JPH02503506A

JPH02503506A - 高温菌によるエタノール生成

Info

Publication number: JPH02503506A
Application number: JP88504326A
Authority: JP
Inventors: ハートレー、ブライアン・セルビー
Original assignee: エルスワース・バイオテクノロジー・リミテッド
Priority date: 1987-05-27
Filing date: 1988-05-24
Publication date: 1990-10-25
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: WO1988009379A2; BR8807524A; ZA883715B; GB8712410D0; FI96871C; FI895633A0; EP0370023A1; IN175484B; DE3852104T2; DE3852104D1; WO1988009379A3; JP2779191B2; FI96871B; EP0370023B1; CA1341168C; AU1788388A; ATE113987T1; AU619470B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】高温菌によるエタノール生成発明の分野本発明は発酵によるアルコール、特にエタノールの生成に関するものである。

全般考察糖あるいは他の炭水化物の転化によって生じた、廃棄物としてのあるいは副産物としての糖からアルコールが生成されることは古くから知られていたが、現在それはますます重要になりつつある。現今では原油は安く、特定の地域では深刻な食料不足が起こっているが、それでさえ、適切に管理すれば農業によって世界中に食料やエネルギーを供給できるにも関わらず、再生不能なエネルギー資源に頼っているという基本的な不健全さから注意をそらすことはできないのである。

我々は主に酵母による既知のアルコール生成過程を研究した結果、もし実施可能ならばアルコールを発酵培地から蒸気として直接都合よく取り出すことができる温度と利用することが、経済効率を高める上での鍵であると結論した。酵母はもちろんそのような温度では増殖することができないので、我々は高温菌に目をむけてきた。

酵母はブドウ糖やマルトース及びショ糖しか発酵させられないが、ある種の微生物はセルロースの酵素的加水分解によって得られたセロビオースや、ヘミセルロースの加水分解によって得られたキシロースやアラビノースもまた利用することができる。後者の糖（五炭糖）は、製紙や、蒸気開繊や希酸加水分解などのワラの前処理によって生じる廃棄汚水の主成分である。サトウキビから得られるエタノール生成の経済効率は、例えば液汁と同様に搾りカスも利用できたら大きく改善されるであろう。

クロストリジウム　サーモサラ力ロリチカム（Ｃ１ｏｓｉｄム」」上虹賎Ｕ胚ｊ μ」■凡す）、クロストリジウムサーモヒドロサルファリカム（吐工佳肛煕■虹匹ユムニｉｅｕｍ）やサーモアナエロバクター　エタノリカス（Ｔｈｅ−ｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｏｒ　ｅｔｈａｎｏｌｉｅｕｓ）といったいくつかの高１Ａｒｌｌが、これら全ての糖を利用してエタノールを高率に生成することが記載されている。しかしながらそれらは偏性嫌気菌で、その報告されている性質は下記のバチルス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ−吐辻姐）菌株と比較して好ましくないものである。さらに我々は通性嫌気面が、嫌気相の副産物を触媒性バイオマスを嫌気的に再生するために利用できるようにする新しい好気−嫌気複合過程を可能にするという利点を見出している。

通性嫌気面は通常エタノールを多くは生成しない、以前の出願において、我々は、Ｂａｅｉｌｌｕｓ　ｓｔｅｉｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈ−ｉｌｕｓ　ＮＣ＾１５０３と思われる突然変異体が、エタノールを高度に生成するよう操作できるような「代謝操縦」方略について記述した１２．その方略には、Ｌ−乳酸脱水素酵素における突然変異を選別することによって、Ｌ−乳酸生成を抑えることが含まれていた。得られた突然変異体は、シヨ糖１モル当たり酢酸塩、エタノール及び＊ｖｉ塩を２：２：４の割合で嫌気的に生成することが期待された。驚くべきことに、ある種の条件下、特に低ｐｏで高温においては、エタノール生成量がこの理論的最大値よりも高く、このことはバッチ培養における最終の不増殖期の間に、ショ糖からエタノールと二酸化炭素への触媒的な転化が生じたためと考えられた。

我々は今回、以前に報告した結果は、記載した菌は我々が想定した（　ＰａｙｔｏｎおよびＨａｒｔｌｅｙ’）　Ｂ、　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ−駐吐旦■のＮＣ＾１５０３　（ＮＣＩＢ　８９２４）　　の誘導菌ではなく、また既知の高温菌の何れでもなかった点で誤っていたことを見出した。その代わりに、それは上述した目的にとって、既知の菌株よりも格段に優れた性質を有する石−辻胆し■且皿ｌ二旦勧旦胚種の新しい菌株に由来することが明らかになってきた。特にそれは、６０℃以上の温度において好気的かつ嫌気的にもＮＣ＾１５０３菌株より格段　　　。

に高い増殖率を示し、ＮＣ＾１５０３菌株では増殖が停止するような７０℃以上の温度において嫌気的に増殖する。さらに、それはセロビオースやＲａｇｇおよびＦｉｅｌ＋（ｓ’によって記述されたＩＣＩ過程によって製造される小麦ワラの粗希酸加水分解物に見出されるような三次糖類をも利用するのである。

従って、本発明は特定の菌だけに制限されないが、セロビオースや三次糖類を含む広範囲の糖を、７０℃以上の温度において好気的かつ嫌気的に高速に発酵させる、し」旦とｏｔｈｓ口咀吐旦胚のＬＬＤ−Ｒ菌株（ＮＣＩＢ寄託、詳細は下達）のような通性嫌気菌に関する。このような菌は通常嫌気的に乳酸を生成するが、この糸路はＮＡＤに連結した乳酸脱水素酵素の突然変異体を選別することによって消去することができる。さらに酢酸塩の生成は、酸性ｐＨ１高温あるいは菌外部に高濃度の酢酸塩を加えるなどの生理学的な制御によって、さらには酢酸塩合成系路の酵素に遺伝的損傷を加えることによって抑えることができるであろう、このことによって、糖をエタノールと二酸化炭素に転化するピルビン酸脱水素酵素を介した嫌気的代謝系路を開放することになる。得られた菌は嫌気的には増殖しないが、増殖せずに糖からエタノールへの転化を触媒することができる。

従って本発明の要点は、そのような菌に最小限の増殖で糖を与えて触媒的嫌気的生成させるために用いられる過程である。エタノールの多くは７０℃以上の蒸気相の中に自動的に取り出されるので、生成相には菌のエタノール耐性濃度（およそ４％、／Ｖ　’）　　を越えることなしに高濃度の糖を与えることができる。

我々はこれらの性質が、遠心分離やｒ通によって液相の生成物を取り除いた後で、連続的に菌を再循環することによって至適発酵生成が得られる新しい連続過程に役に立つことを見出した。触媒生存能を維持するために必要な最低増殖率は、再循環中に菌の一部を放出することによって達成できる。このことによって流入する糖の同等量が新鮮なバイオマスに転化される。一方、菌や未加水分解糖、残存微量エタノールや酢酸塩や蟻酸塩といった副産物を嫌気的「バイオマス」相へ戻される前に、残存している液相のエタノールは取り除かれる。ｔ＆気菌はそれから、もし必要なら間の嫌気「順応」相を介して、触媒的生成相へ戻される。この反応形態のおもしろい特徴は、好気的二酸化炭素を最小に嫌気的二酸化炭素を最大にすることによって、エタノール生成が最大になる自動制御が維持されることにある。

菌株の由来と性質旺吐比駐上山：」！μｊ旦」菌株ＬＬＤ−１５（ＮＣＩＢ１Ｅ託、詳細は下達）は、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性が欠落したＩ旺ユ胚」遣ｙ刀ｌ工吐吐■旦菌株ＮＣ＾１５０３の突然変異体を自殺基質抵抗性（ＰａｙｔｏｎおよびＨａｒｔｌｅｙ ’　）を選択することによって得ようとした際に生じた。普通は後者の菌株の突然変異体と想定されるが、実際は新しい超高温菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ菌株ＬＬＤ−Ｒ由来と考えられた。ＬＬＤ−Ｒ菌株はＬＬＤ−１５菌株から自発的にまた再現性をもってに生じ、プレート法、あるいは例えば糖、酢酸塩やｌ１ｒ１ｖｉ塩を含む低ｐｎの培地といったより速く増殖する培地で連続培養することによって選択できる。その菌は嫌気的にＬ−乳酸塩を生成し、Ｌ−乳酸脱水素酵素を高濃度に含んでおり、従って明らかにＬＬＤ−１５が有する遺伝子欠損の復帰突然変異「野生型」である。

突然変異菌株り一旦と凪お口型吐Ｕ旦菌株ＬＬＤ−１５と野生型ＬＬＤ−Ｒは共に、広範種Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｉｕｓに形態と増殖温度域の点で類似した、ダラム陽性の胞子形成桿菌である。しかしながら一連の生化学的試験及び増殖試験（表１）では、それらはＢ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈ−ｉｌｕｓＮＣＡ　１５０３や５ｈａｒｐ他、ジャーナル　オブ　ジェネラル　マイクロバイオロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、）　　１１７２０１　（１９８０）の広範な集団中の他の全ての関連菌株とは異なっていた。これらの性質はＤｏｎｋ、Ｌ、（１９２０）ジャーナルオブ　バクチリオール（Ｊ、　Ｂａｅｔ−ｅｒｉｏｌ　）臣、３７３以降の旺住且」」遣μ！山旺吐吐旦胚としての一般分類には整合するが、その増殖温度域は明らかにその変異体の由来と思われるＮＣ＾１５０３菌株のそれよりも高い、従って、両歯は新種の菌株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ　ＬＬＤ−Ｒ（ＮＣＩＢ　　１２４０３）とＢａｃｉｌｌｕｓ　　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｓｏ　　ｈｉｌｕｓ　　ＬＬＤ−１５（ＮＣＩＢ　１２４２Ｂ）として、スコツトランドの工業および水産菌の国立寄託機関（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｎｄｕ−ｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　Ｍａｒｉｎｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｏｒｒｙ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　５ｔａｔｉｏｎ。

Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　３１．＾ｂｅｒｄｅｅｎ　、＾Ｂ９８Ｄに）に寄託された。それぞれの寄託日は、１９８７年２月１０日と、１９８７年４月９日である。

ＬＬＤ−ＲとＬＬＤ−１５菌株は、富裕なりＳＴ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｏｘｏｉｄ）　２０．０；　　酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ）　１０．０；　Ｋ２Ｓ０．、１．３：　Ｈｇ５Ｏ＝４［ＩＪ、　０．２７；　ＭｎＣｌ２・４１’ｌｚ０．０．０１５；　ＦｅＣｌ５・６Ｈ２０゜０．００７．クエン酸、０．３２；　（ｇ／Ｉで表示））適当な炭素源を追加し、ＫＯＦＩやＨ，ＳＯ，で要求されるｐＨに調整する）内で良好に増殖する。しかし我々はまた、完全培地ＢＳＴ−８８（炭素源：に２ＳＯ４，０，３；　ＮａＪＰＯ＜、　１．０；　ＨｇＳＯ４，０，４；ＭｎＣＩｚ・４Ｈ２０，０，００３；　ＣａＣｌ２．０．００５；　ＮＨ，ＣＩ、　１．０；　　クエン酸、０．１６．メチオニン、０．２　（ｇ／Ｉで表示）；ニコチン酸、１０；ビオチン、１０；チアミン、１０；　Ｚｎ５Ｏａ４Ｈ２０゜０．４；　　硼酸、０．０１：　ＣｏＣｌ２・６Ｂ２０．０．０５；　ＣｕＳＯ４・５Ｂ２０゜０．２；　Ｎ；Ｃｈ・６Ｆ１．０．　ｏ、ｏｉ：　ＥＤＴ＾、　０．２５　（ｍｇ／Ｉで表示））を開発した。

図の説明図１から６の説明は以下の通り。

図１　旺吐旦胚」遣ｙＪ上旺吐吐旦■の菌株ＬＬＤ−１５における嫌気的系路と理論的生成。

図２　　ｐｌ＋７、Ｄ＝０．２ｈｒ−’におけるショ糖１０ｇ／Ｉ　　（嫌気）あるいは５ｇ／ｌ　　（好気、点線）　、０．５％　トリプトン、０．２５％酵母抽出物による連続培養における定常値。

ａ）バイオマス：ＮＣ＾１５０３菌株（拳）　、ＬＬＤ−Ｒ菌株（■）、ＬＬＤ −１５菌株（０）ｂ）ＬＬＤ−１５菌株による生成物図３７０℃、Ｄ　＝　０．２ｈｒ−富、ｐｌ＋７における、小麦ワラ加水分解物の様々な濃度における菌株ＬＬＤ−１５の連続培養（ＲａｇｇおよびＦｉｅｌｄｓ、　１９８６）　。

図４　エタノール生成における連続２段反応槽図５　部分的菌再循環による連続発酵の機械装置。

図６　部分的菌再循環による連続発酵の関係。

新しい菌株く系統）における嫌気的系踏桟々の実験は主に、２．３５％（ｗ／ｖ）ショ糖／ＢＳＴ培地でのバッチ培養を、変異菌株ＬＬＤ−１５の原種と考えられるＮＣ＾１５０３菌株の至適温度である６０℃で行なった。ＮＣ＾１５０３菌株あるいはＬＬＤ−１５菌株の嫌気的バッチ培養では、最終生成物は主にＬ−乳酸塩であったのに対し、ＬＬＤ−１５菌株はｐｌ＋　７．９においてシヨ！１モル当たりエタノール１．８モル、酢酸塩１．８モル及び蟻酸塩３．２モルを生成した。これは突然変異によってＬ−乳酸脱水素酵素活性が消し去られたので、ピルビン酸−蟻酸塩脱炭酸酵素（ＰＦＬ）糸路（図１）を介した代謝と合致する。

しかしより酸性度の強い、ｐｌ＋　６．２ではエタノールの酢酸塩に対する比は増加して、エタノール２．９、酢酸塩０．２、蟻酸塩１．３となる。これは残余ショ糖から２エタノール＋２二酸化炭素を導く新しい糸路もまた開放されたことを示しており、我々はこれは、通常嫌気条件下では不活性と考えられているピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）を介したものであると考えている０図１における生成物を要約すると下記表となる。

解糖＋ＰＤＩＩ　　　　　　　　２．００　　　０．００　　０．００　　２．００　　２．００解糖十ＰＦＬ　　　　　　　　１．００　　　１．００　　２．００　　０．００　　３．００Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ＋ＰＤＨ１，５００，５００，０００，００３，００Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ＋ＰＦＬ　　１．００　　１．００　１．００　１．００　２．０ＯＬと≧λ：三次糖回路十ＰＤＦＩ　　　　　１．６７　　　０．００　　０．００　　１．６７　　１．６７五炭糖回路＋ＰＦＬ　　　　　Ｏ，８３０，Ｓ３　　１．６７　　０．００　　２．５０ホスホケトラーゼ＋ＰＦＬ　　Ｏ，５０１，５０１，０００，００２，５０ＰＦＬからＰＤＨ−糸路への切り換えはＬＬＤ−１５菌株の嫌気的バッチ発酵の後の段階において生じ、増殖速度の低下と培地中への微量のピルビン酸の出現と一致する。効果は例えば、５％（＠／ｖ）のショ糖濃度といった高い糖濃度でのバッチ発酵中において最も明らかで、そこでは菌の増殖は全ての糖が利用されるよりかなり前に停止したにも関わらず、不増殖菌がショ糖をエタノールと二酸化炭素に転化し続けている。従ってそのようなバッチ発酵においては、エタノール生成はシヨ糖１モル当たり３．６４モル（理論値の９１％）にも達する。より温度が高い（７０℃）と、さらにＰＤＨ系路への切り換えに有利となる。

バッチ発酵の早期にエタノール、酢酸塩や蟻酸塩といった生成物を培地に加えると分かるように、ＰＦＬ系路からＰＤＨ系路への切り換えは培地中の酢酸塩と蟻酸塩の蓄積によるもので、エタノールの蓄積によるものではない、ＰＤＨ系路がかなり作動している時はいつでもピルビン酸の分泌が観察される。このような条件下で増殖した菌は、野生型は非常に低い嫌気的ＰＤＨ量を示すにも関わらず、菌除去抽出液において完全好気菌よりも高いピルビン酸脱水素酵素活性を示す、エタノールと二酸化炭素を生成するもう一方の系となる可能性のある、ピルビン酸脱炭酸酵素やｗｋ酸塩脱水素酵素の活性は検出できない、バイオマスが減少してバッチ発酵の終わりに近づくと胞子が観察できるので、系路間の切り換えは前胞予形成現象かもしれない。

系路間の切り換えが起こることの考え得る理由は以下の通りである。野生型の菌は好気的にも嫌気的にも速く増殖するように適応しているので、糖取り込みと解糖系路を速く活性化させる。嫌気条件下では通常り一乳酸を分泌しているが、その糸路が阻害されるとピルビン酸代謝はＰＦＬ系路に切り換えられる。しかし、特に菌外部の酢酸塩や蟻酸塩の存在下、あるいは陰イオンや陽イオン勾配に対する分泌が流出量を減少させるような酸性ｐＨ下において、酢酸塩と蟻酸塩の分泌量はエネルギー代謝にとって量制限段階となる。従って菌内にピルビン酸が蓄積し、完全好気菌よりも高いピルビン酸脱水素酵素の活性化が引き起こされる。ピルビン酸脱水素酵素を介した流れは、酢酸塩と蟻酸塩不在下におけるアルカリｐＦｌあるいは低ショ糖濃度において観察される高速増殖率を維持するためには未だ不適当であるが、菌は増殖なしに糖をエタノールと二酸化炭素に転化する静止段階に達する。

単一相連続培養野生型（ＬＬＤ−Ｒ菌株）とＬＬＤ−１５菌株とを比較する予備実験を、６０℃ においてＢＴ培地中２−３％ショ糖の条件で行なった（希釈率０．２５ｈｒ−’ ）　、期待されたように野生型は、ｐ）１８において消費シヨ糖１モル当たり３．１３モルからｐ）１６．３５において３．５０モルの幅で主にＬ−乳酸を生成し、Ｙ値（ｇ・菌／ｇ・ショ糖）はおよそ０．０７であった。

突然変異菌株ではｐＨ１７においてエタノールが主な生成物で（２，３モル１モルショ糖）、Ｙ値はより高かった゛（０，１０）　、　ＬＬＤ−１５菌株は酸性ｐ）ｌあるいは高ショ糖濃度における連続培養条件に不安定であったが、復帰突然変異体（ＬＬＤ−１５）によるし−乳酸生成への転換は普通であった。このことはこのような連続培養によって引き起こされたエネルギー効率の増加のための淘汰圧が強力であり、連続過程に潜在的欠点のあることを示している。しかし、７０℃における低ショ糖濃度での連続培養においてはこの復帰は頻度が低く、非復帰突然変異体のＬＬＤ−Ｒ菌株から再選別（ＰａｙｔｏｎおよびＨａｒｔｌｅｙ３の方法）によって消去することができる。

図２ａは、ｐ）１７．０　、希釈率０．２ｈｒ−’で様々な温度における、１％（、／ｖ）　　で嫌気的に、あるいは０．５％ショ糖、０．５％トリプトン、０．２５％酵母抽出物で好気的に増殖するＮＣ＾１５０３、ＬＬＤ−Ｒ及びＬＬＤ −１５菌株の連続培養における定常状態のバイオマスを示している。新しい菌株もＮＣＡｌ５Ｏ３菌株も共に効率的な好気的、嫌気的代謝を示すが、野生型（ＬＬＤ−Ｒ）と突然変異体（ＬＬＤ−１５）は共に７５℃まで活発な嫌気的代謝を行なうのにも関わらず、ＮＣＡｌ３Ｏ３菌株は嫌気条件７０℃以上で死んでしまう、この温度は液相エタノールの沸点に近く、従ってここで記述した過程において重要である。

ＬＬＤ４５菌株の嫌気的連続培養から得られた生成物は図２ｂに示す、エタノールの生成（ｍｍｏｌ／＾、。。）は温度が上昇するにつれて高まり、ピルビン酸の分泌と一致していることが明らかである。

ＮＣＡｌ５Ｏ３菌株は好気的にも嫌気的にもキシロースでは増殖しないが、ＬＬＤ−ＲとＬＬＤ−１５は増殖する。ショ糖で得られた結果は、７０℃における同様の条件での１％キシロースによる連続培養と比較できる（表２）、定常状態が維持され、アルコール生成もまた酸性ｐｎにおいて高くなる。

表２　７０℃、］）＝０．２ｈｒ−’　における、キシロース１０ｇ／Ｉ　、）リプトン５ｇ／ｌ、酵母抽出物２．５ε／！及びＢＳＴ塩によるＬＬＤ−１５菌株の連続嫌気的培養６．５　０．３５　０．９　　１．７０（０，１３）　　　１．７９（０，１７）　　３．４８（０，２５）７．０　０．９８　０．９　　１．４３（０，０４）　　　２．１４（０，０７）　　３．８４（０，１０＞８．０　０．６７　０．９　　０．８２（０，０３）　　　１．０７＜０．０５＞　　２．２０（０，０８）ｐｉ（７における定常状態のバイオマスはショ糖濃度の半分以下であり、従ってキシロースの代謝はエネルギー効率がより低い、ショ糖は、一つのＡＴＰを要する適当な燐酸化酵素＋ホスホリラーゼを介して２つの燐酸六炭糖に代謝されると考えられている。対照的に、２つの燐酸三次糖分子を生成するためには２つのＡＴＰを要すると考えられている。従って、ショ糖は本来、よりエネルギーの高い基質である。

連続キシロース発酵の生成物は、トリプトン−酵母抽出物のかなりの部分がエネルギー生成のために代謝されることを示している。それにも関わらずｐＨ８における生成比は、代謝が三次糖燐酸糸路、解糖及びＰＦＬ系路を経由して進行することを示している。エタノール収率はショ糖による場合よりも低く、このことはＰＤＨ系路を経由する流れはほとんどないことを示唆している。しかし、高温低ｐＩ＋における高ショ糖濃度での発酵は、ショ糖と同様に後者の糸路を経由した流れと、キシロースをエタノールと二酸化炭素に転化する不増殖菌株を生成するような酢酸塩Ｗ酸化酵素や）オスフォトランスアセチラーゼの突然変異体を増加させることが期待できる。

従って、その新しい菌株とその誘導菌は、リグノセルロース廃棄物の加水分解物からエタノール生成を行なうために選別される菌である。連続培養は、ＲａｇｇおよびＦｉｅｌｄｓ’に記載されているＩＣＩ加水分解過程によって生成された小麦ワラの租加水分解物を用いて行なわれてて引き続く脱水化を促進するように設計された短い希酸加水分解過程とによって生成されたキシロースとリグニンに富んだ、実質的な廃棄物の流れである。原料はｐｌ’１７々な希釈率において、新しい菌株による連続培養で試験する。廃棄物の流れは菌の連続培養にとって必要な全ての養分を供給し、全ての糖がある程度まで利用される。

エタノールの生成は低ｐｎにおいて増加し、生成比は三次糖燐酸糸路解糖及びＰＦＬ＋ＰＤＨ系路を経由し糸路謝に一致する（図１参照）。

２段好気／嫌気発酵増殖することなしに糖からエタノールへ転化する性質は、新しい菌株の重要な利点である。上述したように、さらに生理学的拘束を操作したり新しい突然変異を選別することによって、最大限に高めることができる９図１は酢酸塩リン酸化酵素あるいはアセチルＣＯ＾−フォスフオドランスアセチラーゼを欠く菌は、酢酸塩を生成できないことを示している。酢酸塩の分泌はＰＦＬを介した嫌気的流動を維持するために必要であるので、ＰＤＨ経路だけがエタノールと二酸化炭素をもたらすピルビン酸代謝に開放されている。そのような菌は嫌気的には増殖しないが、好気的に繁殖し嫌気的に糖をエタノールに触媒反応で転化する。

さらに我々は、ＰＤＨがエネルギーの流動を制限するように思われるので、菌内ピルビン酸脱水素酵素活性を増加させる突然変異がエタノールの生産性を高めることを見出している。そのような突然変異は、連続培養による増殖、あるいは菌内の酢酸塩や蟻酸塩の蓄積が起こった、すなわち低ｐｎで酢酸塩と蟻酸塩を加えた条件下のプレートによって自発的にあるいは突然変異後に選別される。一方、ＰＤＨ遺伝子の複製を遺伝子工学の技術によって導入することもできる。

最大エタノール生成能は増殖の停止と関連しているので、従来の嫌気的バッチ培養はこの菌株によるエタノール生成には不適当である。バッチ生成は、嫌気的反応槽の中で嫌気的に増殖した菌の大きな接種物を用いるか、全バイオマスが供給される酸素の量に依存しているような部分的嫌気生活の条件下でバッチ発酵を行なうことによって達成できるかもしれない。

さらに増殖しない菌によって触媒する不定連続過程も明らかに不可能である。なぜなら菌の生存力を維持するためには、最小限の糖の取り込み（維持係数、動）が要求されるからである。我々はこれが図５に示したような、再循環や放出を行なわずに部分釣菌再循環をしながら一般嫌気反応槽の中で達成されることを見出した。その装置は量制御装置を介して従来の一般連続培養機のように稼働する。

これが阻害され再循環が始まると、バイオマス量は維持係数によって指定される最大値まで上昇する。

それから全ての基質は生成物に転化される。これは生産のためには明らかに有利であるが、実際には確実に反応生産性が減少（−）するであろう、しかし、もし反応槽から少量（Ｆ８）を放出させ九ζキ、安定な増殖がμ＝Ｆ８／Ｖ　（Ｖ＝反応槽容積）の率で起こる。これは反応生産性の減少に釣り合うように最小にすることができる９図中、糖と養分が率Ｆ１で注入される。一定の放出量Ｆつ、（Ｆ、＜＜Ｆ、）によって、菌増殖速度（μ＝Ｆ、／Ｖ、■＝発酵器容量）が決定される。残りのスープは、最大容量で稼働される中空の繊維の限外ＰＭを通して再循環される。その炉液Ｆ、は量制御装置によって制御され、適量の炉液は発酵槽に戻される。

図６はＬＬＤ−１５菌株の１％シ９１１／ＢＳＴ　　ＡＭ７０℃、ｐＨ７におけるモデル系の結果を示している。区はエタノールの生産容量、菌濃度及び全希釈率Ｄ＝Ｆ、／Ｖとの関係を示している。　Ｓｏは１％、温度７０℃、４００回転／分、ｐｌ＋７．０　、使用菌はＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒｖｏ　ｈｉｌｕｓである。

菌増殖率μ＝Ｆｘ　／Ｖ＝０．１ｈ−’である。成長率は、流出率Ｆｘを固定することによって一定（０，１ｈ−’　）に保った。

全体にわたる希釈率りは、糖と養分の流入率Ｆ、を増加させることによって増加させた。ショ糖消費量（図示せず）は常に系の安定性の高さを示す９７％以上であった。

エタノール生産容量は従来の単相連続発酵（例えば０．６エタノール／１−ｈ）よりも有意に高かった。このことは第一に、高い希釈率において生じた菌濃度の比例した増加によるものである。

このような反応槽はこれらの菌株によるエタノール生成に適したものであるが、我々は通性嫌気菌の特殊な性質によって、図４に示した形態の新しい反応槽においてエタノール生成が最大となることを見出した。要約すると、糖は嫌気反応槽Ａに流速Ｖ／２で注入される。蒸気相のエタノールが水の吸収作用によって二酸化炭素から分離される。使用した菌の一部が遠心分！　（Ｃ）によって取り除かれ、流出流からエタノールの蒸留される。！りの糖とエタノールには養分（Ｎ）を混合率Ｖ、で追加し好気的に触媒性バイオマスを作るのに用いられる（Ｂ）、得られた菌は遠心分離後反応槽Ａに戻す、より詳細に説明すると、サトウキビ液汁、糖蜜、ワラ加水分解物等の糖を、率■、で菌を供給した嫌気反応槽に率■おで加える。

図を説明すると、反応槽Ａはエタノールの生産性が最大になるように温度やｐＨを制御できる簡単な撹拌槽（容積■Ａ）である、蒸気相のエタノールは連続蒸留を行なう前に、水によって二酸化炭素から分離する。しかし高温菌による発酵の主な利点の一つは、水性エタノールの沸点が近づいてくると、水相からエタノールが連続的かつ安価に取り出せ、エタノールによる増殖や生産性の阻害が取り除かれることである（　ＬＬＤ−１５の場合には６０℃においてエタノール濃度が４％以上（、／Ｖ）で成長が停止する）、このことによって高い濃度の糖、例えば糖蜜の供給原料としての使用が可能になる。従って嫌気的反応槽は、再循環二酸化炭素を散布したり、真空気化蒸発装置を介して連続再循環させる真空発酵のように、蒸気相へのエタノールの取り出し率を最大にできる利点がある。

反応槽Ａから流出する菌の多くは、連続遠心分離によって濃縮され再循環される。それから連続蒸留によって、エタノールが上清から取り除かれる。好気的反応槽Ｂに入る流れは菌（や胞子）、残余エタノール、未分解糖及び酢酸塩や蟻酸塩のような副産物を含む、これらの多くはＬＬＤ−Ｒ菌株には嫌気的基質として与えることができる。

従って流れはこれらの廃棄炭素源をバイオマスに最大限に転化するために必要な養分が補充される。

そのバイオマスは遠心分離によって濃縮され、嫌気反応系に戻される（容積■、）、好気菌が嫌気的代謝に順応するまでに遅延期間が認められるという問題がある。

従って酸素制限下で反応槽Ｂを稼働するか、菌が触媒相に戻る前に最適ｐＨ下で低濃度の糖を与える中間「嫌気的順応」反応槽に暴露させるのが好ましいと思われる。

このような反応槽の形態での過程の変数は複雑であるが、系は自動修復できる特徴を有している。任意の原料組成と率（Ｖ、）における最適エタノール生成は、嫌気的二酸化炭素の生成（＝エタノール）が最大で好気的二酸化炭素生成（糖が完全に酸化されたと仮定）が最小の時に生じる。最適生産性はＶ、を最大にすることによって得られる。従って、二酸化炭素感知装置を用いて各容器の注入率、ｐＨ及び温度を制御することにより、系は自動的に最適状態になっていく、このことはある特定の基質を用いる装置を試験的にｒ＃４発する際の労力を最小限にとどめる上でかなり有利であり、さらに可変の組成の原料を扱うような装置にはより有利である。

要約ここで、本発明の好ましい形態について請求項から外れることなく要約すると、本発明は、リグノセルロースの加水分解物から得られた三次糖やセロビオースを含む広範囲の糖を用いて好気的かつ嫌気的に高速に増殖でき、かつ／または７０ ℃以上の温度で代謝することのできる、新しい■住旦ヨ」遣μ！±虹吐吐ユヨのＬＬＤ−Ｒ菌株（ＮＣＴ８１２４２８）のような非常に好熱性の通気嫌気菌の突然変異体を用いる。Ｉ吐出上５ｔｅａｒｏｔｈｅｒμ朴旦■のＬＬＤ−Ｒ菌株（ＭＣＩ８１２４２８）のような突然変異体を、主にエタノールを生成する嫌気的系路に切り換えるように選別する。これらは本文中に参照されている寄託菌株である。

ＬＬＤ−Ｒ菌株は７５℃以上の温度で広範囲の糖を利用して高速に増殖するが、主な嫌気的生成物はＬ−乳酸である。

突然変異菌株ＬＬＤ−１５は二つの主な糸路、すなわちブドウｗ残渣１七ル当たり１モルのエタノール、１モルの酢酸塩及び２モルの蟻酸塩を生成するピルビン酸−蟻酸脱炭酸酵素（ＰＦＬ）糸路と、ブドウ糖１モル当たり２モルのエタノールと２モルの二酸化炭素を生成する、従来は確認されていなかったピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）を経由して同様に高速に増殖する。

ＬＬＤ４５菌株における代謝の流れは、生理学的条件、特に酸性ｐｎでの増殖によって引き起こされるピルビン酸の蓄積、あるいは培地中の酢酸塩と゛Ｗ１酸塩の濃度を操作することによってＰＤＨ系路を経由して振り向けることができる。

より高温にすることもＰＤＨ系路には好都合である。菌はこのような条件では増殖しないかもしれないが、糖をエタノールに転化し続ける。一方、ＰＤＨの流れはさらに、突然変異、例えば酢酸塩の生成を抑制するような突然変異を起こさせることによって増加させることができる。他に好ましい突然変異としては、嫌気的ピルビン酸脱水素酵素の活性がエタノール生成の律速条件であるので、その全活性を高めるような突然変異が挙げられる。

そのような菌株は、触媒性のバイオマスを最初に好気的に種まき段階で増殖させ、次に増殖させずに嫌気的にエタノール生成をさせる、２段発酵、には最適である。これは、濃縮された糖ｙＫｆＩを利用させるために蒸気相のエタノールを取り除き続ける、単相バッチあるいは原料供給バッチ反応槽において達成できる。

ブドウ糖、ショ糖あるいはマルトースのような従来の原料も用いることができるが、三次糖やセロビオースを含むリグノセルロース廃棄物の加水分解物から得られる糖も用いることができる。

本菌株は従来の単相連続培養にはあまり適当ではないが、部分的に直を再循環させる単相系や、蒸気中のエタノールを取り除きながら糖を嫌気的触媒反応槽に加える２相連続系では有利になると思われる。Ｗっだエタノールはこの反応槽から出る流出液から除去し、残った炭素源は好気的バイオマス段階における新しい触媒性バイオマスを作るために使用する。それによって原料中に存在する全ての基質が、嫌気的にも、好気的にも効率的に利用される。さらにこの系は嫌気的に生成される二酸化炭素（バイオマス生成と同等量）を最大にすることによって、自動的にエタノール生成のための最適状態に復帰することができる。これは様々な原料を用いたり混合する時に特に有利である。

参考文献１、ハートレイ、ビー、ニス、　（Ｆｌａｒｔｌｅｙ、　Ｂ、Ｓ、）他、（１９８３）バイオチク（Ｂｉｏｔｅｃｈ　８３’　０ｎｌｉｎｅ　Ｐｕｂｌｉｅｓ、ｔｉｏｎｓＬｔｄ、、　Ｎｏｒｔｈｗｏｏｄ、　Ｕ、に、、　ｐ、　８９５．）２、ハートレイ、ビー、ニス、およびシャーマ、ジー。

（Ｉｌａｒｔｌｅｙ、　Ｂ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｓｂａｍａ、　に、＞（１９８７）セルロース系廃棄物の利用（Ｕｔｉ目５ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌｏｓｉｃ　Ｈａｓｔｅｓ　（ｅｄｓ。

Ｈａｒｔｌｅｙ、　　Ｂ、Ｓ、、　　Ｂｒｏｄａ、　　Ｐ、Ｍ、＾、　　ａｎｄ　　５ｅｎｉｏｒ、　　Ｐ、）　　、　　ＴｈｅＲｏｙａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｌｏｎｄｏｎ）３、ペイトン、エム、ニー、およびハートレイ、ビー。

ニス、　　（Ｐａｙｔｏｎ、　Ｍ、八、　ａｎｄ　Ｈａｒｔｌｅｙ、　Ｂ、Ｓ、）　（１９８５）エフイーエムニス　マイクロパイオール（■ＭＳ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ。

巨工り翻ユ３３３）４、　ラグ、ビー、エルおよびフィールズ、ピー、アール。

（Ｒａｎｇ、　Ｐ、Ｌ　ａｎｄ　Ｆｊｅｌｄｓ、　Ｐ、Ｒ，）リグノセルロース系廃棄物の利用（Ｌｌｔｉｌｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉ　ｎｏｅｅｌｌｕｌｏｓｉｃ　Ｗａｓｔｅｓ（Ｅｄｓ、　Ｈｉｒｔｌｅｙ、　Ｂ、Ｓ、、　Ｂｒｏｄａ、　Ｐ、Ｍ、＾、　ａｎｄ　５ｅｎｉｏｒ、　Ｐ、）。

Ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　Ｌｏｎｄｏｎ、）温　　度　（”Ｃ）点！！＞、０．５％トリプシン、０．２５％酵母抽出物による連続培簑における定常値。

ａ）バイオマス：ＮＣＡｌ３Ｏ３菌株（＠）　、ＬＬＤ−Ｒ菌ａ（ＩＩＩ）、エタノール補正書の翻訳文提出書く特許法第１８４条の８）平成　１年１１月２７日

Claims

【特許請求の範囲】

１．好気的かつ嫌気的に糖を発酵させ、７０℃以上の温度において嫌気的発酵の活動性が高まるような特徴を有するバチルス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）菌株や他の高温通性嫌気菌の選別を含む工程によるエタノールの生成法で、さらに（ｉ）嫌気的発酵は、７０℃以上の温度においてエタノールを連続的に取り除きながら行ない、（ｉｉ）菌の発酵活性は、連続的に嫌気的発酵培地の一部をできればエタノールも共に取り除き、菌を嫌気的発酵に戻す前に、培地中に存在する残余糖や代謝産物を用いて菌を好気的に分裂させることによって維持される、エタノールの生成法。
２．好気的あるいは嫌気的増殖期の後、分裂はしないが基本的にエタノールのみを生成する代謝の活発な嫌気相に入れるような特徴を有する菌を選別し、実質的にこの相において嫌気的発酵が行なわれる、請求の範囲第１項記載のエタノールの生成法。
３．工程の条件は、二酸化炭素が好気的に生成された量に対して嫌気的に生成された量が最大となるように調節してエタノール生成が最大となるようにする、請求の範囲第１項または第２項記載のエタノールの生成法。
４．特に、ＮＡＤ連関乳酸脱水素酵素活性を欠く菌が選別される、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のエタノールの生成法。
５．特に、基本的にヒルピン酸脱水素酵素系路の働きによってエタノールを生成する菌が選別される、請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のエタノールの生成法。
６．特に、発酵中にピルビン酸−蟻酸脱炭酸酵素系路が突然変異あるいは代謝産物の菌内蓄積を引き起こすような条件によって抑制される菌が選別される、請求の範囲第５項記載のエタノールの生成法。
７．糖には五炭糖あるいはセロビオースが含まれることを特徴とする、請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載のエタノールの生成法。
８．特にＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓによる、請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載のエタノールの生成法。
９．特にＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＬＤ−Ｒ（ＮＣＩＢ　１２４０３）あるいはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＬＤ−１５（ＮＣＩＢ　１２４２８）あるいはそれらの変異菌や誘導菌が使用される、請求の範囲第８項記載のエタノールの生成法。
１０．Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅｒａｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＬＤ−Ｒ（ＮＣＩＢ　１２４０３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＬＤ−１５（ＮＣＩＢ　１２４２８）及びそれらの変異菌や誘導菌。
１１．請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかの工程を用いるか否かにかかわらず、糖の嫌気的発酵によるエタノール生成のために用いられる、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈ−ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＬＤ−Ｒ（ＮＣＩＢ　１２４０３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒ−ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＬＬＤ −１５（ＮＣＩＢ　１２４２８）及びそれらの変異菌や誘導菌。