CN107058138A

CN107058138A - 光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建

Info

Publication number: CN107058138A
Application number: CN201710024379.3A
Authority: CN
Inventors: 朱品宽; 曲耀; 卢正宇; 黄丽; 王奕文; 倪兵; 许玲
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法，所用背景菌株为亚洲型禾谷镰刀菌，对亚洲型禾谷镰刀菌中的一个小的LOV结构域蛋白编码基因Favvd进行敲除，获得能持续进行光响应的突变菌株。主要包括如下步骤：利用同源重组片段构建法，将目的基因Favvd的5'‑UTR和3'‑UTR分别与潮霉素基因Hph的上下游编码区融合，获得上下游融合片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型的原生质体中进行双交换同源重组，通过筛选鉴定获得在光诱导条件下高产类胡萝卜素的突变菌株ΔFavvd。该菌株产类胡萝卜素的效率显著提升，能持续响应光信号，具有培养简单，生长速度快，产率高的优点。

Description

光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建

技术领域

本发明涉及一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建，属于生物技术领域。

背景技术

类胡萝卜素是一类呈黄色、橙色或红色的多烯类化合物，因其分布广泛、结构多样及功能较多而成为一种重要的天然色素。它同时存在于植物、动物和微生物中。类胡萝卜素因其结构特性而具有多种生物功效，研究表明，类胡萝卜素可能具有防治心脏病、癌症、白内障和几种人体慢性疾病的作用和其他生物活性作用。此外，类胡萝卜素作为一种优良的食品添加剂和改善人类营养的营养增补剂，它的优良品质和效果，很久以来就被世界各国所公认，被誉为最有希望的抗氧化剂。类胡萝卜素由于其良好的应用前景及卓越的功能，长久以来备受人们青睐。从天然食物提取类胡萝卜素工艺复杂并且成本较高，因此通过微生物发酵法生产类胡萝卜素已成为研究热点。

在丝状真菌中，类胡萝卜素的合成非常普遍，类胡萝卜素使得真菌呈现从黄色到深红色等不同的颜色。许多镰刀菌表面呈现的红色色素是由于光诱导形成的链孢霉黄素(neurosporaxanthin)——一种酸性的脱辅基类胡萝卜素。链孢霉黄素最先在粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中发现。研究表明，粗糙脉孢菌的类胡萝卜素合成与其光响应过程有关。在粗糙脉孢菌中，蓝光受体是主要的光响应承担者，它含有三个组分：WC1、WC2和VVD，其中WC1是一个GATA锌指结构域的转录因子，它既有能够感应光的LOV结构域，又含有具有转录调节功能的锌指结构域，WC2也是一个GATA锌指结构域蛋白，它能够和WC1结合成为WCC复合体，在光照条件下结合在光响应基因的启动子上，启动基因的表达，VVD是一个小的LOV结构域蛋白，是由WCC复合体的下游光响应基因编码的，在光照时间延长或光照强度增加的情况下，VVD能够抑制WCC复合体的作用，解除WCC对光响应基因的调控，从而使光响应基因的表达恢复到原始水平，形成光适应现象。光响应基因中包含很多类型的基因，如参与孢子形成的基因、参与光修复的基因，以及大量参与次级代谢的基因，其中就包括类胡萝卜素生物合成相关的基因。

本发明采用同源重组法构建片段，PEG介导的原生质体转化法进行转化，将亚洲专化型禾谷镰刀菌的蓝光受体基因Favvd进行敲除，获得的突变体在光照条件下失去光适应能力，持续光照能导致该菌株维持较高的光响应水平，因此获得了一株在光照条件下高产类胡萝卜素的基因工程菌株，相对于普通野生型菌株，突变菌株的类胡萝卜素产量提高了约4倍。

发明内容

本发明的目的在于提供一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法。本发明的方法将丝状真菌禾谷镰刀菌中的蓝光受体基因进行敲除，从而获得发酵时高产类胡萝卜素的突变菌株。所述突变菌株产类胡萝卜素的效率显著提升，不仅发酵时类胡萝卜素产量高，并且培养简单，生长速度快，既可用于类胡萝卜素的工业发酵生产，又可为研究丝状真菌的光响应机制提供现实依据。

本发明采用将亚洲型禾谷镰刀菌(Fusarium asiaticum)的蓝光受体基因Favvd进行敲除的方法，获得了一株光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌突变菌株。本发明所采用的背景菌株EXAP-08是从芦笋上分离的一株禾谷镰刀菌，经ITS序列鉴定确定其为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)第六世系的亚洲专化型禾谷镰刀菌，该菌株是亚洲地区专有的一类禾谷镰刀菌。通过使用禾谷镰刀菌标准菌株PH-1蓝光受体基因Fgvvd的外围引物，对EXAP-08中的相关基因进行PCR扩增，将扩增产物进行测序和序列比对，发现该基因与Fgvvd序列相似性达到99％以上，再进行氨基酸序列比对和结构域分析，发现该基因编码的蛋白质与已经报道的其他几种真菌中的VVD蛋白高度相似，因此将其确定为亚洲专化型禾谷镰刀菌的蓝光受体基因，并命名为Favvd。该基因序列已经上传于NCBI数据库，编号为Genbank：KX907849。所述背景菌株亚洲型禾谷镰刀菌(Fusarium asiaticum)已在非专利文献Zhu P.,Wu L.,Liu L.et al.2013.Fusarium asiaticum:an emerging pathogenjeopardizing postharvest asparagus spears.Journal of Phytopathology 161(10):696-703.中进行了记载。

本发明所采用的背景菌株可以是任意已知的禾谷镰刀菌属的菌株，并不限于所述的亚洲专化型禾谷镰刀菌(Fusarium asiaticum)。

本发明首次利用真菌的光生物学原理来制备高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株，具体为：禾谷镰刀菌的蓝光受体WC-1和WC-2组成的WCC复合体在光照下能激活大多数光响应基因的表达，其中包括一个小的LOV结构域的蓝光受体编码基因Favvd的表达，当光照时间延长或光照强度增加时，FaVVD能抑制WCC复合体的这种刺激作用，从而使光响应基因的表达量恢复到原始水平，形成光适应现象；如果FaVVD缺失后，对WCC复合体的抑制作用消失，以上所述的光适应现象也将消失。本发明首次发现在禾谷镰刀菌中，蓝光受体能够通过光适应现象来调节类胡萝卜素的合成，因此，将基因Favvd敲除后，类胡萝卜素合成的光适应现象就会消失，相关基因会在持续光照下维持高表达水平，从而使类胡萝卜素的合成持续高效进行，这时就会在菌丝内积累大量的类胡萝卜素。这一原理的应用不仅使得镰刀菌能大量产生可用于工业生产的类胡萝卜素，而且可以用于研究真菌的光生物学的其他机理，是本研究领域的一项创新发明。

本发明是通过以下技术方法实现的，本发明涉及的光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建包括如下步骤：

对禾谷镰刀菌中的一个小的LOV结构域蛋白编码基因进行敲除，获得能持续进行光响应的突变菌株。利用同源重组片段构建法，将目的基因Favvd的5'-UTR和3'-UTR分别与潮霉素基因Hph的上下游编码区融合，获得上下游融合片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型的原生质体中进行双交换同源重组，通过筛选鉴定获得在光诱导条件下高产类胡萝卜素的突变菌株ΔFavvd。

该突变菌株的光响应基因包含类胡萝卜素合成相关基因，将蓝光受体基因Favvd敲除后，突变菌株能持续进行光响应，因此在持续光照条件下能大量产生类胡萝卜素。

所述LOV结构域蛋白编码基因是蓝光受体基因Favvd，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述蓝光受体基因编码的蛋白质FaVVD是禾谷镰刀菌光适应功能的承担者，缺失后禾谷镰刀菌无法进行光适应。

禾谷镰刀菌的光适应现象包括光照时间延长和光照强度增加时类胡萝卜素合成基因表达量的下调。光适应能力缺失后，在持续光照下，突变菌株类胡萝卜素合成基因持续高表达，从而产生大量类胡萝卜素。

采用同源重组技术敲除禾谷镰刀菌的蓝光受体基因Favvd，即用潮霉素抗性基因替代目的基因表达框区域来达到使目的基因突变的目的。

本发明光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：

(a)在潮霉素抗性基因Hph包含启动子的编码区的5'端连接蓝光受体基因Favvd的起始密码子上游大约1kb的非编码区，构建上游融和片段；

(b)在潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区的3'端连接蓝光受体基因Favvd的终止密码子下游大约1kb的非编码区，构建下游融和片段。

(c)采用PEG介导的原生质体转化法，将步骤(a)和步骤(b)获得的上游融和片段、下游融合片段进行扩增后，同时转入亚洲型禾谷镰刀菌(Fusarium asiaticum)EXAP-08的原生质体中。

其中，融合片段在转入野生型原生质体后利用其同源臂通过同源重组用潮霉素抗性基因替换蓝光受体基因Favvd。

具体地，所述方法包括：

(1)以野生型镰刀菌EXAP-08 DNA为模板，在基因Favvd的上游非编码区设计特异性引物Favvd-U-F、Favvd-U-R，利用这一对引物采用PCR技术扩增Favvd起始密码子前面的非编码区，得到第一片段。以质粒P22为模板，用引物U-Hph-F和U-Hph-R和PCR扩增含Olic启动子的潮霉素上游臂，得到第二片段。用融合PCR的方法将所述第一片段和第二片段融合成上游融合片段5'Favvd-U-Hph。

其中，所述Favvd-U-F、Favvd-U-R、U-Hph-F和U-Hph-R的序列如表1所示。

其中，所述扩增Favvd起始密码子上游非编码区的PCR技术的条件为：

(a)PCR体系：模板DNA2μl；上游引物2μl；下游引物2μl；2×高保真magic Mix 25μl，双蒸水19μl。

(b)PCR程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，4℃保存。

其中，所述Favvd起始密码子上游非编码区为964bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

其中，所述扩增潮霉素抗性基因Hph包含Olic启动子的编码区的PCR技术的条件为：

其中，所述潮霉素抗性基因Hph包含Olic启动子的编码区为1323bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

其中，所述第一片段和第二片段含有一段20bp左右的同源序列。

其中，所述融合PCR的条件为：

(a)PCR体系：第一片段900ng；第二片段900ng；上游引物Favvd-U-F 2μl；下游引物U-Hph-R2μl；2×高保真magic Mix 25μl，双蒸水补充体积至50μl。

(b)PCR程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸5min，34个循环，68℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物进行回收，得到上游融合片段。

其中，所述上游融合片段5'Favvd-U-Hph为2267bp。

(2)以野生型EXAP-08 DNA为模板，在基因Favvd的下游非编码区设计特异性引物Favvd-D-F、Favvd-D-R，利用这一对引物和PCR技术扩增Favvd终止密码子下游非编码区，得到第三片段；以质粒P22为模板，用引物D-Hph-F和D-Hph-R扩增潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区，得到第四片段；用融合PCR的方法，将第三片段和第四片段融合成为下游融合片段3'Favvd-D-Hph。

其中，所述Favvd-D-F、Favvd-D-R、D-Hph-F和D-Hph-R的序列如表1所示。

其中，所述扩增Favvd终止密码子下游非编码区的PCR技术的条件为：

其中，所述Favvd终止密码子下游非编码区为971bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

其中，所述扩增潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区的PCR技术的条件为：

其中，所述潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区为1313bp，核苷酸序列如SEQID NO:5所示。

其中，所述第三片段和第四片段含有一段20bp左右的同源序列。

其中，所述融合PCR的条件为：

(a)PCR体系：第三片段900ng；第四片段900ng；上游引物D-Hph-F 2μl；下游引物Favvd-D-R 2μl；2×高保真magic Mix 25μl，双蒸水补充体积至50μl。

(b)PCR程序：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸5min，34个循环，68℃终延伸10min，4℃保存。PCR产物进行回收，得到下游融合片段。

其中，所述融合片段3'Favvd-D-Hph为2264bp。

(3)PCR产物经割胶回收后用Takara pMD^TM18-T试剂盒克隆，转入大肠杆菌感受态细胞，涂板在含有氨苄青霉素的LB抗性平板上，挑取阳性克隆，液体LB中过夜培养后，从菌液中提取质粒，所得质粒经测序无误后，将连接有上游片段的质粒命名为PFavvd-U。将连接有下游片段的质粒命名为PFavvd-D。两个质粒均保存在-80℃冰箱中供再次敲除使用。

(4)突变菌株的获得与鉴定

利用PEG介导的原生质体转化法，将回收后的上、下游融合片段扩增产物转入野生型菌株EXAP-08的原生质体中，转化后的原生质体平铺在含有潮霉素抗性的CM平板上，将长出的单菌落挑取至潮霉素抗性板上，在潮霉素抗性平板上传3代，传至第4代时刮取菌丝，提取DNA和RNA进行DNA、RNA和Southern水平的鉴定，获得正确的蓝光受体突变体ΔFavvd。

其中，所述野生型菌株EXAP-08的原生质体的获得方法为：在生长三天的菌落边缘打取直径5mm菌碟，放入稻草培养基中(5个菌碟/50ml培养基)振荡培养，120rpm，25℃，四天后收集孢子。将孢子放入YEPD培养基中，使孢子终浓度为1×10⁶个/ml，振荡培养(120rpm，25℃)过夜，收集幼嫩菌丝，用无菌水洗一次，1.2M KCl洗一次，然后将菌丝放入酶液中裂解，每隔1.5小时用血球计数板观察一次裂解情况，待出现大量原生质体后用四层擦镜纸过滤收集原生质体备用。

其中，所述稻草培养基的配制方法为：称取30g干稻草，剪碎成2-3cm的长度，放入沸水中煮沸30分钟，先用三层纱布过滤，再用两层滤纸抽滤，滤液定容至100ml，高压蒸汽灭菌。

其中，所述酶液配制方法为：崩溃酶750mg；裂解酶450mg，溶于30ml 1.2M KCl中，120rpm，振荡1小时，4500rpm，离心5min，收集上清液，无菌滤器过滤。

其中，所述转化过程中的基因同源重组策略如图2所示。

其中，所述转化子DNA水平的鉴定包括：引物P3/P4鉴定目的基因是否成功突变，P5/P6鉴定抗性基因是否成功插入，P1/P4鉴定目的基因上游是否成功突变，P2/P3鉴定目的基因下游是否成功突变，P1/P6鉴定抗性基因上游插入位置是否正确，P2/P5鉴定抗性基因下游插入位置是否正确，引物序列见表2，引物位置见图2。RNA水平鉴定包括：鉴定潮霉素基因是否成功表达，鉴定目的基因是否表达，管家基因β-tubulin作为参照。Southernbloting鉴定融合片段插入位置是否正确。

表1同源重组片段构建所需引物

所述获得的正确的蓝光受体突变体菌丝在4℃冰箱中用CM或PDA斜面保存，孢子可用稻草培养基诱导产生，孢子悬浮液(1×10⁶个/ml)中加入甘油(终浓度20％)，在-80℃冰箱中保存。

(5)突变菌株类胡萝卜素的合成

本发明提出了由所述构建方法得到的光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株发酵生产类胡萝卜素的方法，类胡萝卜素的大量产生需要在持续光照、光照强度60Lux的条件下，在CM固体培养基上生长2～4天的菌落边缘打取菌碟，放入液体CM培养基中，25℃持续光照条件(如，光照强度60Lux)，振荡培养72h；光照强度越高，类胡萝卜素产生速率越快，产量越高。

本发明的一个具体实施方式中，所述基因工程菌株发酵生产类胡萝卜素的方法为：在CM固体培养基上生长3天的菌落边缘打取直径5mm的菌碟，放入液体CM培养基中(5个菌碟/50ml培养基)，振荡培养，120rpm，25℃，持续光照，培养72h后，突变菌株与野生型相比产生大量类胡萝卜素，对突变菌株的类胡萝卜素含量进行定量测定，结果显示野生型的类胡萝卜素产量为4.02mg/g，而突变菌株的产量可达到14.8mg/g。

其中，所述发酵生产类胡萝卜素的方法，需要在持续光照，光照强度60Lux，25℃的CM液体培养基中培养诱导类胡萝卜素的产生。所述CM液体培养基的组成为：30g蔗糖、2gNaNO₃、2.5g酸水解酪蛋白(N-Z Amine)、1g酵母提取物、1g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.5gKCl，蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌，灭菌后加入0.2ml微量元素母液和10ml维他命母液。

其中，所述微量元素母液的配方为：5g柠檬酸(citric acid)、5g ZnSO₄·6H₂O、1gFe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O、250mg CuSO₄·5H₂O、50mg MnSO₄、50mg H₃BO₃、50mg Na₂MoO₄·2H₂O、95ml蒸馏水。

所述维他命母液的配方为：4g肌糖(Inositol)、200mg泛酸钙(Ca pantothenate)、200mg氯化胆碱(Choline·Cl)、100mg硫胺素(Thiamine)、75mg维生素B6(Pyridoxine)、75mg烟酰胺(Nicotinamide)、50mg抗坏血酸(Ascorbic acid)、30mg核黄素(Riboflavin)、5mg(P-氨基苯甲酸)(p-aminobenzoic acid)、5mg叶酸(Folic acid)、5mg生物素(Biotin)、无水乙醇:水(体积比50:50)定容至1L。

微量元素母液和维他命母液配制完成后需要用无菌滤器过滤除菌后避光保存。

所述CM固体培养基的制备方法为：在1L体积的上述CM液体培养基中，加入20g琼脂粉，即制备得到所述CM固体培养基。

其中，所述类胡萝卜素的测定方法为：将上述持续光照下培养72h的菌丝用抽滤法收集，进行冷冻干燥，称取冷冻干燥后的菌丝200mg(或其整数倍)，放入研磨管中，同时加入500μL(或其整数倍)甲醇和750μL(或其整数倍)正己烷，以及3颗小钢珠(直径2mm)，在组织破碎仪中将菌丝体进行破碎，之后放入离心机中12000rpm离心10min，所得上清液即为类胡萝卜素粗提取液。吸取200μl上清液加入到96孔板中，利用酶标仪测定445nm处的吸光值。

本发明还提出了对类胡萝卜素合成相关基因CarA和CarB进行定量测定的方法，具体为：在固体CM培养基上铺玻璃纸，将野生型和突变体菌株的菌碟分别接种其上，每种菌接种两份，分别置于25±1℃环境下培养48h，其中一份在持续黑暗条件下培养，其中一份样品在培养至46h时转移至光照环境中，48h时刮取菌丝，迅速放入液氮中，利用Trizol法提取RNA并反转录为cDNA，然后进行荧光定量(Q-PCR)检测，利用引物Q-CarA F:GTTGCTTCCGGTCAAGAAATG和Q-CarB R:CCAGGACAGAGGAAGGTAGA对类胡萝卜素合成相关基因CarA进行定量，利用引物Q-CarB F:GGAGTCAAACGACAGCATCTT和Q-CarB R:AGTACAACAACCGCATCCTTAC对类胡萝卜素合成相关基因CarB进行定量，采集各个Q-PCR反应的CT值，使用2^–△△CT方法计算相对基因表达差异，分别以野生型菌丝在黑暗下的CarA和CarB基因表达量为对照。

所述Trizol法提取RNA的步骤可参考TRIzol Reagent(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)使用说明书。

本发明还提出了一种用于裂解镰刀菌幼嫩菌丝以制备原生质体的酶液的制备方法，具体方法为：崩溃酶750mg；裂解酶450mg，溶于30ml1.2M KCl中，120rpm，振荡1小时，4500rpm，离心5min，收集上清液，无菌滤器过滤。

本发明还提出了如上方法制备得到的所述用于裂解镰刀菌幼嫩菌丝以制备原生质体的酶液。

本发明还提出了所述酶液在裂解镰刀菌幼嫩菌丝以制备原生质体中的应用。

本发明还提出了一种由镰刀菌菌丝制备类胡萝卜素粗提取液的方法，具体操作为：将持续光照下培养72h左右的菌丝用抽滤法收集，进行冷冻干燥，称取冷冻干燥后的菌丝200mg(或其整数倍)，放入研磨管中，同时加入500μL(或其整数倍)甲醇和750μL(或其整数倍)正己烷，以及3颗小钢珠(直径2mm)，在组织破碎仪中将菌丝体进行破碎，之后放入离心机中12000rpm离心10min，所得上清液即为类胡萝卜素粗提取液。

本发明的有益效果在于：本发明采用同源重组技术，成功将禾谷镰刀菌的蓝光受体基因Favvd用潮霉素基因代替，获得了在持续光诱导条件下高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株ΔFavvd。所获得的突变菌株发酵产生类胡萝卜素的条件简单，不需要加入其它化学试剂或药品，不会对环境造成污染，具有培养简单，生长速度快，产量高等优点，具有实用潜力，也可用于研究真菌的光响应过程。

本发明所涉及的蓝光受体基因Favvd的基因序列已上传至NCBI数据库，序列号为：Genbank：KX907849。

附图说明

图1是本发明所用菌株的蓝光受体蛋白FaVVD与其他真菌中VVD蛋白氨基酸序列比对。图中所示序列依次为Aspergillus oryzae 3.042 hypothetical protein Ao3042_05945(Ao3042_05945,GenBank:EIT77819.1),Fusarium asiaticum VVD protein(FaVVD,GenBank:KX907849),Fusariumfujikuroiputative vivid PAS protein VVD(FjVVD,GenBank:KLO84159.1)，Fusarium graminearum PH-1hypothetical protein FGSG_08456(FGSG_08456,XP_011320312.1),Neurospora crassa OR74A vivid PAS protein VVD(NaVVD,XP_957606.3),Trichoderma reesei QM6a cellulose signaling associatedprotein envoy(ENVOY,XP_006968888.1)。

图2是同源重组法构建转化片段。首先将潮霉素基因的上游编码区与基因Favvd的上游非编码区1kb左右的片段进行融合获得上游融合片段，再将潮霉素基因的下游编码区与基因Favvd的下游非编码区1kb左右的片段进行融合获得下游融合片段，最后两个片段通过同源重组组成潮霉素Hph片段，进而将目的基因替换。图中所示引物的功能是检测突变的正确性，鉴定结果见图3，所用引物见表2。

图3是突变菌株鉴定图。(A)DNA水平鉴定结果，引物P3/P4鉴定显示目的基因已成功突变，P5/P6鉴定显示抗性基因已成功插入，P1/P4鉴定显示目的基因上游已成功突变，P2/P3鉴定显示目的基因下游已成功突变，P1/P6鉴定显示抗性基因上游插入位置正确，P2/P5鉴定显示抗性基因下游插入位置正确。(B)RNA水平鉴定结果，hph一行显示潮霉素基因成功表达，Favvd一行显示目的基因不表达，β-tubulin一行为管家基因作为参照。(C)Southern bloting鉴定结果，杂交结果显示，Favvd三株突变体插入位置正确，且不存在异位插入。

图4是突变菌株类胡萝卜素合成相关基因CarA、CarB定量表达情况。左图：CarA定量表达结果显示突变菌株ΔFavvd在光照下的CarA基因表达量显著高于野生型，是野生型的大约30倍。右图：CarB定量表达结果显示ΔFavvd在光照下的CarB基因表达量显著高于野生型，是野生型的大约60倍。突变菌株的两个基因CarA、CarB在黑暗下表达量均与野生型无明显差异。

图5是突变菌株发酵培养产生类胡萝卜素。发酵条件为液体CM培养基，25℃，持续光照(光照强度60Lux)120rpm振荡培养，在培养至72h时，突变菌株ΔFavvd在光照下产生明显的橘黄色色素，显著多于野生型EXAP-08和回补菌株ΔFavvd-com，而在黑暗下所有菌株都不产生橘黄色色素。

图6是不同菌株类胡萝卜素产量。定量测定图4所示的发酵瓶中的类胡萝卜素，结果显示光照条件下突变菌株的类胡萝卜素单位产量明显高于野生型和回补菌株，是野生型的大约4倍。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

以下实施例中使用的质粒以及试剂均可以通过公开的市售渠道获得。

实施例1、亚洲型禾谷镰刀菌蓝光受体基因Favvd的序列克隆

本发明所用的野生型菌株EXAP-08为芦笋上分离的一株亚洲型禾谷镰刀菌，属于禾谷镰刀菌复合种群的第六世系。由于该菌株未完成全基因组测序，因此首先从Broad数据库中查找出禾谷镰刀菌标准菌株PH-1的蓝光受体基因Favvd的基因序列，并在该基因表达框的非编码区域设计引物，以野生型EXAP-08的DNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增，扩增产物由公司进行测序。测序结果与其他几种真菌的蓝光受体基因Favvd进行氨基酸序列比对，发现序列同源性为57.46％(比对结果见图1)，以此将该基因假设为亚洲型禾谷镰刀菌的蓝光受体基因，命名为Favvd。

实施例2、敲除片段的构建

通过同源重组的方法，将蓝光受体基因Favvd用潮霉素抗性基因Hph替换敲除。具体实施步骤如下：

以野生型EXAP-08 DNA为模板，在基因Favvd的上游非编码区设计特异性引物Favvd-U-F和Favvd-U-R(表1)，利用这一对引物和PCR技术扩增Favvd起始密码子前面的964bp的非编码区。以质粒P22为模板，用引物U-Hph-F和U-Hph-R扩增含Olic启动子(1323bp)的潮霉素上游臂。扩增后得到的两个片段含有一段20bp左右的同源序列，用融合PCR的方法将2个片段融合成上游融合片段(2267bp，5'Favvd-U-Hph片段)。

以野生型EXAP-08 DNA为模板，在基因Favvd的下游非编码区设计特异性引物Favvd-D-F和Favvd-D-R，利用这一对引物和PCR技术扩增Favvd终止密码子下游非编码区约971bp。以质粒P22为模板，用引物D-Hph-F和D-Hph-R扩增含终止子的潮霉素后半部分(1313bp)，扩增后得到的两个片段含有一段20bp左右的同源序列，这2个片段融合成为下游融合片段(2264bp，3'Favvd-D-Hph)。

分别用引物Favvd-U-F、U-Hph-R和D-Hph-F和Favvd-D-R将上游融合片段和下游融合片段进行高保真扩增，得到的产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物在-20℃保存备用。

表2突变菌株鉴定引物

引物名称	核苷酸序列(5'→3')
		P1	AGAACGAACAACAAACA
P2	GTCCGATAAAAGCATAAGG
		P3	CTTGTTCCGAGTAATGGG
P4	TGATGGTCAGGAGGTTGT
		P5	CGGCGTAGGGTTGTTCC
P6	TGGCGACCTCGTATTGG

实施例3、突变菌株的获得与鉴定

用固体CM培养基培养野生型菌株(25℃，黑暗)，在生长三天的菌落边缘打取直径5mm的菌碟，将其放在装有液体稻草培养基的三角瓶中进行振荡培养(120rpm，25℃，光照)，4天后收集孢子，将收集好的孢子放在YEPD培养基中振荡(120rpm，25℃，光照)过夜，待其长出幼嫩菌丝，将幼嫩菌丝通过离心收集(4500rpm，10min)，之后采用PEG介导的原生质体转化法将上、下游融和片段一同转入原生质体中，将原生质体平铺在含有潮霉素抗性的CM培养基上，2天后将长出的转化子挑取在潮霉素抗性板上，并在潮霉素抗性板上继续传三代，将所有转化子在传至第四代时刮取菌丝，用CTAB法提取基因组DNA，对其进行DNA水平鉴定，确保目的基因已经被成功敲除，之后随机挑选3株转化子，分别在光照和黑暗下培养1天后刮取菌丝，并用Trizol法提取总RNA，反转为cDNA后进行转录水平的鉴定，确保目的基因已经不表达，最后进行Southern bloting鉴定有无异位突变，鉴定结果见图3，最终确定目标突变的正确性。

实施例4、突变菌株的类胡萝卜素合成相关基因表达量的定量测定

获得正确的突变菌株后，选取一株突变菌株首先对其类胡萝卜素合成相关基因的表达量进行定量测定。将直径5mm的菌碟接种在铺有玻璃纸的固体CM平板上，在黑暗，25℃条件下培养，生长46h后将一组放在光照下培养2h，另一组继续放在黑暗下，2h后刮取不同培养条件下的菌丝，利用Trizol法提取RNA，反转为cDNA后进行荧光定量(Q-PCR)检测，对类胡萝卜素合成相关基因CarA和CarB进行定量，采集各个Q-PCR反应的CT值，使用2^–△△CT方法计算相对基因表达差异。结果如图4。

由结果可以看出，在转录水平上，与野生型相比，突变菌株ΔFavvd在光照的诱导下，类胡萝卜素合成基因相关基因CarA和CarB表达量大大提高，增加约30倍和80倍，远远高于野生型EXAP-08在同等条件下的表达量，而在黑暗条件下，CarA和CarB的表达量与野生型相比无显著差异。

实施例5、突变菌株的发酵培养和类胡萝卜素产量测定

挑选一株突变体进行发酵培养和类胡萝卜素产量的测定，以野生型EXAP-08和回补菌株ΔFavvd-com作为对照。

将菌株培养在固体CM平板上，25℃，黑暗下培养3天，在菌落边缘打取直径5mm的菌碟，放入液体CM培养基中振荡培养(120rpm，25℃，光照强度60Lux)，黑暗条件下的培养作为对照。培养至72h时，突变菌株ΔFavvd的培养液出现明显的橘黄色(见图5)，利用抽滤法收集此时的菌丝，并将其进行冷冻干燥。

冷冻干燥后的菌丝进行类胡萝卜素生物量的测定：分别称取200mg菌丝，放入2ml研磨管中，同时向管中加入500μL甲醇和750μL正己烷，以及3颗小钢珠(直径2mm)，在组织破碎仪中将菌丝体进行破碎，之后放入离心机中12000rpm离心10min，取上清液，利用酶标仪测定445nm处的吸光值。类胡萝卜素的计算公式如下：

式中，X代表类胡萝卜素的含量，mg/g；A代表样品在445nm处的吸光值；V_T代表提取液的总体积，ml；A^％ _1cm代表胡萝卜素分子平均吸收系数，2500；g为测定样品的重量，g。

(测定结果见图6)

由结果可以看出：突变菌株ΔFavvd的类胡萝卜素产量在光照诱导下达到14.8mg/g，明显高于野生型和回补菌株，是野生型的大约4倍，说明将蓝光受体基因Favvd敲除后，突变体在光照下的类胡萝卜素合成量明显升高。

综上所述，本发明通过同源重组法将亚洲型禾谷镰刀菌中的蓝光受体基因Favvd进行敲除，获得了一株在光照条件下高产类胡萝卜素的基因工程菌株，该菌株具有培养简单、生长速度快、类胡萝卜素产量高的优点，可用于工业生产，也可用于研究真菌的光响应过程。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 696

<212> DNA

<213> Fusarium asiaticum

<400> 1

atggcatcta agacagttcc cgccatgaat ccctgggaag tcaatgctct taacgtgagt 60

ttctatcaga tatcacattt ctcaagaagc acttattgac ttggctagta cgagttccct 120

caagaaggtt ctctaaacgt tgacggctca gtgaactccg cgggcacttg gcgtcgagtt 180

caagaccctg tcatctaccc aggcctctat gctcccagtg gcattgatat catgtccatc 240

ttggtaagct tgcatatttc actctacctg ccatttacta accatcacca gttccgagta 300

atgggacgac caaaccccca agttgttttg ggccccgtcg actgctctgt cgcccttgtc 360

gtttgcgaca tggccggagc tgatgctccc gtcatctacg tctcggagtc tttcactgat 420

cttaccggat actcttctcg tgaagccgta ggccgaaact gtcgcttcct ccaagcaccg 480

cctggccagg agcgtcgtcc cgacaggaag ggtgcagaca aggtcgcctc acatcgcatg 540

cgccaggctc tcatggctgg gatggagatt cagacttctg tcaccaacta caagaagtac 600

gggcagccgt tcaacaacct cctgaccatc attccagtcc ctgccgacaa cactggcacc 660

tgttactgca tcggctttct atgtgaaatg gattag 696

<210> 2

<211> 964

<212> DNA

<213> Fusarium asiaticum

<400> 2

ggagaagtag accgatgggt accgatcgtg cgtaaggagc cggccaacaa cgatctctcc 60

aactgttcgg ggatcatgag aatcgaacac tctcaaccaa tcgttcatgt ctgatcccta 120

cccacatcga cgtttgtact gcagatacgc ctcatgtctc atgattcaaa ccccttccct 180

ctcatttttg aacggttgtt cagccactac cgattctctc ggtcaatatg taggtaaagt 240

agagatgagg ctgtagtaca agctgcactg cgatgaacca cagttcattc aactacaaca 300

tcaagaaaag cgtcaattcg gtcattgttc taaaaccata ttctgcaatc aaactgcgcc 360

tcttcaaaac cccaatgaca ggcggcacat cagcatcagc atcagcatca tgacaaccaa 420

cactaacatc tgaatactac acccacacca ttcggtccgt ctccacgccc ccaaatatcg 480

gccgtcgttg ttcttcgctt ctcagggtcc atcgcgattt gcattcggaa gtcttcaaag 540

cttccgcctc tgctacttta ccgtggttgt tattgcaaat ctgacctgtg ataactatcc 600

aaccagccgc atcccagaaa actccacgag ttccttctcg cttattacct gccagttcat 660

acatgcacca cactcataac atcccttcct ctcaatcgat cagtctgcca tccgataccg 720

agtcacatcc tccagcatat ccgcttccac tgatacctta ccaaccgctt acgccgtcat 780

actagaccta tccctggttt acttggccct atcgcactga gcccatacgg aaccagctct 840

atacagctgc atacttatct ctttcctcaa cctttatatg acggcctcaa tgcgcaccat 900

caacaactca ccattacatc tgagcttttc atcctcacgc tcaccctctc ctcattgttc 960

gacc 964

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> Hygromycin 人工序列

<400> 3

gctctagact gcagctgtgg agccgcattc ccgattcggg ccggattggt caagatttgc 60

gtccgaggtg ccgtctatca ttctagcttg cggtcctggg cttgtgactg gtcgcgagct 120

gccactaagt ggggcagtac cattttatcg gacccatcca gctatgggac ccactcgcaa 180

atttttacat cattttcttt ttgctcagta acggccacct tttgtaaagc gtaaccagca 240

aacaaattgc aattggcccg tagcaaggta gtcagggctt atcgtgatgg aggagaaggc 300

tatatcagcc tcaaaaatat gttgccagct ggcggaagcc cggaaggtaa gtggattctt 360

cgccgtggct ggagcaaccg gtggattcca gcgtctccga cttggactga gcaattcagc 420

gtcacggatt cacgatagac agctcagacc gctccacggc tggcggcatt attggttaac 480

ccggaaactc agtctccttg gccccgtccc gaagggaccc gacttaccag gctgggaaag 540

ccagggatag aatacactgt acgggcttcg tacgggaggt tcggcgtagg gttgttccca 600

agttttacac accccccaag acagctagcg cacgaaagac gcggagggtt tggtgaaaaa 660

agggcgaaaa ttaagcggga gacgtattta ggtgctaggg ccggtttcct ccccattttt 720

cttcggttcc ctttctctcc tggaagactt tctctctctc tcttcttctc ttcttccatc 780

ctcagtccat cttcctttcc catcatccat ctcctcaccc ccatctcaac tccatcacat 840

cacaatcgat ccgaattccg cggaattcat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt 900

cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg 960

cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa 1020

tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc 1080

gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg ggagtttagc gagagcctga cctattgcat 1140

ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt 1200

tctacaaccg gtcgcggagg ctatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag 1260

cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat 1320

atg 1323

<210> 4

<211> 971

<212> DNA

<213> Fusarium asiaticum

<400> 4

atcacagcca ttcaaaacga ctacaacact cgacggcaac gacgacaatg aaaacaatgt 60

gatgagatga ctctcatctt atacctcacg tcccccttgt cctttacgac tatacggcag 120

ggatataccc ctcgccaaac atacaacaac actcaaaatt ccaaagtacc gacacaaact 180

tcagtcttct cctcacctcc cctgcttcga cattgggtct tggtttcttt atgtcgttcc 240

ggtatcactg cttcaaggca ttcacgaata tttacgatac cctctacatt tcctttctcc 300

aaaacagtta cagctcatca cactggaagc acttcaaggt gttaaggtca cattcatcac 360

aacatatggt ttagcgttgt tttttagttc atcatttggg tctttactat catatcttga 420

tgatttacgc gccatgaagg ttacggattt ttagattgca ttttgctgga actcgggctc 480

gggcttgaat attacagcag catggttcgc gggaaagatc ttgttttctc gttttattat 540

agactctgct ctcaggcatg ggcatatctt gttaggcgct tcaggagtac acttgtctat 600

ttctcattac ctgttcctca tcatggaaca aggagttggc aggagtcagt tgggcatcaa 660

agtagctgat caatatggca tgagatcgtc aatgcaacat gaacgaccga acatcctgtt 720

attaggtgga ttatcgtatc cgatcataca ataaatataa ttgttccaac ttggttttgt 780

tacatacaat cagtacttta tcttgtgatt gaccggcgtt tccgaatcgc ctaacaacag 840

cccttgctga caggtctcga tctttacacc tccctgtctt ttcacgcgat cgagacaaaa 900

aaccaaccaa gacaaagcaa gtatagccaa gctgaatggg tctctcaacc cgttagctgt 960

caccgcctaa t 971

<210> 5

<211> 1313

<212> DNA

<213> Hygromycin 人工序列

<400> 5

aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag ttcgacagcg 60

tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc ttcgatgtag 120

gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac aaagatcgtt 180

atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt gacattgggg 240

agtttagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc acagggtgtc acgttgcaag 300

acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tacaaccggt cgcggaggct atggatgcga 360

tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg caaggaatcg 420

gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat gtgtatcact 480

ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc gatgagctga 540

tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat ttcggctcca 600

acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc gaggcgatgt 660

tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg ttggcttgta 720

tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga tcgccacgac 780

tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg gttgacggca 840

atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga tccggagccg 900

ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc gatggctgtg 960

tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg gcaaagaaat 1020

agagtagatg ccgaccggat ctgtcgatcg acaagctcga gtttctccat aataatgtgt 1080

gagtagttcc cagataaggg aattagggtt cctatagggt ttcgctcatg tgttgagcat 1140

ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata aaatttctaa 1200

ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc cagatccccc gaattaattc ggcgttaatt 1260

cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta ttaagttgtc taagcggatc ccg 1313

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggagaagtag accgatggg 19

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccacagctgc agtctagagc ggtcgaacaa tgaggagagg g 41

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccctctcctc attgttcgac cgctctagac tgcagctgtg g 41

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccctctcctc attgttcgac cgctctagac tgcagctgtg g 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttgtctaag cggatcccga tcacagccat tcaaaacga 39

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acagctaacg ggttgagaga 20

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcgttttgaa tggctgtgat cgggatccgc ttagacaac 39

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tcgttttgaa tggctgtgat cgggatccgc ttagacaac 39

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gttgcttccg gtcaagaaat g 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccaggacaga ggaaggtaga 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ggagtcaaac gacagcatct t 21

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agtacaacaa ccgcatcctt ac 22

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agaacgaaca acaaaca 17

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtccgataaa agcataagg 19

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cttgttccga gtaatggg 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgatggtcag gaggttgt 18

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cggcgtaggg ttgttcc 17

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tggcgacctc gtattgg 17

Claims

1.一种光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于，将产类胡萝卜素的菌株的蓝光受体基因进行敲除，得到所述光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述产类胡萝卜素的镰刀菌菌株，含亚洲型禾谷镰刀菌(Fusarium asiaticum)。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蓝光受体基因为一个小的LOV结构域蛋白编码基因Favvd，序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

(a)在潮霉素抗性基因Hph包含Olic启动子的编码区的5'端连接蓝光受体基因Favvd起始密码子上游非编码区，构建上游融合片段5'Favvd-U-Hph；

(b)在潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区的3'端连接蓝光受体基因Favvd终止密码子下游非编码区，构建下游融合片段3'Favvd-D-Hph；

(c)采用PEG介导的原生质体转化法，将步骤(a)和步骤(b)获得的上游融合片段、下游融合片段进行扩增后，同时转入产类胡萝卜素的菌株的原生质体中；

其中，所述Favvd起始密码子上游非编码区为964bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述潮霉素抗性基因Hph包含Olic启动子的编码区为1323bp，核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；

所述Favvd终止密码子下游非编码区为971bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述潮霉素抗性基因Hph包含终止子的编码区为1313bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，用于扩增所述蓝光受体基因Favvd起始密码子上游非编码区的特异性引物为Favvd-U-F、Favvd-U-R：

Favvd-U-F：GGAGAAGTAGACCGATGGG；

Favvd-U-R：CCACAGCTGCAGTCTAGAGCGGTCGAACAATGAGGAGAGGG；

用于扩增包含Olic启动子的编码区的潮霉素抗性基因Hph的引物为U-Hph-F、U-Hph-R：

U-Hph-F：CCCTCTCCTCATTGTTCGACCGCTCTAGACTGCAGCTGTGG；

U-Hph-R：CCCTCTCCTCATTGTTCGACCGCTCTAGACTGCAGCTGTGG；

用于扩增所述蓝光受体基因Favvd终止密码子下游非编码区的引物为Favvd-D-F、Favvd-D-R：

Favvd-D-F：GTTGTCTAAGCGGATCCCGATCACAGCCATTCAAAACGA；

Favvd-D-R：ACAGCTAACGGGTTGAGAGA

用于扩增包含终止子的编码区的潮霉素抗性基因Hph的引物为D-Hph-F和D-Hph-R：

D-Hph-F：TCGTTTTGAATGGCTGTGATCGGGATCCGCTTAGACAAC

D-Hph-R：TCGTTTTGAATGGCTGTGATCGGGATCCGCTTAGACAAC。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，扩增所述蓝光受体基因Favvd起始密码子上游非编码区的PCR体系为：产类胡萝卜素的菌株基因组DNA 2μl；上游引物Favvd-U-F 2μl；下游引物Favvd-U-R 2μl；2×高保真magic Mix 25μl，双蒸水19μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，得到第一片段；

用于扩增包含Olic启动子的编码区的潮霉素抗性基因Hph的PCR体系为：产类胡萝卜素的菌株基因组DNA2μl；上游引物U-Hph-F 2μl；下游引物U-Hph-R 2μl；2×高保真magic Mix25μl，双蒸水19μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，得到第二片段；

利用引物Favvd-U-F和U-Hph-R制备上游融合片段5'Favvd-U-Hph的PCR体系为：第一片段900ng；第二片段900ng；上游引物Favvd-U-F 2μl；下游引物U-Hph-R 2μl；2×高保真magic Mix 25μl，双蒸水补充体积至50μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸5min，34个循环，68℃终延伸10min，得到上游融合片段5'Favvd-U-Hph；用于扩增所述蓝光受体基因Favvd终止密码子下游非编码区的PCR条件为，PCR体系：产类胡萝卜素的菌株基因组DNA 2μl；上游引物Favvd-D-F 2μl；下游引物Favvd-D-R 2μl；2×高保真magic Mix 25μl，双蒸水19μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，得到第三片段；

用于扩增包含终止子的编码区的潮霉素抗性基因Hph的PCR条件为，PCR体系：产类胡萝卜素的菌株基因组DNA 2μl；上游引物D-Hph-F 2μl；下游引物D-Hph-R 2μl；2×高保真magicMix 25μl，双蒸水19μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，得到第四片段；

利用引物Favvd-D-R和D-Hph-F进行融合制备下游融合片段的PCR体系为：第三片段900ng；第四片段900ng；上游引物D-Hph-F 2μl；下游引物Favvd-D-R 2μl；2×高保真magicMix 25μl，双蒸水补充体积至50μl；PCR程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸5min，34个循环，68℃终延伸10min，得到下游融合片段3'Favvd-D-Hph。

7.如权利要求1～6之任一项所述的构建方法构建得到的光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株。

8.如权利要求7所述的光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株发酵生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述方法包括：在CM固体培养基上生长2～4天的光诱导型高产类胡萝卜素的镰刀菌基因工程菌株的菌落边缘打取菌碟，放入液体CM培养基中，25±1℃持续光照条件，振荡培养70～74h。

9.一种CM培养基，其特征在于，包括：30g蔗糖、2g NaNO₃、2.5g酸水解酪蛋白、1g酵母提取物、1g KH₂PO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.5g KCl，蒸馏水定容至1L，加入0.2ml微量元素母液和10ml维他命母液；

其中，所述微量元素母液的配方为：5g柠檬酸、5g ZnSO₄·6H₂O、1g Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O、250mg CuSO₄·5H₂O、50mg MnSO₄、50mg H₃BO₃、50mg Na₂MoO₄·2H₂O、95ml蒸馏水；

所述维他命母液的配方为：4g肌糖、200mg泛酸钙、200mg氯化胆碱、100mg硫胺素、75mg维生素B6、75mg烟酰胺、50mg抗坏血酸、30mg核黄素、5mg P-氨基苯甲酸、5mg叶酸、5mg生物素、无水乙醇:水(体积比50:50)定容至1L。

10.一种类胡萝卜素合成相关基因CarA和CarB定量测定的方法，其特征在于，在固体CM培养基上培养产类胡萝卜素的菌丝两份，分别置于25±1℃环境下培养48h，其中一份在持续黑暗条件下培养，另一份在黑暗下培养46h后转入光照下培养2h，刮取菌丝；利用TRIzol法提取RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量(Q-PCR)检测，利用引物Q-CarA F:

GTTGCTTCCGGTCAAGAAATG和Q-CarA R:FCCAGGACAGAGGAAGGTAGA对类胡萝卜素合成相关基因CarA进行定量，利用引物Q-CarB F:GGAGTCAAACGACAGCATCTT和Q-CarB R:AGTACAACAACCGCATCCTTAC对类胡萝卜素合成相关基因CarB进行定量，采集各个Q-PCR反应的CT值，使用2^–△△CT方法计算相对基因表达差异。

11.一种可用于裂解镰刀菌幼嫩菌丝以制备原生质体的酶液，其特征在于，所述酶液的制备方法包括以下步骤：崩溃酶750mg；裂解酶450mg，溶于30ml 1.2M KCl中，120rpm，振荡1小时，4500rpm，离心5min，收集上清液。

12.如权利要求11所述的酶液在裂解镰刀菌幼嫩菌丝以制备原生质体中的应用。

13.一种由镰刀菌菌丝制备类胡萝卜素粗提取液的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：将持续光照下培养72h左右的菌丝用抽滤法收集，进行冷冻干燥，称取冷冻干燥后的菌丝，同时加入甲醇和正己烷，以及小钢珠，在组织破碎仪中将菌丝体进行破碎，之后放入离心机中12000rpm离心10min，所得上清液即为类胡萝卜素粗提取液，其中，所述菌丝、甲醇和正己烷的用量比为200mg：500μL：750μL。