainen so-lunkierrätys, tai kaksivaiheisessa, jatkuvassa systeemissä, 21 96871 jossa sokerit syötetään anaerobiseen, katalyyttiseen reaktoriin, samalla kun etanoli jatkuvasti poistuu höyryyn. Jäljelle jäänyt etanoli tislataan tämän reaktorin vesipitoisesta effluentista ja jäännöshiililähteet käytetään uuden, katalyyttisen biomassan aikaansaamiseksi aerobisessa biomassa-vaiheessa. Näin syötettyjen raaka-aineiden kaikki potentiaaliset substraatit käytetään tehokkaasti hyödyksi joko anaerobisesta tai aerobisesti. Lisäksi systeemi on automaattisesti itse-optimoituva etanolin tuottamiseksi maksimoimalla anaerobisesti tuotetun C02:n (ekvivalentti biomassan tuotantoon) . Tämä voi olla erityinen etu, kun käytetään sekoitettuja ja vaihtelevia syöttöaineita.

Viitteet 1. Hartley, B.S. et ai. (1983) julkaisussa "Biotech 83" Online Publications Ltd., Northwood, GB. s. 895 2. Hartley, B.S. ja Shama, G. (1987) julkaisussa "Utilisa-tion of Cellulosic Wastes" (toimittajat Hartley, B.S., : . . Broda P.M.A. ja Senior, P.), The Royal Society, Lontoo 3. Payton, M.A. ja Hartley, B.S. (1985) FEMS Microbiol.

Lett. 26. 333 • · • · · *·'·1 4. Ragg, P.L. ja Fields, P.R. julkaisussa "Utilisation of

Lianocellulosic Wastes" (toimittajat Hartley, B.S, Broda • · :.· · P.M.A. ja Senior, P.), The Royal Society, Lontoo • · · • 1 · • · · • · · • · • · • · · I < ·

Claims (10)

96871 22 Patentt ivaat imukset

1. Kaksivaiheinen suljettu menetelmä etanolin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että (i) suoritetaan etanolia tuottava anaerobinen sokerei-den fermentaatio anaerobisessa fermentaatiokasvualustassa lämpötilassa ainakin noin 70 °C, sellaisen termofiilisen, fakultatiivisesti anaerobisen bakteerin läsnäollessa, joka kykenee fermentoimaan sokereita sekä aerobisesti että anaerobisesti ja tuottamaan etanolia anaerobisessa fermen-taatiossa lämpötilassa 70 °C tai sen yli, (ii) poistetaan kohdan (i) mukaisen anaerobisen fermen-taation aikana jatkuvasti etanolia, (iii) poistetaan kohdan (i) mukaisen anaerobisen fer-mentaation aikana jatkuvasti osa fermentaatiokasvualustas-ta, (iv) erotetaan bakteerit poistetusta fermentaatiokasvu-alustasta ja kierrätetään erotetut bakteerit kohdan (i) mukaiseen anaerobiseen fermentaatioon, (v) poistetaan etanoli poistetusta fermentaatiokasvu-alustasta ja (vi) lisätään etanolista vapaa fermentaatiokasvualusta aerobiseen reaktoriin ja viljellään bakteereita, palautetaan osa saaduista bakteereista ja kasvualusta kohdan (i) mukaisen anaerobisen fermentaation anaerobiseen kasvualustaan katalyyttisen biomassan ylläpitämiseksi. • · · • · ·

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu • : : siitä, että bakteerille on edelleen tunnusomaista aerobisen tai anaerobisen kasvuvaiheen jälkeen, ei-moni s tuvan, mutta metabolisesti aktiivisen anaerobisen faasin esiintyminen, • · ***. jolloin pääasiallisesti muodostuu ainoastaan etanolia ja *. 1 anaerobinen fermentaatio suoritetaan olennaisesti tässä | : : faasissa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmäolosuhteet säädetään siten, että il 23 96871 maksimoidaan suhde anaerobisesti - aerobisesti tuotetun C02:n välillä, jolloin etanolin saanto maksimoituu.

4. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on erityisesti sellainen, jolta olennaisesti puuttuu NAD-kytketty lak-taattidehydrogenaasiaktiivisuus.

5. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on erityisesti sellainen, joka tuottaa etanolia olennaisesti pyru-vaatt idehydrogenaa sire itt iakt i ivi suude11a.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on erityisesti sellainen, jossa fer-mentaation kuluessa pyruvaatti-formiaattilyaasireittivir-taus tukahdutetaan mutaatiolla tai olosuhteilla, aiheuttamalla metaboliittien solunsisäistä kerääntymistä.

7. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sokerit sisältävät : pentooseja tai sellobioosia.

8. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kanta on erityisesti Bacillus stearothermophilus. • · · • · · • · • » ·

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään erityisesti ί.Ι.ί B. stearothermophilus LLD-R-kantaa (NCIB 12403) tai B. stearothermophilus LLD-15-kantaa (NCIB 12428) tai näiden e.'t . variantteja. • · · • · 1 < < • I

·; 10. Bacillus stearothermophilus LLD-R (NCIB 12403) ja Bacillus stearothermophilus LLD-15 (NCIB 12428). • · · • · 24 96871