CN101617039A - 经修饰的蓝细菌 - Google Patents

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Abstract

公开了包含在表达和/或编码区序列方面被修饰的目的基因的经修饰光能自养细菌，其中对所述目的基因的修饰能增加所述细菌中的期望产物的产量，所述增加是相对于其中在目的基因方面没有被修饰的光能自养细菌中的期望产物的产量而言。

Description

经修饰的蓝细菌
政府资助条款插入
本发明是在美国能源部授予的批准号为DE-FG03-01ER15251的政府资助下作出的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本中请要求2006年10月20日提交的题为“经修饰的蓝细菌”的第60/853,285号美国临时专利申请的优先权，该临时专利申请的全部公开内容通过引用特地并入本文。
技术领域
本发明主要涉及细菌学领域。在某些方面，本发明涉及具有被过量表达的、被下调的、被导入的、被缺失的或被修饰的目的基因以产生期望的产物的经修饰的光能自养细菌。期望的产物可加工成生物燃料、生物塑料、动物饲料添加剂、营养品(nutraceutical)、食品添加剂、肥料等。
背景技术
目前世界面临的两大挑战，一是二氧化碳不断污染环境造成全球变暖，二是世界的自然能源如化石燃料日益被消耗。存在着这样一个很成问题的循环，即化石燃料消耗的增加与二氧化碳空气污染的增加相关联。
例如，已估计到美国每年因燃烧化石燃料产生17亿吨的二氧化碳(参见美国2002/0072109号出版物)。这与全球每年因消耗化石燃料产生70-80亿吨的二氧化碳相比还是小巫见大巫(Marland等人，2006)。二氧化碳空气污染的增加会导致全球变暖的增加，进而会增加诸如洪水、干旱、热浪、飓风、龙卷风等的极端天气事件的发生频率和强度。全球变暖的其他后果可包括农业收成的改变、物种的灭绝、疾病媒介物种类的增加。
已提出了二氧化碳整治(remediation)方法。例如，美国2002/0072109号出版物公开了原位生物固定系统(biological sequestration system)，该系统能降低以化石燃料为动力的发电机组的排放物中的含碳化合物的浓度。该系统使用光合作用微生物如藻类和蓝细菌，这些微生物附着于布置在密封箱(containment chamber)中的被太阳光子照射的生长表面。蓝细菌会吸收和利用以化石燃料为动力的发电机组所产生的二氧化碳。
就第二个挑战来说，全球能源需要持续增加，这对非可再生的化石燃料能源供应提出了更高的需求。最近已开发处替代能源。例如，目前正在种植诸如玉米、大豆、亚麻籽、油菜籽、甘蔗和棕榈油的农业产品，以用于生产生物燃料。各种产业如农业、住宅业和林业产生的可生物降解副产物也可用来生产生物能源。例如，稻草、木材、牲畜粪、稻米、壳皮、污水、生物可降解废物和食品残余物可通过厌氧消化转化成生物气。但是，植物因为在一年当中在CO2扩散和固定、生长季节和太阳能收集方面的限制，光能向生物质和生物燃料转化的生产率低。更高的太阳能转化效率是通过藻类和蓝细菌来实现。
使用生物生产乙醇的方法也已有描述。例如，Muller等人的4,242,455号美国专利描述了一个连续工艺，该工艺是用强无机酸对诸如淀粉颗粒和/或纤维素碎片、纤维等的碳水化合物高分子颗粒的含水浆液进行酸化，以形成可发酵糖。可发酵糖然后用酵母菌属(Saccharomyces)的至少两个菌株发酵生成乙醇。Chibata等人的4,350,765号美国专利描述了通过使用固定化的酵母菌属或发酵单胞菌属(Zymomonas)细菌和含有可发酵糖的营养培养肉汤来生产高浓度乙醇的方法。Arcuri等人的4,413,058号美国专利描述了用来生产乙醇的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株，生产方法是将该菌株放在连续反应柱中，并使含水糖液流流过该柱。
Hartley等人的PCT中请WO/88/09379描述了兼性厌氧嗜热细菌菌株的用途，所述菌株能通过发酵包括纤维二糖和戊糖在内的多种糖类生产乙醇。这些细菌菌株在乳酸脱氧酶中含有突变。因此，这些在厌氧条件下通常产生乳酸的菌株改为生产乙醇。
美国2002/0042111号出版物公开了可用来生产乙醇的经遗传修饰的蓝细菌。该蓝细菌包括这样的构建物，该构建物包含获自运动发酵单胞菌质粒pLOI295的编码丙酮酸脱羧酶(pdc)和醇脱氢酶(adh)的DNA片段。
发明内容
本发明通过提供经修饰以引入、缺失和/或改变目的基因的序列或表达水平从而提高期望产物的产量的光能自养细菌，克服了本领域的不足。期望的产物可加工成几种有用的产品，如生物燃料、生物塑料、动物饲料添加剂、贵重色素或抗氧化剂、或者有机肥料。
本发明的一个实施方案涉及这样的经修饰的光能自养细菌，所述经修饰的光能自养细菌包含一个或多个其表达已被改变和/或其基因产物功能已被改变的目的基因，改变的结果是导致该细菌中的一种或多种选自由脂肪酸、脂质类胡萝卜素、其他类异戊二烯、碳水化合物、蛋白质、生物气或它们的组合所构成的群组的产物的产量，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达不被改变的光能自养细菌中的所述一种或多种产物的量而言得到了增加。在另一个实施方案中，将多个改变导入一个或多个基因中，其中所述多个改变共同增加期望的产物的产量。经修饰的光能自养细菌可以是能吸收和固定二氧化碳的类型。在某些方面，经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的二氧化碳吸收和固定量而言，其二氧化碳吸收和固定量得到了增加。
可对目的基因的表达加以改变，以造成该基因被上调或下调。在另一个实施方案中，可通过改变内源基因、缺失内源基因或修饰内源基因的控制序列来改变表达。在又一个实施方案中，可通过将一个或多个转基因序列添加到一个或多个未经修饰的基因中，来改变目的基因的表达。
本说明书和权利要求书中所用的术语“天然光能自养细菌”，指在自然界中存在的、不具有按本发明公开的方式发生改变的基因功能的光能自养细菌。但是，当然可以通过获得之前已作改变以增加期望产物的产量的细菌，来实施本发明。这些之前的改变可包括对该细菌作出的任何操作。
本发明的光能自养细菌可以是最初作出改变的细菌，或者可以是任何一代的后代，只要该能导致这样的结果的改变被传递到后代，所述结果是该细菌中的一种或多种期望的产物的产量，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达不被改变的光能自养细菌中的所述一种或多种产物的量而言，得到了增加。
可用于本发明的情形的光能自养细菌的非限制性实例，包括蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、螺杆菌(heliobacteria)、光合酸杆菌(photosynthetic acidobacteria)、紫色硫细菌或紫色非硫细菌。在某些方面，经修饰的光能自养细菌是蓝细菌。蓝细菌可以是属于色球藻目(Chroococcales)、念珠藻目(Nostocales)、颤藻目(Oscillatoriales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、原绿藻目(Prochlorophytes)或真枝藻目(Stigonematales)。色球藻目可包括选自由Aphanocapsa(隐球藻属)、Aphanothece(隐杆藻属)、Chamaesiphon(管孢藻属)、Chroococcus(色球藻属)、Crocosphaera、蓝细菌、Cyanobium、蓝丝菌属(Cyanothece)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、Gloeobacter(粘杆菌属)、Gloeocapsa(粘球藻属)、Gloeothece(粘杆藻属)、Euhalothece、Halothece、Johannesbaptistia、Merismopedia(平裂藻属)、Microcystis(微囊藻属)、Rhabdoderma(棒条藻属)、Synechococcus(聚球藻属)、Synechocystis(集胞藻属)和嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)构成的群组的藻种(species)。念珠藻目可包括选自由Coleodesmium、Fremyella、Microchaete(微毛藻属)、Rexia、Spirirestis、Tolypothrix(单歧藻属)、Anabaena(鱼腥藻属)、Anabaenopsis(项圈藻属)、Aphanizomenon(束丝藻属)、Aulosira(管链藻属)、Cyanospira、Cylindrospermopsis(柱胞藻属)、Cylindrospermum(筒孢藻属)、Nodularia(节球藻属)、Nostoc(念珠藻属)、Richelia(植生藻属)、Calothrix(眉藻属)、Gloeotrichia(胶刺藻属)和Scytonema(伪枝藻属)构成的群组的藻种。颤藻目可包括选自由Arthrospira(节螺藻属)、Geitlerinema、Halomicronema、Halospirulina(盐螺旋藻属)、Katagnymene、Leptolyngbya(瘦鞘丝藻属)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、Lyngbya(鞘丝藻属)、Microcoleus(微鞘藻属)、Oscillatoria(颤藻属)、Phormidium(席藻属)、Planktothricoides(拟浮丝藻属)、Planktothrix(浮丝藻属)、Plectonema(织线藻属)、Limnothrix(湖生蓝丝藻属)、Pseudanabaena(假鱼腥藻属)、Schizothrix(裂须藻属)、Spirulina(螺旋藻属)、Symploca(束藻属)、Trichodesmium(束毛藻属)和Tychonema构成的群组的藻种。宽球藻目可包括选自由Chroococcidiopsis(拟色球藻属)、Dermocarpa(皮果藻属)、Dermocarpella(小皮果蓝细菌属)、Myxosarcina(黏囊藻属)、Pleurocapsa(宽球藻属)、Stanieria(斯塔尼尔氏菌属)和Xenococcus(异球藻属)构成的群组的藻种。原绿藻目可包括选自由Prochloron(原绿藻属)、Prochlorococcus(原绿球藻属)和Prochlorothrix(原绿发藻属)构成的群组的藻种。真枝藻目可包括选自由Capsosira(蒴链藻属)、Chlorogloeopsis(拟绿胶蓝细菌属)、Fischerella(费氏藻属)、Hapalosiphon(软管藻属)、Mastigocladopsis、Mastigocladus(鞭枝藻属)、Nostochopsis(拟念珠藻属)、Stigonema(真枝藻属)、Symphyonema(聚线藻属)、Symphyonemopsis、Umezakia和Westiellopsis构成的群组的藻种。在某些方面，蓝细菌是集胞藻(Synechocystis sp.)PCC 6803或嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-I藻株。
在其中目的基因被改变表达水平、被缺失或被导入的一些实施方案中，经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的脂质产量而言，其一种或多种脂质的产量得到了增加。经修饰的光能自养细菌可被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的脂质含量而言，其脂质含量得到了增加。脂质含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％或更大，或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数百分数。此外，脂质含量可占通过技术人员公知的方法计算出的该生物理论干重的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数百分数。可被过量表达和可导致脂质产量或脂质含量增加的目的基因，可包括质体1中小泡诱导蛋白(vesicle-inducingprotein in plastids 1，VIPP1)基因(sll0617)，类似的pspA型基因slr 1188，与对类囊体膜形成和组成重要的yidC和oxaI相似的slr 1471基因，乙酰-CoA羧化酶基因(sll0728、slr0435、sll0053和sll0336)，转乙酰酶基因，脂肪酸生物合成基因fabD(slr2023)、fabH(slr1511)、fabF(sll1069和slr1332)、fabG(slr0886)、fabZ(sll1605)和fabI(slr1051)，编码覆盖与原纤或类囊体膜相关的疏水实体(hydrophobic entity)的蛋白质的质体球蛋白(plastoglobulin)/原纤蛋白基因(slr1024和sll1568)，去饱和酶基因，编码1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶的sll1848，或者磷脂甘油酰基转移酶基因如slr2060。膜的脂质含量还可通过如下方式来提高：通过能识别膜中的蛋白质的蛋白酶(包括ftsH基因sll1463、slr0228、slr1390和slr1604，clpB基因slr0156和slr 1641，clpP基因slr0542、sll0534和slr0165)的过量表达；和通过代谢工程增加用于脂质生产的固定碳(fixed carbon)的量(例如通过sll0920、PEP羧化酶基因、sll0401、柠檬酸合酶基因的下调和/或参与贮藏化合物(storage compound)的合成的基因的缺失来增加，所述参与贮藏化合物的合成的基因包括参与糖原生物合成的slr1176、参与聚羟基丁酸形成和代谢的slr1829/1830和参与藻青素形成和代谢的slr2001/2002)。此外，生物所产生的脂质的类型可通过引入如下基因来改变：使甘油三酯得以形成的基因(如来自酵母(LRO1)或拟南芥(TAG1)的二酰基甘油酰基转移酶)，或者能定性或定量改变糖酯、硫脂和磷脂的形成或脂肪酸饱和度的基因。集胞藻中的脂肪酸去饱和是通过DesA(Slr1350)、DesB(Sll1441)、DesC(Sll0541)和DesD(Sll0262)来催化，对相应基因的表达进行调节，可调节脂肪酸去饱和水平，进而调整细胞的温度耐受性。参与途径的调节或类囊体膜形成的调节的基因的差异表达，也会导致脂质含量的增加或生物燃料值(biofuel value)的增加。在某些实施方案中，目的基因包括集胞藻PCC 6803的sll0336、sll0728、sll1568、slll848、slr2060、sll0617、slrl471、sll1463、slr0228、slr1024、slr1390、slr1604、slr0156、slr1641、slr0542、slr0165、slr0435、sll0053、slr2023、slr1511、sll1069、slr1332、slr0886、sll1605、slr1051、slrll76、slr1188、slr1024、sll1568、slr1829、slrl830、slr2001、slr2002、slrl350、sll1441、sll0541、sll0262、sll0920、sll0401和sll0534。本领域普通技术人员会认识到，在其他光能自养细菌中存在着这些基因的同源物(homologue)。这些同源物也可在那些菌(藻)种中进行改变、引入或缺失。此外，可通过引入能使得可以进行三酰基甘油合成的基因，来对细胞中的脂质的类型进行修饰。三酰基甘油过量产生可导致细胞中合成出可进行收获和分离的脂质小体。
不囿于任何具体的理论，三酰基甘油是从磷脂酸(Sll1848产物)通过除去磷酸产生二酰基甘油，然后通过二酰基甘油酰基转移酶加入另一个酰基基团而形成的。负责从磷脂酸除去磷酸的酶是可能由集胞藻中的sll0545编码的磷脂酸磷酸酶。这个基因可从高甘油三酯菌株(如混浊红球菌(Rhodococcus opacus))过量表达，从而过量表达磷脂酸磷酸酶。为形成甘油三酯，可引入来自酵母的LRO1或来自其他体系的重要的二酰基甘油酰基转移酶。LRO1类似于真核生物中的卵磷脂胆固醇酰基转移酶基因，能介导酵母指数生长过程中的甘油三酯合成的大部分。同源物存在于油料种子植物中，这个酶的酰基供体可为磷脂。另外，也可引入来自拟南芥(来自TAG1基因座的cDNA)的、很可能用乙酰-CoA作为酰基供体的二酰基甘油乙酰转移酶。这样，集胞藻中的甘油三酯形成可得以最大化。在原核生物中，所产生的甘油三酯通常作为细胞质内含体贮藏，内含体类似于植物油料种子中的油体，即被蛋白质/磷脂单层包围的脂质小滴。它们是含少量(1-2％)磷脂和蛋白质的基本上纯的甘油三酯，在膜处形成。
在其中目的基因被改变表达水平、被缺失或被导入的一些实施方案中，经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的类胡萝卜素或其他类异戊二烯的产量而言，其一种或多种类胡萝卜素或其他类异戊二烯的产量得到了增加。经修饰的光能自养细菌可被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的类胡萝卜素或其他类异戊二烯含量而言，其类胡萝卜素或其他类异戊二烯含量得到了增加。类胡萝卜素的非限制性实例包括β-胡萝卜素、玉米黄素、蓝溪藻黄素乙、myxol、海胆酮和它们的生物合成中间体。其他类异戊二烯的非限制性实例包括异戊二烯、生育酚和它们的生物合成中间体。类胡萝卜素含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％或更大百分数，或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数的百分数。此外，类胡萝卜素含量可占通过技术人员公知的方法计算出的该生物理论干重的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数的百分数。该生物中的任何其他类异戊二烯的含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％或更大百分数，或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数的百分数。另外，一些在天然生物中可能不被产生的类异戊二烯可通过本文公开的方法在经修饰的生物中产生。任何类异戊二烯的含量可占通过技术人员公知的方法计算出的该生物理论干重的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数的百分数。可进行修饰和可导致类胡萝卜素产量或类胡萝卜素含量的表达发生改变的目的基因，可为能表达或调节作为类胡萝卜素前体的C5化合物IPP和DMAPP的产生的基因(例如集胞藻PCC 6803的slr0348)；能表达或调节异戊烯基二磷酸异构酶的产生的基因(例如集胞藻PCC 6803的sll1556)；crtP基因(例如集胞藻PCC 6803的slr1254)；crtQ基因(例如集胞藻PCC 6803的slr0940)；crtD基因(例如集胞藻PCC 6803的slr1293)；crtLdiox基因(例如集胞藻PCC 6803的sll0254)和crtR基因(例如集胞藻PCC 6803的sll1468)。为给集胞藻提供合成异戊二烯的潜力，目的基因可以是被导入集胞藻中置于强启动子下的来自植物如杨树品种的异戊二烯合酶基因或其同源物。本领域普通技术人员会认识到，在其他光能自养细菌中存在着这些基因的同源物。这些同源物也可在那些菌(藻)种中进行过量表达或改变。
在其中目的基因被改变表达水平、被缺失或被导入的一些实施方案中，经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的碳水化合物产量而言，其一种或多种碳水化合物的产量得到了增加。经修饰的光能自养细菌可被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的碳水化合物含量而言，其碳水化合物含量得到了增加。该生物中的碳水化合物的含量可增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％或更大百分数，或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数的百分数。另外，一些在天然生物中可能不被产生的碳水化合物可通过本文公开的方法在经修饰的生物中产生。该生物中产生的碳水化合物中的任何一种或多种的含量，可单独占或与其他碳水化合物共同占通过技术人员公知的方法计算出的该生物理论干重的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％或者在任何这些点之间可得出的任何范围或整数的百分数。碳水化合物的非限制性实例包括单糖和磷酸单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、景天庚酮糖二磷酸和果糖二磷酸)、二糖(例如蔗糖)、寡糖(例如果寡糖和甘露寡糖)和多糖(例如糖原及其衍生物)。本领域普通技术人员会认识到，可以以使得碳水化合物不能被转化成糖原而是被转化成聚乳酸(PLA)、聚-3-羟基丁酸(PHB)或别的聚羟基烷酸(PHA)或脂质或其他生物燃料的方式，对糖原合成酶和糖原分支酶的基因进行突变(例如插入或缺失)。或者，基因可以是参与中心碳代谢的基因。
在某些方面，目的基因与组成型启动子可操作地连接。组成型启动子的非限制性实例包括psbDII启动子、psbA3启动子和psbA2启动子。目的基因可与可诱导型启动子可操作地连接。可诱导型启动子的非限制性实例包括nirA启动子、isiAB启动子、petE启动子、nrsRS启动子、nrsABCD启动子和ndhF3启动子。可将多个基因导入置于同一启动子的控制之下。
本发明的另一个实施方案公开了增加光能自养细菌的期望产物的产量的方法。所述方法可包括改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能，从而导致光能自养细菌中一种或多种产物或者一个或多个目的基因的产量的增加，其中所述改变导致所述一种或多种产物的产量，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达不被改变的光能自养细菌所产生的所述产物的量而言，得到了增加。所述方法还可包括在合适的条件下生长光能自养细菌，以产生出其量得到增加的期望产物。这可包括对以下各方面的优化：温度(包括温度的时空变化)、氮水平(包括氮的具体化学组成，如硝酸盐、亚硝酸盐、有机胺、氨等)、二氧化碳水平、光强度、光暴露时间(或者更一般来说是光强度的时间调节)、光波长(光强度的光谱调节)、光分布(光强度的空间调节)、磷水平、硫水平(包括不同形式的硫如有机硫、硫酸盐等的具体水平)、矿物质水平(包括每种单独金属如铁、镁、锰、锌等的具体水平)、混合速度(包括依时间或位置进行的混合调节)、细菌密度(多快收获细菌才能得到特定的稳态细胞密度)、营养物流入(碳、氮、硫、磷、矿物质等)的速度和时间调节以及环境的对于细菌生长速度和组成重要的其他方面。光能自养细菌可以是能吸收和固定二氧化碳的类型。调节目的基因表达水平和/或缺失天然基因和/或引入外来基因，能增加二氧化碳的吸收和固定，这个增加是相对于没有改变目的基因表达水平和/或缺失天然基因和/或引入外来基因的光能自养细菌的二氧化碳吸收和固定量而言。期望的产物可以是(但不限于)某种脂质(或各种脂质的混合物)、某种碳水化合物(或各种碳水化合物的混合物)、碳水化合物的糖成分、类胡萝卜素(或各种类胡萝卜素的混合物，例如β-胡萝卜素、玉米黄素、蓝溪藻黄素乙、myxol、海胆酮和它们的生物合成中间体)、别的某种类异戊二烯(或各种类异戊二烯的混合物)、蛋白质(或蛋白质的混合物)、蛋白质的氨基酸成分或者贮藏产物藻青素(及相关化合物)。在蛋白质的情况中，可产生出各种蛋白质的特定混合物，该混合物用于动物饲料、生产疫苗或其他有价值的蛋白质产品的目的来进行优化。还有，各种特定的蛋白质如果它们会污染或降低期望产物的收率的话，可对它们在细胞中的水平进行下调。所述方法还可包括将期望的产物加工成生物燃料。生物燃料的非限制性实例包括生物柴油、生物醇(例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)和生物气(氢气、异戊二烯、甲烷、乙烷、丙烷和丁烷)。在其他方面，所述方法可包括将期望的产物加工成生物塑料。生物塑料的非限制性实例包括聚乳酸(PLA)、聚-3-羟基丁酸(PHB)或聚-3-羟基烷酸(PHA)。期望的产物可加工成动物饲料添加剂或者有机肥料。
光能自养细菌的合适生长条件包括本说明书中描述的条件和本领域普通技术人员公知的条件。例如在一个实施方案中，合适的生长条件包括给该细菌提供二氧化碳源。二氧化碳源可有多种。在一个实施方案中，来源获自烟道气。在另一个实施方案中，二氧化碳源可以是大气。合适生长条件可包括给该细菌提供固定氮源。固定氮源可有多种。在一个实施方案中，来源获自地下水、氨、硝酸钠或硝酸铵。提供给光能自养细菌的二氧化碳的量可在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20％或更大百分数之间，其中％指CO2在提供给培养物的气体中的分压。提供给光能自养细菌的固定氮的量可在培养基中在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95mM或更大mM之间。合适生长条件可包括在如下温度范围生长细菌：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、80、90℃或更高温度或者可从中得到的任何范围或整数。在某些方面，温度范围是在10-55℃之间。合适生长条件还可包括使光能自养细菌暴露于光(例如日光)。
本发明的另一个实施方案包括从光能自养细菌产生期望的产物的方法。所述方法可包括获得本发明的经修饰光能自养细菌或者获得通过本发明方法产生的经修饰光能自养细菌，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能会导致光能自养细菌中的一种或多种产物或者一个或多个目的基因的产量的增加，从而导致期望产物的产量相对于其中所述一个或多个目的基因的表达不被改变的光能自养细菌所产生的期望产物的量而言得到了增加；在合适条件下生长该光能自养细菌以产生期望的产物；和分离期望的产物。光能自养细菌可以是能吸收和固定二氧化碳的类型。调节目的基因表达水平和/或缺失天然基因和/或引入外来基因，能增加二氧化碳的吸收和固定，这个增加是相对于目的基因表达水平没有被修饰和/或没有携带天然基因的缺失和/或外来基因的引入的光能自养细菌的二氧化碳吸收和固定量而言。期望产物的非限制性实例包括脂质、碳水化合物、类胡萝卜素、其他类异戊二烯、色素、抗氧化剂、其他次级代谢物、蛋白质或者它们的混合物。分离步骤的非限制性实例包括本说明书中描述的分离步骤和本领域普通技术人员公知的分离步骤。非限制性实例包括用有机溶剂提取、用无害化学品(例如CO2或水)在超临界条件下提取或者通过两相分配提取。所述方法还可包括通过本说明书中描述的方法和本领域普通技术人员公知的方法将期望的产物加工成生物燃料、生物塑料、类胡萝卜素、动物饲料或肥料。
本发明的另一个实施方案包括固定二氧化碳的方法。所述方法可包括获得本发明的能够吸收和固定二氧化碳的经修饰光能自养细菌或者获得通过本发明方法产生的能够吸收和固定二氧化碳的经修饰光能自养细菌，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能会导致二氧化碳吸收和固定的增加，这个增加是相对于其中所述一个或多个目的基因不被改变的光能自养细菌的二氧化碳吸收和固定量而言；在合适条件下生长该光能自养细菌以吸收和固定二氧化碳；和给该经修饰光能自养细菌提供二氧化碳来源，其中该来源的至少一部分二氧化碳被该经修饰光能自养细菌固定。非限制性的二氧化碳来源可以是烟道气、大气CO2或其他CO2来源。所述方法还可包括固定烟道气中的至少一部分二氧化碳。
可以理解的是，本说明书讨论的任何实施方案可用本发明的任何方法或组合物来实施，反之本发明的任何方法或组合物可在本说明书讨论的任何实施方案中实施。此外，本发明的组合物可用来实现本发明的方法。
权利要求书和/或说明书中单数形式的名词的使用可意指“一个”，但也指“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义。
权利要求书和/或说明书中出现的词语“一个(种)或多个(种)”定义为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个(种)或更多个(种)。
词语“一种或多种产物”可以是单个类别中的多种产物(即两种或更多种脂质；两种或更多种生物气)，多个类别中的单种产物(即1种脂质、1种脂肪酸、1种碳水化合物等)，或者它们的组合。例如涉及基因表达的术语“(被)改变(的)”包括任何类型的改变，所述任何类型的改变包括(a)表达的上调或下调；(b)天然基因的改变(例如通过可诱导型启动子构建物等进行的改变)；(c)内源基因中的突变；通过转基因的构建物(即转基因)(在不同的生物中天然存在的，或者突变的)进行的改变；(d)以上改变的组合；等等。
在本申请中，术语“约”和“大约”表示某数值包括装置、用以测定该数值的方法的固有误差变化，或者研究对象当中存在的变化。在一个非限制性实施方案中，这两个术语定义为10％内，优选5％内，更优选1％内，最优选0.5％内。
术语“或”在权利要求书中的使用是用来意指“和/或”，虽然本公开内容对于指仅仅两选项之一和“和/或”的定义是支持的，但是除非明确指出，仅仅是指两选项(alternatives)之一或者说两选项是互相排斥的。
本说明书和权利要求书中使用的词语“包含”(及其任何语法变体形式)、“具有”(及其任何语法变体形式)、“包括”(及其任何语法变体形式)或“含有”(及其任何语法变体形式)是包涵式的(inclusive)或开放式的(open-ended)，并不将另外的未述及的要素或方法步骤排除在外。
本发明的其他目标、特征和优点由以下详细说明将变得显而易见。但是应认识到，详细说明和具体的实施例虽然指出了本发明的具体实施方案，但仅仅是以举例说明的方式给出，因为各种落入本发明精神和范围内的变化和修改由这个详细说明将变得对本领域技术人员显而易见。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，纳入这些附图是旨在进一步说明本发明的某些方面。结合本文给出的具体实施方案的详细说明参考一个或多个这些附图，可更好地理解本发明。
图1.糖磷酸标准品和集胞藻提取物的LC/MS。LC洗脱时间在X轴上，代表具体糖磷酸的糖磷酸质量在Y轴上。Z轴表示MS信号的强度。A.浓度为20μM的糖磷酸标准品。B.对来自光能混合营养生长的(photomixotrophically grown)集胞藻野生型培养物的细胞提取物的LC/MS，监测只体糖磷酸的质量。注意，有些中间体在提取物中以显著浓度存在，而其他中间体则几乎不可检测。
图2.MS/MS验证LC/MS峰的实例。259m/z峰是在第一次MS后选择，这个图中显示的信号是第二次MS后的97m/z(磷酸)信号的强度。LC洗脱时间在X轴上绘出。
图3.对光能混合营养生长的集胞藻培养物进行13C-葡萄糖标记时3-磷酸甘油酸(3PG)同位素体(isotopomer)的动态分布。在时间0，加入0.5mM13C-葡萄糖。在不同的时间采集样品，分析3PG(未标记质量(185)、质量+1、质量+2、质量+3)的质量分布。
图4.代谢物浓度对MS信号面积的校准。向细胞提取物加入不同浓度的标准品。提取物中相应代谢物的浓度是与横坐标的截距(intersect)的绝对值。G6P：空心圆圈；3PG：实心圆圈；PEP：空心三角形。
图5.细胞提取物中的己糖-6-磷酸(G6P+F6P)库(pool)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)库、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)库和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)库的同位素分布与加入标记葡萄糖后在光能混合营养条件下的生长时间的函数关系。在时间0，加入0.5mM13C-葡萄糖。各同位素体在X轴上按质量分离(从左到右：未标记质量、质量+1、质量+2等)。数据是三个实验的平均值。标准偏差分析显示相对强度变化超过5％是显著的。
图6.细胞提取物中的己糖-6-磷酸(G6P+F6P)库、磷酸甘油酸(3PG+2PG)库、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)库和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)库的同位素分布与加入标记碳酸氢盐后在光能混合营养条件下的生长时间的函数关系。在时间0，加入0.5mM未标记葡萄糖和5mM NaH13CO3。各同位素体在X轴上按质量分离(从左到右：未标记质量、质量+1、质量+2等)。数据是三个实验的平均值。标准偏差分析显示相对强度变化超过5％是显著的。
图7.细胞提取物中的己糖-6-磷酸(G6P+F6P)库、磷酸甘油酸(3PG+2PG)库、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)库和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)库的同位素分布与25μM阿特拉津存在下在光能异养条件下的生长时间的函数关系。在时间0，加入0.5mM13C-葡萄糖。各同位素体在X轴上按质量分离(从左到右：未标记质量、质量+1、质量+2等)。数据是三个实验的平均值。标准偏差分析显示相对强度变化超过约5％是显著的。
图8：野生型非分裂期(图8A)和分裂期(图8B)集胞藻PCC 6803蓝细菌细胞的透射电子显微镜照片。在这两个时期，最外围的一批类囊体膜对(白色无柄箭头)汇聚在邻近细胞质膜的部位。标出了羧酶体(黑色无柄箭头)、PHA颗粒(星号)、脂质小体(白色有柄箭头)和隔膜(黑色有柄箭头)。图8C-F是过量表达编码涉及类囊体膜生物发生的蛋白质的VIPP1基因的集胞藻PCC 6803蓝细菌突变株的电子显微镜照片。图8C显示类囊体膜的数量显著增加，紧贴的各张膜(白色星号)似乎脱离成单张类囊体薄片(白色有柄箭头)。图8D.图8C的放大。图8E显示这一突变株所独有的与类囊体膜(黑色无柄箭头)紧密结合的薄层结构(黑色星号)的存在。图8F.图8E的放大。标尺＝200nm。
图9：用0.04％尼罗蓝(图9A)活体染色12小时后的集胞藻PCC 6803细胞。各照片是用在488nm处激发和在560-620nm之间检测的共聚焦激光扫描显微镜(图9A-D)或用落射荧光显微镜(epi-fluorescent lightmicroscope)(图9E-F)获得的。图9A.在标准BG-11培养基中培养的处于对数期早期的野生型细胞。图9B.在N限制培养基(1.67mM硝酸盐)中培养的稳定期野生型细胞。图9C.在其中用10mM NH4Cl代替NaNO3(16.7mM)的改良BG-11培养基中培养的对数期早期野生型细胞。图9D.对数期中期的PS II缺失/氧化酶缺失(PS II-less/oxidase-less)细胞。图9E.对数期中期的氧化酶缺失细胞。图9F.对数期中期的NDH-I缺失细胞。除了PS II缺失/氧化酶缺失的培养物外，所有的培养物都进行光能自养生长。标尺大小：1μm。
图10.在光能自养条件下生长的处于对数期早期的集胞藻PCC 6803各藻株的超微结构，但PS II缺失/氧化酶缺失藻株的生长是个例外，在5mM葡萄糖存在下进行光能混合营养生长。图10A.野生型；图10B.氧化酶缺失藻株；图10C.PS II缺失/氧化酶缺失藻株；图10D.N饥饿后的野生型。较大的白色空间是由薄切片制备过程中洗出的PHA所致。标尺大小200nm。
图11.从在光能混合营养条件下生长的PS II缺失/氧化酶缺失藻株分离并通过GC/MS分析的全细胞甲醇分解产物(methanolysis product)(图11A)。检测到两个主要的峰。峰1和峰2的GC/MS指纹分别在图11B和C中显示。峰1的质谱碎片图与PHB的甲醇分解产物即3-羟基丁酸甲酯的质谱碎片图匹配(图11B)，而峰2的质量谱图提示了在长时间的甲醇分解作用后葡萄糖或糖原的可能降解产物即乙酰丙酸甲酯的形成(图11C)。
图12.代表被扩增的集胞藻accA基因、accB基因、accC基因和accD基因的PCR产物，这些基因一起编码ACC复合物。
图13.含有所有ace基因的质粒构建物，其中侧翼区是设计来插入到集胞藻基因组的psbA2基因座中。旁边的凝胶图说明有多个转化子携带期望的质粒。
图14.用来产生集胞藻的VIPP-I过量表达藻株的构建物的质粒图。这个拷贝的VIPP-I基因被插入置于psbA3启动子之下。
具体实施方式
如上所述，二氧化碳污染环境一直是个问题。全球因消耗化石燃料产生的二氧化碳估计每年有70-80亿吨(Marland等人，2006)。另外，统计显示世界化石燃料资源的消耗日益增加。尽管目前有降低二氧化碳污染量和使用替代能源的方法存在，但这些方法往往费用高和效率低。
本申请人的发明克服了本领域当前的不足。例如，本发明公开了光能自养细菌和使用这些细菌的相应方法，这些细菌已经过修饰，包括这样的目的基因，即其序列或表达水平已被修饰，和/或已被缺失和/或已从外部来源导入，其中目的基因的序列或表达水平修饰或者导入或者缺失能增加期望的产物(例如脂质、类胡萝卜素、别的类异戊二烯如异戊二烯或生育酚、别的次级代谢物、碳水化合物、藻青素或蛋白质)的产量，所述增加是相对于不被修饰以改变目的基因的光能自养细菌中的期望产物的量而言。经修饰的光能自养细菌可以是能吸收和固定二氧化碳的类型。在某些方面，改变目的基因的表达或序列或者缺失或引入目的基因还可增加二氧化碳的吸收和固定，所述增加是相对于不被修饰以改变目的基因的光能自养细菌中的二氧化碳吸收和固定量而言。
本发明的这些和其他的方面在以下各段节内容中作更详细的描述。
A.光能自养细菌
光能自养细菌包括能够用光作为能源合成食物的细菌。光能自养细菌还能够利用二氧化碳作为其主要碳源。可用于本发明的情形的光能自养细菌的非限制性实例，包括蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、螺杆菌(heliobacteria)、光合酸杆菌(photosynthetic acidobacteria)、紫色硫细菌或紫色非硫细菌。在具体的实施方案中，光能自养细菌是蓝细菌。
1.蓝细菌
一般来说，蓝细菌可在世界上的几种栖息地找到。例如，已在海洋、淡水、裸石和土壤中找到这类细菌。通常，蓝细菌包括单细胞形式、菌落形式和丝状形式。一些丝状菌落显示出分化成营养细胞和光合作用细胞的能力。在一些情况下，当固定氮浓度低时，会有固氮酶的厚壁异形囊胞形成。能形成异形囊胞的菌种是为固氮而发生特化的，能够将氮气固定为氨(NH3)、亚硝酸盐(NO2 -)或硝酸盐(NO3 -)，这些物质随后可被转化成蛋白质和核酸。蓝细菌通常包括厚的革兰氏染色阴性的细胞壁。
对蓝细菌细胞结构、构造、功能和生物化学的研究已成为许多研究工作的主题。二十世纪六十年代初到八十年代的研究工作使人们认识了许多蓝细菌菌种的胞内一般构造，并鉴定出几种细胞结构，如捕光天线、藻胆蛋白体(Gantt和Conti 1969；Edwards和Gantt 1971；Bryant等人，1979)，多磷酸盐小体、藻青素颗粒、聚羟基烷酸(PHA)颗粒(Jensen和Sicko 1971)，羧酶体/多面体、脂质小体、类囊体中心、含DNA区域(Asato和Ginoza 1973；Roberts和Koths 1976)和核糖体(Ris和Singh 1961)。
例如，蓝细菌包括高度组织化的内膜系统，这些内膜在光合作用中起作用。蓝细菌中的光合作用通常用水作为电子供体，产生氧气作为副产物。蓝细菌能吸收二氧化碳并将它还原成碳水化合物、脂质和其他含碳副产物。在大多数蓝细菌中，光合作用机制(machinery)嵌入在内膜系统(即类囊体膜)中。
已知有超过一千种不同的蓝细菌。例如，蓝细菌可分类成至少以下各目：色球藻目(Chroococcales)、念珠藻目(Nostocales)、颤藻目(Oscillatoriales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、原绿藻目(Prochlorophytes)或真枝藻目(Stigonematales)。色球藻目的蓝细菌属的非限制性实例包括Aphanocapsa(隐球藻属)、Aphanothece(隐杆藻属)、Chamaesiphon(管孢藻属)、Chroococcus(色球藻属)、Crocosphaera、Cyanobacterium(蓝细菌)、Cyanobium、蓝丝菌属(Cyanothece)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、Gloeobacter(粘杆菌属)、Gloeocapsa(粘球藻属)、Gloeothece(粘杆藻属)、Euhalothece、Halothece、Johannesbaptistia、Merismopedia(平裂藻属)、Microcystis(微囊藻属)、Rhabdoderma(棒条藻属)、Synechococcus(聚球菌属)、Synechocystis(集胞藻属)和嗜热聚球藻(Thermosynechococcus)。念珠藻目的蓝细菌属的非限制性实例包括Coleodesmium、Fremyella、Microchaete(微毛藻属)、Rexia、Spirirestis、Tolypothrix(单歧藻属)、Anabaena(鱼腥藻属)、Anabaenopsis(项圈藻属)、Aphanizomenon(束丝藻属)、Aulosira(管链藻属)、Cyanospira、Cylindrospermopsis(柱胞藻属)、Cylindrospermum(筒孢藻属)、Nodularia(节球藻属)、Nostoc(念珠藻属)、Richelia(植生藻属)、Calothrix(眉藻属)、Gloeotrichia(胶刺藻属)和Scytonema(伪枝藻属)。颤藻目的蓝细菌属的非限制性实例包括Arthrospira(节螺藻属)、Geitlerinema、Halomicronema、Halospirulina(盐螺旋藻属)、Katagnymene、Leptolyngbya(瘦鞘丝藻属)、Limnothrix(湖生蓝丝藻属)、Lyngbya(鞘丝藻属)、Microcoleus(微鞘藻属)、Oscillatoria(颤藻属)、Phormidium(席藻属)、Planktothricoides(拟浮丝藻属)、Planktothrix(浮丝藻属)、Plectonema(织线藻属)、Limnothrix(湖生蓝丝藻属)、Pseudanabaena(假鱼腥藻属)、Schizothrix(裂须藻属)、Spirulina(螺旋藻属)、Symploca(束藻属)、Trichodesmium(束毛藻属)和Tychonema。宽球藻目的蓝细菌属的非限制性实例包括Chroococcidiopsis(拟色球藻属)、Dermocarpa(皮果藻属)、Dermocarpella(小皮果蓝细菌属)、Myxosarcina(黏囊藻属)、Pleurocapsa(宽球藻属)、斯塔尼尔氏菌属(Stanieria)和Xenococcus(异球藻属)。构成的群组的藻种。原绿藻目的蓝细菌属的非限制性实例包括Prochloron(原绿藻属)、Prochlorococcus(原绿球藻属)和Prochlorothrix(原绿发藻属)。真枝藻目的蓝细菌属的非限制性实例包括Capsosira(蒴链藻属)、Chlorogloeopsis(拟绿胶蓝细菌属)、Fischerella(费氏藻属)、Hapalosiphon(软管藻属)、Mastigocladopsis、Mastigocladus(鞭枝藻属)、Nostochopsis(拟念珠藻属)、Stigonema(真枝藻属)、Symphyonema(聚线藻属)、Symphyonemopsis、Umezakia和Westiellopsis。本说明书中所确定的蓝细菌菌种和本领域普通技术人员公知的蓝细菌菌种，认为可用于本发明的情形。以下两段落仅以举例方式提供了集胞藻PCC 6803和嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcus elongatus sp.)BP-I这两种具体蓝细菌菌种的详细说明。
2.集胞藻PCC 6803
集胞藻PCC 6803是一种单细胞生物，它显示出非常合乎需要的分子遗传特性、生理特性和形态特性的独特组合。例如，这个菌种能自发转化，能通过双同源重组将外来DNA并入其基因组中，能在许多不同的生理条件下生长(例如光能自养生长/光能混合营养生长/光能异养生长)，且相对较小(直径约1.5μm)(Van de Meene等人，2005，通过引用并入本文)。已对其完整基因组进行了测序(Kaneko等人，1996)，且已发现了很高比例的在其他细菌菌群中没有同源物的开放读框。集胞藻PCC 6803可获自美国模式培养物保藏所(ATCC)，检索号为ATCC 27184(Rippka等人，1979，通过引用并入本文)。
3.嗜热蓝细菌聚球藻BP-1
嗜热蓝细菌聚球藻BP-I是一种单细胞嗜热蓝细菌，栖息在温泉中，最适生长温度大约为55℃(Nakamura等人，2002，通过引用并入本文)。这种细菌的完整基因组已被测序。基因组包括2,593,857个碱基对的环状染色体。预测了总共2,475个潜在的蛋白质编码基因、一组rRNA基因，42个代表42种tRNA的tRNA基因和4个小结构RNA的基因。
B.目的基因
在本发明的优选方面，目的基因包括那些当其序列或表达水平被改变时、当被缺失时或者当被导入时能够增加该细菌中的期望产物(例如脂质、别的燃料如氢或醇类、类胡萝卜素、别的类异戊二烯如异戊二烯或生育酚、碳水化合物、藻青素或蛋白质)的产量的基因，所述增加是相对于在目的基因方面没有被修饰的细菌中的期望产物的产量而言。在某些方面，目的基因当其序列或表达水平被改变时、当被缺失时或者当被导入时还能增加二氧化碳的吸收和固定，所述增加是相对于在目的基因方面没有被修饰的细菌中的二氧化碳吸收和固定量而言。
在某些方面，目的基因包括那些当其序列或表达水平被改变时、当被缺失时或者当被导入时，所述改变的表达水平、缺失或者导入能增加该细菌细胞中的脂质的产量的基因。所述改变的表达水平、缺失或者导入能增加该细菌细胞中的脂质含量。这种基因的非限制性实例包括质体1中小泡诱导蛋白(VIPP1)基因(sll0617)，类似的pspA型基因slr 1188，与对类囊体膜形成和组成重要的yidC和oxaI相似的slr 1471基因，乙酰-CoA羧化酶基因(sll0728、slr0435、sll0053和sll0336)，脂肪酸生物合成基因fabD(slr2023)、fabH(slr1511)、fabF(sll1069和slr1332)、fabG(slr0886)、fabZ(sll1605)和fabI(slr1051)，编码覆盖与原纤或类囊体膜相关的疏水实体的蛋白质的质体球蛋白/原纤蛋白基因(slr1024和sll1568)，编码1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶的sll1848，或者磷脂甘油酰基转移酶基因如slr2060。膜的脂质含量还可通过如下方式来提高：通过能识别膜中的蛋白质的蛋白酶(包括ftsH基因sll1463、slr0228、slr1390和slr1604，clpB基因slr0156和slr 1641，clpP基因slr0542、sll0534和slr0165)的过量表达；和通过代谢工程增加用于脂质生产的固定碳的量(例如通过sll0920、PEP羧化酶基因、sll0401、柠檬酸合酶基因的下调和/或参与贮藏化合物的合成的基因的缺失来增加，所述参与贮藏化合物的合成的基因包括参与糖原生物合成的slr1176、参与聚羟基丁酸形成和代谢的slr1829/1830和参与藻青素形成和代谢的slr2001/2002)。虽然以上指定是对于集胞藻而言，但在其他的蓝细菌中存在着同源物，这些同源物被认为可用于本发明的情形。
在其他方面，可对目的基因进行修饰，以显示出细菌细胞中的类胡萝卜素或其他类异戊二烯的水平发生改变。该修饰可增加细菌细胞的类胡萝卜素或其他类异戊二烯的含量。类胡萝卜素的非限制性实例包括β-胡萝卜素、玉米黄素、蓝溪藻黄素乙、myxol、海胆酮和它们的生物合成中间体。其他类异戊二烯的非限制性实例包括异戊二烯、生育酚和它们的生物合成中间体。这种基因的非限制性实例包括：能表达或调节作为类胡萝卜素前体的C5化合物IPP和DMAPP的产生的基因(例如集胞藻PCC 6803的slr0348)；能表达或调节异戊烯基二磷酸异构酶的产生的基因(例如集胞藻PCC 6803的sll1556)；crtP基因(例如集胞藻PCC 6803的slr1254)；crtQ基因(例如集胞藻PCC 6803的slr0940)；crtD基因(例如集胞藻PCC 6803的slr1293)；crtLdiox基因(例如集胞藻PCC 6803的sll0254)和crtR基因(例如集胞藻PCC 6803的sll1468)。虽然上述指明是对于集胞藻而言，但在其他的蓝细菌中存在着同源物，这些同源物被认为可用于本发明的情形。同样，来自其他生物如植物的基因(例如异戊二烯合酶)也被认为可用于本发明的情形。
在另外的方面，改变目的基因的序列或表达和/或缺失或者导入基因，能大大改变细菌细胞中的碳水化合物产量和水平。所述基因的改变的表达和/或缺失或者导入，能改变该细菌细胞的碳水化合物含量。这种基因包括那些当过量表达时能改变该细菌细胞的碳水化合物产量或碳水化合物含量的基因，所述碳水化合物例如单糖和磷酸单糖(例如葡萄糖、果糖、木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、景天庚酮糖二磷酸和果糖二磷酸)、二糖(例如蔗糖)、寡糖(例如果寡糖和甘露寡糖)和多糖(例如糖原及其衍生物)。这种基因的非限制性实例包括：表达糖原合成酶的基因和表达糖原分支酶的基因。本领域普通技术人员会认识到，可以以使得碳水化合物被转化成聚乳酸(PLA)、聚-3-羟基丁酸(PHB)、聚羟基烷酸(PHA)或脂质而不是作为糖原被储藏的方式，对糖原合成酶和糖原分支酶的基因进行突变(例如插入或缺失)。
技术人员会知道，本发明所描述的基因及其编码的蛋白质可在GenBank数据库和CyanoBase数据库获得，这两个数据库通过网站www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez和http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/进行访问。在本说明书中，描述了集胞藻PCC 6803这种生物(藻株PCC 6803)的各种基因，例如sll0617。这个术语例如“sll0617”是指各自每个基因的替用别名(alternate alias)或基因座标签(locus tag)，可用来通过上述数据库获得完全基因序列。例如，可将术语“sll0617”结合术语“集胞藻PCC 6803”在可通过上述NCBI网站访问的GenBank数据库中进行查询，以获得基因信息和获得完全基因序列的链接。有完全注解的集胞藻基因组，包括其开放读框在内，可通过上述CyanoBase网站访问。这个方法是本领域技术人员一点即通的。
C.调节目的基因的表达
本发明的实施方案包括用以调节本发明光能自养细菌当中的某些目的基因的表达水平的方法和组合物。目的基因可被修饰其序列或表达水平，和/或被缺失和/或被从外部来源引入。这可导致相应的期望基因产物(例如蛋白质或酶)的产生得到调节和/或与这种基因产物有关的途径得到调节(例如增加或过量表达目的基因，以获得其数量得到增加的相应基因产物和/或与该基因产物有关的代谢途径各成分)。本发明的实施方案可包括被引入到一个或多个基因中的多个改变，其中所述多个改变共同增加期望产物的产量。
1.重组表达系统
在某些实施方案中，基因产物和/或与该基因产物有关的代谢途径各成分是用重组表达系统(例如本发明的重组光能自养细菌)来合成。通常，这涉及到将编码期望基因产物的DNA(例如导致脂质、碳水化合物、类胡萝卜素或藻青素的形成)置于适当调节区域的控制之下，和在本发明的光能自养细菌(即宿主)中表达表达蛋白质，并且如果期望的话分离出被表达的基因产物或与该基因产物有关的途径的产物。这使得基因所编码的蛋白质能够以提高的数量被表达。这可通过增加该基因在宿主中的拷贝数、增加宿主中的启动子区域的结合强度或者通过启动子置换来实现。其他的基因改变机制包括减少基因表达、缺失基因、插入别的生物的基因或者改变其序列或调节蛋白。
通常，会将基因产物的DNA序列进行克隆或亚克隆到含有启动子的载体(例如质粒)中，然后将该载体转化到该细菌中，导致适当DNA区域的整合和造成该细菌表达该基因产物。还可将调节序列插入到本发明细菌的基因组中(例如被可操作地连接到(operatively coupled)编码目的基因产物的基因的异源调节序列)。或者，可通过使宿主暴露于能通过刺激自然调节过程增加蛋白质表达的特定条件或特定物质，来刺激内源启动子或调节机制。
常用的进行蓝细菌的基因/表达插入的方法，包括将构建物通过双同源重组整合到基因组中(参见例如Li等人，(1993)；Williams(1998)；Grigorieva等人，(1982)，通过引用并入本文)。在某些实施方案中，可采用双同源重组，使用这样的构建物导入基因中断(gene interruption)或缺失，该构建物中有两个区域与蓝细菌基因组有序列一致性。
a.核酸
采用本说明书提供的信息，可用本领域技术人员公知的标准方法，制备出被本发明光能自养细菌过量表达的核酸。例如，可通过体外方法如聚合酶链反应(PCR)，对蛋白质编码核酸进行克隆或扩增。有多种克隆和体外扩增方法为技术人员所熟知。足以指导技术人员进行体外扩增方法的技术的实例，可在以下文献中找到：Berger、Sambrook和Ausubel，以及4,683,202号美国专利；Innis(1990)；The Journal of NIH Research(1991)；Kwoh等人，(1989)；Guatelli等人，(1990)；Lomell等人，(1989)；Landegren等人，(1988)；Van Brunt(1990)；Wu和Wallace，(1989)；and Barringer等人(1990)。
编码本发明的期望产物的核酸，还可通过适当序列的克隆和限制酶切(restriction)来制备，或者通过用诸如以下的方法进行直接化学合成来制备：Narang等人，(1979)的磷酸三酯方法；Brown等人，(1979)的磷酸二酯方法；Beaucage等人，(1981)的二乙基亚磷酰胺方法；和4,458,066号美国专利的固相载体方法。
核酸可用DNA扩增方法如聚合酶链反应(PCR)来克隆。因此，例如，用含有一个限制位点的正义引物和含有另一个限制位点的反义引物，对核酸序列或亚序列进行PCR扩增。这会产生出具有末端限制位点的、编码期望序列或亚序列的核酸。然后容易地可将这个核酸连接到含有这样的核酸的载体中，该核酸编码第二分子且具有适当的相应限制位点。合适的PCR引物可由本领域技术人员用本文提供的序列信息和代表性引物进行确定。适当的限制位点还可通过定点诱变加入到编码期望的蛋白质或蛋白质亚序列的核酸中。含有期望的序列或亚序列的质粒用适当的限制性内切核酸酶进行切割，然后按标准的方法连接到编码第二分子的载体中。
化学合成通常产生单链的核酸。这可通过与互补序列进行杂交来转变成双链DNA，或者通过以该单链为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变成双链DNA。技术人员会认识到，DNA的化学合成是有限度的，更长的序列可通过将较短的各序列连接在一起来获得。或者，可克隆出亚序列并用适当的限制性内切核酸酶切割适当的亚序列。然后将各片段连接在一起产生期望的DNA序列。
b.载体
术语“载体”用以指这样的携带核酸分子，其中可插入核酸序列以便导入到本发明的光能自养细菌中，在该光能自养细菌中该核酸序列可被整合到基因组中、被复制和/或被过量表达。核酸序列可以是“外源的(exogenous)”，意思是该序列对于导入载体的细菌来说是外来的，或者是该序列与该细菌中的某序列同源，但它在该细菌细胞核酸当中所处的位置是通常不存在它的位置。载体包括质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YACs)。本领域技术人员会有良好的装备来通过标准的重组技术构建载体(参见例如Maniatis等人，1989和Ausubel等人，1994，两篇文献都通过引用并入本文)。
术语“表达载体”指任何类型的包含编码能够被转录的RNA的核酸的遗传构建物。在一些情况中，RNA分子任何可被翻译成蛋白质、多肽或肽。在其他情况中，这些序列不被翻译，例如在反义分子或核酶的生产中。表达载体可含有多个“控制序列”，控制序列是指被可操作地连接的(operablylinked)编码序列在特定细菌细胞中的转录所必需和可能还有翻译所必需的核酸序列。除了支配转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体也可含有还起到其他功能的核酸序列，这些核酸序列在下文进行描述。
如上所述，可将编码要表达的期望产物的核酸与每个细菌细胞的适当表达控制序列可操作地连接。这可包括调节序列如本说明书中描述的那些调节序列、核糖体结合位点和转录终止信号。
i.调节序列
本发明重组光能自养细菌的设计会决定于诸如所要转染的细菌和/或所要表达的具体蛋白质的选择的因素。适当调节序列的使用可使得多肽在本发明的多种宿主细胞中的表达水平得到改变。调节序列是本领域技术人员公知的(参见例如Goeddel(1990)；Berger和Kimmel，Guide to MolecularCloning Techniques，Methods in Enzymology 152 Academic Press，Inc.，SanDiego，Calif；Sambrook等人，(1989))。
例如，可将期望产物的基因与组成型启动子可操作地连接，以进行高水平、连续表达。或者，可采用可诱导型启动子和/或组织特异性启动子。可用于本发明情形的这种启动子的非限制性实例，包括诸如psbDII启动子、psbA3启动子和psbA2启动子的组成型启动子。例如Lagarde等人，(2000)提供了有关在集胞藻PCC 6803藻株中使用psbA2启动子来过量表达参与类胡萝卜素生物合成的基因的详细描述，在He等人，(1999)中有关于使用psbA3启动子的详细描述。这些参考文献中的信息通过引用并入本文。可诱导型启动子的非限制性实例包括nirA启动子、isiAB启动子、petE启动子、nrsBACD启动子、nrsAB启动子和ndhF3启动子(参见Aichi等人，(2001)；Vinnemeier等人，(1998)；Zhang等人(1994)；Lopez-Maury等人，(2002)；McGinn等人，(2003)，这些文献都通过引用并入本文)。
“启动子”是这样的控制序列，它是核酸序列中的某个区域，在该区域转录起始和速度得到控制。它可含有这样的遗传元件，即调节性蛋白质和分子如RNA聚合酶和其他转录因子会在这些遗传元件处进行结合，以引发核酸序列的特异性转录的遗传元件。词语“可操作地定位(operativelypositioned)”、“可操作地连接(operatively linked)”、“置于(在)......控制下”和“置于(在)......转录控制下”意指启动子相对于核酸序列处在正确的功能位置和/或方向，以控制该序列的转录起始和/或表达。
启动子通常包含起到定位RNA合成的起始位点的作用的序列。另外的启动子元件能调节转录起始频率。通常，这些元件位于起始位点上游最多100bp的区域，不过有许多启动子已证实在起始位点下游也含有功能元件。为使编码序列“置于启动子的控制下”，将转录读框的转录起始位点的5′末端定位在选定启动子的“下游”(即选定启动子的3′端)。该“上游”启动子会刺激DNA的转录和促进被编码的RNA的表达。
各启动子元件之间的间距常常是灵活的，使得当各元件发生倒转或者发生相对移动时启动子功能可得到保持。视启动子而定，似乎各个启动子能协同地或独立地起到激活转录的作用。启动子可以或可不与“增强子”协同使用，增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
启动子可以是天然伴随核酸序列的启动子，这可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列来获得。这种启动子可称为是“内源的”。同样，增强子可以是天然伴随核酸序列的增强子，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸区段置于重组或异源肩动子的控制下，会获得某些优点，重组或异源启动子是指通常不伴随其自然环境中的核酸序列的启动子。同样，重组或异源增强子、操纵基因(operator)或其他调节序列是指通常不伴随其自然环境中的核酸序列的增强子、操纵基因或其他调节序列。这种启动子、增强子、操纵基因或其他调节序列可包括其他基因的启动子、增强子、操纵基因或其他调节序列，从任何其他病毒或者原核细胞或真核细胞分离的启动子、增强子、操纵基因或其他调节序列，和“不天然存在的”即含有另外转录调节区域的另外元件和/或能改变表达的突变的启动子、增强子、操纵基因或其他调节序列。
当然，重要的是应用能有效指导DNA区段在本发明光能自养细菌中的表达的启动子、增强子、操纵基因或其他调节序列。分子生物学领域技术人员一般都知道启动子、增强子、操纵基因或其他调节序列用于蛋白质表达的用途(参见例如Sambrook等人，2001)。所应用的启动子可以是组成型启动子、条件特异性启动子、可诱导型启动子，和/或在适当条件下可用于指导所引入DNA区段的改变的表达(altered expression)，象这样在期望的产物的大规模生产中是有利的。启动子可以是异源启动子或内源启动子。
ii.起始信号
编码序列的有效翻译可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG或GTG起始密码子和邻近序列如核糖体结合位点。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG或GTG起始密码子和邻近序列如核糖体结合位点在内。本领域普通技术人员会能够容易确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与期望编码序列的读框同框(in-frame with)，以确保基因的整个编码区域的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达的效率可通过并入适当的转录增强子元件来增强。
iii.多克隆位点
载体可包括多克隆位点(MCS)，这是含有多个限制酶位点的核酸区域，任何一个限制酶位点都可与标准的重组技术协同使用来消化该载体(参见例如Carbonelli等人，1999；Levenson等人，1998和Cocea，1997，通过引用并入本文)。“限制酶消化”是指用只在核酸分子中的特定位置起作用的酶对核酸分子进行催化切割。许多这些限制酶可市售获得。这种酶的使用是本领域技术人员公知的。通常，使用在MCS当中进行切割的限制酶将载体线性化或片段化，以使外源序列能够被连接到该载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，这两个核酸片段相互间可以或可不毗邻。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员公知的。
iv.剪接位点
大多数被转录的真核生物RNA分子会经历RNA剪接，以从初级转录物除去内含子。含有真核生物的序列的载体通常会含有转录物的cDNA(mRNA的拷贝)以进行蛋白质表达(参见例如Chandler等人，1997，通过引用并入本文)。
v.终止信号
本发明的载体或构建物可包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由参与RNA聚合酶对RNA转录物的特异性终止的DNA序列组成。因此，在某些实施方案中，可以理解的是能结束RNA转录物的产生的终止信号。终止子可在体内使用以达到合乎需要的信息水平。
设想用于本发明的终止子，包括本文所述的或本领域普通技术人员知道的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如基因的终止序列，如rho依赖性终止子和rho非依赖性终止子。在某些实施方案中，终止信号可能是可转录序列或可翻译序列的缺乏，这例如因为序列截短所致。
vi.复制起点
为了使载体在本发明的细菌细胞中扩增，载体可含有一个或多个复制起点位点(常称为“ori”)，这是复制在其处起始的特定核酸序列。
vii.可选择标记和可筛选标记
在本发明的某些实施方案中，含有本发明核酸构建物的细菌细胞可通过在表达载体中包括标记得以在体外或体内进行鉴定。这种标记会给细胞赋予可鉴定的变化，使得含有该表达载体的细胞容易进行鉴定。通常，可选择标记是能赋予便于进行选择的特性的标记。阳性可选择标记是其存在便于对其的选择的标记，而阴性可选择标记是其存在防止对其的选择的标记。阳性可选择标记的一个实例是药物抗性标记。
通常，药物选择标记的并入有助于转化子的克降和鉴定，例如，能赋予对氯霉素、红霉素、庆大霉素(gentimycin)、壮观霉素、链霉素、博莱霉素(zeocin)和卡那霉素的抗性的基因是有用的可选择标记。还使用互补方法(complementation approach)，该方法是营养缺陷体用其所缺乏的基因进行功能互补。除了赋予便于根据条件的实施对转化子进行辨别的表型的标记外，还可以理解的是了基于比色荧光分析的其他类型的标记，包括诸如GFP和YFP的可筛选标记在内。此外，应用萤光素酶的标记可被用作报道基因。本领域技术人员还会知道如何应用免疫标记，很可能是与FACS分析联用。我们认为使用什么标记并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时被表达即可。可选择标记和可筛选标记的更多实例对于本领域技术人员是公知的。
viii.载体的非限制性实例
在某些实施方案中，可以理解的是将质粒载体用于转化本发明的光能自养细菌细胞。通常，使用自杀质粒载体，其中携带目的基因或构建物的期望质粒序列不在光能自养细菌宿主中复制，而是通过双同源重组被迫整合到宿主基因组中。质粒载体不会在大肠杆菌中复制。载体通常携带有在大肠杆菌中能被识别的复制位点，以及能够在大肠杆菌和光能自养细菌细胞的转化细胞中提供表型选择的标记序列。
另外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体，也可用作这些宿主的转化载体。例如，可利用λ噬菌体GEMTM-11来制备可用于转化宿主细胞的重组噬菌体载体。
更多的有用质粒载体包括适合于蛋白质过量表达的pET载体，以及包含与亲和标签所成的翻译融合体的载体，所述亲和标签包括His标签和Strep标签，供进行后续的纯化和分离或切割。其他合适的融合蛋白是与β-半乳糖苷酶、遍在蛋白等所成的融合蛋白。
c.将核酸导入光能自养细菌中
尽管集胞藻PCC 6803是天然可转化的，不需要进行处理来使DNA有效吸收和整合到基因组中，但是供进行核酸递送以转化本发明的光能自养细菌的合适方法，可包括几乎任何本文所述的或者本领域普通技术人员会知道的据以将核酸(例如DNA)导入到这种细菌中的方法。这种方法包括但不限于：通过自发转化或通过标准转化方法进行的DNA直接递送(Sambrook等人，2001)；先体外后体内转染(ex vivo transfection)方法(Wilson等人，1989，Nabel等人，1989)；注射方法(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括微注射方法(Harland和Weintraub，1985；美国专利5,789,215，通过引用并入本文)在内；电穿孔方法(美国专利5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等人，1986；Potter等人，1984)；磷酸钙沉淀方法(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等人，1990)；使用DEAE-葡聚糖接着使用聚乙二醇的方法(Gopal，1985)；直接超声装载(direct sonic loading)方法(Fechheimer等人，1987)；脂质体介导转染方法(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987；Wong等人，1980；Kaneda等人，1989；Kato等人，1991)和受体介导转染方法(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)；微粒轰击方法(PCT申请WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,7835,563,055，5,550,318，5,538,877和5,538,880，各自通过引用并入本文)和这些方法的任何组合。通过应用诸如这些技术，本发明的光能自养细菌可得到稳定转化。
2.诱变
对于基因的表达的剖析和工程改造来说，诱变可能是强有力的工具。它还可用来减轻基因的反馈调节和/或消除或下调竞争性途径等。在应用诱变的情况下，可通过多种标准的诱变程序来实现诱变。突变是一个据以使生物的数量或结构出现变化的过程。突变可涉及到单个基因、成批基因或整个染色体的核苷酸序列的修饰。单个基因的变化，可能是涉及到DNA序列当中单核苷酸碱基的去除、添加或置换的点突变的结果，或者可能是涉及到大量核苷酸的插入或删除的变化的结果。
突变可以是通过使用特定的靶向方法进行的定点突变。突变也可因为诸如以下的事件而自发产生：DNA复制的保真度出现错误，或者基因组当中的可转座遗传元件(转座子)发生移动。在暴露于化学或物理诱变剂后，也会诱导产生突变。这种突变诱导剂包括电离辐射、紫外光和多种化学物质，这些化学物质例如烷基化剂和多环芳烃，它们(通常在一些代谢生物转化后)都能够与核酸发生直接或间接的相互作用。由这种环境媒介物(environmental agent)引起的DNA损伤当在受影响的DNA被复制或修饰时可导致碱基序列的修饰，从而导致出现突变。
a.定点诱变
对于基因的表达的剖析和工程改造来说，结构指导的位点特异性诱变(structure-guided site-specific mutagenesis)代表着强有力的工具。该技术是通过向选定的DNA中导入一个或多个核苷酸序列变化，来使序列变体得以制备和测试。
位点特异性诱变使用到编码期望突变的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足够数量的邻近的未经修饰核苷酸。这样，提供出具有足够大小和复杂度的引物序列，以在被横跨的缺失接点(deletion junction)的两侧形成稳定的双链体。优选长度约17-25个核苷酸的引物，其中序列的接点的两侧有约5-10个残基被改变。
该技术通常采用以单链形式和双链形式两种形式存在的噬菌体载体。可用于定点诱变的载体包括诸如M13噬菌体的载体。这些噬菌体载体可市售获得，它们的用途通常是本领域技术人员公知的。在定点诱变中还例行采用双链质粒，这可取消将目的基因从噬菌体转移到质粒的步骤。
一般来说，首先是获得单链质粒，或者使双链载体的两条链解链，所述单链载体或双链载体在其序列当中包括编码期望蛋白质或遗传元件的DNA序列。然后使合成法制备的带有期望突变序列的寡核苷酸引物与单链DNA制品进行退火，当选择杂交条件时要考虑到错配的程度。使杂交产物经受DNA聚合酶如大肠杆菌聚合酶I(Klenow片段)处理，以完成带有突变的链的合成。因此形成出异源双链体，其中一条链编码原始的非突变序列，另一条链带有期望的突变。然后用这个异源双链体载体转化本发明的光能自养细菌细胞。可选择出包含带有突变的序列排列(mutated sequencearrangement)的重组载体的克隆。
有关给定蛋白质残基的功能重要性和信息含量的全面信息，最好可通过饱和诱变来获得，在饱和诱变中对所有19个氨基酸置换都进行了研究。这个方法的缺点是多残基饱和诱变(组合诱变)的后勤工作(logistics)令人生畏(Warren等人，1996，1996；Zeng等人，1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等人，1995；1995；Hilton等人，1996)。必须研究数百个、或许甚至数千个的位点特异性突变株。但是，有改进的技术使得突变株的产生和快速筛选更加直接了当，特别是如果存在着对具有期望特性的突变株的严格功能选择方案的话。另参见美国专利5,798,208和5,830,650关于“预排(walk-through)”诱变的描述。
其他的定点诱变方法在美国专利5,220,007、5,284,760、5,354,670、5,366,878、5,389,514、5,635,377和5,789,166中公开。
b.随机诱变
i.插入诱变
插入诱变是基于通过已知DNA片段的插入使基因发生的失活。由于它涉及到某种类型的DNA片段的插入，所产生的突变通常是功能损失型突变而不是功能获得型突变。但是，产生功能获得型突变的插入也有数例(Oppenheimer等人，1991)。插入诱变在细菌和果蝇(Drosophila)中已非常成功(Cooley等人，1988)，已在诸如玉米(Schmidt等人，1987)、拟南芥(Arabidopsis)(Marks等人，1991；Koncz等人，1990)和金鱼草(Antirrhinum)的植物中成为强有力工具。可进行基因剔除，已产生遗传工程改造的细菌。“剔除”基因应作广泛解释为包括减少或消除被编码的基因产物的产生。因此，基因剔除可例如通过定点突变、插入诱变、移码突变或者控制该基因的表达的该基因或调节区域的全部或部分的缺失来作出。
可转座遗传元件是能从细胞基因组中的一个位置移动(转座)到另一个位置的DNA序列。第一个别识别的可转座元件是玉米(Zea mays)的Activator/Dissociation元件。此后在多种生物中也鉴定出可转座元件，这些生物既有原核生物也有真核生物。
基因组中的可转座元件其特征是侧接有短DNA序列的同向重复序列(direct repeat)，该短DNA序列是在转座过程中得到复制的，称为靶标位点复制。几乎所有的可转座元件无论其类型和转座机制如何，都在它们的插入位点作出这种复制。在一些情况中，被复制的碱基的数目是恒定的，在其他情况中，每次转座事件的被复制碱基数不同。大多数可转座元件在其末端具有反向重复序列。这些末端反向重复序列其长度可为几个碱基到几百个碱基，在许多情况中已知它们是转座所必需的。
原核生物可转座元件在大肠杆菌和革兰氏阴性细菌中研究得最多，但在革兰氏阳性细菌中也存在。它们如果长度小于约2kbp，通常称为插入序列，如果更长则称为转座子。通过转座进行复制的噬菌体如mu和D108构成了可转座元件的第三种类型。每种类型的元件都编码至少一个多肽即它们自身转座所必需的转座酶。转座子往往还包括编码与转座无关的功能的基因，例如抗生素抗性基因。
转座子可按其结构分成两类。第一类即混合或复合转座子在每个末端具有插入序列的拷贝，通常处于反向方向。这些转座子需要它们末端IS元件之一所编码的转座酶。第二类转座子具有约30个碱基对的末端重复序列，不含有来自IS元件的序列。
转座通常要么是保守型转座，要么是复制型转座，不过在一些情况中可同时为这两种转座。在复制型转座中，一个拷贝的转座元件保留在供体位点，另一个拷贝则插入在靶标位点。在保守型转座中，转座元件从一个位点切除并在另一个位点插入。
通过RNA中间体进行转座的元件往往称为反转录转座子，它们最典型的特征是它们编码据认为具有反转录酶活性的多肽。有两种类型的反转录转座子。一些反转录转座子与反转录病毒的被整合前病毒DNA(integrated proviral DNA)相似之处在于，它们在每个末端具有长的同向重复序列即长末端重复序列(LTRs)。这些反转录转座子与原病毒之间的相似性延伸到它们的编码能力。它们含有与反转录病毒的gag基因和pol基因相关的序列，这提示它们是通过与反转录病毒生活周期有关的机制进行转座。第二种类型的反转录转座子不含末端重复序列。它们也编码gag样多肽和pol样多肽，和通过RNA中间体的反转录进行转座，但通过与反转录病毒样元件的机制不同的机制进行转座。通过反转录进行的转座是一个复制过程，不需要将元件从供体位点切除。
可转座元件是自发突变的重要来源，已影响了基因和基因组进化的方式。它们可通过插入在基因当中来使基因失活，且可通过它们的转座酶活性直接造成整个染色体重排(gross chromosomal rearrangement)，或者因为分散在基因组周围的某元件各拷贝之间的重组间接造成整个染色体重排。会发生切除的可转座元件往往不严密地发生切除，且如果所添加或删除的碱基数是三的倍数的话，可产生出编码发生了改变的基因产物的等位基因。
可转座元件本身可通过不寻常的方式进化。如果它们象其他DNA序列一样进行遗传，则某元件在一个物种中的各拷贝与紧密相关物种中的各拷贝的相似程度，大于与较远缘物种中的各拷贝的相似程度。但情况并非总是如此，这提示可转座元件偶而从一个物种横向传输到另一个物种。
ii.化学诱变
化学诱变能提供某些优点，例如能够找到具有不同程度的表型严格性(phenotypic severity)的一整套突变等位基因，且执行起来容易和费用低。大部分的化学致癌物都能在DNA中产生突变。苯并[α]芘、N-乙酰氧基-2-乙酰氨基芴和黄曲霉毒素B1会在细菌细胞和哺乳动物细胞中造成GC向TA的颠换。苯并[α]芘还会产生碱基置换，如AT置换成TA。N-亚硝基化合物会引起GC向AT的转换。因暴露于n-亚硝基脲所引起的胸腺嘧啶的O4位置的烷基化，会导致TA向CG的转换。
诱变性和致癌性之间的高相关性是Ames试验的基础性假设(McCann等人，1975)，Ames试验结合所加入的大鼠肝脏均浆能快速测定细菌系统中的突变株，该大鼠肝脏均浆含有微粒体细胞色素P450，以在需要的情况下提供诱变剂的代谢激活。
在脊椎动物中，已发现有几种致癌物能在ras原癌基因中产生突变。N-亚硝基-N-甲脲会在大鼠中引发乳腺癌、前列腺癌和其他的癌，其中大多数的肿瘤在Ha-ras癌基因的密码子12的第二个位置处显示G向A的转换。苯并[α]芘引发的皮肤肿瘤在Ha-ras基因的第二个密码子中含有A向T的转化。
iii.放射诱变
生物分子的完整性会被电离辐射所降解。入射能的吸附(adsorption)会导致离子和自由基的形成和一些共价键的断裂。对辐射损害的易感性似乎随不同的分子和同一分子的不同晶型而大为不同。它取决于总积累剂量，还取决于剂量速率(dose rate)(因为一旦自由基存在，它们所引起的分子损害取决于它们的自然扩散速率，因此取决于实际时间)。通过使样品尽可能冷冻，损害可得到降低和控制。
电离辐射会造成DNA损害和细胞杀灭，这通常与剂量速率成比例。已提出电离辐射是通过与DNA直接相互作用或者通过形成自由基物质导致DNA损害，来引发多种生物效应(Hall，1988)。这些效应包括基因突变、恶性转化和细胞杀灭。尽管已证明电离辐射会在一些原核生物细胞和低等真核生物细胞中引发某些DNA修复基因的表达，但对于电离辐射对哺乳动物基因表达的调节的作用却知之甚少(Borek，1985)。有几个研究描述了哺乳动物细胞受辐射后所观察到的蛋白质合成模式的变化。例如，人恶性黑素瘤细胞的电离辐射处理与几种未鉴定的蛋白质的诱导有关(Boothman等人，1989)。细胞周期蛋白和共调节多肽的合成在大鼠REF52细胞中受到电离辐射的抑制，但在癌基因转化的REF52细胞系中却没有受到抑制(Lambert和Borek，1988)。其他的研究已证明，某些生长因子或细胞因子可能参与X射线引发的DNA损害。在这点上，在辐射后血小板衍生生长因子从内皮细胞中释放出来(Witte，等人，1989)。
“电离辐射”包括包含颗粒或光子的辐射，所述颗粒或光子具有足够的能量或者能通过核相互作用产生足够的能量来产生电离(电子的获得或失去)。示例性的和优选的电离辐射是X射线辐射。给定细胞中所需的电离辐射的量通常取决于该细胞的性质。通常，有效的表达诱导剂量小于造成细胞损害或直接造成死亡的电离辐射的剂量。测定有效辐射量的方法是本领域公知的。
iv.体外扫描诱变
还可使用易错PCR引入随机诱变(Cadwell和Joyce，1992)。可通过用模板的多个稀释物在多个管子中进行PCR，提高诱变的速度。
一个特别有用的诱变技术是丙氨酸扫描诱变，其中用丙氨酸这个氨基酸对多个残基逐个进行置换，使得可确定出失去侧链相互作用所产生的效应，同时还使得造成蛋白质构象的大规模搅乱的风险减至最低(Cunningham等人，1989)。
在最近几年，已开发出用极少量的蛋白质估计配体结合的平衡常数的技术(Blackburn等人，1991；美国专利5,221,605和5,238,808)。这一用少量材料就能进行功能试验的能力，可被利用来开发进行抗体的饱和诱变的高效体外方法。由于用这个方式能高效率地产生所有19个氨基酸置换并加以分析，现在有可能在多个目的残基上进行饱和诱变，这个方法可称为体外扫描饱和诱变(Burks等人，1997)。
体外扫描饱和诱变提供了获得大量的结构-功能信息的快速方法，包括：(i)鉴定能调节配体结合特异性的残基，(ii)基于对那些在给定位置保持活性的氨基酸和那些在给定位置废除活性的氨基酸的鉴定，更好地理解配体结合，(iii)评估活性位点或蛋白质亚结构域的总体可塑性，(iv)鉴定到导致结合增加的氨基酸置换。
v.通过片段化和重装配进行随机诱变
在美国专利5,380,721中描述了产生被展示多肽的文库的方法。该方法包括获得多核苷酸文库成员，将各多核苷酸集合并进行片段化，从中重新组成(reform)片段，进行PCR扩增，从而将各片段进行同源重组，形成出经洗牌的一批(a shuffled pool of)重组多核苷酸。
D.监测代谢流
代谢流即材料被加工通过代谢途径的速率，是细胞代谢的基本度量。对通向例如脂肪酸生物合成途径的代谢流与通向柠檬酸循环的代谢流进行比较测量，有助于确定具体途径的相对重要性，并提供对于生物反应网络分析和代谢工程来说必需的关键定量数据(Fernie等人，2005；Klapa等人，2003；Sauer，2004)。
碳水化合物代谢是生物生理的关键所在，因为碳水化合物能给包括脂肪酸生物合成途径在内的大多数其他途径提供前体代谢物，并且是主要的能源(White，2000)。诸如集胞藻PCC 6803的蓝细菌具有特别复杂的中央代谢途径，因为它们具有通过糖酵解途径和戊糖磷酸途径进行葡萄糖降解的基因(Nakamura等人，1998)，并通过具有许多与戊糖磷酸途径共同的步骤的Calvin-Benson-Bassham循环进行CO2固定。
通过跟踪稳定的最终产物中的同位素分布，已确定了集胞藻PCC 6803的异养培养物(黑暗，5mM葡萄糖)和光能混合营养培养物(光照，5mM葡萄糖)中流通中央碳水化合物代谢途径的总代谢流(Yang等人，2002a；Yang等人，2002b；Yang等人，2002c)。加入稳定同位素标记的底物，从氨基酸的标记谱图推导出胞内代谢物库(metabolite pool)的最终同位素富集情况，氨基酸的标记谱图可通过质谱(MS)或核磁共振(NMR)光谱进行检测。所得的数据提供了大量的用来计算胞内代谢流的信息。虽然这个分析能使得可以对许多速率同时进行估计，但这种分析具有几个缺点：(i)它是在稳态培养物上使用，没有获得动态通量率(flux rate)；(ii)分析要求所有的被分析物和途径/反应是确切知道的；和(iii)数据处理繁杂，要求作出一些不可能在所有实验调价下都有效的假设。这可导致产生假象，特别是如果对错综复杂的途径进行模拟的话(van Winden等人，2005)。
鉴于这些潜在的缺点，期望有简单和客观方法来分析中央碳水化合物代谢的各部分。因此，本发明人开发出了一个方法，在该方法中能更直接地随时间推移对各个反应进行检测。胞内中央代谢的代谢物如糖磷酸可用多种技术进行监测，例如酶学测定、HPLC(Bhattacharya等人，1995；Groussac等人，2000)、CE/MS(Soga等人，2002)、GC/MS(Fiehn等人，2000；；Roessner等人，2000)和LC/MS(Buchholz等人，2001；Buchholz等人，2002；Mashego等人，2004；van Dam等人，2002)。Buchholz等人，(2001)开发出了用LC-ESI-MS对大肠杆菌K12中的糖酵解中间体的胞内浓度进行定量的方法。通过这个方法，有可能以小的样品体积平行鉴定和定量不同的糖磷酸。对于代谢流的分析，MS检测方法的最决定性的优点是它们使得能够进行13C跟踪，通过该跟踪可确定胞内代谢物的标记谱图。最近，van Winden等人(2005)通过LC/MS直接测量了大肠杆菌培养物的未经标记的和经13C标记的中央代谢中间体。
本发明人使用LC/MS方法和13C跟踪方法的组合，来直接测量经13C标记的代谢中间体随时间的富集情况。这个方法使得本发明人能够获得有关代谢流网络和代谢流动态学的详细信息，因为它使得可以对不同生长条件下各种糖磷酸之间的相互转化速度进行深入分析。
D.期望的产物的回收
在一些情况下，需要回收所表达的期望产物。期望的产物一旦得到表达，可按照本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳、溶剂提取、分子筛等等(主要参见R.Scopes，(1982)ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher(1990)Methods in EnzymologyVol.182：Guide to Protein Purification.，Academic Press，Inc.N.Y.)。[00130]在某些方面，期望产物的回收的初始步骤可包括使细胞裂解或破碎。可以使用本领域技术人员知道的适当的裂解方法，这些方法包括热处理、超声处理、机械磨蚀、加压和突然降压、在加入的惰性介质帮助下进行的磨蚀和破碎、电穿孔以及碱或酸处理。细胞破碎后，可将细胞裂解物进行直接溶剂或超临界CO2提取以获得脂质基(lipid-based)产物(参见例如Serrano-Carreon等人，(2002)；Nobre等人，(2006)；Topal等人，(2006)，均通过引用并入本文)。或者，可通过两相分配系统分离期望的产物(参见例如Rito-Palomares(2004)；Cisneros等人，(2004)；Serrano-Carreon等人，(2002)，均通过引用并入本文)。
E.用以测定改变了的表达的测定法
可以理解的是，本发明的光能自养细菌通过使用本说明书中描述的方法会显示出改变了的期望产物水平。“改变了的(已被改变的)”或“经修饰的”包括相对于期望产物在细菌中的天然表达来说的不同水平的表达。目的基因可以在其序列或表达水平上是经修饰的，和/或可以是被缺失的和/或从外部来源被引入的。这可导致相应的期望基因产物(例如蛋白质或酶)的产生受到调节，和/或与这种基因产物有关的途径受到调节(例如增加或过量表达目的基因，以使相应的基因产物和/或与该基因产物有关的代谢途径各成分的获得量增加)。这种改变可通过多种方法进行评估，包括放射标记、荧光标记、染色、质谱、酶活性测量和/或蛋白质纯化。简单和直接的方法包括那些在SDS/PAGE和蛋白质染色或蛋白质印迹后进行定量分析的方法，所述定量分析例如对所得凝胶或印迹的光密度扫描。期望产物的水平与天然细菌中的水平相比出现明确的增加则表明是过量表达，过量表达是特定期望产物相对于细菌细胞所产生并例如在凝胶上可见的其他蛋白质的相对丰度。
F.光能自养细菌的生长/培养条件
通过生长本发明的光能自养细菌进行的期望产物的大规模生产，可通过分批培养方法或连续培养方法来进行。典型的分批培养方法是这样的密闭系统，其中培养基的组成在培养开始时设定好，在培养过程中不进行人工改变。因此，在培养过程的开始时，用期望的(一种或多种)生物接种培养基，然后让生长或代谢活性进行，而不向系统加入什么东西。但是通常来说，“分批”培养是就碳源的添加而言是分批的，往往试图对诸如pH和氧浓度的因素进行控制。在分批系统中，系统的代谢物组成和生物质组成持续变化，直到培养时间结束为止。在分批培养当中，细胞缓慢通过(moderate through)静止延迟期进入高生长对数期，最后进入生长速度减少或停止的稳定期。稳定期的细胞如果不经处理会最终死亡。一些系统中，往往是对数期的细胞导致最终产物或中间体的大量产生。在其他系统中则可在稳定期或对数期后期获得所述产生。标准分批系统的一个改进是补料分批系统，该系统包括典型的分批系统，例外是底物随着培养的进行递增地加入。当分解代谢物阻遏易于抑制细胞的代谢时，和在需要在培养基中具有有限数量的底物的情况中，补料分批系统是有用的。分批培养方法和补料分批培养方法是普通的和本领域公知的，它们的实例可在以下文献中找到：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.，或者Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，这些文献通过引用并入本文。
或者使用连续培养，这是一个开放系统，其中向生物反应器连续加入确定成分培养基，同时移取等量的经调理的培养基(conditioned medium)进行加工。连续培养通常将细胞维持在恒定的高液相密度，其中细胞主要处在对数生长期。或者，可用固定化细胞来实施连续培养，其中连续加入碳和营养物，并将有价值的产物、副产物或废产物连续从细胞团(cell mass)中移取出来。细胞固定化可用多种由天然和/或合成材料构成的固相载体来进行。
G.光能自养细菌的生长和加工系统
在本发明的某些方面，光能自养细菌可在大规模生产系统中生长。一种这样的系统描述于Willem F.J.Vermaas和Bruce E.Rittmann的、在2006年10月20日当天或当天前后提交的、题为《生长细胞的系统和方法》的60/862,366号美国临时专利申请，及Willem FJ.Vermaas和Bruce E.Rittmann的、在2007年10月20日当天或当天前后提交的、题为《生长光合作用细胞的系统和方法》的_____号PCT申请，这两个专利申请通过引用并入本文。
H.期望的产物的加工
在某些方面，期望的产物(例如脂质、类胡萝卜素、碳水化合物或藻青素)可如下来获得：(i)获得其中一个或多个目的基因的表达的水平已被改变的经修饰光能自养细菌，其中所述一个或多个基因的改变了的表达能增加所述一种或多种期望产物的产量，所述增加是相对于其中所述一个或多个基因的表达的水平不被改变的光能自养细菌所产物的所述一种或多种期望产物的量而言；(ii)在合适的条件下生长该光能自养细菌以产生期望的产物；和(iii)分离该期望的产物。分离出的该产物可进一步加工成几种不同的产品。非限制性实例包括生物燃料、生物塑料、动物饲料添加剂和有机肥料。
在生物燃料方面，通过本发明方法产生的脂质和碳水化合物可进一步加工成生物柴油和生物气。生物柴油是一种使用方式类似于石油基柴油燃料的液体燃料来源。生物柴油可通过用短链醇如甲醇或乙醇在称为酯交换的步骤中替代甘油来合成生产。酯交换过程通常涉及在室温下将甲醇(50％过量)与NaOH(100％过量)混合，然后与脂质/油剧烈混合和让甘油沉淀(约占生物柴油混合物的15％)。上清液是生物柴油，含有甲基化脂肪酸和甲醇的混合物，NaOH催化剂保持溶解在甘油部分。在工业上，可将酯送到清理(clean-up)或纯化工艺，该工艺由水洗、真空干燥和过滤组成。酯交换可用甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇来进行。催化剂可以是氢氧化钠或氢氧化钾。已证明甲醇/油摩尔比会在很大程度上影响反应的效率，对于甲酯设备(methyl ester plants)的最佳大小具有重要的关系。另选的方法包括超临界流体甲醇方法或者使用超声波反应器和本领域普通技术人员知道的其他方法(参见例如Aresta(2005)；Saka等人，(2006)，通过引用并入本文)。
生物气可通过本领域技术人员知道的方法用通过本发明方法获得的碳水化合物来制备。例如，这种方法和方案的非限制性实例在Gong等人，(1999)中有说明。仅以举例方式来说，采用葡萄糖氧化来形成还原当量(reducing equivalent)，后者可用来在蓝细菌中通过氢化酶将质子还原成氢(Nandi等人，(1998)，通过引用并入本文)。另一个非限制性实例包括光生物氢生产(photobiohydrogen production)(Prince等人，(2005)，通过引用并入本文)。
生物塑料可通过本领域技术人员知道的方法用通过本发明方法获得的碳水化合物来制备。例如，蓝细菌(PHB)在转移到还原条件时其中的PHA水平增加7倍，加入葡萄糖会导致进一步的增加。有关生物塑料生产的非限制性实例在Taroncher等人，(2000)中有描述。另外，尽管蓝细菌天然不会产生聚乳酸，但可用遵循为大肠杆菌开发的原理的正确的酶对它们进行修饰以产生聚乳酸(Zhou等人，(2005)，通过引用并入本文)。另外可只将本发明的光能自养细菌用来固定被供应给它的二氧化碳而不是为了加工期望的产物，或者除了加工期望的产物外，本发明的光能自养细菌还可用来固定被供应给它的二氧化碳。这例如在从二氧化碳来源减少或除去二氧化碳(例如减少烟道气中的二氧化碳的量)方面是有利的。非限制性的可用来执行这一点的系统描述于Willem F.J.Vermaas和Bruce E.Rittmann的、在2006年10月20日当天或当天前后提交的、题为《生长细胞的系统和方法》的60/862,366号美国临时专利申请，及Willem FJ.Vermaas和Bruce E.Rittmann的、在2007年10月20日当天或当天前后提交的、题为《生长光合作用细胞的系统和方法》的号PCT申请，这两个专利申请通过引用并入本文。
实施例
纳入以下实施例是为了说明本发明的某些非限制的方面。本领域技术人员应认识到，以下实施例中公开的技术代表着本发明人发现的能在本发明的实施中很好地发挥作用的技术。但是，本领域技术人员根据本公开内容会认识到，可不背离本发明的精神和范围，对所公开的具体实施方案作出许多修改方案，而这些修改方案仍能获得相同或类似的结果。
实施例1
用以增加脂质含量的经修饰集胞藻PCC 6803蓝细菌
集胞藻PCC 6803这一蓝细菌被修饰成能过量表达VIPP1基因sll0617。为实现vippl基因(sll0617)的高表达水平，将它克隆置于集胞藻psbA3基因(sll1867)的组成型天然启动子之下。将vippl基因克隆在pA31hcgA3质粒的壮观霉素类似物中的天然psbA3基因的上游(287bp)和下游(394bp)区域之间(He等人，1999)；所得的质粒命名为Highvippl，在图14中示出。vippl(sll0617)基因的序列获自CyanoBase，构建了两个引物来扩增集胞藻基因组的对应于804bp的vippl基因、vippl基因起始密码子上游的15bp和vippl基因终止密码子下游的18bp的837bp片段。引物的序列为5′-GAG GATAAG TAA GtC ATG aGA TTA TTT GAC和5′-CTG GCT GAG TTA AtgCAt TTA CAG ATT ATT TAA CC。小写字母表示为分别给第一引物和第二引物导入BspHI和NsiI的单一限制位点所作的核苷酸碱基修饰。将扩增的vippl片段和pA31hcgA3的壮观霉素抗性盒(cassette)分别用(BspHI，NsiI)和(NcoI，PstI)进行消化。连接后，通过电穿孔进行大肠杆菌转化，转化后将细胞在室温下进行涂平板；只有当在电穿孔之后的所有步骤中将细胞在室温下(而不是37℃)进行温育时，才能成功获得经质粒测序表明具有全长vippl基因的大肠杆菌转化子。
集胞藻PCC 6803的转化
按照(Vermaas等人，1987)，用Highvippl质粒(图14)转化集胞藻。通过壮观霉素抗性选择出携带嵌合vippl基因的集胞藻转化子，在之后再对转化子进行划线时，采用增加壮观霉素浓度来获得单菌落的完全分离。为验证全长vippl基因在集胞藻基因组的期望位点处的基因组整合，用聚合酶链反应来扩增psbA3基因的末端上游序列和T1T2终止子序列的开端之间的片段。上游psbA3基因的末端序列为5′-GAC AAA TAC ATA AGG AATTAT AAC c，定位到(map to)T1T2终止子序列的开端的引物的序列为5′-GCC AAA ACA GCC AAG CTT GGC。第一引物用来进行正向DNA测序，后一引物用来进行扩增的嵌合vippl基因的反向DNA测序。
如下文所说明和如表1和图8所示，这个基因的过量表达使集胞藻PCC 6803蓝细菌中的脂质含量增加到占干重的几乎50％。sll0617基因被置于psbA3启动子之下。集胞藻细胞是在50微摩尔光子m-2s-1下30℃生长。脂质提取是通过标准方法来进行(参见例如Tasaka等人，1996)。
表1倍增时间(h)和脂质占干重的％，淡水，非胁迫条件。藻株为野生型，除非另有指明
生物   倍增时间(h)  脂质(干重的％)   测定方法   备注   参考文献
蓝细菌
“(组囊藻)Anacystisnidulans”(聚球藻属)   14   7   从脂肪酸测定1)   [1]
集胞藻PCC 6803   12   20   重量分析法2)   [2]
集胞藻PCC 6803，Sll0617过量表达株   13   47   重量分析法2)   [2]
绿藻
纤维藻(Ankistrodesmus sp.)   24   25   重量分析法2)   +0.1MNaCl   [3]
布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)   72   45   重量分析法2)   [3]
微绿球藻(Nannochloris sp.)   20   21   重量分析法2)   +0.1MNaCl   [3]
1)因为过程中的损失，很可能被低估
2)因为共分离的杂质，很可能被高估
[1]Sato等人，BBA 572(1979)19-28
[2]Vermaas实验室，未发表
[3]Ben-Amotz等人，J.Phycol.21(1985)72-81
实施例2
通过集胞藻PCC 6803的中央碳水化合物代谢途径对代谢流进行动态分析，
和通过accABCD过量表达进行脂肪酸生物合成的增强
1.材料和方法
化学物质。用作标准物的化学物质(葡萄糖-6-磷酸(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)、果糖-1，6-二磷酸(FBP)、甘油醛-3-磷酸(GAP)、磷酸二羟丙酮(DHAP)、3-磷酸甘油酸(3PG)、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、6-磷酸葡萄糖酸(6PG)、核糖-5-磷酸(R5P)、核酮糖-5-磷酸(Ru5P)、核酮糖-1，5-二磷酸(RuBP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P))购自(St.Louis，MO)。均匀地进行13C-标记的D-葡萄糖(U-13C6-D-葡萄糖)获自Cambridge Isotope Laboratories，Inc.(Andover，MA)。所有的溶液都使用Milli-Q级别的水(Millipore，Van Nuys，CA)。
生长条件和13C-葡萄糖标记。将集胞藻PCC6803株野生型和缺乏磷酸果糖激酶和/或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的突变株在用5mM TES[N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]-NaOH(pH 8.0)缓冲的BG-11中，在空气中30℃进行培养。对于光能混合营养生长和光能异养生长，生长培养基补加5mM葡萄糖。对于光能异养生长，向培养基加入25μM的除草剂阿特拉津，该除草剂阻断通过PS II的电子传递。将培养物用强度为50μmol光子m-2s-1的白光进行照射，在120rpm的搅拌速度下进行摇动。通过用ShimadzuUV-160分光光度计在730nm处测量光密度，监测培养物的生长情况。
为进行13C标记，将处于对数生长期后期的细胞(OD730＝1.0)在补加1mM葡萄糖的BG-11培养基中稀释40倍。当细胞密度达到OD730＝0.5时，向培养物加入0.5mM 13C葡萄糖或5mM13C NaHCO3(标记的碳酸氢盐与0.5mM未标记的葡萄糖一起加入)，将培养物在通常的生长条件下继续进行温育。在时间0时加入标记的葡萄糖或碳酸氢盐后的不同时间，采集样品。
样品制备。在加入标记后的各确定时间，从标记的集胞藻PCC 6803(OD730＝0.5)培养物移取100ml等分试样。培养物等分试样是通过滤过玻璃微纤维滤器(FG/B，Whatman)进行快速收集，并用35ml水洗涤除去残余培养基。将带细胞的滤器立即投入20ml冷(-40℃)甲醇中，并在这些条件下温育30分钟以猝灭反应。然后将甲醇/滤器/细胞混合物在70℃下温育6分钟，进行代谢物提取。弃去滤器后，将甲醇在N2下4℃蒸发。最后，将剩余的粉末溶于0.25ml水中。在Optima TLX 120超离心机(Beckman)中280,000g(80,000rpm)下进行超离心1小时后，将澄清的上清液转移到新的管子并在-70℃下保藏。
HPLC分离。用多孔石墨碳Hypercarb柱(100×2.1mm，5mm，Thermo-Electronic，Bellefonte，PA)进行HPLC。另外，应用Hypercarb保护柱(10×2.1mm)来保护主柱。使用Beckman HPLC系统，施加流速为0.125mlmin-1的二元梯度。注射体积为50μl。溶剂A为12mM乙酸铵水溶液，溶剂B为水。施加来进行分离的梯度是在最初20分钟溶剂B从60％线性增加到100％。保持这个100％水平5分钟，然后在接着的2分钟内再降低到60％B。保持这个60％水平10分钟，以使柱子再平衡。
用柱后T型分流器以0.125ml min-1的流速泵送甲醇与HPLC洗脱液汇合，然后将该混合物通过ESI界面引导到质谱仪中。
质谱分析。质谱(MS)分析是用ABI 365三重四极杆质谱仪(AppliedBiosystems/MDS Sciex)来进行。氮气既用作鞘气(sheath gas)也用作碰撞气(collision gas)。数据采集和分析是用Analyst软件(Applied Biosystems/MDSSciex)进行。
质谱实验的最佳参数是通过用注射泵以10μl min-1的速度直接注射不同的标准物以全扫描模式进行测定。将用G6P(5μM G6P的甲醇∶12mM乙酸铵(50∶50％，v/v)溶液)进行调整(tuning)获得的调整参数(tune parameter)，进行MS和MS/MS检测。应用以下ESI参数：加热的毛细管的温度：300℃；电喷雾毛细管电压：4.2kV；帘气(curtain gas)：8psi；聚焦电压：100V。所有其他参数通过自动调整进行确定。
使用Q1多重离子模式(Q1 Multiple Ion mode)来定量中间体和它们的同位素体的浓度。使用MS/MS模式来鉴定或确认化学物质的身份。
代谢物的鉴定和定量。样品中的代谢物按它们的保留时间、m/z、特异性片段化模式进行鉴定，且如果需要的话通过给提取物掺入浓度为10-50μM的代谢物标准物进行鉴定。13C-标记实验进一步证实了代谢物的鉴定。代谢物的定量是应用标准的加入方法通过[M-H]-离子来完成(Skoog和Leary，1992)。制备了仅含有一种已知浓度的被分析物的标准溶液。通过给细胞提取物掺入递增数量的这一标准溶液，获得了峰面积对浓度的线性回归曲线。
13C分布分析。在加入13C标记后0、0.33、1.5、5、20和60分钟，收集13C-标记的从光能混合营养培养物和光能异养培养物收集的样品。细胞提取物通过HPLC进行分离并通过MS以MIM模式进行测量，该模式能同时跟踪各种中间体的不同质量同位素体。从不同质量同位素体的峰面积计算它们的含量和分布。
2.结果
通过LC/MS分离和鉴定代谢中间体。
通过HPLC分离代谢中间体，这不仅对于MS检测灵敏度的改进是必需的，而且对于中间体的鉴定和定量也是必需的。Hypercarb HPLC柱适合分离其保留时间范围宽的各种糖磷酸和相关化合物(图1A)。结合MS的质量分离，碳水化合物代谢中间体的所有可供利用的(available)相关标准物都明确地得到分离，20M溶液容易地得到检测。一些标准物如S7P和SBP并非可市售获得，尽管这些化合物根据它们的质量可在细胞提取物中得到鉴定(图1B)。
如图1A所示，不同标准物的保留时间在5-25分钟之间。即使一些标准物如R5P(质量229，第一个峰)和G6P(质量259，第一个峰)在LC上互相重叠，它们因为质量的不同可通过MS来区分。相反，质量169(GAP，峰1(洗脱时间最短)；DHAP，峰2(洗脱时间较长))、229(R5P，峰1；Ru5P，峰2)和259(G6P，峰1；F6P，峰2)的异构体被LC分离，但不被MS分离。LC和/或MS对各化合物之间的明确分离使得能够定量这些中央代谢中间体。
既然已证实各标准物通过这个方法在M浓度下可检测到，因此对集胞藻提取物进行分析。为使MS灵敏度最大化，应尽可能将颗粒物从样品中除去，使得离子抑制减至最低。为此，在进行LC/MS分析前将样品在超离心机中以80,000rpm(280,000g)进行离心。如所预期，当通过LC/MS以扫描模式分析细胞提取物时，发现许多对应于细胞中大量的不同代谢物的峰(数据未显示)。在这里，本发明人完全关注于中央碳水化合物代谢中间体。图1B显示以MIM MS模式测量的糖磷酸，其中只监测选定的m/z值。鉴定出的峰包括对应于质量167(PEP)、185(2PG，峰1；3PG，峰2)、229(R5P，峰1；Ru5P，峰2)、259(G6P，峰1；F6P，峰2)、289(S7P)、309(RuBP)和369(SBP)的峰；“峰1”是相对于峰2而言洗脱时间较短的峰。当扫描m/z 169、199、275和339时没有峰被发现(图1B)，尽管标准物给出大的信号(图1A)。这一点连同标准物在提取程序的过程中没有显著降解的这个观察结果(数据未显示)，表明GAP(质量167)、DHAP(质量167)、E4P(质量199)、6PG(质量275)和FBP(质量339)没有在细胞中积累。
给各样品掺入20μM标准物(未显示)，以便定量各峰和检查各化合物是否得到正确鉴定。此外，还使用MS/MS模式来验证各化合物的正确确定。后一点的一个实例在图2中提供，其中各峰是通过在第二MS中对第一MS中质量为259(G6P和F6P的离子的质量)的各分子的典型磷酸片段(97m/z)进行选择性监测来获得。在这个模式中，259m/z的离子通过第一四极(quadrupole)并在碰撞室(collision cell)中被打碎；只有97m/z片段被选择通过第二四极并被检测器计数。图2中显示的结果证实图1中的两个259m/z峰的确含有磷酸基团。其他的糖磷酸峰也被证实在MS/MS中产生磷酸片段。
细胞提取物中的同位素体测量和定量在被鉴定的糖磷酸当中，尤其是G6P、F6P、PEP、3PG、2PG和S7P在对集胞藻提取物进行LC/MS时一贯地产生显著和可再现的MS峰，它们被用来在用13C-D-葡萄糖或碳酸氢盐标记细胞后进行同位素体分布分析。作为同位素体随时间推移的标记情况的一个实例，图3显示了在从光能混合营养生长的细胞制备的集胞藻提取物中，在13C-葡萄糖标记开始后的不同时间时3PG标记的动力学。在13C-葡萄糖标记开始时(t＝0)，大部分的3PG分子含有三个12C碳(质量185)。该质量+1同位素在t＝0时的丰度为约3.6％，这与13C的天然丰度一致，而质量187或188的3PG分子(携带两个或三个标记的碳)的丰度非常小。在13C-葡萄糖的存在下生长20秒后，标记的3PG开始出现，而在1.5min时，可见明显的188(三个标记的碳)3PG峰。这之后，具有两个13C原子的3PG分子开始增加和变成主要的标记同位素体。加入标记葡萄糖一小时后，3PG的同位素体分布图谱包括大量的所有同位素体并显然达到了稳定状态；温育更长时间各峰的大小和比例也没有显著变化(未显示)。
在理论上，信号的LC/MS峰面积应与该化合物的浓度成线性关系。为验证集胞藻细胞提取物中的中央代谢中间体的我们的检测范围的线性，在向细胞提取物加入已知浓度的标准物后，测定G6P、3PG和PEP的MS信号的峰面积。G6P、3PG和PEP在原始提取物中的浓度从这些曲线(图4)获得，对应于横坐标的负值。虽然S7P浓度因为没有标准物不能以这种方式计算出来，但它的峰面积与所荷载的细胞提取物的体积线性相关。
G6P和F6P的比例和标记谱图及3PG和2PG的比例和标记谱图在这里研究的所有实验条件下是相似的，这提示这些异构体之间的交换速度非常高。为简化数据采集和处理，将G6P和F6P并入同一组即G6P+F6P，3PG和2PG并入同一组即3PG+2PG。
集胞藻中13C-标记谱图的动力学本发明人比较了集胞藻提取物中G6P+F6P、3PG+2PG、PEP和S7P同位素体的分布随细胞生长模式(光能混合营养生长对光能异养生长)的变化和随加入13C后的时间的变化，以了解这个蓝细菌中的中央代谢流。即使当细胞在相同生长模式下(光能混合营养生长或光能异养生长)生长时被测量的各中间体的同位素体分布是完全可再现的，从细胞提取到的这些化合物的总浓度在各实验间有显著变化(表2)。用以下参数和假设，将提取物中的被测量浓度回算到细胞中的内部浓度：(1)若用Shimadzu UV-160分光光度计监测，对数生长期的集胞藻培养物具有1011个细胞/OD730/升；(2)细胞的平均直径为2μm；(3)代谢物提取效率为100％；对加到冷的细胞/甲醇混合物与加到用于MS的最终提取物的可供利用标准物进行定量比较表明，提取过程没有造成任何显著的定量损失(数据未显示)。目前不清楚是什么原因造成细胞中代谢物浓度的波动；不能完全进行控制和估计的参数是化合物在冷甲醇中从细胞提取的效率。
表2.集胞藻PCC 6803在光能混合营养生长条件和光能异养生长条件下的胞内代谢中间体浓度。
Figure G2007800461487D00471
a数据代表三个独立实验的平均值。胞内浓度是在假设提取效率为100％、球形细胞平均半径为的1m的前提下计算。
b提供S7P和SBP的相对浓度而不是绝对浓度，因为没有纯的标准物。
cUD：不可检测。
在任何情况中，G6P+F6P、3PG+2PG、PEP和R5P各自在光能混合营养生长模式和光能异养生长模式这两种模式下的浓度相差两倍以内。而RuBP和SBP这两种Calvin-Benson-Bassham循环特有的化合物在光能异养生长条件下不可检测，但在光能混合营养生长条件下存在。S7P水平在光能异养生长条件下增加约两倍。
用13C-葡萄糖标记光能混合营养生长的培养物图5中示出了得自光能混合营养生长的培养物的提取物中的同位素体分布随加入13C-葡萄糖后的时间的关系。产生图5的实际数据在表3中列出。在光能混合营养生长的培养物中，在加入13C-葡萄糖20秒后，标记的G6P+F6P就占总G6P+F6P库(pool)的约40％，这表明葡萄糖在集胞藻中的吸收和转化非常快速。不足为奇的是，在这个时间点，完全标记的G6P+F6P是最丰富的同位素体(265m/z)。但是，在G6P+F6P库中质量比未标记质量多1、2、3或4的分子的快速出现是明显的(它们各自在标记20秒后占总库的约6％)。质量+2、+3和+4的峰的快速出现表明碳原子通过容易地可逆的转醛醇酶和转酮醇酶反应而非常快速地重新分配。具有一个13C原子的G6P+F6P分子的快速形成，可由部分标记的G6P+F6P(例如1，2-13C2或3，4，5，6-13C4G6P+F6P)通过反应10和11发生脱羧，然后通过反应12和16再形成G6P+F6P而导致，或者由部分标记的G6P+F6P(例如3，4，5，6-13C4G6P+F6P)通过反应3和4发生分裂，然后与未标记的二羟基丙酮3-磷酸或甘油醛3-磷酸分子重组而导致。进行标记20分钟后，对应于未标记的G6P+F6P的峰减少到占全体约15％，这表明在有加入的葡萄糖可供利用的情况下，细胞中没有大批(a major buffer or reservoirof)未标记糖聚合物被转化成单体。
表3.光能混合营养生长的集胞藻PCC 6803中在13C-葡萄糖标记后己糖-6-磷酸(G6P+F6P)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的动态同位素体分布a
Figure G2007800461487D00491
a数据是三个独立实验的平均值。
bID，同位素体分布：同位素体相对于化合物总量的百分数。SD，标准偏差。
3PG+2PG和PEP的13C分布图谱相似，但这些化合物的标记进行得比G6P和F6P慢得多。20秒后，3PG+2PG和PEP几乎没有得到标记(图5)，这些C3中间体中的一半携带上至少一个标记碳花掉了约5分钟时间。在1.5分钟时，3PG+2PG和PEP的主要标记峰是源自完全标记的G6P+F6P的其中所有三个碳都被标记的峰。5分钟时及以后，3PG+2PG和PEP的主要标记峰含有两个标记碳。3PG+2PG和PEP的标记谱图在后面的时间点没有很大变化，在加入标记后约20分钟时为止13C-标记的同位素体分布已达到稳定状态。每分子具有两个13C的3PG+2PG库占优势，这提示在光能混合营养条件下，相当部分的3PG是通过Calvin-Benson-Bassham循环来合成，每两个合成的3PG掺入一个未标记的CO2，而另外的部分标记的3PG源自转醛醇酶和转酮醇酶反应中的同位素混杂(isotope scrambling)。
在光能混合营养条件下，S7P库快速地和部分地被标记，更类似G6P+F6P标记谱图，而不是3PG+2PG或PEP的标记谱图。用13C-葡萄糖标记20秒后，对应于未标记的S7P的峰已减少到50％以下，因此在这个时间点有一半以上的S7P分子含有一个或多个13C碳。在20秒时间点时标记的与未标记的S7P分子的比例甚至比G6P+F6P的还高。这表明转酮醇酶/转醛醇酶反应的速度非常高，因为这些反应将F6P的标记直接或间接地转移到S7P和其他化合物。在这些标记的S7P同位素体当中，在标记开始后20秒时最丰富的一个含有两个13C碳。这种分子可通过完全标记的F6P与未标记的GAP反应形成具有两个标记碳的木酮糖-5-磷酸(X5P)，然后X5P与未标记的R5P反应产生具有两个13C的S7P和产生GAP来形成。完全标记的F6P和未标记的E4P直接转化成S7P和PGA会在S7P中产生三个13C，S7P在标记开始进行后不久丰度较低(图5)，这提示在我们的实验条件下，通过转酮醇酶反应进行的分子交换比通过转醛醇酶进行的分子交换更快速。更长的标记时间以后，所有的S7P同位素体以可观的数量(占总数的6-20％)存在，这表明标记在S7P中几乎完全混杂(scrambling)。在任何情况中，各糖磷酸之间的分子交换似乎比向磷酸甘油酸的转化要快得多，这提示甘油醛-3-磷酸和磷酸甘油酸之间的步骤进行得比较慢。
用NaH13CO3标记光能混合营养生长的培养物。图6显示了用5mMNaH13CO3标记光能混合营养生长的培养物的结果；培养物中还加入0.5mM未标记的葡萄糖。这些数据在表4中定量给出。由于光合作用的CO2固定导致3PG的形成，不足为奇的是，源自碳酸氢盐的13C最快速地被掺入到3PG+2PG和PEP库中：在标记开始进行后20秒，已可显示出明显可测量数量的具有一个标记13C的3PG+2PG和PEP，而在该时间标记G6P+F6P极少被检测到(图6)。五分钟后，3PG+2PG和PEP库中有一半以上的分子含有至少一个13C。具有一个以上的13C的3PG+2PG分子的形成是预期到的，因为一些3PG再次被用于Calvin-Benson-Bassham循环的反应中。在更长的标记时间后，3PG+2PG和PEP的标记谱图没有很大变化，这表明13C标记谱图已接近稳态，掺入的标记的量接近于通过Calvin-Benson-Bassham循环固定的碳的量，和源自(未标记的)葡萄糖的量。
表4.光能混合营养生长的集胞藻PCC 6803a中进行13C-NaHCO3标记后己糖-6-磷酸(G6P+F6P)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的动态同位素体分布。
Figure G2007800461487D00511
a数据是三个独立实验的平均值。
bID，同位素体分布：同位素体相对于化合物总量的百分数。SD，标准偏差。
具有单个13C的G6P+F6P(质量259)在标记开始进行后1.5分钟才开始出现，而双重标记的G6P+F6P在标记开始进行后5分钟大量存在。13C-标记的S7P出现得比3PG+2PG和PEP慢，但比G6P+F6P快。这与符合以下方面：S7P在Calvin-Benson-Bassham循环中(相对于CO2固定)晚于3PG，大部分的从CO2固定接受碳的F6P+G6P是经S7P和其他Calvin-Benson-Bassham循环中间体而形成，而不是经通过逆糖酵解发生的糖异生而形成。
即使在加入标记的碳酸氢盐后1小时，在标记的S7P分子当中，最丰富的同位素体只有单一13C，随着质量的增加，较重的同位素体的存在快速减少。这主要是有未标记的葡萄糖存在以及转酮醇酶和转醛醇酶催化的交换的速度高的结果，并支持这样的观点：在光能混合营养生长条件下，葡萄糖代谢和CO2固定两者都对碳代谢有显著贡献。
用13C-葡萄糖标记光能异养生长的培养物。当集胞藻在光能异养条件下生长时(即在PS II抑制剂阿特拉津及固定碳源如葡萄糖的存在下)，净CO2固定是可忽略的，因为即使在加入NaH13CO3后两小时，3PG+2PG库保持未被标记(数据未显示)。的确，如图7所示，光能异养生长条件至今为止是本研究中所研究的三个条件中用13C-葡萄糖快速标记所有中间体最为有效的一个条件。标记进行20秒后，G6P+F6P库有一半以上已经被标记，且与光能混合营养条件下的情况形成对比的是，完全标记的糖磷酸最为普遍。由于光能异养培养物中的G6P+F6P的库大小类似于光能混合营养生长的细胞的G6P+F6P的库大小(表2)，在光能异养条件下葡萄糖利用得比在光能混合营养条件下要快。在本研究监测到的所有时间，完全标记的G6P+F6P最为丰富，这表明与光能混合营养条件形成对比的是，在中央代谢中极少发生CO2固定或者其他化合物向糖磷酸的代谢。
如同在其他生长条件下观察到的那样，3PG+2PG和PEP具有类似的标记谱图。尽管最丰富的同位素体是完全标记的化合物，具有两个标记的C的同位素体相对于完全标记的同位素体来说也是丰富的，特别是在1.5-20分钟的标记时间范围。对3PG+2PG和PEP进行的标记发生得比对G6P+F6P进行的标记或对S7P进行的标记要慢，这进一步支持了对在光能混合营养条件下作出的观察结果的解释即，通过转醛醇酶和转酮醇酶反应容易发生相互交换，而与磷酸甘油酸的相互交换则慢得多。虽然完全标记的3PG、2PG或PEP可通过糖酵解途径或戊糖磷酸途径形成，但这些仅携带两个13C标记的分子的形成要求糖酵解途径或戊糖磷酸途径的酶类共同作出贡献。衍自戊糖磷酸途径反应的具有2-5个13C-标记碳的部分标记F6P，可通过糖酵解产生携带两个13C标记碳的3PG和2PG。
在光能异养条件下用13C-葡萄糖进行标记20秒后，标记的S7P分子特别是掺入了2、4或7个13C原子的那些S7P分子，其总数超过未标记的S7P分子。仅掺入一个13C的S7P分子基本上不存在。随着标记时间的增加，具6个13C原子的分子的库也增加，而具有较少13C原子的库通常随时间推移而减少，这反映出未被标记的中间体的库被损耗。在进行标记60分钟后，大部分的S7P完全被标记，一些具有1个未被标记的C。
图5-7所示的结果表明，同位素体分布模式取决于生长模式和所加入的同位素的种类。同位素体分布模式在每个条件下都十分可再现，这表明视具体的生长条件而定，集胞藻中流向中央糖磷酸途径的代谢流是确定的(well-defined)。因此，各中间体的测量浓度的变动(表2)很可能反映的是提取效率的变动，而不是在相同条件下生长的不同集胞藻培养物的代谢能力的大变动。
标记水平。为更直接地确定标记随时间推移掺入到中央代谢物中的量，对不同生长条件下随时间推移G6P+F6P、3PG+2PG、PEP和S7P中13C的量和总碳的量进行了计算对比。结果在表5中总结，证实了之前章节内容中作出的较为定性的观察结果，即G6P+F6P和S7P在光能混合营养条件和光能异养条件这两个条件下用13C-葡萄糖作为标记进行标记都比3PG+2PG和PEP要快，而当用碳酸氢盐进行标记时，标记出现在3PG+2PG和PEP中要比出现在G6P+S7P中快得多，因为三碳中间体更接近于初级CO2固定产物(3PG)。相似的标记比例大概暗示着快速的代谢相互联系(metabolic interconnection)。但是，即使当对标记的葡萄糖与碳酸氢盐中的碳数目加以校正时，3PG+2PG和PEP中的标记的量在用碳酸氢盐标记时也比在用葡萄糖标记时出现得更慢。其原因可能在于葡萄糖和碳酸氢盐/CO2之间吸收速度的差异、Calvin-Benson-Bassham循环的动力学与葡萄糖代谢的动力学的差异和/或在实验开始时未标记的碳库的大小的差异。
将标记比例对标记时间作图后，每个化合物在开始进行标记后的无穷时间(infinite time)时的标记比例(即最终稳态标记比例)可通过回归分析来外推断(表5)。在供给13C-葡萄糖的光能异养培养物中，糖磷酸和三碳磷酸中的碳有90％可被标记，这与在这些条件下CO2固定被抑制相符合：中央碳代谢途径中几乎所有的碳都衍自葡萄糖。但是，当培养物进行光能混合营养生长时，3PG+2PG库中的总碳只有一半被13C-标记，不管提供的是标记的葡萄糖还是碳酸氢盐(表5)。这表明当细胞在光能混合营养条件下生长时，3PG+2PG和PEP水平上的碳有约一半来自碳酸氢盐，另一半来自葡萄糖。但是，在光能混合营养条件下，G6P+F6P和S7P被葡萄糖标记比被碳酸氢盐标记更强烈；这大概是因为这个事实：这些糖磷酸离葡萄糖只有几个代谢步骤，而3PG是通过Calvin-Benson-Bassham循环进行的CO2固定的产物。在任何情况中，有趣的是，表5中的每个化合物的13C-葡萄糖标记分数(fraction)加13C-碳酸氢盐标记分数在达到稳态标记时接近于90％，这提示在光能混合营养条件下葡萄糖代谢途径和CO2固定途径完全互补。
表5.集胞藻PCC 6803在光能混合营养(PM)和光能异养(PH)生长条件下用13C-葡萄糖(G)或13C碳酸氢盐(B)进行标记时，藻体中的动态标记比例a
Figure G2007800461487D00541
a标记比例定义为13C标记的总量占化合物(包括它所有的同位素体)的所有碳的百分数。数据是三个独立实验的平均值。
b标示“最终”的那一列代表稳态时的标记比例，是从本表的数据外推到“无穷”时间时的标记比例。
这提供了新的方法，来分析集胞藻中的中央代谢流，从而监测13C-标记的代谢中间体在加入标记碳源后随时间的推移的动态分布。在集胞藻中，流向中央代谢途径的代谢流相对于中间体的库大小是快的，因为中间体的标记谱图在20秒到1.5分钟的时间尺度上发生显著变化。
当将13C葡萄糖加到培养物时，它容易被细胞吸收并被磷酸化。从G6P+F6P库，分子可用于戊糖磷酸途径或糖酵解，或者通过转醛醇酶和转酮醇酶反应被转化成其他的糖磷酸。当用均匀标记的13C-葡萄糖来标记光能混合营养培养物或光能异养培养物时(图5和7)，一个意想不到的特征是部分标记的G6P+F6P分子的快速形成，这表明标记发生快速混杂，从而G6P+F6P库和部分标记的具有不同碳原子数的分子的库之间发生相互转化。G6P+F6P库中的标记的混杂情况类似于S7P，这提示这两类糖磷酸之间发生直接或间接的但动力学上快速的相互作用。这个快速混杂的方式可能是多样的，每种同位素体通过数个反应的组合而形成。对标记谱图的详细分析可揭示出不同生长条件下的一般代谢流。具体的说，涉及F6P的转酮醇酶和转醛醇酶反应在同位素体的快速混杂中起到主要作用。转醛醇酶反应的速度(F6P+E4P生成S7P+GAP，反之亦然)似乎没有和转酮醇酶反应的速度一样高，因为在光能混合营养条件下加入13C-葡萄糖20秒后具有3个或7个标记碳的S7P没有占优势(图5)。此外，具有5个13C的S7P同位素体水平低但具有2个13C的S7P同位素水平高的这一事实提示，从Ru5P流向R5P的通量相对较低；与之成对比的是，Ru5P和X5P之间的通量快得多，以确保Calvin Calvin-Benson-Bassham循环和戊糖磷酸途径的自由流动。
在G6P+F6P的光能异养标记谱图中，在标记后的所有时间点最丰富的同位素体是质量+6，这与这些生长条件下葡萄糖的快速流入一致。和在光能混合营养条件中一样，G6P+F6P的质量+2和质量+4的快速标记表明反应16出现且是可逆的。与在光能混合营养条件下的生长相比，在20秒后具有5个标记C的G6P+F6P同位素体丰富，而具有一个标记C的G6P+F6P同位素体不丰富。这个差异很可能是因为E4P在光能异养条件下容易被标记所致，这可提示E4P库较小或者与源自葡萄糖的碳的交换较快速。具有3个标记碳的G6P+F6P同位素体，很可能是在标记的S7P与未标记的GAP发生转醛醇酶反应(反应15)后衍自标记的S7P。
S7P库源自携带至少两个13C的完全标记R5P和X5P的完全标记S7P同位素体，在生长在光能异养条件下的细胞中开始进行标记后20秒就已大量存在，远早于标记的3PG+2PG的增加，这表明S7P的下游有限速步骤。具有两个标记碳的S7P同位素体——大概是通过未标记的R5P与标记的X5P的反应(反应14)而形成——只是短暂的，在开始进行标记后1.5分钟基本上消失(图7)，这表明糖磷酸库被快速标记。其他的部分标记的S7P同位素体库(例如具有4个或5个13C的同位素体)随时间的消失进一步支持这个论断。
3PG+2PG和PEP库。在13C-葡萄糖情况下，3PG+2PG峰中的标记的量直到1.5分钟时间点为止都保持非常小，不管细胞是在光能混合营养条件下还是在光能异养条件下生长(表5)。在集胞藻中，GAP库小(图1B)，标记到达3PG+2PG和PEP库的延迟提示，从GAP到3PG的通量相对于各糖磷酸之间的通量是慢的。
在集胞藻中，有两个GAP脱氢酶，一个(GAP-1)显然催化正向反应(从GAP到二磷酸甘油酸)，另一个(GAP-2)则催化反向反应(从二磷酸甘油酸到GAP)(Koksharova等人，1998)。编码GAP-1的基因的表达是弱的(Figge等人，2000)，因此这个步骤可能是限速的，以使碳从糖磷酸库的损失减至最低。如果的确GAP-1是限速的，由于戊糖磷酸途径和糖酵解都利用这个步骤，这些途径哪个对蓝细菌的糖代谢最重要的这个问题(Yang等人，2002a)可能已失去了其重要性的大部分。GAP脱氢酶在调节糖磷酸代谢网络中的重要性，在其他光合作用系统中也有报道(Ihlenfeldt和Gibson，1975；Tamoi等人，2005；Wedel和Soll，1998)。
在光能混合营养条件下，3PG通过碳固定的形成(不涉及GAP-1)似乎是主要途径。这可与这个观点相一致：RuBisCO活性本身不是蓝细菌中的光合作用流的主要瓶颈(Marcus等人，2005)。如图6和表5中所示，在光能混合营养条件下用标记的碳酸氢盐对3PG+2PG和PEP库进行的标记，要比对糖磷酸库进行的标记多得多，这表明从3PG到PEP的通量非常快，G6P+F6P库从糖异生的流入与其从葡萄糖的流入相比不占优势。高标记比例还提示，Calvin-Benson-Bassham循环在对固定的CO2进行循环中是非常快的。由于CO2只能给3PG+PEP库提供大约一半的碳源(表5)，通过Calvin-Benson-Bassham循环产生的3PG有三分之二需要流回糖磷酸，包括F6P在内。集胞藻中GAP-2的mRNA和蛋白质表达水平在光能混合营养条件下比在光能异养条件下增加约两倍(Yang等人，2002b)。反应16(GAP+S7P生成F6P+E4P)除了从糖异生的流入和葡萄糖利用外，还涉及G6P+F6P库的再生，同时，被消耗的S7P还得到更新。值得注意的是，在RuBP再生过程中，碳流的主流是从3PG到GAP、X5P、Ru5P和RuBP，这些中间体库因为碳水化合物代谢网络的特性所致的化学反应屏障，与其他中间体如G6P+F6P、E4P和S7P相对分隔。
糖酵解和戊糖磷酸途径。有几篇文章指出，在光能异养条件下，大部分的G6P是通过戊糖磷酸途径(涉及6-磷酸葡萄糖酸的脱羧)被利用，极少数是通过糖酵解代谢(例如(Pelroy等人，1972；Yang等人，2002a))。的确，S7P在光能异养条件下非常快速地被完全标记(图7)，这表明所有的糖磷酸库(包括E4P、X5P等)都被快速标记，符合活性戊糖磷酸循环。在光能混合营养条件下没有观察到S7P被完全标记(图5)，这表明存在着大量的未标记糖磷酸库，和G6P向磷酸葡萄糖酸的转化可能较少。但是，Knowles和Plaxton(Knowles和Plaxton，2003)报道说，在集胞藻中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的活性(以及磷酸果糖激酶的活性)在光能混合营养生长条件下和光能异养条件下保持不变，这提示糖酵解和戊糖磷酸途径的大多数反应主要在底物水平上被调节。但是，G6P+F6P库(表1)以及G6P/F6P分布(数据未显示)在两个生长条件之间没有很大变化。而且，在黑暗中在葡萄糖的存在下，G6PDH活性据报道增加10倍以上(Kurian等人，2006)，G6PDH被无细胞提取物中的RuBP和NADPH高度抑制(Pelroy等人，1972；Pelroy等人，1976)。因此，在至少光能异养条件下，通过戊糖磷酸途径的重要流是显而易见的，这一点与观察结果完全一致。
在光能混合营养条件下，被13C葡萄糖一碳标记的G6P+F6P的峰揭示G6PDH仍具有功能性，不过这个通量会非常小，因为在这些条件下3PG+2PG库不被快速标记。然而，在一些研究中(Shasri和Morgan，2005；Yang等人，2002a)，这个通量被忽视。这个不一致更可能是因为对他们的数据的阐释而造成，尽管生长条件也有差异，主要是光强度和无机碳源的差异。虽然戊糖磷酸途径和Calvin-Benson-Bassham循环主要是逆过程(reverse process)，但Calvin-Benson-Bassham循环在混合营养条件下占优势并不排除G6PDH仍具有功能性的可能性。我们的通量图(flux map)与之前的(Yang等人，2002a)相比的另一主要差异是，在我们构建的代谢网络中，DHAP、GAP和3PG+2PG库由于它们在中央代谢网络中的角色和在13C标记测量中的可区别行为而被单独考虑。基于C13碳酸氢盐对3PG+2PG的标记谱图，发现在光能混合营养条件下，要求G6P+F6P从循环的3PG再生。
这里给出的结果表明，对随时间推移的稳定同位素标记情况进行的直接检测，提供了测定各化合物之间的代谢关系和速度的直接方式。这个工作目前是第一步，对化合物的建模(modeling)以及更灵敏的检测会有助于更详细的分析。应用另外的标记，可进行更为灵敏的代谢物检测，且结合突变分析，可进行还更详细的体内代谢流分析。这个方法可容易地应用到容易吸收特定固定碳化合物的微生物，以直接和快速测量其代谢流，甚至代谢网络尚未完全了解的微生物也可应用这个方法。
表6.光能异养生长的集胞藻PCC 6803中进行13C-葡萄糖标记后己糖-6-磷酸(G6P+F6P)、磷酸甘油酸(3PG+2PG)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)的动态同位素体分布a。
Figure G2007800461487D00591
a数据是三个独立实验的平均值。
bID，同位素体分布：同位素体相对于化合物总量的百分数。SD，标准偏差。
通向accABCD过量表达
代谢工程中通向脂质生物合成增加的第一步，是过量表达乙酰-CoA羧化酶AccABCD的各成分。对集胞藻PCC 6803的accA基因、accB基因、accC基因和accD基因的编码区进行了PCR扩增(图12)，用以使这些基因在集胞藻基因组中联合表达的质粒在图13中显示。
实施例3
用以增加PHB(生物塑料)含量的经修饰蓝细菌
1.材料和方法
细菌菌株和培养条件：为了解PHB合成在集胞藻PCC 6803中的生理角色，在不同培养条件下比较了代谢途径发生改变从而导致PHB含量显著不同的一系列突变株。已描述了缺乏三个末端氧化酶(细胞色素aa3型细胞色素c氧化酶(CtaI)、推定的细胞色素bo型醌醇氧化酶(CtaII)和细胞色素bd型醌醇氧化酶(Cyd))的突变株(Howitt等人，1998)。之后通过另外缺失编码光合系统II的CP47蛋白的psbB，建立了缺乏光合作用氧释放和呼吸氧耗的PS II缺失/氧化酶缺失的突变株(Howitt等人，2001)。蓝螺藻(CyanoRubrum)这个由Michael Gurevitz博士(以色列特拉维夫大学)惠赠的突变株，其中的原始蓝细菌RuBisCO基因用来自深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的相应基因进行了替代，深红红螺菌是一种进行不产氧光合作用的微生物(Amichay等人，1992)。由于R.rubrum RuBisCO的氧合-羧化活性比相对较高，该突变株只能在增高的CO2浓度下生长。缺乏偏好I型NADPH的脱氢酶(NDH-1)的ndhB-菌株——这个菌株由TeruoOgawa博士(之前在日本名古屋大学)惠赠——也因为Ci转运受削弱而要求富含CO2的空气来生长(Ogawa，1991)。通过缺失集胞藻PCC 6803中存在的三个相应基因(ndbA、ndbB和ndbC)，构建了缺乏NADH氧化性II型脱氢酶(NDH-2)的菌株(Howitt等人，1999)。
将集胞藻PCC 6803野生型、缺失末端氧化酶突变株、PS II缺失/氧化酶缺失突变株和NDH-2缺失突变株在BG-11培养基中进行生长，在30℃下鼓泡通入空气；对于蓝螺藻菌株和NDH-1缺失菌株，鼓泡通入富含2％CO2的空气。BG-11培养基用5mM TES[N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]-NaOH(pH 8.0)缓冲，例外的是，向PS II缺失/氧化酶缺失的培养物加入的是10mM TES-NaOH(pH 8.0)。由于PS II缺失/氧化酶缺失突变株失去了光能自养生长的能力，在所有条件下给它在培养基中供应5mM葡萄糖。当指明时，从BG-11去掉NaNO3，用10mM NH4Cl代替(“还原型N(N-reduced)”)。通过将被沉淀下来的在正常BG-11培养基中生长的细胞洗涤并转移到分别省去了NaNO3或K2HPO4的BG-11中，获得氮饥饿的培养物或磷饥饿的培养物。在氮或磷限制的条件中，培养基中的氮源或磷源各自减少到原始浓度的10％。当指明时，将6-二偶氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)加到BG-11培养基中至0.5mM终浓度，DON是谷氨酸合酶(也称谷氨酸合酶-谷氨酰胺-2-酮戊二酸氨基转移酶(GOGAT))的特异性抑制剂。
对于在平板上的生长，加入1.5％(w/v)琼脂和0.3％(w/v)硫代硫酸钠，给BG-11补加特定菌株因为存在着引入的伴随基因失活(gene inactivation)的抗生素抗性标记而能抵抗的抗生素。所用浓度为：20μg的博来霉素(zeocin)ml-1、25μg的卡那霉素ml-1、25μg的红霉素ml-1、25μg的壮观霉素ml-1和/或14μg的氯霉素ml-1。
各菌株在50μmol光子m-2s-1的光强度下进行光能自养生长，除非另有指明。通过用Shimadzu UV-160分光光度计在730nm处测量培养物的光密度，监测生长情况。在OD730～0.5时获得对数期中期培养物；稳定期培养物在生长7天后收获。
光学显微镜和电子显微镜检查：为通过光学显微镜观察PHB颗粒，将50μl的经过滤灭菌的噁嗪染料尼罗蓝A 1％水溶液加到集胞藻培养物的2ml等分试样，在观察前使细胞在标准条件下生长12小时。然后离心沉淀细胞，用BG-11培养基洗涤两次。将细胞用一薄层的1％(w/v)BG-11琼胶固定化在显微镜载玻片上，立即用盖玻片盖住。将各载玻片在Zeiss落射荧光显微镜(Axioskop)或Leica TCS SP2多光子共聚焦激光扫描显微镜下进行检查，在488nm处激发，在560nm至620nm之间检测荧光发射。在染色后，以微分干涉差(DIC)模式或荧光模式监测细胞形态(激发滤光片：BP 450-490；光束滤光片：FT 510；屏障滤光片：BP 515-565)。基本上按之前的描述(Mohamed等人，2005)，进行透射电子显微镜检查。细胞用Balzers高压冷冻机进行冷冻固定。用1％戊二醛和2％单宁酸的丙酮溶液在-85℃下进行冷冻置换(Freeze-substitution)48-72小时，再在1％OsO4的丙酮溶液中进一步固定8小时。将细胞包埋在Spurrs树脂中，切成70nm厚的切片；然后将这些切片用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色。用PhilipsCM12扫描透射电子显微镜在80kV下观察细胞。
PHA分析和定量：通过气相色谱-质谱(GC/MS)分析不同菌株的胞内PHA含量。将OD730＝0.5(代表对数期)或OD730＞1.0(代表稳定期；培养了7天)的细胞培养物通过离心(10min，3,200×g，4℃)或者通过1μm孔径膜过滤进行收集，用水洗涤细胞两次。将所得的沉淀在液氮中冷冻，在-80℃下保藏，冻干至少24小时。然后将细胞在105℃下干燥4小时。用Mini-BeadBeaterTM(Biospec Products，Bartlesville，OK)将干燥的细胞(10-30mg)在1.5ml氯仿中进行破碎(3×60s，各次破碎之间在冰上温育30秒)。取出1ml等分试样，与1ml酸化的甲醇(20％HCl v/v)合并，进行甲醇分解作用。将样品和PHB标准物(0.1-10mg/ml)在带有衬特富龙盖(Teflon-lined cap)的15ml Pyrex试管中95℃下加热2.5小时。随后，通过在冰上温育5分钟将样品冷却。通过将0.5ml的较浓稠的氯仿相转移到另一含有0.5ml H2O的10ml Pyrex试管中，实现进一步的纯化。剧烈振荡3分钟并离心(1,500×g，3分钟)后，将2μl含有PHB甲酯的氯仿相注射到GC柱上进行分析。
GC/MS分析是在具有DB-5MS柱(30m×0.25μm内径，0.25μm膜厚)的Shimadzu 17-A气相色谱仪和与数据处理器(GCMSsolutions软件；Shimadzu，日本)连接的Shimadzu QP5000质谱仪上进行。在200℃下，线性速度为20-30cm/s，以氦为载气。注射口的温度设定为210℃，界面温度设定为250℃。使用了一下GC炉温度方案(temperature profile)：60℃下1分钟，接着以8℃/分钟的升温速度升到160℃，然后在160℃下等温加热5分钟，最后运行是在200℃下4分钟。平衡时间为60℃下2分钟。在每次以总离子扫描模式进行检测后，使用单离子监测(SIM)模式，以获得更高的定量准确性。
烟酰胺核苷酸测定：修改两个独立的方法以用来分析每个菌株中的烟酰胺核苷酸水平。首先，通过从(Zhang等人，2000)改进的酶促反应方法，分光光度测定NAD和NADP的还原水平。在4℃下离心收获到大约400-500ml的液体培养物。将所得沉淀用H2O洗涤两次，重悬在1ml含有的0.1M Tris-HCl，pH 8.0、0.01M EDTA和0.05％(v/v)Triton X-100的提取缓冲液中。加入大约一半体积的玻璃微珠(70-100μm直径)，用Mini-BeadBeaterTM破碎细胞(4×30s，在各次振动之间在冰上温育1分钟)。破碎后，所有步骤均在黑暗中进行，以避免吡啶核苷酸的光降解。将所得混合物在Eppendorf微量机中离心14,000rpm离心3分钟，上清液转移到新管。将上清液用一半体积的氯仿提取两次，以除去脂质和大部分蛋白质。在如下四个不同条件下获取340nm处的吸光度读数。通过将20μl提取物加到原始提取缓冲液至1ml最终体积，测定总(NADPH+NADH)水平(A1)。通过将另一20μl的提取物加到含有0.1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.01MMgCl2、0.05％(v/v)Triton X-100、5mM葡萄糖-6-磷酸和5.0IU NADP特异性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD；Sigma Chemical Co.，G-4134)的1ml反应混合物并在37℃下温育5分钟，样品中所有的NADp+都转化成NADPH(A2)。将第三等份的20μl提取物在含有0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.6)、0.05％(v/v)Triton X-100、5mM谷胱甘肽(GSSG)和5.0IU谷胱甘肽还原酶(GR；Sigma)的反应混合物中25℃下温育5分钟，使所有NADPH的转化成NADP+(A3)。第四个读数是在20μl提取物在0.1M Tris-HCl，pH 8.0、1％(w/v)牛血清白蛋白、7％乙醇、5.0IU NAD特异性醇脱氢酶的1ml混合物中25℃下反应5分钟后读取，NAD+转化成NADH(A4)。所有的反应混合物都在加入提取物之前在相应的温度下预温育5分钟。A1-A3代表样品中的NADPH的总量；A2-A1代表NADP+的总量；A3代表NADH的总量；A4-A1代表NAD+的总量。NAD(P)H的摩尔消光系数取6.3×103cm-1(Bergmeyer，1975)。
从Klaidman等人(1995)的方法改造的基于荧光的高压液相(HPLC)方法，之前已被描述(Cooley等人，2001)为可提取和检测衍生化后的NADP-NADPH和NAD-NADH。首先，将1升的细胞(OD730＝0.5)沉淀下来，并重悬于1ml的含有0.06mM KOH、0.2mM KCN和1mM红菲绕啉二磺酸的混合物中1。在这个溶液中，氧化形式的NAD和NADP用CN进行衍生化，使得该氧化形式通过荧光能以与还原形式的效率几乎相当的效率可见(在330nm处激发后在460nm处发射)(Klaidman等人，1995)。加入玻璃微珠至1.5ml的总体积，如上所述破碎细胞。将样品在Eppendorf5415微量离心机中14,000rpm下离心5分钟除去不溶物，上清液用0.5体积的氯仿提取，以确保除去脂质。样品在荷载前先离心通过0.45-μm孔径的微量离心滤器(microcentrifuge spin filter)。通过带荧光检测的HPLC，用带Agilent 1100荧光检测器和Supelco Supelcosil 5μm C18柱(4.6×250mm分析柱，设计用于有效分离核苷酸)的HP1100LC监测氧化形式的和还原形式的NAD和NADP的浓度和比例。
2.结果
PHA颗粒的目视鉴定。用相差光学显微镜术对PHA颗粒的直接观察，常被用作细菌中PHA的可行筛选方法(McCool等人，1999)。但是，这个方法并不适用于蓝细菌，因为存在着类囊体膜以及诸如藻青素和聚磷酸盐的内含体。为增强PHA颗粒的可见性，用亲脂性噁嗪染料尼罗蓝A对细胞染色。该染料的噁嗪酮形式即尼罗粉红(nile pink)是通过尼罗蓝A在水溶液中自发氧化形成的。传统上，尼罗蓝染色包括将细胞热固定到载玻片上，这能将细胞杀死，然后用相对高浓度的染料进行染色(Ostle等人，1982)。但是，在蓝细菌中，由于色素的存在，这个处理会导致高背景荧光。相反，活的蓝细菌细胞是这样染色的：将0.04％(w/v；终浓度)尼罗蓝A水溶液加到对数生长期前期的2ml培养物等分试样，使培养物再生长12小时后才采样。对照实验表明，最高达0.25％(w/v)的染料不会影响细胞生长的速度或者最大细胞密度(数据未显示)。在显微镜载玻片上包埋在琼脂中的细胞在这些条件下能存活至少3-4小时，而尼罗蓝/尼罗红荧光产量没有很大的减少。
在激发时，PHA颗粒在集胞藻细胞的红色自体荧光背景上可见为明亮的橙色斑点(图9)。在营养平衡的条件下，在正常的BG-11培养基中，直到稳定期后期为止，在野生型的细胞中(图9A)或者蓝螺藻菌株或NDH-2缺失菌株的细胞中(未显示)没有检测到的PHB颗粒。但是，即使在BG-11培养基中在对数生长期过程中，在PS II缺失/氧化酶缺失突变株(图9D)、氧化酶缺失突变株(图9E)和NDH-1缺失突变株(图9F)的细胞中也观察到多个颗粒。在转移到其中氮源减少到原始浓度的10％的氮限制培养基后，野生型几乎立即积累PHA，在稳定期可看到每个细胞平均有约4个颗粒(图9B)。当将还原型氮源如氯化铵供应给生长培养基替代硝酸盐后，光能自养生长的野生型在对数生长过程中积累PHA(图9C)。用铵替代硝酸盐后，培养物以正常速度生长并保持其正常外观。
前一段落给出的结果提示，减少固定氮源会导致PHA的积累，这可能是因为对用于硝酸盐还原的NADH/NADPH的需求降低所致。但是，另一解释会是，可供利用的氮少，这本身就导致PHA积累：16.7mM硝酸盐被10mM铵替代，因为更高的铵浓度是有毒的。为试验这个可能性，将0.5mM(终浓度)的谷氨酸合酶特异性抑制剂DON加到BG-11培养基中的对数生长期野生型培养物。由于氮同化作用被阻断，培养物的颜色很快就从蓝绿色变成黄棕色，这反映了藻胆素蛋白的降解。但是，在DON存在和不存在下在野生型中发现的PHA颗粒数非常相似，每个细胞为1个或1个以下(数据未显示)。因此，氮同化作用的缺乏本身并不导致PHA积累。
电子显微镜检查：为验证尼罗蓝A染色的荧光颗粒的确对应于类似PHA颗粒的包含体，对在标准的BG-11中生长的显示极少荧光颗粒的对数期野生型集胞藻PCC 6803，以及对两个其他菌株(氧化酶缺失突变株和PSII缺失/氧化酶缺失突变株)和对野生型，在N限制后进行电子显微镜检查(图10)。在后三种情况中，观察到尼罗蓝染色颗粒的水平增加。的确，考虑到用于透射电子显微镜检查的切片的厚度(70nm)小于沿着横穿细胞的z轴的荧光焦场的投影(600-800nm)，尼罗蓝A荧光颗粒的数量很好地对应于细胞当中的空白空间(open space)的数量。在进行电子显微镜检查时，PHA颗粒通常是作为电子透明内含体(electron-transparent inclusion)可见到(Ballard等人，1987)，这可能因为PHA在样品制备过程中被洗出。对多个切片的检查显示，在正常条件下生长的野生型中只有约20％的被切片细胞含有这种颗粒，在每个被切片细胞中的数量只仅仅三个(表7)。但是，在PS II缺失/氧化酶缺失的突变株中，极大部分的被切片细胞含有至少一个颗粒，且颗粒大小(直径约145nm)比在正常条件下生长的野生型中的颗粒大小(直径约75nm)大得多。注意，对于直径超过切片厚度的颗粒，取决于样品制备过程中颗粒如何被切割，颗粒直径可能被低估。在氮限制的野生型细胞中，类囊体结构组织化程度低(图10D)，每个细胞的平均颗粒数增加一个数量级。如图10C和D所示，在集胞藻中，颗粒通常不被发现与类囊体或细胞质膜结合，与之相反的是聚球藻MA19中的情况，在这个菌中已知PHB颗粒被发现非常接近类囊体膜或被类囊体膜包围，或者是缺乏糖原生物合成的集胞藻突变株中的情况，在这个突变株中有时颗粒被发现与细胞质膜紧密结合。
表7.集胞藻藻株的电子显微镜薄(70nm)切片中见到的PHA颗粒的平均数目和大小
Figure G2007800461487D00661
a该测量是在至少50个细胞的切片上进行；颗粒数目代表每个被切片细胞的平均颗粒数。
b颗粒直径是在每个藻株中计数到的所有颗粒的平均值。
PHA在其组成上可能不同，用GC/MS来测定这些内含体的化学性质。为此，在特定培养阶段收获细胞，冷冻干燥，然后在105℃下烘焙以除去残留含水量。将细胞破碎后，所得材料在氯仿中进行甲醇分解作用2.5小时。其中一个主要甲醇分解作用产物的质量谱图(图11A中的峰1)与3-羟基丁酸的甲酯(图11B)完全匹配，然而没有获得羟基戊酸酯或其他酯类的迹象。所观察到的第二个主峰被鉴定为乙酰丙酸的甲酯(图11C)，之后证实是干燥细胞中葡萄糖或糖原的存在所造成的假象(数据未显示)。这些数据表明，集胞藻PCC 6803能够产生的唯一PHA是PHB均聚酯(homopolyester)。
PHB含量：如在前面章节中所示，PHB的积累不仅决定于藻株的基因型，而且与细胞生长的阶段或条件有关。不同条件下和不同藻株中PHB积累的量在表8中列出。PHB含量是从干燥的细胞提取PHB并进行甲醇分解作用后，以购自Sigma的PHB作为标准物，通过GC/MS测定的。PHB含量(占干重的百分数)始终是比从荧光和电子显微镜观察(图9和10)预期到的要低。这可能是因为不完全的PHB提取和/或甲醇分解作用造成的。因此，表8中所列的PHB含量代表了PHB数量的下限。但是，认为提取效率对于所有细胞和条件都是相似的，因此可在各藻株和条件之间定量比较PHB含量。在具有平衡的营养物的培养基中在正常生长条件下，野生型以及NDH-2缺失藻株和蓝螺藻藻株都合成极少的PHB，PHB含量为0.3％或更少。但是，氧化酶缺失突变株和NDH-1缺失突变株在这些条件下积累的PHB多一个数量级，PS II缺失/氧化酶缺失突变株积累的PHB的量甚至是氧化酶缺失突变株和NDH-1缺失突变株的两倍。
表8.集胞藻PCC 6803及其突变株在不同生长条件下的PHB积累。各培养物在所列条件下生长7天后进行PHB含量分析。所示的结果是三个独立实验的平均值。
Figure G2007800461487D00671
a除非另有规定，否则各培养物是在补加5mM TES-NaOH(pH 8.0)的BG-11培养基中在50μmol光子m-2s-1下进行光能自养生长。
bBG-11中的硝酸盐减少到1.67mM(原始浓度的10％)。
cBG-11中的硝酸盐被10mM NH4Cl替代。
dBG-11补加10mM乙酸钠。
eBG-11补加10mM TES-NaOH(pH 8.0)缓冲液和5mM葡萄糖。
f鼓泡通过富含2％CO2的空气。
ND：未测出。
在氮限制的条件下，所有藻株都积累高水平的PHB：数量与PS II缺失/氧化酶缺失藻株在正常条件下的数量大体相当。当以氨的形式给细胞提供还原型氮源时，获得相似的结果。
由于PHB似乎在还原型NADP的条件下积累，且NAD(P)H被用于乙酰乙酰基～CoA还原，PHB可能是再生NADP的发酵产物，因此测量在微好氧条件下的生长的几个藻株的PHB水平。这些藻株中的PHB水平类似于在正常条件下生长的对照藻株的水平(数据未显示)，因此PHB似乎不是集胞藻中的发酵产物。
为测定PHB途径开始前后的代谢物水平是否影响PHB合成，将10mM乙酸钠加到培养物中。如表8所示，野生型细胞积累多达4.7％PHB，这提示细胞中乙酸盐(或者衍生代谢物)的水平显著影响PHB水平。
一个另外要考虑的因素是培养物的生长速度，因为在分批培养中，如果在对数期结束时每个细胞的PHB含量相似的话，生长速度较高的藻株会比生长速度较慢的藻株产生更多的PHA。表9中比较了不同藻株在不同条件下的生长。在对照条件下，除氧化酶缺失藻株之外的所有突变株都比野生型生长慢。在氮限制条件下，所有藻株生长的倍增时间为16-21小时。在乙酸盐或铵的存在下，各藻株的生长速度基本上和在标准的BG-11中的相同。因此，不同突变株中和不同条件下PHB积累的巨大差异不能简单地由生长速度的差异来解释。
表9.在不同培养条件下生长的集胞藻PCC 6803野生型和突变株的倍增时间。所显示的数据是至少三个独立测定的平均值。
Figure G2007800461487D00691
a除非另有规定，否则各培养物是在补加5mM TES-NaOH(pH 8.0)的BG-11培养基中在50μmol光子m-2s-1下进行光能自养生长。
bBG-11中的硝酸盐减少到1.67mM(原始浓度的10％)。
cBG-11中的硝酸盐被10mM NH4Cl替代。
dBG-11补加10mM乙酸钠。
eBG-11补加10mM TES-NaOH(pH 80)缓冲液和5mM葡萄糖。
f鼓泡通过富含2％CO2的空气。ND：未测出。
氧化还原辅因子水平：到目前为止的结果似乎表明，PHB积累是在特定条件下出现，包括在加入的乙酸盐存在下在内。对于PHB合成重要的一个其他的可能因素是细胞中的NADPH水平，因为NADPH被用于PHB合成，且因为高NADP还原水平似乎会抑制TCA循环中的异柠檬酸脱氢酶(Cooley等人，2000)并因此可能导致高乙酸盐水平。为确定PHB积累和细胞的氧化还原状态之间的关系，测量并比较了还原型/氧化型烟酰胺核苷酸的水平，作为细胞质氧化还原状态的指标。NADPH/NADP水平和NADH/NAD水平是用两个独立的方法进行测定：通过在特定处理后在340nm处进行分光光度检测来测定，和通过带荧光检测的HPLC来测定。分光光度方法快速，但可能特异性不够充分，而HPLC方法较慢(从而使得有更多时间发生假象的相互作用)，但特异性更高。所得的两组数据相当，差异小于20％(数据未显示)；因此，这里只给出HPLC数据(表10)。对于这些测定，所有的培养物都在对数期中期收获，在进一步实验前的30分钟进行提取。
表10.在BG-11、在氮限制条件和还原型氮(NH4Cl)条件下生长的对数期各藻株中的稳态吡啶核苷酸水平和还原型辅因子/总辅因子比例(浓度单位为μM/OD730)。
Figure G2007800461487D00701
a除非另有规定，否则各培养物是在补加5mM TES-NaOH(pH 80)的BG-11培养基中在50μmol光子m-2s-1下进行光能自养生长。
bBG-11中的硝酸盐减少到1.67mM(原始浓度的10％)。
cBG-11中的硝酸盐被10mM NH4Cl替代。
dBG-11补加10mM乙酸钠。
eBG-11补加10mM TES-NaOH(pH 8.0)缓冲液和5mM葡萄糖。
f鼓泡通过富含2％CO2的空气。FR：完全还原型。
ND：未测出。
不同集胞藻PCC 6803藻株之间NAD(H)和NADP(H)的总量相差最多达大约10倍。但是，对于每个藻株，当在不同条件下生长时，NAD(H)和NADP(H)的量相差最多仅达3-4倍(表10)。然后所有藻株中的NAD(H)水平相对较低，数据中的标准偏差相应地较大，NADP库大小较大，在不同藻株之间相差最高达10倍(表10)。与之前的观察结果(Cooley等人，2001)一致的是，NAD和NADP还原状态极大地取决于藻株。NAD在NDH-2缺失藻株中被完全还原，在其他藻株中有35-70％的NAD被还原。NDH-1缺失突变体具有实质上完全还原的NADP(H)库，而在氧化酶缺失突变体中NADP发生40-70％还原。与之对比，在野生型、蓝螺藻和NDH-2缺失突变株中NADP库相当地被氧化。后一参数(NADP还原状态)因此似乎与PHB积累的水平相关。
为进一步查明NADP还原状态和PHB积累量之间的可能相关性，测定了野生型中以及氧化酶缺失突变株和PS II缺失/氧化酶缺失突变株中，NADP和NAD水平及还原状态随固定氮的限制和还原型氮源(氨)的存在的变化关系。当在具有限制性硝酸盐水平的BG-11培养基中或者在氨存在下的BG-11培养基中进行培养时，NADH/NAD(总)比例在氨存在下或在限制数量的硝酸盐下没有很大变化，但是在这些条件下测试的三个藻株中，在野生型中NADPH/NADP(总)比例增加5-6倍，达到与氧化酶缺失突变株和PS II缺失/氧化酶缺失突变株中的高还原水平相当的水平(表10)。
将表4报道的结果与表2所列的PHB含量数据进行比较，可清楚知道在所有情况中高NADPH/NADP(总)比例都与集胞藻PCC 6803中的高PHB含量相关。NADH/NAD(总)比例和PHB积累之间没有明显可见这种相关性。
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Claims (97)

1.一种经修饰的光能自养细菌，所述经修饰的光能自养细菌包含一个或多个其表达已被改变和/或其基因产物功能已被改变的目的基因，改变的结果是导致该细菌中的一种或多种选自由脂肪酸、脂质类胡萝卜素、其他类异戊二烯、碳水化合物、蛋白质、生物气或它们的组合所构成的群组的产物的产量，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达不被改变的光能自养细菌中的所述一种或多种产物的量而言得到了增加。
2.权利要求1的经修饰的光能自养细菌，其中至少一个目的基因的表达，相对于该基因在未经修饰的细菌中的表达而言，已被改变和上调。
3.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中至少一个目的基因的表达，相对于该基因在未经修饰的细菌中的表达而言，已被改变和下调。
4.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中至少一个目的基因的表达，已通过对未经修饰的细菌中的内源基因的表达的改变而得到改变。
5.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中至少一个内源基因的表达和/或其基因产物的功能，是通过使该基因缺失、使该基因突变或者对该基因的控制序列进行修饰来改变。
6.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因包含至少一个其表达和/或基因产物功能已通过突变而得到改变的基因。
7.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中至少一个目的基因的表达和/或其基因产物的功能，已通过将转基因序列加到未经修饰的细菌中而得到改变。
8.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因包含至少一个转基因。
9.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因包含至少两个其表达已被改变和/或其基因产物功能已被改变的基因。
10.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述细菌能吸收和固定二氧化碳。
11.权利要求10的经修饰的光能自养细菌，所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的二氧化碳吸收和固定量而言，其二氧化碳吸收和固定量得到了增加。
12.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的脂质产量而言，其一种或多种脂质的产量得到了增加。
13.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的脂质含量而言，其脂质含量得到了增加。
14.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因选自由质体1中小泡诱导蛋白(VIPP1)基因，pspA基因，yidC/oxaI同源物，质体球蛋白基因，乙酰-CoA羧化酶基因，转乙酰酶基因，去饱和酶基因，PEP羧化酶基因，柠檬酸合酶基因，脂肪酸生物合成基因，蛋白酶基因，参与糖原、聚羟基丁酸或藻青素生物合成或降解的基因，磷脂酸磷酸酶基因和酰基转移酶基因组成的群组。
15.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因选自由sll0336、sll0728、sll1568、sll1848、slr2060、sll0617、slr1471、sll1463、slr0228、slr1024、slr1390、slr1604、slr0156、slr1641、slr0542、slr0165、slr0435、sll0053、slr2023、slr1511、sll1069、slr1332、slr0886、sll1605、slr1051、slr1176、slr1188、slr1024、sll1568、slr1829、slr1830、slr2001、slr2002、slr1350、sll1441、sll0541、sll0262、sll0920、sll0401、sll0534、sll0545、slr0348、sll1556、slr1254、slr0940、slr1293、sll0254和sll1468这些基因及它们的同源物组成的群组。
16.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的类胡萝卜素产量而言，其一种或多种类胡萝卜素的产量得到了增加。
17.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的类胡萝卜素含量而言，其类胡萝卜素含量得到了增加。
18.权利要求16和17中任一项的经修饰的光能异养细菌，其中所述类胡萝卜素选自由β-胡萝卜素、玉米黄素、蓝溪藻黄素乙、myxol、海胆酮和它们的生物合成中间体组成的群组。
19.权利要求16和17中任一项的经修饰的光能异养细菌，其中所述一个或多个目的基因选自由slr0348、sll1556、slr1254、slr0940、slr1293、sll0254和sll1468这些基因和它们的同源物组成的群组。
20.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的类异戊二烯产量而言，其一种或多种其他类异戊二烯的产量得到了增加。
21.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的类异戊二烯含量而言，其类异戊二烯含量得到了增加。
22.权利要求20和21中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一种或多种其他的类异戊二烯选自由异戊二烯、生育酚和它们的生物合成中间体组成的群组。
23.权利要求20和21中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一种或多种目的基因选自由植物异戊二烯合酶基因、生育酚生物合成基因和它们的同源物组成的群组。
24.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的碳水化合物产量而言，其一种或多种碳水化合物的产量得到了增加。
25.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌被进一步定义为，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能不被改变的光能自养细菌的碳水化合物含量而言，其一种或多种碳水化合物的含量得到了增加。
26.权利要求25的经修饰的光能自养细菌，其中所述碳水化合物选自由单糖、双糖、寡糖和多糖组成的群组。
27.权利要求25和26中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述碳水化合物是选自由葡萄糖、半乳糖和果糖组成的群组的单糖。
28.权利要求25和26中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述碳水化合物选自由单糖磷酸木酮糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、核糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸、赤藓糖-4-磷酸、景天庚酮糖-二磷酸和果糖-二磷酸组成的群组。
29.权利要求25和26中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述碳水化合物是蔗糖。
30.权利要求25和26中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述碳水化合物是选自由果寡糖和甘露寡糖组成的群组的寡糖。
31.权利要求25和26中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述碳水化合物是选自由糖原及其衍生物组成的群组的多糖。
32.权利要求25-31中任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因包含编码糖原合成酶或糖原分支酶的基因或者参与中心碳代谢的基因。
33.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因包含至少一个与组成型启动子可操作地连接的基因。
34.权利要求33的经修饰的光能自养细菌，其中所述组成型启动子选自由psbDII、psbA3和psbA2组成的群组。
35.前述权利要求任一项的经修饰的光能自养细菌，其中所述一个或多个目的基因包含至少一个与诱导型启动子可操作地连接的基因。
36.权利要求35的经修饰的光能自养细菌，其中所述诱导型启动子选自由nirA、isiAB、petE、nrsRS、nrsBACD和ndhF3组成的群组。
37.权利要求1的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌是蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、螺杆菌(heliobacterium)、酸杆菌(acidobacterium)、紫色硫细菌或紫色非硫细菌。
38.权利要求37的经修饰的光能自养细菌，其中所述经修饰的光能自养细菌是蓝细菌。
39.权利要求38的经修饰的光能自养细菌，其中所述蓝细菌是集胞藻(synechocystis)。
40.权利要求39的经修饰的光能自养细菌，其中所述蓝细菌是集胞藻PCC 6803。
41.权利要求38的经修饰的光能自养细菌，其中所述蓝细菌是嗜热聚球藻(Thermosynechococcus)。
42.权利要求41的经修饰的光能自养细菌，其中所述蓝细菌是嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcus elongatus sp.)BP-1。
43.权利要求38的经修饰的光能自养细菌，其中所述蓝细菌属于以下各个目：色球藻目(Chroococcales)，念珠藻目(Nostocales)，颤藻目(Oscillatoriales)，宽球藻目(Pleurocapsales)，原绿藻目(Prochlorophytes)，或真枝藻目(Stigonematales)。
44.权利要求43的经修饰的光能自养细菌，其中所述目是色球藻目，藻种选自由隐球藻属(Aphanocapsa)、隐杆藻属(Aphanothece)、管孢藻属(Chamaesiphon)、色球藻属(Chroococcus)、Crocosphaera、蓝细菌(Cyanobacterium)、Cyanobium、蓝丝菌属(Cyanothece)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、粘杆菌属(Gloeobacter)、粘球藻属(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)、Euhalothece、Halothece、Johannesbaptistia、平裂藻属(Merismopedia)、微囊藻属(Microcystis)、棒条藻属(Rhabdoderma)、聚球菌属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)和嗜热聚球藻(Thermosynechococcus)组成的群组。
45.权利要求43的经修饰的光能自养细菌，其中所述目是念珠藻目，藻种选自由Coleodesmium、Fremyella、微毛藻属(Microchaete)、Rexia、Spirirestis、单歧藻属(Tolypothrix)、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、束丝藻属(Aphanizomenon)、管链藻属(Aulosira)、Cyanospira、柱胞藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、植生藻属(Richelia)、眉藻属(Calothrix)、胶刺藻属(Gloeotrichia)和伪枝藻属(Scytonema)。
46.权利要求43的经修饰的光能自养细菌，其中所述目是颤藻目，藻种选自由节螺藻属(Arthrospira)、Geitlerinema、Halomicronema、盐螺旋藻属(Halospirulin)、Katagnymene、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、拟浮丝藻属(Planktothricoides)、浮丝藻属(planktothrix)、织线藻属(Plectonema)、湖生蓝丝藻属(Limnothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、裂须藻属(Schizothrix)、螺旋藻属(Spirulina)、束藻属(Symploca)、束毛藻属(Trichodesmium)和Tychonema组成的群组。
47.权利要求43的经修饰的光能自养细菌，其中所述目是宽球藻目，藻种选自由拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、皮果藻属(Dermocarpa)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、黏囊藻属(Myxosarcina)、宽球藻属(Pleurocapsa)、斯塔尼尔氏菌属斯塔尼尔氏菌属(Stanieria)和异球藻属(Xenococcus)。
48.权利要求43的经修饰的光能自养细菌，其中所述目是原绿藻目，藻种选自由原绿藻属(Prochloron)、原绿球藻属(Prochlorococcus)和原绿发藻属(Prochlorothrix)组成的群组。
49.权利要求43的经修饰的光能自养细菌，其中所述目是真枝藻目，藻种选自由蒴链藻属(Capsosira)、拟绿胶蓝细菌属(Chlorogloeopsis)、费氏藻属(Fischerella)、软管藻属(Hapalosiphon)、Mastigocladopsis、鞭枝藻属(Mastigocladus)、拟念珠藻属(Nostochopsis)、真枝藻属(Stigonema)、聚线藻属(Symphyonema)、Symphyonemopsis、Umezakia和Westiellopsis组成的群组。
50.一种增加来自光能自养细菌期望的产物的产量的方法，所述方法包括改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能，从而导致光能自养细菌中一种或多种产物或者一个或多个目的基因的产量的增加，其中所述改变导致所述一种或多种产物的产量，相对于其中所述一个或多个目的基因的表达不被改变的光能自养细菌所产生的所述产物的量而言，得到了增加。
51.权利要求50的方法，所述方法进一步包括在合适的条件下生长光能自养细菌，以产生出其量得到增加的期望产物。
52.权利要求50和51中任一项的方法，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能包括改变至少两个基因的表达或功能。
53.权利要求50-52中任一项的方法，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能包括通过下调来改变至少一个基因的表达。
54.权利要求50-53中任一项的方法，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能包括改变至少一个转基因的表达。
55.权利要求50-54中任一项的方法，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能包括通过突变来改变至少一个基因的表达。
56.权利要求50-55中任一项的方法，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能包括通过上调来改变至少一个基因的表达。
57.权利要求50-56中任一项的方法，其中所述光能自养细菌能吸收和固定二氧化碳。
58.权利要求50-57中任一项的方法，其中改变一个或多个目的基因的表达和/或基因产物功能能增加二氧化碳的吸收和固定，所述增加是相对于其中所述一个或多个目的基因的表达不被改变的光能自养细菌对二氧化碳的吸收和固定的量而言。
59.权利要求50-58中任一项的方法，其中所述期望的产物包含一种或多种脂质。
60.权利要求59的方法，所述方法进一步包括将所述一种或多种脂质加工成生物燃料。
61.权利要求60的方法，其中所述生物燃料是生物柴油。
62.权利要求50-58中任一项的方法，其中所述期望的产物包含一种或多种碳水化合物。
63.权利要求62的方法，所述方法进一步包括将所述一种或多种碳水化合物加工成生物燃料。
64.权利要求63的方法，其中所述生物燃料是醇或气体。
65.权利要求64的方法，其中所述生物燃料是选自由甲醇、乙醇、丙醇和丁醇组成的群组的醇。
66.权利要求64的方法，其中所述生物燃料是选自由氢气、异戊二烯、甲烷、乙烷、丙烷和丁烷组成的群组的气体。
67.权利要求62的方法，所述方法进一步包括将所述一种或多种碳水化合物加工成生物塑料。
68.权利要求67的方法，其中所述生物塑料包含聚乳酸、聚-3-羟基丁酸或聚-3-羟基烷酸。
69.权利要求50-58中任一项的方法，其中所述期望的产物包含一种或多种类胡萝卜素。
70.权利要求69的方法，其中所述类胡萝卜素选自由β-胡萝卜素、玉米黄素、蓝溪藻黄素乙、myxol、海胆酮和它们的生物合成中间体组成的群组。
71.权利要求50-58中任一项的方法，其中所述期望的产物包含一种或多种藻青素或者相关化合物或衍生物。
72.权利要求50-71中任一项的方法，所述方法进一步包括将所述光能自养细菌产生的过量副产物加工成生物塑料、生物燃料、动物饲料添加剂或有机肥料中的一种或多种。
73.权利要求50-72中任一项的方法，其中合适的生长条件包括给所述光能自养细菌提供二氧化碳源。
74.权利要求73的方法，其中所述二氧化碳源是从烟道气提供。
75.权利要求73和74中任一项的方法，其中提供给所述光能自养细菌的二氧化碳的量占烟道气总体积的0.03-5.0％。
76.权利要求50-75中任一项的方法，其中合适的生长条件包括给所述光能自养细菌提供氮源。
77.权利要求76的方法，其中所述固定氮源是从地下水、氨或硝酸盐提供。
78.权利要求76和77中任一项的方法，其中提供给所述光能自养细菌的氮的量为0.03-5.0mM。
79.权利要求50-78中任一项的方法，其中合适的生长条件包括使所述光能自养细菌在10-55℃的温度范围生长。
80.权利要求50-79中任一项的方法，其中合适的生长条件包括使所述光能自养细菌照射阳光。
81.权利要求50-80中任一项的方法，其中所述光能自养细菌是蓝细菌、绿色硫细菌、绿色非硫细菌、螺杆菌、光合酸杆菌、紫色硫细菌或紫色非硫细菌。
82.权利要求81的方法，其中所述光能自养细菌是蓝细菌。
83.权利要求82的方法，其中所述蓝细菌是集胞藻。
84.权利要求83的方法，其中所述蓝细菌是集胞藻PCC 6803。
85.权利要求82的方法，其中所述蓝细菌是嗜热聚球藻。
86.权利要求85的方法，其中所述蓝细菌是嗜热蓝细菌聚球藻BP-1。
87.权利要求50-86中任一项的方法，其中所述一个或多个目的基因中的至少一个与组成型启动子可操作地连接。
88.权利要求87的方法，其中所述组成型启动子选自由psbDII、psbA3和psbA2组成的群组。
89.权利要求50-88中任一项的方法，其中所述一个或多个目的基因中的至少一个与诱导型启动子可操作地连接。
90.权利要求89的方法，其中所述诱导型启动子选自由nirA、isiAB、petE、nrsRS、nrsBACD和ndhF3组成的群组。
91.一种从光能自养细菌产生一种或多种期望的产物的方法，所述方法包括：
(i)获得权利要求1-49中任一项的经修饰的光能自养细菌和/或通过权利要求50-90中任一项的方法产生的经修饰的光能自养细菌；和
(ii)使所述光能自养细菌在合适的条件下生长以产生期望的产物。
92.权利要求91的方法，所述方法进一步包括分离期望的产物。
93.权利要求91和92中任一项的方法，其中所述一种或多种期望的产物是脂质、碳水化合物、类胡萝卜素、别的类异戊二烯、蛋白质或它们的混合物。
94.权利要求91-93中任一项的方法，其中所述一种或多种期望的产物是通过用有机溶剂、用超临界无毒溶剂如水或CO2进行提取或者通过两相分配来分离。
95.权利要求91-94中任一项的方法，所述方法进一步包括将所述一种或多种期望的产物加工成生物燃料、生物塑料、类胡萝卜素、动物饲料或肥料中的一种或多种。
96.一种固定二氧化碳的方法，所述方法包括：
(i)获得权利要求1-49中任一项的和/或通过权利要求50-90中任一项的方法产生的经修饰的光能自养细菌，所述经修饰的光能自养细菌能够吸收和固定二氧化碳；
(ii)在合适条件下生长该光能自养细菌以吸收和固定二氧化碳；
和
(iii)给所述经修饰光能自养细菌提供二氧化碳源；
其中该二氧化碳源的至少一部分二氧化碳被所述经修饰的光能自养细菌固定。
97.权利要求96的方法，其中所述二氧化碳源是烟道气，且其中所述烟道气中的至少一部分二氧化碳被所述经修饰的光能自养细菌固定。
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