CN103882048A - 一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，特点是具体步骤如下：从盐生杜氏藻中克隆出玉米黄质合成的关键限速酶基因—β-胡萝卜素羟化酶基因，并将基因构建到穿梭表达载体pRL25C中，通过三亲接合方法转到鱼腥藻中，通过抗性筛选得到转基因的鱼腥藻，并经过16000Lx强光处理后，优点是实现转基因鱼腥藻的玉米黄质的含量较野生型藻有较大幅度的提高，最大可提高3.8倍。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种通过在鱼腥藻中表达盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因以提高玉米黄质含量的方法。
背景技术
玉米黄质（3，3'-二羟基-β-胡萝卜素）作为一种天然萜烯类不饱和类胡萝卜素，可通过Wittig方法化学合成。但化学合成的玉米黄质不仅难被人体吸收，甚至对人体有害，目前只有从天然植物或藻类提取的玉米黄质才具有抗氧化等生物活性。天然玉米黄质主要存在于蔬菜（菠菜、羽衣甘蓝、玉米、辣椒等）、花卉（金盏花、万寿菊花等）和水果（枸杞、甜橙）中，禽蛋的蛋黄中也存在玉米黄质（鸡蛋、鹌鹑蛋），但含量较低。玉米黄质和其他的类胡萝卜素一样，存在共轭双键结构，使得玉米黄质具备强抗氧化功效，可以阻断自由基链式传递。玉米黄质可防止脂质过氧化，而细胞脂质的过氧化与肿瘤的发生具有一定关系，因此玉米黄质具有清除自由基的能力，可有效预防癌症，科研人员对100名大肠癌和肺癌的患者血液进行检查，患者血液中的玉米黄质含量比健康者低大约20%。此外玉米黄质作为重要的营养素，抑制心血脑血管的脂质过氧化以达到预防心血管疾病和中风。玉米黄质在保护眼睛视力方面也有着不可替代的作用。氧化、光损伤是造成老年性黄斑变性和白内障的主要原因。据估计有超过1700万美国人有AMD症状，超过200万人遭遇功能性失明，而在中国也有数以万计的人遭遇白内障痛苦。玉米黄质在保护视力方面具有独特的生理功能。一些临床研究发现在饮食中提高膳食纤维或血清中玉米黄质和叶黄素的含量，可有效降低老年性黄斑变性和老年性白内障患病风险。
植物中合成类胡萝卜素途径表明，玉米黄质是通过一系列酶作用合成，其中β-胡萝卜素羟化酶（chyb）是玉米黄质合成过程中一个关键限速酶，它能以β-胡萝卜素为底物催化形成 β-隐黄素，β-隐黄素可进一步生成双羟基终产物玉米黄质。该酶是一种非血红素双铁加氧酶，它可能是通过获得光合电子传递链中铁氧还蛋白的电子，在含铁的酶活性中心利用活化的分子氧去打断β-胡萝卜素羟化酶C3（C3'）处的C-H键并形成羟基。植物能合成玉米黄质外，许多海洋微藻能在特定的条件下具有合成玉米黄质的能力，如蓝藻中的集胞藻6803、北冰洋聚球藻；绿藻中的盐生杜氏藻等，但是蓝藻中的鱼腥藻中玉米黄质的含量非常低。
鱼腥藻7120作为模式藻类，自身含有多种氨基酸、藻蓝蛋白及类胡萝卜素，可以作为微藻饲料，并能高效固氮而提供生物氮源。鱼腥藻7120于2001年继集胞藻6803完成全基因组测序，已经成为很多实验室研究工作中对象。随着三亲接合转化体系的完善，鱼腥藻7120目前已经成功表达了多种外源基因，成为蓝藻中可进行外源基因转移模式藻。转基因蓝藻在生物工程上具有广阔的应用前景，如药物重组，生产具有生物活性物质（抗肿瘤药物、疫苗），进行污水处理等等，对环境保护和医药研发方面产生不可估量的效益。盐生杜氏藻的显著特性是其在逆境胁迫下可合成比其他生物高很多的β-胡萝卜素来抵御不利环境，同时盐生杜氏藻中还有另一种类胡萝卜素——玉米黄质，因此，盐生杜氏藻chyb基因序列对提高其他植物中玉米黄质的含量具有很大的潜在价值。但是，盐生杜氏藻不易进行外源基因转移，且会出现整合不易、表达不稳、基因沉默等缺点，不利于采用代谢工程策略提高次生代谢产物含量或生产药用物质。
目前国内外还没有公开任何关于通过在鱼腥藻中表达盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因以提高玉米黄质含量的方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能使鱼腥藻在强光下大量积累玉米黄质的提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，具体包括以下步骤：
（1）提取盐生杜氏藻RNA，参照PrimeScript®RT Master Mix试剂盒说明，以RNA作为合成逆转录模板；
（2）盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因的获得
根据盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（登录号: JN118489）开放阅读框，设计上游引物chyb-orf-F：CGGGATCCATGCAGGCGCTACCGCTCCAG和下游引物chyb-orf–R： CGGAATTCCTACACTCTTTGGACGCCACAGCT，PCR反应体系为：dd H2O 9.5 μl，Premix Ex TaqTMHot
Start Version 12.5μl，chyb-orf–F 1μl，chyb-orf-R 1μl，盐生杜氏藻cDNA 1 μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得chyb目的基因条带，纯化回收连接到pMD-19T 克隆载体中，转化E.coli DH5a感受态细胞中，得到重组质粒pMD-19T-chyb；
（3）穿梭表达载体pRL-25C-chyb构建
将重组质粒pMD-19T-chyb 和穿梭表达载体pRL-25C同时进行BamH I和EcoR I双酶切，回收大、小目的片段，连接回收的目的基因片段和线性载体片段，16℃连接过夜，转化挑选阳性克隆，得到穿梭表达载体pRL-25C-chyb；
（4）供体菌的获得
将接合转移质粒pRL-443，辅助质粒pRL-623，pRL-25C-chyb质粒转化到感受态细胞HB101中，采用含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基筛选，挑选单菌落，得到供体菌；
（5）三亲接合
取一定体积对数期鱼腥藻，4000 rpm室温离心5 min，用新鲜的BG11液体培养基洗涤重悬两次，使其OD665达到0.3（1个OD浓度约4.5 ×107cells/mL）, 取一定体积的供体菌，4000 rpm室温离心5 min后用LB液体培养基洗涤重悬两次，调整浓度使其与鱼腥藻细胞浓度一致，将同浓度鱼腥藻与供体菌按3:1体积混匀后，光照培养24h；
（6）转基因鱼腥藻筛选
将混有供体菌的鱼腥藻涂至硝酸纤维素酯膜上，再将硝酸纤维素酯膜置于无抗BG11固体培养基，倒置光照培养3d， 再逐步将硝酸纤维素酯膜分别移至含7.5 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含15 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含20 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基和含30 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基上培养，挑选单藻落，移至含30 μg/mL卡那抗生素的BG11液体培养基中培养，逐级扩大培养，获得转基因鱼腥藻；
（7）转基因鱼腥藻检测
提取转基因鱼腥藻DNA作为模板，采用chyb-RT-F：CCGCCTCGTCTCAGGAATG；chyb-RT-R:
ACCGAGCCCACATCTCCATT作为引物，以野生鱼腥鱼腥藻DNA和质粒pRL-25C-chyb分别作为空白对照和阳性对照，进行PCR扩增；
（8）转基因鱼腥藻强光处理
将步骤（7）中PCR扩增成功的转基因鱼腥藻在普通光照下培养3天使盐藻处于对数生长期，然后在黑暗条件下饥饿培养16 h后，置于强光16000 Lx 下培养7天，即获得高玉米黄质含量的鱼腥藻。
步骤（7）中PCR扩增的体系和条件为：dd H2O 9.5 μl，Premix Ex TaqTMHot Start
Version 12.5μl，chyb-orf–F 1μl，chyb-orf-R 1μl，DNA 1 μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，检测chyb目的基因的整合情况。
所述的BG11液体培养基的配置方法如下：在800 mL水中加入50 mL贮备液1、2 mL贮备液2、2 mL贮备液3、2 mL贮备液4、1 mL贮备液5和0.61g Tris，混匀后将pH值调节至8.0，加水定容至1000 mL，高压灭菌备用，其中各贮备液成分如下表所示，
所述的BG11固体培养基的配置方法为BG11 液体培养基100 mL中加入0.8g琼脂粉，高压灭菌即可。
所述的含7.5 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入7.5 mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用；所述的含20μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入20 mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用；所述的含30μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入30mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用；所述的含30μg/mL卡那抗生素的BG11液培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加入30mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
所述的LB液体培养基的配置方法为：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，H2O 800 ml，调pH值到7.2，补充H2O到1000 ml，高压灭菌。
所述的含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基的配置方法如下：1000 ml LB液体培养基中加入15 g琼脂粉，高压灭菌，冷却至60℃时，分别加入50 mg卡那抗生素，34 mg氯霉素和50mg氨苄抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，该方法从盐生杜氏藻中克隆出玉米黄质合成的关键限速酶基因——β-胡萝卜素羟化酶基因，并将基因构建到穿梭表达载体pRL25C中，通过三亲接合方法转到鱼腥藻中，通过抗性筛选得到转基因的鱼腥藻。并经过强光处理后，实现转基因鱼腥藻的玉米黄质的含量较野生型藻有较大幅度的提高，最大可提高3.8倍。高产玉米黄质鱼腥藻藻株的获得，为通过鱼腥藻生物反应器规模化生产玉米黄质提供了优良藻株，生产的玉米黄质可用于治疗心血管疾病和癌症的治疗、眼睛保健和美容化妆等领域。
附图说明
图1是盐生杜氏藻chyb全长序列；
图2是穿梭表达载体pRL-25C-chyb构建示意图；
图3是未转基因鱼腥藻和转基因鱼腥藻玉米黄质含量图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，具体包括以下步骤：
1、提取盐生杜氏藻RNA，参照PrimeScript®RT Master Mix试剂盒说明，以RNA作为合成逆转录模板；
2、盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因的获得
根据盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（登录号: JN118489）开放阅读框，设计上游引物chyb-orf-F：CGGGATCCATGCAGGCGCTACCGCTCCAG和下游引物chyb-orf–R：
CGGAATTCCTACACTCTTTGGACGCCACAGCT，PCR反应体系为：dd H2O 9.5 μl，Premix Ex TaqTMHot
Start Version 12.5μl，chyb-orf–F 1μl，chyb-orf-R 1μl，盐生杜氏藻cDNA 1 μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得chyb目的基因条带，纯化回收连接到pMD-19T 克隆载体中，转化E.coli DH5a感受态细胞中，得到重组质粒pMD-19T-chyb；挑取重组子后送至上海生物生工工程股份有限公司进行测序，盐生杜氏藻chyb全长序列如图1所示，盐生杜氏藻chyb 基因全长为1433 bp，包含一个完整的开放阅读框，其长度为969 bp，编码322氨基酸序列。
3、穿梭表达载体pRL-25C-chyb构建
将重组质粒pMD-19T-chyb 和穿梭表达载体pRL-25C同时进行BamH I和EcoR I双酶切，回收大、小目的片段，连接回收的目的基因片段和线性载体片段，16℃连接过夜，转化挑选阳性克隆，得到穿梭表达载体pRL-25C-chyb；穿梭表达载体pRL-25C-chyb构建如图2所示，PCR检测及双酶切检测后送至上海生物生工工程股份有限公司测序，结果表明，盐生杜氏藻chyb基因已整合到穿梭表达载体pRL-25C中；
4、供体菌的获得
将接合转移质粒pRL-443，辅助质粒pRL-623，pRL-25C-chyb质粒转化到感受态细胞HB101中，用含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基筛选，挑选单菌落，得到供体菌；分别进行chyb基因和Ampr基因PCR检测，结果表明，供体菌中PCR扩增得到chyb基因和Ampr基因，说明供体菌转化成功；
5、三亲接合
取一定体积对数期鱼腥藻，4000 rpm室温离心5 min，用新鲜的BG11液体培养基洗涤重悬两次，使其OD665达到0.3（1个OD浓度约4.5 ×107cells/mL）, 取一定体积的供体菌，4000 rpm室温离心5 min后用LB液体培养基洗涤重悬两次，调整浓度使其与鱼腥藻细胞浓度一致，将同浓度鱼腥藻与供体菌按3:1体积混匀后，光照培养24h；
6、转基因鱼腥藻筛选
将混有供体菌的鱼腥藻涂至硝酸纤维素酯膜上，再将硝酸纤维素酯膜置于无抗BG11固体培养基，倒置光照培养3d， 再逐步将硝酸纤维素酯膜分别移至含7.5 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含15 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含20 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基和含30 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基上培养，挑选单藻落，移至含30 μg/mL卡那抗生素的BG11液体培养基中培养，逐级扩大培养，获得转基因鱼腥藻；
7、转基因鱼腥藻检测
提取转基因鱼腥藻DNA作为模板，采用chyb-RT-F：CCGCCTCGTCTCAGGAATG；chyb-RT-R:
ACCGAGCCCACATCTCCATT作为引物，以野生鱼腥鱼腥藻DNA和质粒pRL-25C-chyb分别作为空白对照和阳性对照，进行PCR扩增；其中PCR扩增的体系为：dd H2O 9.5 μl，Premix Ex TaqTMHot Start
Version 12.5μl，chyb-orf–F 1μl，chyb-orf-R 1μl，DNA 1 μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，检测chyb目的基因的整合情况；
8、转基因鱼腥藻强光处理
将步骤（7）中PCR扩增成功的转基因鱼腥藻在普通光照下培养5天后，置于强光16000 Lx 下培养7天，即获得高玉米黄质含量的鱼腥藻。
上述BG11液体培养基的配置方法如下：在800 mL水中加入50 mL贮备液1、2 mL贮备液2、2 mL贮备液3、2 mL贮备液4、1 mL贮备液5和0.61g Tris，混匀后将pH值调节至8.0，加水定容至1000 mL，高压灭菌备用，其中各贮备液成分如下表1所示，
表1 各贮备液成分
所述的BG11固体培养基的配置方法为BG11 液体培养基100 mL中加入0.8g琼脂粉，高压灭菌即可。
上述LB液体培养基的配置方法为：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，H2O 800 ml，调pH值到7.2，补充H2O到1000 ml，高压灭菌。LB固体培养基的配置方法为1000 ml LB液体培养基加入15 g琼脂粉，高压灭菌即可。
上述含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基的配置方法如下：1000 ml LB液体培养基中加入15 g琼脂粉，高压灭菌，冷却至60℃时，分别加入50 mg卡那抗生素，34 mg氯霉素和50mg氨苄抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
上述含7.5 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入7.5 mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
上述含20μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入20 mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
上述含30μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入30mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
上述含30μg/mL卡那抗生素的BG11液培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加入30mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
玉米黄质的提取：取高玉米黄质含量的鱼腥藻，离心后去上清，收集约0.1 g藻泥沉淀，加入1mL甲醇（含0.01% BHT，色谱纯），放置水平摇床，50 r/min 振摇过夜，12,000 rpm，4℃ 离心15 min，转移上清于干净的EP管，取200μl用于高效液相色谱检测。
高效液相色谱检测：色谱系统为：Aliance e2695 separations module HPLC系统（Waters, Milford, MA, USA），Waters 2998二极管阵列检测器。色谱条件为：色谱柱：ODS-C18（15 cm×4.6 mm, 5μm）。流动相A：甲醇，流动相B：超纯水。甲醇/水（9:1, v/v）洗脱22 min，100% 甲醇洗脱15 min，甲醇/水（9:1, v/v）洗脱 16 min。进样量为10μl，流速为0.8mL/min。检测波长为260 nm，柱温为25 ℃，样品温度维持在4 ℃。结果如图3所示，强光处理下的野生型鱼腥藻7120中玉米黄质相对含量比正常光下的增长19.7%，差异显著（P<0.05）。而转基因鱼腥藻7120中玉米黄素含量（36.4μg/g）相对于野生型对照组含量（22.9μg/g）增加了59%，差异极显著（P<0.01）。经强光处理后，转基因鱼腥藻玉米黄素含量（80.8μg/g）是正常光下转基因藻2.2倍（P<0.01），是强光野生藻含量的2.9倍（P<0.01），为正常光下野生藻含量的3.8倍（P<0.01）。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）提取盐生杜氏藻RNA，参照PrimeScript®RT Master Mix试剂盒说明，以RNA作为合成逆转录模板；
（2）盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因的获得
根据盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（登录号: JN118489）开放阅读框，设计上游引物chyb-orf-F：CGGGATCCATGCAGGCGCTACCGCTCCAG和下游引物chyb-orf–R：
CGGAATTCCTACACTCTTTGGACGCCACAGCT，PCR反应体系为：dd H2O 9.5 μl，Premix Ex TaqTMHot
Start Version 12.5μl，chyb-orf–F 1μl，chyb-orf-R 1μl，盐生杜氏藻cDNA 1 μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得chyb目的基因条带，纯化回收连接到pMD-19T 克隆载体中，转化E.coli DH5a感受态细胞中，得到重组质粒pMD-19T-chyb；
（3）穿梭表达载体pRL-25C-chyb构建
将重组质粒pMD-19T-chyb 和穿梭表达载体pRL-25C同时进行BamH I和EcoR I双酶切，回收大、小目的片段，连接回收的目的基因片段和线性载体片段，16℃连接过夜，转化挑选阳性克隆，得到穿梭表达载体pRL-25C-chyb；
（4）供体菌的获得
将接合转移质粒pRL-443，辅助质粒pRL-623，pRL-25C-chyb质粒转化到感受态细胞HB101中，采用含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基筛选，挑选单菌落，得到供体菌；
（5）三亲接合
取一定体积对数期鱼腥藻，4000 rpm室温离心5 min，用新鲜的BG11液体培养基洗涤重悬两次，使其OD665达到0.3（1个OD浓度约4.5 ×107cells/mL）, 取一定体积的供体菌，4000 rpm室温离心5 min后用LB液体培养基洗涤重悬两次，调整浓度使其与鱼腥藻细胞浓度一致，将同浓度鱼腥藻与供体菌按3:1体积混匀后，光照培养24h；
（6）转基因鱼腥藻筛选
将混有供体菌的鱼腥藻涂至硝酸纤维素酯膜上，再将硝酸纤维素酯膜置于无抗BG11固体培养基，倒置光照培养3d， 再逐步将硝酸纤维素酯膜分别移至含7.5 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含15 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基，含20 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基和含30 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基上培养，挑选单藻落，移至含30 μg/mL卡那抗生素的BG11液体培养基中培养，逐级扩大培养，获得转基因鱼腥藻；
（7）转基因鱼腥藻检测
提取转基因鱼腥藻DNA作为模板，采用chyb-RT-F：CCGCCTCGTCTCAGGAATG；chyb-RT-R:
ACCGAGCCCACATCTCCATT作为引物，以野生鱼腥鱼腥藻DNA和质粒pRL-25C-chyb分别作为空白对照和阳性对照，进行PCR扩增；
（8）转基因鱼腥藻强光处理
将步骤（7）中PCR扩增成功的转基因鱼腥藻在普通光照下培养3天使盐藻处于对数生长期，然后在黑暗条件下饥饿培养16 h后，置于强光16000 Lx 下培养7天，即获得高玉米黄质含量的鱼腥藻。
2.根据权利要求1所述的一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于：步骤（7）中PCR扩增的体系和条件为：dd H2O 9.5 μl，Premix Ex TaqTMHot
Start Version 12.5μl，chyb-orf–F 1μl，chyb-orf-R 1μl，DNA 1 μl，反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保存，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，检测chyb目的基因的整合情况。
3.根据权利要求2所述的一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于：所述的BG11液体培养基的配置方法如下：在800 mL水中加入50 mL贮备液1、2 mL贮备液2、2 mL贮备液3、2 mL贮备液4、1 mL贮备液5和0.61g Tris，混匀后将pH值调节至8.0，加水定容至1000 mL，高压灭菌备用，其中各贮备液成分如下表所示，
所述的BG11固体培养基的配置方法为BG11 液体培养基100 mL中加入0.8g琼脂粉，高压灭菌即可。
4.根据权利要求3所述的一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于：所述的含7.5 μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入7.5 mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用；所述的含20μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入20 mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用；所述的含30μg/mL卡那抗生素的BG11固体培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加8g琼脂粉，高温高压灭菌，冷却至60℃时，加入30mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用；所述的含30μg/mL卡那抗生素的BG11液培养基配置方法分别如下：取BG11 培养液1000 mL，加入30mg卡那抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
5.根据权利要求2所述的一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于：所述的LB液体培养基的配置方法为：蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，H2O 800 ml，调pH值到7.2，补充H2O到1000 ml，高压灭菌。
6.根据权利要求5所述的一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法，其特征在于：所述的含有50μg/mL卡那抗生素，34μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄抗生素的三抗LB固体培养基的配置方法如下：1000 ml LB液体培养基中加入15 g琼脂粉，高压灭菌，冷却至60℃时，分别加入50 mg卡那抗生素，34 mg氯霉素和50mg氨苄抗生素，倒入培养皿中冷却备用。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN101432436A (zh) * | 2004-08-16 | 2009-05-13 | 纳幕尔杜邦公司 | 类胡萝卜素羟化酶 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 章丽: "盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆及在鱼腥藻7120中的转化", 《宁波大学硕士学位论文》, 19 June 2013 (2013-06-19) * |
| 章丽等: "盐生杜氏藻β-胡萝卜素羟化酶基因（chyb）的克隆及表达分析", 《农业生物技术学报》, 31 August 2013 (2013-08-31), pages 920 - 930 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087604A (zh) * | 2015-09-10 | 2015-11-25 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种sll0147基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用 |
| CN105087627A (zh) * | 2015-09-10 | 2015-11-25 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 一种sll0659基因在合成集胞藻类胡萝卜素中的应用 |
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