CN105087604B - 一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用。所述应用中涉及的sll0147基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次公开了集胞藻PCC6803的sll0147基因在类胡萝卜素合成中的重要作用，通过申请人在集胞藻PCC6803中利用过表达方法增加sll0147基因的表达后，突变株中类胡萝卜素组分百分含量有明显变化，其中蓝藻叶黄素含量增加了47.4％，玉米黄素含量增加了93.8％，而海胆酮含量降低了60.9％，β‑胡萝卜素含量降低了15.9％。
Description
技术领域
本发明涉及一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用，特别涉及集胞藻PCC6803中sll0147基因在调控集胞藻PCC6803中玉米黄素生成中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
类胡萝卜素(Carotenoids)是胡萝卜素(Carotenes)和叶黄素(Xanthophylls)两大类色素的总称，通常是碳氢化合物及其氧化衍生物，由8类异戊二烯单位组成，是一类重要的天然色素，目前已发现的类胡萝卜素有700多种，常见的有α-胡萝卜素(α-Carotene)、β-胡萝卜素(β-Carotene)、玉米黄素(Zeaxanthin)、叶黄素(Lutein)和虾青素(Astaxanthin)等。
类胡萝卜素在自然界中分布广泛，主要由植物、藻类、蓝藻以及一些细菌、真菌等微生物合成，动物自身不能合成类胡萝卜素，只能通过食物链获取。在光合生物中，类胡萝卜素作为捕光色素成分参与光合作用和通过清除自由基的参与抗光氧化的保护作用，同时在动物和人类体内也发挥着重要作用。例如类胡萝卜素(尤其是β-胡萝卜素)是作为人体内维生素A的重要来源，类胡萝卜素如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素及叶黄素等具有很强的抗氧化活性，可以有效地抑制自由基的产生，阻断体内的链式自由基反应，阻止脂质过氧化，延缓衰老和老年动脉粥样硬化的形成。它同样可以治疗疾病并提高机体免疫力。同时，类胡萝卜素也具有较大的医用价值，人类摄食类胡萝卜素不仅可以预防眼病、心血管病的发生，还可以增强生物机体的特异性及非特异性免疫功能，增强肿瘤免疫。
目前，在国内外市场上，类胡萝卜素主要作为医药原料、功能食品、膳食补充剂和饲料色素，价格昂贵，市场需求量极大。功能性天然色素的类胡萝卜红素在医药、食品、化妆品等方面都有着良好的应用前景，它的开发应用将给农业、食品加工业、医药行业等相关的行业带来可观的经济效益，具有广阔的市场前景。类胡萝卜素的生产方法包括化学合成法、微生物发酵法和天然植物提取法三种。其中天然提取法正逐步成为类胡萝卜素生产的主要方法。从植物资源中提取主要是以果蔬为原料，存在成本高、生产工艺复杂、产品得率偏低等问题，目前此方法已不占主导地位。与植物相比，大多数的藻类能够合成类胡萝卜素，如蓝藻中的北冰洋聚球藻能合成玉米黄素、β-胡萝卜素、隐黄质等，红球藻(Haematococcuspluvialis)在氮磷饥饿条件下，细胞中的虾青素积累增大，绿藻中的杜氏藻(Dunaliella)能大量积累β-胡萝卜素。同时由于微藻不与农作物争地、争水；在环境胁迫如缺氮等条件下，有些单细胞微藻可大量积累类胡萝卜素，所以有很多利用微藻生产高附加值物质的研究。而随着代谢工程技术的发展及日趋成熟，通过改造、阻断及引入新的代谢途径来提高细胞内类胡萝卜素的含量，可以在提高目标产物的得率同时减少副产物的生成。
近年来，应用类胡萝卜素合成相关基因的转基因植物研究取得了较大进展。类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合酶(PSY)催化两个牻牛基牻牛基焦磷酸(GGPP)分子合成八氢番茄红素(phytoene)。PSY是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键调节酶，其编码基因成为植物类胡萝卜素遗传工程中的首选目的基因。GGPP是许多途径的反应前体，在番茄中过量表达PSY1基因时，GGPP大量转向合成类胡萝卜素，而赤霉素的合成水平下降。在油菜种子中过量表达细菌的PSY基因发现成熟的种子中类胡萝卜素含量增加了50倍。在水稻胚乳中共表达水仙的PSY基因、LCY基因和细菌的CRTI基因，结果转基因水稻种子胚乳中积累了大量β-胡萝卜素及其氧化产物叶黄体素、玉米黄质等，这种水稻米粒金黄，被誉为“金色水稻”。利用果实特异性启动子在番茄中过量或反义表达Lcy-b基因，结果发现过量表达的转基因植株果实中的β-胡萝卜素含量大量增加。过量表达番茄红素β-环化酶基因的转基因番茄，发现番茄红素向β-胡萝卜素的转化加强，而且总类胡萝卜素的含量也增加了50％以上。在拟南芥中过量表达胡萝卜素羟化酶(BCH)使叶黄素的含量增加，其他类胡萝卜素的含量并没有明显的降低。不过，通过基因工程技术提高植物的类胡萝卜素含量和种类，还面临着许多问题，如前体GGPP的供应与几种物质代谢调控的平衡等。
蓝藻(cyanobacteria)又称蓝细菌，是一类能进行光合作用的原核生物。蓝藻细胞可以利用简单的无机物合成有机物，所表达的外源基因产物不形成包含体，并且多数蓝藻及其提取物对人畜无毒，是转基因研究的良好受体。集胞藻PCC 6803(Synechocystissp.spPCC6803)做为一种单细胞蓝藻，具有生长速度快、培养条件简单、不产生毒素、细胞结构简单、遗传背景清楚、方便分子操作等特点，适合于利用广核生物反应器大规模生产，是很好的蓝藻基因工程受体。鉴于蓝藻表达的外源基因产物易纯化、不含毒素、藻细胞培养成本低且不容易污染等的优点，随着藻类基因工程的发展，使利用蓝藻作为外源基因表达载体以生产药物等高附加值产品成为可能。
集胞藻PCC6803中显著积累四种类胡萝卜素，即β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、海胆酮(Echinenone)和蓝藻叶黄素(Myxoxanthophyll)。目前，已经从集胞藻PCC6803中克隆到6个与类胡萝卜素合成有关的基因，它们参与了从牻牛基牻牛基焦磷酸(GGPP)的合成到β-胡萝卜素的羟基化与酮基化反应。分别为编码八氢番茄红素合成酶的crtB，编码八氢番茄红素脱氢酶的crtP，编码ζ-胡萝卜素脱氢酶的crtQ，编码β-胡萝卜素酮醇酶的crtO，编码β-胡萝卜素羟化酶的crtR，和编码胡萝卜素异构酶的crtH。
番茄红素是类胡萝卜素合成途径中的重要分支点，在不同环化酶的作用下形成一系列的胡萝卜素。已从聚球藻7942中克隆了编码番茄红素环化酶的crtL。近年来，在绿硫细菌中发现了一类新的双功能番茄红素环化酶基因CruA，在大肠杆菌中可以将番茄红素转化为γ-胡萝卜素。而在聚球藻7002(Synechococcus sp.PCC 7002)中也发现了同源基因CruA和CruP。集胞藻PCC6803中不含crtL-e，而尚未见有关crtL-b的报道。集胞藻PCC6803中sll0147基因与聚球藻CruA氨基酸相似性为63.32％，已有研究表明，sll0147的突变对番茄红素环化过程影响不明显，但尚没有对集胞藻PCC6803中sll0147基因在提高集胞藻PCC6803β-胡萝卜素合成方面应用的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用。利用过表达方法增加sll0147基因的表达后，发现转基因藻类胡萝卜素组分百分含量有明显变化，其中蓝藻叶黄素含量增加了47.4％，玉米黄素含量增加了93.8％，而海胆酮含量和β-胡萝卜素百分含量则明显降低，分别降低了60.9％和15.9％。
本发明技术方案如下：
一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用，所述的sll0147基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述应用，步骤如下：
(1)以psbA2ORF前500bp片段为启动子片段，与sll0147基因进行基因融合，制得融合片段Promotor+sll0147；
所述psbA2ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)制备同源重组上游臂slr1285U基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(3)制备同源重组下游臂slr1285D基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
(4)通过对质粒pKK233-2进行扩增，向大肠杆菌T1T2终止子中引入PstI、BamHI酶切位点，经PstI、BamHI内切酶酶切后，与同样经PstI、BamHI内切酶酶切的质粒pBluescriptSK连接，制得质粒pBluescript SK T1T2；
(5)用KpnI内切酶酶切步骤(2)制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段，与同样经KpnI内切酶酶切的步骤(4)制得的质粒pBluescript SK T1T2连接，制得质粒pBluescript SK T1T2-slr1285U；
(6)用SacI内切酶酶切步骤(3)制得的同源重组下游臂slr1285D基因片段，与同样经SacI内切酶酶切的步骤(5)制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285U连接，制得质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD；
(7)用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Gm，回收庆大霉素抗性Gm片段，与同样经BamHI内切酶酶切的步骤(6)制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD连接，制得质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD；
(8)将步骤(1)制得的融合片段Promotor+sll0147经SalI、EcoRI内切酶酶切后，与同样经SalI、EcoRI内切酶酶切的步骤(7)制得的质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD连接，制得重组载体p5S1285UDsll0147；
(9)将步骤(8)制得的重组载体p5S1285UDsll0147转化集胞藻PCC6803，经筛选，制得转基因集胞藻，然后经培养，提取，制得类胡萝卜素。
根据本发明优选的，所述步骤(4)扩增大肠杆菌T1T2终止子的扩增引物的核苷酸序列如下：
T1T2-F：5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；
T1T2-R：5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；
扩增程序如下：
94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存；
扩增体系如下：
2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物T1T2-F 1μL，反向引物T1T2-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。
根据本发明优选的，所述步骤(9)中的培养条件为：在28～32℃、35～45μE·m-2·s-1持续光照条件下，于BG-11培养基中振荡培养。
集胞藻PCC6803中的sll0147基因序列为2007个碱基，编码669个氨基酸。以psbA2ORF前500bp片段为启动子片段，与sll0147基因进行基因融合。以psbA2500bp启动子片段为上游臂，以psbA2ORF为下游臂，并插入卡那霉素抗性片段，构建同源重组载体，再进行遗传转化集胞藻PCC6803，增加集胞藻PCC6803内源基因sll0147的表达，得到集胞藻PCC6803sll0147基因过量表达的转基因突变藻株。
有益效果
1、本发明首次公开了集胞藻PCC6803的sll0147基因在类胡萝卜素合成中的重要作用，通过在集胞藻PCC6803中利用过表达方法增加sll0147基因的表达后，突变株中类胡萝卜素组分百分含量有明显变化，其中蓝藻叶黄素含量增加了47.4％，玉米黄素含量增加了93.8％，而海胆酮含量降低了60.9％，β-胡萝卜素含量降低了15.9％；
2、本发明首次在集胞藻PCC6803中过量表达sll0147基因，为对于提高集胞藻PCC6803中蓝藻叶黄素和玉米黄素含量、增强其生物量具有重要意义，这为集胞藻PCC6803中类胡萝卜素的研究提供了理论支持；
3、本发明在集胞藻PCC6803中，通过双同源重组方法增加sll0147基因在集胞藻PCC6803中的表达水平，显著提高了集胞藻PCC6803中类胡萝卜素，尤其是玉米黄素的含量。因此，该基因在集胞藻PCC6803中增加类胡萝卜素含量、增强其生物量具有重要意义，这为提高集胞藻PCC6803中类胡萝卜素的研究提供了新的思路。
附图说明
图1为集胞藻PCC6803 sll0147基因过量表达载体结构图；
图2为集胞藻PCC6803 sll0147基因过量表达突变体PCR扩增检测电泳图；
图3为集胞藻PCC6803 sll0147基因过量表达突变株生长曲线图；
图4为集胞藻PCC6803 sll0147基因过量表达突变株HPLC检测图。
具体实施方式
以下实施例描述了本发明在构建集胞藻PCC6803 sll0147基因过量表达及转化集胞藻PCC6803的方法及其在增加突变藻株类胡萝卜素含量方面的应用。下面结合说明书附图及实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
施例中所用实验材料来源如下：
大肠杆菌菌株(Escherichia coli)DH5α及快速连接载体T3购自北京全式金生物技术有限公司；
野生型集胞藻PCC6803购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库；
质粒pSDpbluescript SK购自天津博美科生物技术有限公司；
质粒PUC4k购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；
质粒pBluescript-Gm购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；
其它所使用的酶、试剂及试剂盒等均为市售产品。
实施例1
分离克隆用于构建转集胞藻PCC6803 sll0147基因过表达载体的sll0147基因cDNA片段、psbA2启动子片段，同源重组上游片段slr1285U cDNA片段和同源重组上游片段slr1285D cDNA片段。
集胞藻PCC 6803 psbA2启动子片段克隆：根据GenBank登陆的集胞藻PCC 6803(登录号：BA000022，AP012205)中将psbA2ORF前500bp作为启动子序列，设计引物：
Promotor-SalI-F:5’-AATGTCGACTGCCCAGATGCAGGCCTTC-3’；
Promotor-R：5’-GTAGAGCAGTTCACGCATTTGGTTATAATTCCTTAT-3’；
扩增程序如下：
94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得集胞藻PCC 6803 psbA2启动子片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
大肠杆菌T1T2终止子片段克隆：根据GenBank登陆的大肠杆菌T1T2片段序列设计引物：
T1T2-F：5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；
T1T2-R：5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃10min，4℃保存；
Promotor+sll0147片段克隆：
根据NCBI blast网站(http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)输入聚球藻7002CruA核苷酸序列(Genbank登录号：EF529626.1)，得到序列号为CP003265的集胞藻PCC6803中的sll0147基因序列，设计扩增引物(3'端加His标签)：
sll0147-F：5’-ATGCGTGAACTGCTCTAC-3’；
sll0147-His-EcoRI-R：5’-ATAGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGCTTGGATTGTTGAGCTA-3’
扩增程序如下:
94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。
PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得集胞藻PCC6803 sll0147基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
分别取psbA 2启动子片段和集胞藻PCC6803 sll0147基因片段2μl为模板，进行融合PCR反应，所用程序为：
94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸5min，2个循环；加入引物Promotor-SalI-F和sll0147-His-EcoRI-R各0.5μl，进行如下程序：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，25个循环；72℃延伸10min，4℃保存。连接到T3载体克隆载体后转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。获得Promotor+sll0147片段。
同源重组上游臂slr1285U基因片段克隆：
根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 slr1285序列(登录号为：CP003265.1)上游1627bp到上游624bp处作为上游臂，设计扩增引物：
Slr1285U-KpnI-F：5'-ATAGGTACCGAAACCTGGGTGAGTCTGGCT-3'
Slr1285U-KpnI-R：5'-ATAGGTACCTGTTGGAAGGTTGCTGATTACT-3'
扩增程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得同源重组上游臂slr1285U基因片段。
同源重组下游臂slr1285D基因片段克隆：
根据GenBank数据库中公布的集胞藻PCC6803 slr1285序列(登录号为：CP003265.1)上游611bp到slr1285ORF392bp处作为下游臂，设计扩增引物：
Slr1285D-SacI-F：5'-ATAGAGCTCTTTAGTGAAAAAATATTGAC-3'
Slr1285D-SacI-R：5'-ATAGAGCTCGTCATCAGCCAGCAAAATTGC-3'
扩增程序如下:94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。PCR反应结束后进行电泳切胶回收，获得同源重组下游臂slr1285D基因片段。
实施例2
集胞藻PCC6803 sll0147基因过表达载体的构建：
质粒pBluscript SK plus-T1T2的制备：
扩增大肠杆菌T1T2终止子的质粒pKK233-2(购自Clontech公司)，在其5’端引入PstI酶切位点，在其3’端引入BamHI酶切位点，所用引物为：
T1T2-F：5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；
T1T2-R：5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’；
扩增程序如下:
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后；72℃延伸10min，4℃保存；获得基因片段经PstI和BamHI双酶切后与经相同酶切的pBluescript SK连接，得到质粒pBluescript SK T1T2。
实施例1制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段用KpnI单酶切，回收slr1285U基因片段；用同样的方法单酶切质粒pBluescript SK T1T2，回收载体片段1。连接回收的slr1285U基因片段和载体片段1，转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得前期载体，命名为pBluescript SK T1T2-slr1285U。
连接反应体系为：
T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL，10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH2O 11μL，总反应体系为20μL。16℃连接过夜。
实施例1制得的同源重组下游臂slr1285D基因片段用SacI单酶切，回收slr1285D基因片段；用同样的方法单酶切pBluescript SK T1T2-slr1285U回收载体片段2。连接回收的slr1285D基因片段和载体片段2，转化大肠杆菌DH5α。通过筛选阳性克隆，获得前期载体，命名为pBluescript SK T1T2-slr1285UD。
连接反应体系为：
T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL，10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH2O11μL，总反应体系为20μL。16℃连接过夜。
将质粒pBluescript-Gm用BamHI单酶切，回收庆大霉素抗性Gm片段，质粒pBluescriptSKT1T2-slr1285UD用BamHI单酶切，回收载体片段3。连接回收的Gm片段和载体片段3，转化大肠杆菌DH5α，通过酶切筛选阳性克隆，获得卡那霉素抗性载体，命名为pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD。
连接反应体系为：
T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL，10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH2O11μL，总反应体系为20μL。16℃连接过夜。
将实施例1中得到的阳性克隆Promotor+sll0147质粒DNA用SalI、EcoRI酶切，回收基因片段Promotor+sll0147。同样，对含有T1T2终止子且具有庆大霉素抗性的质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD进行SalI、EcoRI单酶切，回收载体片段4。连接基因片段Promotor+sll0147和载体片段4，转化大肠杆菌DH5α。
连接反应体系为：
T4DNA连接酶1μL，载体片段3μL，目的片段3μL，10×T4DNA ligation Buffer 2μL，ddH2O11μL，总反应体系为20μL。16℃连接过夜。
通过酶切筛选阳性克隆，获得集胞藻PCC6803原核表达载体，命名为表达载体p5S1285UDsll0147，如图1所示。
通过自然转化方法(Williams,J.G.K.,1988.Construction of specificmutationsin photosystem II photosynthetic reaction center by geneticengineering methods in Synechocystis 6803.Methods Enzymol.167:766-778.)将构建好的载体导入集胞藻PCC6803中，经抗生素筛选，鉴定得到转基因阳性集胞藻，步骤如下：
取对数培养期(OD730＝0.6)的集胞藻PCC6803培养液30ml，在室温条件下，4500g离心8min，弃上清；加新鲜BG-11液体培养基洗涤一次后，加新鲜BG-11液体培养基至终浓度OD730＝4.8，并立刻用来转化；将收集的藻液分装到到1.5ml EP管中(每管400μl)，每管加5～10μg质粒，弱光条件下光照温育6小时，期间摇晃一次。将混合物涂到含有卡那抗生素(12μg/ml)的BG-11平板培养基上。约10天可见转化子。制得含sll0147基因过表达载体p5S1285UDsll0147的转基因集胞藻PCC6803。
实施例3
sll0147基因过量表达藻株PCR检测
以含表达载体p5S1285UDsll0147的转基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803为材料，提取总DNA进行PCR检测分析。具体方法如下：
采用中性酚试剂(购自Invitrogen公司)并利用玻璃珠震荡法从sll0147基因敲除和过表达的集胞藻和野生型集胞藻中提取DNA。具体操作步骤如下：取50ml OD730＝1.8的蓝藻，4℃，5000rpm离心10min收集藻细胞，加入0.4mL中性酚接0.4mL BG-11液体培养基，然后加入适量的直径为0.17mm左右的玻璃珠(购自sigma公司)至玻璃珠界面上方有0.5mL的悬浮液。通过涡旋振荡器以最大速率震荡1min，4℃，11900rpm离心10min，取上清液至新的1.5ml离心管中，加入0.5mL苯酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比25:24:1)，颠倒混匀15s，静置3～5min，4℃，11900rpm离心10～15min。取上清到新的1.5ml离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min。4℃，11900rpm离心10min。去上清，加入1ml 75％乙醇(v/v)，颠倒振荡几次，4℃，7500rpm离心10min。弃上清，室温下敞口晾干至沉淀透明，加入适量ddH2O溶解沉淀，制得sll0147基因过表达的集胞藻和野生型集胞藻总DNA。
以sll0147基因过量表达转基因集胞藻基因组DNA和野生型集胞藻DNA为模板，以Slr1285U-KpnI-F和Slr1285D-SacI-R为引物，进行PCR扩增，具体扩增程序如下：
94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃10min，4℃保存。电泳检测PCR产物如图2所示。
实施例4
集胞藻PCC6803 sll0147基因过表达突变藻株生长曲线测定
将野生型集胞藻PCC6803和sll0147基因过量表达转基因藻株分别接种于50mlBG-11液体培养基中，调节OD730＝0.1，于30℃，40μE.m-2.s-1持续光照条件下振荡培养(180rpm)，分别于1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天取样，通过测定OD730来监测其生长情况。
实施例5
集胞藻PCC6803 sll0147基因过表达突变藻株类HPLC检测
将野生型集胞藻PCC6803和sll0147基因过量表达转基因藻株分别接种于50mlBG-11液体培养基中，于对数生长期离心收集藻细胞，于液氮中冷冻干燥。用甲醇(HPLC级别)从冷冻干燥的野生型集胞藻PCC6803和sll0147基因过量表达转基因藻细胞中提取色素。通过高效液相色谱法(HPLC)分离类胡萝卜素，所用色谱柱型号为Spherisorb ODS24.0mm×250mm C18色谱柱，15分钟内乙酸乙酯梯度为0-100％，乙氰-水-三乙胺(体积比为9:1:0.01)流速为1ml/min。个别峰的吸收光谱利用光电二极管阵列检测器获得。β-carotene标准品购自美国Sigma公司。
经检测，结果如图4所示，利用过表达方法增加sll0147基因的表达后，发现转基因藻类胡萝卜素组分百分含量有明显变化。与野生型集胞藻PCC6803相比，蓝藻叶黄素含量和玉米黄素含量均有明显增加，而海胆酮含量和β-胡萝卜素则明显降低。其中蓝藻叶黄素含量增加了47.4％，玉米黄素含量增加了93.8％，而海胆酮含量和β-胡萝卜素百分含量则明显降低，分别降低了60.9％和15.9％。
Claims (5)
1.一种sll0147基因在提高集胞藻类胡萝卜素中蓝藻叶黄素和玉米黄素含量中的应用，所述的sll0147基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；步骤如下：
（1）以psbA2 ORF前500bp片段为启动子片段，与sll0147基因进行基因融合，制得融合片段Promotor+sll0147；
所述psbA2 ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）制备同源重组上游臂slr1285U基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
（3）制备同源重组下游臂slr1285D基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
（4）通过对质粒pKK233-2进行扩增，向大肠杆菌T1T2 终止子中引入PstI、BamHI酶切位点，经PstI、BamHI内切酶酶切后，与同样经PstI、BamHI内切酶酶切的质粒pBluescript SK连接，制得质粒pBluescript SK T1T2；
（5）用KpnI内切酶酶切步骤（2）制得的同源重组上游臂slr1285U基因片段，与同样经KpnI内切酶酶切的步骤（4）制得的质粒pBluescript SK T1T2连接，制得质粒pBluescriptSK T1T2-slr1285U；
（6）用SacI内切酶酶切步骤（3）制得的同源重组下游臂slr1285D基因片段，与同样经SacI内切酶酶切的步骤（5）制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285U连接，制得质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD；
（7）用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Gm，回收庆大霉素抗性Gm片段，与同样经BamHI内切酶酶切的步骤（6）制得的质粒pBluescript SK T1T2-slr1285UD连接，制得质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD；
（8）将步骤（1）制得的融合片段Promotor+sll0147经SalI、EcoRI内切酶酶切后，与同样经SalI、EcoRI内切酶酶切的步骤（7）制得的质粒pBluescript SK T1T2-Gm-slr1285UD连接，制得重组载体p5S1285UDsll0147；
（9）将步骤（8）制得的重组载体p5S1285UDsll0147转化集胞藻PCC6803，经筛选，制得转基因集胞藻，然后经培养，提取，制得类胡萝卜素。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）扩增大肠杆菌T1T2 终止子的扩增引物的核苷酸序列如下：
T1T2-F ：5’-ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’；
T1T2-R ：5’-TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）扩增大肠杆菌T1T2 终止子的扩增程序如下：
94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环后，72℃ 10min，4℃保存。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（4）扩增大肠杆菌T1T2 终止子的扩增体系如下：
2×Hifi PCR Mix 10μL，大肠杆菌基因组DNA模板1μL，正向引物T1T2-F 1μL，反向引物T1T2-R 1μL，ddH2O 7μL，总反应体系为20μL。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤（9）中的培养条件为：在28～32℃、35～45 μE·m-2·s-1持续光照条件下，于BG-11培养基中振荡培养。
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