CN101432436A - 类胡萝卜素羟化酶 - Google Patents
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Abstract
提供了从泡囊短波单胞菌DC263分离的用于生产羟化类胡萝卜素的新CrtZ类胡萝卜素羟化酶。此外,发现以前从Novosphingobiumaromaticivorans鉴定的一种假定蛋白具有类胡萝卜素羟化酶活性。两种羟化酶基因都表现出与以前报道的其它CrtZ羟化酶的低同源性。羟化酶在异源宿主细胞中的表达使得能够生产羟化类胡萝卜素。
Description
本申请要求2004年8月16日提交的美国临时申请No.60/601947的权益。
发明领域
本发明属于分子生物和微生物领域。更具体地,本发明涉及编码用于环状的羟化类胡萝卜素化合物的微生物制备的酶的核酸分子。
发明背景
类胡萝卜素是在自然界普遍存在的色素,由所有光合作用生物合成,并且在一些异养细菌和真菌中合成。类胡萝卜素给花、植物、昆虫、鱼类和鸟类提供颜色。类胡萝卜素的颜色从黄色到红色,具有棕色和紫色的变异。作为维生素A的前体,类胡萝卜素是我们的饮食的基本成分,它们在人类健康中起额外的重要作用。由于动物不能从头合成类胡萝卜素,它们必须通过饮食手段获得类胡萝卜素。因此,植物或细菌中类胡萝卜素生产和组成的操作可以提供类胡萝卜素的新的或改进的来源。类胡萝卜素的工业用途包括药物、食品添加剂、动物原料添加剂和化妆品中的着色剂,等等。
尽管在自然界鉴定出了超过600种不同的类胡萝卜素的存在,但在工业上,仅仅有少数类胡萝卜素被用于食品色素、动物原料、药物和化妆品。这很大程度是由于生产的困难。目前,用于工业目的的大多数类胡萝卜素是通过化学合成而生产的;但是,非常难以化学制备这些化合物(Nelis and Leenheer,Appl.Bacteriol.70:181-191(1991))。可以通过提取植物材料或通过微生物合成而获得天然类胡萝卜素。但是,仅仅有少数植物被广泛用于商业化的类胡萝卜素生产,并且这些植物中的类胡萝卜素生产能力是相对低的。因此,从这些植物生产的类胡萝卜素是非常昂贵的。
增加类胡萝卜素生物合成的生产能力的一种途径是应用重组DNA技术(综述于Misawa and Shimada,J.Biotech.,59:169-181(1998))。需要在非产类胡萝卜素细菌和酵母中生产类胡萝卜素,从而能够控制质量、数量和选择最合适和有效的生产生物。后者对于消费者的商业化生产经济学(因此对于可获得性)特别重要。
CrtZ型类胡萝卜素羟化酶是一类将羟基导入环状类胡萝卜素如β-胡萝卜素或角黄素的β-芷香酮环,以产生羟化的类胡萝卜素的酶。所述类胡萝卜素的实例包括虾青素、β-隐黄素、玉米黄素、3-羟基海胆酮、3′-羟基海胆酮、adonirubin、adonixanthin、四羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮、四羟基-β,β′-胡萝卜素-4-酮、眉藻黄素、erythroxanthin、nostoxanthin、屈曲黄素、3-羟基-γ-胡萝卜素、3-羟基-4-酮基-γ-胡萝卜素、细菌玉红黄素、bacteriorubixanthinal和黄体素。
已经报道了类胡萝卜素羟化酶基因来自多种细菌、真菌、藻类和植物物种。一些物种的实例包括但不限于斯氏泛菌(WO 03/016503;WO02/079395)、噬夏孢欧文氏菌(EP 393690 B1;Misawa et al.,J.Bacteriol.,172(12):6704-6712(1990))、草生欧文氏菌(Hundle et al.,MoI.Gen Genet,245(4):406-416(1994);Hundle et al.,FEBS Lett,315(3):329-334(1993);Schnurr et al.,FEMS Microbiol.Lett,78(2-3):157-161(1991);和US5684238)、Agrobacterium aurantiacum(Misawa et al.,J Bacteriol.,177(22):6575-6584(1995);US 5811273)、产碱菌物种(US 5811273)、黄杆菌物种(US 6677134;US 6291204;US 2002147371;WO 2004029275;和Pasamontes et al.,Gene,185(1):35-41(1997)),副球菌物种(CN1380415)、Haematococcus pluvialis(WO 00/061764;Linden,H.,Biochimica et Biophysica Acta,1446(3):203-212(1999)),和植物物种,如拟南芥(Tian,L.and DellaPenna,D.,Plant MoI.Biol.,47(3):379-388(2001);US 2002102631)。在微生物宿主细胞中重组表达了许多这些β-胡萝卜素羟化酶基因。但是,需要鉴定用于对商业上适于生产羟化类胡萝卜素,如虾青素和玉米黄素的微生物进行遗传工程化的新crtZ羟化酶基因。
此外,特别需要鉴定具有相对低到中度核酸序列同一性(即<70%的核酸同一性)的Crtz羟化酶,用于稳定表达多种羟化酶基因,因为高度同源的基因将难以整合,并且容易导致遗传不稳定性(即不需要的同源重组)。具有趋异核苷酸序列(相对于彼此)的CrtZ基因最适于在单个宿主细胞中表达多种羟化酶。当羟化酶活性成为类胡萝卜素生物合成途径中的限速步骤时,这特别重要。假定可获得的底物池不是限制性的,预计增加可以在生产宿主中同时表达的crtZ基因数目,可以增加类胡萝卜素产量。当优化需要的产物(即类胡萝卜素)的重组生产时,这特别重要。
因此,要解决的问题是提供用于类胡萝卜素(即玉米黄素和虾青素)的工程化生产的新crtZ羟化酶基因。
发明概述
本发明也通过提供从泡囊短波单胞菌DC263分离的新crtZ基因而解决了上述问题,所述基因可以用于在重组宿主细胞中生产类胡萝卜素。此外,已经发现以前鉴定为编码具有未知功能的假定蛋白的、来自Novosphingobium aromaticivorans的基因编码类胡萝卜素羟化酶。也提供了用本发明的CrtZ羟化酶生产羟化类胡萝卜素的方法。
因此,本发明提供了编码类胡萝卜素羟化酶的分离的核酸分子,其选自:
(a)编码SEQ ID NO:17所示氨基酸的分离的核酸分子;
(b)包含第一核苷酸序列的分离的核酸分子,所述第一核苷酸序列编码与包含SEQ ID NO:17所示氨基酸的多肽具有至少95%同一性的类胡萝卜素羟化酶;
(c)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子:0.1X SSC,0.1%SDS,65℃和用2X SSC,0.1%SDS洗涤,然后用0.1X SSC,0.1%SDS洗涤;和
(d)与(a)、(b)或(C)互补的分离的核酸分子。
此外,本发明提供了由本发明的核酸分子编码的多肽以及包含所述多肽的遗传嵌合体和转化的宿主。
在一种实施方案中,本发明提供了获得编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子的方法,该方法包括:
(a)合成至少一种相应于SEQ ID NO:16所示序列的一部分的寡核苷酸引物;和
(b)用步骤(a)的寡核苷酸引物扩增存在于克隆载体中的插入片段;
其中扩增的插入片段编码类胡萝卜素羟化酶。
在另一种实施方案中,本发明提供了生产羟化类胡萝卜素化合物的方法,该方法包括:
(a)提供生产具有至少一个β-芷香酮型环的环状类胡萝卜素的宿主细胞;
(b)用编码本发明的类胡萝卜素羟化酶的核酸分子转化(a)的宿主细胞;和
(c)在合适的条件下使(b)的转化的宿主细胞生长,从而生产羟化类胡萝卜素。
在另一种实施方案中,本发明提供了调节生物中环状的羟化类胡萝卜素生物合成的方法,该方法包括:
(a)提供包含类胡萝卜素生物合成途径的宿主细胞,所述宿主细胞生产具有至少一个β-芷香酮型环的环状类胡萝卜素;
(b)用编码本发明的类胡萝卜素羟化酶的核酸分子转化(a)的宿主细胞;和
(c)使(b)的转化的宿主细胞在使羟化类胡萝卜素生物合成受到调节的条件下生长。
附图简述、序列说明和生物保藏
图1显示了通过酮酶从多种可能的前体制备虾青素的途径,和从β-胡萝卜素进行的羟化酶反应。
图2显示由泡囊短波单胞菌DC263和Sphingomonas melonis DC18生产的天然类胡萝卜素的HPLC分析。
图3显示由生产玉米黄素的大肠杆菌菌株生产的类胡萝卜素的HPLC分析,所述菌株表达来自泡囊短波单胞菌DC263或Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278的crtZ基因。
图4显示由生产虾青素的大肠杆菌和甲基单胞菌种16a菌株生产的类胡萝卜素的HPLC分析,所述菌株表达来自泡囊短波单胞菌DC263的crtZ基因。
图5显示由生产虾青素的大肠杆菌和甲基单胞菌种16a菌株生产的类胡萝卜素的HPLC分析,所述菌株表达来自aromaticivoransATCC No.700278的crtZ基因。
下列序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求---序列规则”),并符合世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(管理说明的规则5.2和49.5(a-bis),以及第208节和附录C)。应用于核苷酸和氨基酸序列信息的符号和格式遵循37 C.F.R.§1.822所述规则。
SEQ ID NO:1是用于16S rRNA基因测序的引物("HK12")的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是用于16S rRNA基因测序的引物("JCR14")的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是用于16S rRNA基因测序的引物("JCR15")的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是泡囊短波单胞菌DC26316S rRNA基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是Sphingomonas melonis DC1816S rRNA基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是来自肠杆菌科DC260(US 10/808979)的crtEXYIBZ类胡萝卜素合成基因簇的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是引物pWEB260F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是引物pWEB260R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是引物pWEB404F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是引物pWEB404R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是来自成团泛菌DC404(US 10/808807)的crtEidiYIB类胡萝卜素合成基因簇的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是泡囊短波单胞菌DC263crtW酮酶(US 60/531310)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是Sphingomonas melonis DC18crtW酮酶(US60/531310)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是引物pEZ263-F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是引物pEZ263-R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是泡囊短波单胞菌DC263 crtZ类胡萝卜素羟化酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17是泡囊短波单胞菌DC263 CrtZ类胡萝卜素羟化酶的推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是Agrobacterium aurantiacum CrtZ类胡萝卜素羟化酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是引物crtZ-DC263_F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22是引物crtZ-DC263_R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23是引物41ZSPH_F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是引物SPH_ZR的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25是引物crt-260_F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是引物crt-260SOE_R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27是引物crt-260SOE_F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是引物crt-260RI_R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29是引物crt-260RI_F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是引物crt-260_R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31是引物crtW-263_F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是引物crtW-263_R的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33是引物crtW-263_F2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是引物crtW-263_R2的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35是用于扩增来自甲基单胞菌16a的Phps1启动子的第一引物。
SEQ ID NO:36是用于扩增来自甲基单胞菌16a的phps1启动子的第二引物。
SEQ ID NO:37是引物crtW_sphingo_F的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是引物crtW_sphingo_R的核苷酸序列。
申请人业已按照布达佩斯条约有关用于专利程序的微生物保藏的国际认可的规定进行了以下生物学保藏:
保藏人鉴别参考 | 国际保藏号 | 保藏日 |
甲基单胞菌16a | ATCC PTA 2402 | 2000年8月22日 |
在本文中,"ATCC"表示美国典型培养物保藏中心,位于10801University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,U.S.A。"国际保藏号"是由ATCC为保藏的培养物确定的保藏号。
所列出的保藏物应当在指明的国际保藏机构保藏至少30年,并且在披露它的专利获得授权之后可以公众可以得到。所述保藏物的可获得性并不构成许可以损害通过政府行为授予的专利权的形式来实施本发明。
发明详述
本发明的crtZ基因及其表达产物,即类胡萝卜素羟化酶,可以用于建立具有生产羟化类胡萝卜素化合物的能力的重组生物。从命名为泡囊短波单胞菌DC263的细菌菌株分离了编码类胡萝卜素羟化酶的新核酸分子。此外,将来自Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278( ZP_00094836.1)的一种假定蛋白鉴定为类胡萝卜素羟化酶,其可以用于采用本发明的方法生产羟化类胡萝卜素化合物。
在经过工程化以生产合适底物(如β-胡萝卜素或角黄素)的转基因微生物宿主中表达了本发明的crtZ羟化酶基因。通过在异源宿主中生产羟化类胡萝卜素(例如玉米黄素或虾青素)而测量基因的功能表达。
本发明的类胡萝卜素羟化酶基因可以用于多种生产或调节环状的羟化类胡萝卜素化合物的途径中。本发明的crtZ羟化酶基因可以用于在具有生产合适底物的能力的异源宿主中生产类胡萝卜素。此外,本发明的crtZ羟化酶基因可以与异源宿主中的一种或多种趋异的类胡萝卜素羟化酶基因同时共表达,以优化羟化类胡萝卜素的生产。由于本发明的crtZ基因与其它已知crtZ羟化酶具有相对低到中度的核苷酸序列同一性,同时表达所述crtZ基因应该是可能的。相对低/中度核苷酸序列同一性增加了多种CrtZ羟化酶在微生物生产宿主中稳定表达以便进行最优的类胡萝卜素生产的可能性。
此处描述的基因和基因序列使得人们能够将羟化类胡萝卜素的生产直接掺入工业上合适的微生物宿主细胞中。这方面使得任何掺入了这些基因的微生物菌株成为更理想的生产宿主。生产的类胡萝卜素可以从生产宿主分离,用于多种应用中,包括动物原料。任选地,可以将重组微生物宿主细胞直接掺入动物原料(无类胡萝卜素分离步骤),这是因为存在已知加入需要的着色和健康益处的类胡萝卜素。鱼(如鲑鱼和鳟鱼)和虾水产养殖是本发明的特别有用的应用,因为类胡萝卜素着色对于这些生物的价值是特别重要的(F.Shahidi and J.A.Brown,Critical Reviews in Food Science,38(1):1-67(1998))。具体地,作为一种类胡萝卜素的虾青素目前被用于水产养殖业。
在本公开内容中,应用了大量术语和缩写。相关定义如下所述。
“可读框”缩写为ORF。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
此处用到的“分离的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物,它们是单链或双链的,任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式中的分离的核酸分子可以包含cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段。
此处用到的术语"pBHR-crt1"是指产生β-胡萝卜素的质粒。该质粒是通过将来自斯氏泛菌(ATCC 8199)的crtEXYIB类胡萝卜素基因簇克隆到pBHR1(MoBioTech,Goettingen,Germany;参见WO 02/18617,其相应于US 09/941947,在此引入作为参考)中而构建的。得到的质粒含有在氯霉素抗性基因启动子控制下表达的斯氏泛菌基因簇。
此处用到的术语"pDCQ300"是指生产β-胡萝卜素的质粒。该质粒是通过将来自斯氏泛菌(ATCC No.8199)的类胡萝卜素基因簇crtEYIB克隆到pTrcHis2-Topo载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中而构建的。
此处用到的术语“pDCQ301”是指生产β-胡萝卜素的质粒,该质粒是通过将含有crtEYIB基因簇的pDCQ300的4.5kB EcoRI片段克隆到载体pBHR1(MoBiTec)的唯一EcoRI位点中而构建的。在pDCQ301中,将唯一的MfeI位点工程化到crtE和crtY的基因间区域中。
此处用到的术语"pDCQ329"是指生产β-胡萝卜素的质粒。该质粒是通过将分离自肠杆菌DC260的crtEXYIB基因簇克隆到宽宿主范围的载体pBHR1(US 10/808979)中而构建的。
此处用到的术语"pDCQ330"是指生产β-胡萝卜素的质粒。该质粒是通过将来自成团泛菌DC404的crtEidiYIB类胡萝卜素基因簇克隆到宽宿主范围的载体pBHR1(US10/808807和US60/527083)中而构建的。
此处用到的术语"pDCQ340"是指表达来自肠杆菌DC260的crtEYIB基因簇的质粒。去除了天然基因簇中的crtX基因。将基因簇克隆到载体pBHR1中。
此处用到的术语"pDCQ342"是指表达crtWEYIB基因簇的质粒。将来自泡囊短波单胞菌的crtW编码序列克隆到pBHR1中来自肠杆菌DC260的crtEYIB基因簇的上游。
此处用到的术语"pDCQ342TA"是指表达来自泡囊短波单胞菌DC263的crtW基因的质粒,该基因克隆到pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)中。
此处用到的术语"pDCQ344"是指表达crtZWEYIB基因簇的质粒。将来自泡囊短波单胞菌DC263的crtZ编码序列克隆到pDCQ342的crtWEYIB基因簇的上游,得到生产虾青素的质粒。
此处用到的术语"pDCQ352"是指表达来自泡囊短波单胞菌DC263的crtZ基因的质粒,该基因克隆到pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)中。
此处用到的术语"pDCQ363"是指包含从甲基单胞菌种16a扩增并且克隆到pBHR1中的phps1启动子的质粒。
此处用到的术语"pDCQ364"是指包含克隆到质粒pDCQ363中的来自Novosphingobium aromaticivorans的crtZ基因的编码序列的质粒。
此处用到的术语"pDCQ365"是指包含克隆到质粒pDCQ364中的来自Sphingomonas melonis DC18的crtW基因的编码序列的质粒。来自Sphingomonas melonis DC18的crtW基因的编码序列和来自Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278的crtZ基因的编码序列在来自甲基单胞菌种16a的phps1启动子的控制下作为一个转录单位共表达。
此处用到的术语"pDCQ366"是指包含克隆到β-胡萝卜素合成质粒pDCQ330中的来自pDCQ365的crtWZ转录单位的质粒,得到能够生产虾青素的质粒。
此处用到的术语"pDCQ370TA"是指表达克隆到pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)中的来自泡囊短波单胞菌DC263的crtZ基因的质粒。其掺入了侧翼于pDCQ352中的crtZ基因的不同的限制位点。
此处用到的术语"pTrc-His2-crtZ(Sphingo)"是指表达克隆到pTrcHis2-TOPO载体(Invitrogen)中的来自Novosphingobiumaromaticivorans ATCC No.700278的crtZ基因的编码序列的质粒。
此处用到术语"类异戊二烯"或"萜类化合物"是指这样的化合物,它们是衍生自类异戊二烯途径的任何分子,包括10碳萜类化合物及其衍生物,如类胡萝卜素和叶黄素。
此处用到的术语“类胡萝卜素”只指包含由五碳异戊二烯单元缩合形成的多烯主链的化合物。类胡萝卜素可以是非环状的,或以一个(单环)或两个(双环)环状端基终止。术语“类胡萝卜素”可以包括胡萝卜素和叶黄素。“胡萝卜素”是指烃类的类胡萝卜素。包含羟基-、甲氧基-、氧代-、环氧-、羧基-或醛官能团形式,或糖苷、糖苷酯或硫酸酯内的一个或多个氧原子的胡萝卜素衍生物被通称为“叶黄素”。特别适于本发明的类胡萝卜素是单环和双环类胡萝卜素。
此处用到术语“类胡萝卜素生物合成途径”是指包含上游类异戊二烯途径和/或下游类胡萝卜素生物合成途径的成员的基因。
此处用到的术语“上游类异戊二烯途径”、“类异戊二烯途径”和“上游途径”可以互换使用,并且是指参与将丙酮酸和甘油醛-3-磷酸转化为法呢基焦磷酸(FPP)的酶。编码这些酶的基因包括,但不限于:类异戊二烯途径中的"dxs"基因(编码1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶);"dxr"基因(编码1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶);"ispD"基因(编码2C-甲基-D-赤藓糖醇胞苷酰转移酶;也称作ygbP);"ispE"基因(编码4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基赤藓糖醇激酶;也称作ychB);"ispF"基因(编码2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环状二磷酸合酶;也称作ygbB);"pyrG"基因(编码CTP合酶);参与二甲基烯丙基二磷酸酯形成的"lytB"基因;参与2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸合成的"gcpE"基因;"idi"基因(负责IPP在分子内转化为二甲基烯丙基焦磷酸);和"ispA"基因(编码香叶基转移酶或法呢基二磷酸合酶)。
此处用到的术语“下游类胡萝卜素生物合成途径”和“下游途径”可以互换使用,是指将FPP转化为一组类胡萝卜素的酶。这些包括酶包括参与diapophytoene(其合成代表C30类胡萝卜素的生物合成中特有的第一步)或八氢番茄红素(其合成代表C40类胡萝卜素的生物合成中特有的第一步)合成的基因和基因产物。导致产生多种C30-C40类胡萝卜素的所有后续反应包括在下游类胡萝卜素生物合成途径中。这些基因和基因产物包括所有“crt”基因,包括但不限于:crtM,crtN,crtN2,crtE,crtX,crtY,crtI,crtB,crtZ,crtW,crtO,crtA,crtC,crtD,crtF和crtU。最后,术语“下游类胡萝卜素生物合成酶”是开放式的术语,是指下游途径中的任何和所有酶,包括但不限于:CrtM,CrtN,CrtN2,CrtE,CrtX,CrtY,CrtI,CrtB,CrtZ,CrtW,CrtO,CrtA,CrtC,CrtD,CrtF和CrtU。
“C30 diapocarotenoids”由6个类异戊二烯单元组成,它们的连接方式使得类异戊二烯单元的排列在分子的中心反转,使得两个中心甲基处于1,6-位置关系,其余的非末端甲基处于1,5-位置关系。所有C30类胡萝卜素可以从形式上衍生自具有共轭双键的长中心链的非环状C30H42结构,所述衍生是通过:(i)氢化,(ii)脱氢,(iii)环化,(iv)氧化,(v)酯化/糖基化,或这些过程的任意组合。
“四萜烯”或“C40类胡萝卜素”由8个类异戊二烯单元组成,它们的连接方式使得类异戊二烯单元的排列在分子的中心反转,使得两个中心甲基处于1,6-位置关系,其余的非末端甲基处于1,5-位置关系。所有C40类胡萝卜素可以从形式上衍生自非环状C40H56结构。C40类胡萝卜素的非限定性实例包括:八氢番茄红素,番茄红素,β-胡萝卜素,玉米黄素,虾青素和角黄素。
此处用到的术语"CrtE"是指由crtE基因编码的香叶基香叶基焦磷酸合酶,其将反式-反式-法呢基二磷酸和异戊烯基二磷酸转化为焦磷酸和香叶基香叶基二磷酸。
此处用到的术语"Idi"是指由idi基金编码的异戊烯基二磷酸异构酶(E.G.5.3.3.2)。
此处用到的术语"CrtY"是指由crtY基因编码的番茄红素环化酶,其将番茄红素转化为β-胡萝卜素。
此处用到的术语"Crtl"是指由crtl基因编码的八氢番茄红素去饱和酶。Crtl通过导入4个双键,经过六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素和四氢番茄红素的中间体,将八氢番茄红素转化为番茄红素。
此处用到术语"CrtB"是指由crtB基因编码的八氢番茄红素合酶,其催化从prephytoene diphosphate到八氢番茄红素的反应。
此处用到的术语"CrtZ"是指由crtZ基因编码的类胡萝卜素羟化酶(如β-胡萝卜素羟化酶),也称作3,3′β-芷香酮羟化酶,其催化羟化反应。氧化反应将羟基加入3和/或3′位置具有β-芷香酮型环的环状类胡萝卜素。该反应分别将环状类胡萝卜素,如β-胡萝卜素或角黄素加入羟化类胡萝卜素玉米黄素或虾青素。该过程中的中间体典型地包括β-隐黄素和adonirubin。已知CrtZ羟化酶典型地表现出底物灵活性,使得能够依赖于可获得的底物,产生多种羟化类胡萝卜素。
此处用到的术语"CrtW"是指由crtW基因编码的β-胡萝卜素酮酶,其催化氧化反应,该反应中将酮基导入环状类胡萝卜素的β-芷香酮型环。术语“类胡萝卜素酮酶”或“酮酶”是指可以将酮基加入环状类胡萝卜素的β-芷香酮型环的4和/或4’位置的一组酶。
此处用到的术语“CrtX”是指由crtX基因编码的玉米黄素葡糖基转移酶,其将玉米黄素转化为玉米黄素-β-二葡糖苷。
此处用到的术语“羟基”是指单价自由基或基团,其包含一个氧和一个氢原子("-OH")。
此处用到的术语“酮基”是指这样的基团,其中的羰基与两个碳原子键合:R2C=O(两个R都不是H)。
此处用到的术语“酮基类胡萝卜素”是指在环状类胡萝卜素的芷香酮环上具有至少一个酮基的类胡萝卜素。酮基类胡萝卜素的实例包括角黄素和虾青素。
此处用到的术语“环状类胡萝卜素”是指具有至少一个能够被本发明的CrtZ类胡萝卜素羟化酶羟化的β-芷香酮环或β-芷香酮环衍生物的类胡萝卜素。
此处用到的术语“类胡萝卜素羟化酶”、“β-胡萝卜素羟化酶”、“羟化酶”和“CrtZ羟化酶”可互换使用,是指由crtZ基因编码的类胡萝卜素羟化酶,其催化在环状类胡萝卜素的β-芷香酮环上添加羟基。
此处用到的术语“羟化类胡萝卜素”是指在环状类胡萝卜素的芷香酮环上具有至少一个羟基的类胡萝卜素。羟化类胡萝卜素的实例包括玉米黄素和虾青素。
此处用到的“基本相似”是指这样的核酸分子,其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的取代,但不影响由DNA序列编码的蛋白的功能特性。“基本相似”也指这样的核酸分子,其中一个或多个核苷酸碱基的改变不影响核酸分子介导由反义或共阻抑技术导致的基因表达改变的能力。“基本相似”也指对本发明的核酸分子的修饰,例如一个或多个核苷酸碱基的缺失或插入基本不影响得到的转录物的功能特性。因此,可以理解,本发明不仅仅包括具体举例的序列。
例如,本领域公知,导致在特定位点产生化学上等同的氨基酸但不影响编码的蛋白的功能特性的基因改变是常见的。为了本发明的目的,取代定位为在以下5组之一中进行的交换:
1.小的脂族、非极性或微极性残基:Ala,Ser,Thr(Pro,Gly);
2.极性、带负电的残基和它们的酰胺:Asp,Asn,Glu,Gln;
3.极性、带正电的残基:His,Arg,Lys;
4.大的脂族、非极性残基:Met,Leu,Ile,Val(Cys);和
5.大的芳香族残基:Phe,Tyr,Trp。
因此,一种疏水性氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码另一种疏水性较低的残基(如甘氨酸)或疏水性更高的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地,也可以预计导致用一种带负电的残基取代另一种残基(如天冬氨酸取代谷氨酸)或一种带正电的残基取代另一种残基(如赖氨酸取代精氨酸)的改变可以产生功能等同的产物。
在很多情况下,预计导致蛋白N-末端和C-末端部分改变的核苷酸改变也不会改变蛋白的活性。
提出的每种修饰都是本领域技术人员公知的,这是通过保留编码的产物的生物活性而确定的。此外,本领域技术人员可以理解,本发明包括的基本相似的序列也由它们在严格条件下(0.1 X SSC,0.1% SDS,65℃,用2X SSC,0.1% SDS洗涤,然后用0.1X SSC,0.1% SDS洗涤)与此处举例的序列杂交的能力而确定。本发明的优选的基本相似的核酸分子是DNA序列与此处报道的核酸分子的DNA序列具有至少80%同一性的核酸分子。更优选的核酸分子是与此处报道的核酸分子的DNA序列具有至少90%同一性的核酸分子。最优选的是与此处报道的核酸分子的DNA序列具有至少95%同一性的核酸分子。
当单链形式的核酸分子可在合适的温度和溶液离子强度条件下退火至另一个核酸分子时,该核酸分子与所述另一个核酸分子,诸如cDNA、基因组DNA或RNA分子是“可杂交的”。杂交和洗涤条件众所周知,实例参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989),尤其是其中的第11章和表11.1(此处称作“Maniatis”)。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。可调节严格条件,以筛选中度相似的分子(诸如远缘相关生物来源的同源序列),乃至高度相似的分子(诸如可复制近缘相关生物来源的功能酶的基因)。杂交后的洗涤决定了严格条件。一组优选条件采用了系列洗涤步骤,首先于室温用6X SSC、0.5%SDS洗涤15分钟,接着于45℃用2X SSC、0.5%SDS重复洗涤30分钟,再于50℃用0.2X SSC、0.5%SDS洗涤30分钟并重复2次。更优选的一组严格条件采用了较高温度,其中的洗涤步骤除了最后两次用0.2X SSC、0.5%SDS洗涤30分钟的温度提高至60℃外,其它条件与上述一致。另一组优选的高度严格条件所采用的最后两次洗涤是于65℃在0.1X SSC、0.1%SDS中进行。杂交要求两个核酸含有互补序列,但根据杂交的严格性,碱基之间仍然可能出现错配。使核酸杂交所需的合适严格性取决于杂交核酸的长度和互补程度,这些变量是本领域所熟知的。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高,含有这些序列的核酸杂合体的Tm值越高。核酸杂交的相对稳定性(相应于较高Tm)按照下列次序降低:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。业已推导出计算长度大于100个核苷酸的杂合体的Tm的方程式(参见,Maniatis,同上,9.50-9.51)。错配位置对较短核酸,即寡核苷酸的杂交而言更为重要,且该寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Maniatis,同上,11.7-11.8)。在一种实施方案中,可杂交核酸的长度至少为大约10个核苷酸。可杂交核酸的优选最小长度是至少大约15个核苷酸;更优选的是至少大约20个核苷酸;最优选长度是至少大约30个核苷酸。此外,技术人员应认识到的是,可根据诸如探针长度等因素的需要调节温度和洗涤液的盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”指包括了多肽的特定氨基酸序列或基因的特定核苷酸序列的部分,通过本领域技术人员对这些特定序列的人工评估,或者通过利用诸如BLAST的算法进行的计算机自动序列比对和鉴定,便足以根据这些特定序列推断上述多肽或基因的同一性(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1993))。通常,为了推定多肽或核酸序列与已知蛋白或基因的同源性,序列必须包括10个或以上的相邻氨基酸或30个或以上的核苷酸。此外,就核苷酸序列而言,包括20-30个相邻核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可被应用在基因鉴定(例如DNA杂交)和分离(例如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的序列依赖性方法中。还可将具有12-15个碱基的短寡核苷酸作为扩增引物应用于PCR,以获得包括该引物的特定核酸片段。因此,核苷酸序列的“主要部分”包括足够的序列,以便特异性地鉴定和/或分离包括该序列的核酸分子。本说明书描述了编码一种或多种特定微生物蛋白的部分或完整氨基酸和核苷酸序列。了解本文所报道序列优势的技术人员可将全部公开序列或其主要部分应用在本领域技术人员已知的许多方面。本发明相应包括附带序列表所提供的完整序列,以及上述序列的主要部分。
术语“互补”被用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如,就DNA而言,腺苷与胸腺嘧啶互补,胞嘧啶与鸟嘌呤互补。本发明因此包括与附带序列表所报道的完整序列互补的分离核酸片段,以及那些基本相似的核酸序列。
正如本领域所知,术语“同一性百分比”指两个或以上的多肽序列或两个或以上的多核苷酸序列之间的关系,是通过对这些序列进行比较而得以确定的。在本领域中,“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度,在该情况中,可根据这些序列之间的匹配情况得以确定。通过已知方法,包括但不限于:Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,Ed.)Oxford University:NY(1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,Ed.)Academic:NY(1993);Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,Eds.)Humana:NJ(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,Ed.)Academic(1987);以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,Eds.)Stockton:NY(1991)中所描述的那些方法,可快速计算“同一性”和“相似性”。确定同一性的优选方法被设计用于提供受检序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法被编成了公用计算机程序。序列比对和同一性百分比计算可利用LASERGENE生物信息处理系统(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的Megalign程序或Vector NTIv.7.0(Informax,Inc.,Bethesda,MD)的AlignX程序进行。序列多重比对可以利用Clustal比对法(Higgins and Sharp,CABIOS.5:151-153(1989))并采用默认参数(GAP PENALTY=10,GAP LENGTHPENALTY=10)进行。利用Clustal法进行两两比对的默认参数是:KTYPLE 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5和DIAGONALSSAVED=5。
合适的核酸分子(本发明的分离多核苷酸)编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少大约80%同一性的多肽。更优选的核酸分子编码与本文所报道的氨基酸序列具有大约90%同一性的氨基酸序列。甚至更优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少大约95%同一性的氨基酸序列。本发明的合适的核酸分子不仅具有上述同源性,还典型地编码具有至少大约161个氨基酸的多肽。
此处用到的术语“趋异基因”、“趋异羟化酶”和“趋异序列”可以互换使用,并且是指在CrtZ羟化酶之间缺乏核酸分子分子序列同一性。2个或更多crtZ基因之间的核苷酸序列比较使得能够对序列同一性的相关程度方面的关系进行分类。高度同源(即具有高核苷酸序列同一性)基因的同时表达容易导致遗传不稳定性。中度或高度趋异基因的表达容易导致稳定的共表达。用于共表达的优选的crtZ羟化酶基因是当通过序列比对进行比较时具有小于约75%同一性的那些。用于共表达的更优选的crtZ羟化酶基因是当通过序列比对进行比较时具有小于约65%同一性的那些。用于共表达的甚至更优选的crtZ羟化酶基因是当通过序列比对进行比较时具有小于约60%同一性的那些。用于共表达的最优选的crtZ羟化酶基因是当通过序列比对进行比较时具有小于约55%同一性的那些。
此处用到的术语“密码子简并”指遗传密码允许核苷酸序列变异而不影响被编码多肽的氨基酸序列的特性。因此,本发明涉及编码氨基酸序列的全部或主要部分的任何核酸分子,所述氨基酸序列编码SEQ ID NOs:17和20所示的本发明的微生物多肽。技术人员熟知特定宿主细胞在选择核苷酸密码子以确定特定氨基酸方面所表现的“密码子偏倚性”。因此,当合成一种基因,使其提高在宿主细胞内的表达时,理想的方法是对该基因进行设计,使其密码子选择频率接近该宿主细胞的优选密码子选择频率。
“合成基因”可从利用本领域技术人员已知方法化学合成的寡核苷酸构件装配而得。将这些构件连接并使它们退火形成可继续通过酶促方法被装配并构建完整基因的基因片段。与DNA序列相关的“化学合成的”指在体外装配组分核苷酸。DNA的人工化学合成可通过已完善的方法实现;或者可以利用许多商业可提供机器进行自动化学合成。因此,可以在优化核苷酸序列以反映宿主细胞密码子偏倚性的基础上,对所述基因进行相应调整,使其实现最佳的基因表达。技术人员知道当密码子选择偏向宿主所偏好的那些密码子时基因表达成功的可能性。可根据对宿主细胞来源的基因的调查确定优选密码子,其中的序列信息是已知的。
“基因”指可表达特定蛋白的核酸片段。此处用到的该术语可能包括或不包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列。“天然基因”指被发现存在于自然界中并具有自身调节序列的基因。“嵌合基因”指并非天然基因且包括被发现无法同时存在于自然界中的调节和编码序列的所有基因。因此,嵌合基因可包括不同来源的调节序列和编码序列,或来源相同但排列方式不同于在自然界中所发现方式的调节序列和编码序列。“内源基因”指位于生物基因组内的天然位置上的天然基因。“外源”基因指通常不存在于宿主生物内,而是通过基因转移被导入该宿主生物内的基因。外源基因可包括被插入非天然生物内的天然基因,或嵌合基因。“转基因”指通过转化方法已被导入基因组内的基因。
术语“遗传构建体”是指用于改变生物基因型的一系列连续核酸。遗传构建体的非限定性实例包括但不限于核酸分子和可读框、基因、质粒等。
“编码序列”指编码用于特定氨基酸序列的DNA序列。此处用到的“合适的调节序列”指位于编码序列上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎-环结构。
“启动子”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。编码序列通常位于启动子序列的3’端。启动子可能全部来源于天然基因,或者包含来源于自然界存在的不同启动子的不同元件,或者甚至包括合成的DNA片段。本领域技术人员应理解的是,不同启动子可引导基因在处于不同组织或细胞类型内、或不同发育期或反应于不同环境或生理条件的表达。可使基因在大部分细胞类型中的大部分时间内表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。应进一步认同的是,由于大多数情况是调节序列的准确边界尚未被完整定义,因此不同长度的DNA片段可能具有一致的启动子活性。
“3’非编码序列”指位于编码序列下游的DNA序列,包括聚腺苷酸化识别序列(正常情况下限于真核生物)及其它编码调节信号的序列,该调节信号能够影响mRNA加工或基因表达。聚腺苷酸化信号的特征通常在于可影响mRNA前体3’末端添加聚腺苷酸束(正常情况下限于真核生物)。
“RNA转录物”指DNA序列在RNA聚合酶催化下转录的产物。当RNA转录物是所述DNA序列的完全互补拷贝时,它被称为一级转录物,或者当其可能是所述一级转录物的转录后加工衍生的RNA序列时,则被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可被细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”指与mRNA互补和由其衍生的双链DNA。“有义”RNA指包括上述mRNA并因此可被细胞翻译成蛋白的RNA转录物。“反义RNA”指与靶一级转录物或mRNA的全部或一部分互补并可阻断靶基因表达的RNA转录物(U.S.5,107,065;WO99/28508)。反义RNA可能与特定基因转录物的任意部分,即5’非编码序列、3’非编码序列或编码序列均具有互补性。“功能RNA”指反义RNA、核糖酶RNA或其它不被翻译但仍然影响细胞过程的RNA。
术语“可操作连接”指核酸序列与单个核酸片段的连接使二者之一的功能受另一方的影响。例如,当启动子能够影响宿主编码序列的表达时,该启动子与该编码序列是可操作连接的(即该编码序列受该启动子的转录控制)。编码序列可与调节序列按有义或反义方向可操作连接。
本文所用术语“表达”指来源于本发明所述核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还可指mRNA翻译成多肽。
“转化”指将核酸分子转移进宿主生物内,获得遗传稳定的遗传。在本发明中,宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(如质粒)基因。含有该转化的核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。
“接合”是指特定类型的转化,其中发生DNA(如来自细菌质粒)从一个细菌细胞(即“供体”)向另一个细菌细胞(即“受体”)的单方向转移。该过程涉及细胞与细胞的直接接触。
术语“碳底物”是指能够被本发明的宿主生物代谢的碳源,并且特别是选自单糖、二糖、多糖和一碳底物或其混合物的碳源。术语“C1碳底物”是指任何缺乏碳-碳键的含碳分子。非限定性实例是甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲酸盐、甲基化的胺(如单胺、二胺和三甲胺)、甲基化硫醇和二氧化碳。特别优选的是能够代谢甲烷和/或甲醇的那些生物。
术语“C1代谢者”是指具有利用单碳底物作为其唯一的能量和生物量来源的微生物。C1代谢者典型地是甲基营养生物和/或甲烷营养生物。术语“C1代谢菌”是指具有利用单碳底物作为其唯一的能量和生物量来源的细菌。C1代谢菌是C1代谢者的亚组,其典型地是甲基营养生物和/或甲烷营养生物。
术语“甲基营养生物”是指能够氧化不含碳-碳键的有机化合物的生物。当甲基营养生物能够氧化CH4时,甲基营养生物也是甲烷营养生物。一方面,微生物宿主细胞是在作为主要碳源的甲烷和/或甲醇上生长的甲基营养生物。
术语“甲烷营养生物”或“甲烷营养菌”表示能够利用甲烷作为其主要碳源和能量源的原核生物。甲烷完全氧化为二氧化碳是通过有氧降解途径进行的。用于本发明的甲烷营养生物的典型实例包括(但不限于)甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属和甲基弯曲菌属。一方面,甲烷营养生物是在甲烷和/或甲醇上生长的高生长甲烷营养菌株。另一方面,甲烷营养生物是甲基单胞菌种16a(ATCC PTA-2402)及其衍生物。
术语“高生长甲烷营养菌株”是指能够利用甲烷或甲醇作为唯一碳源和能量源进行生长,并且具有功能性Embden-Meyerhof碳流途径,导致高速度生长和每克代谢的C1底物的高细胞团产率(US 6689601)的细菌。此处描述的具体“高生长甲烷营养菌株”是指"甲基单胞菌16a"、"16a"或"甲基单胞菌种16a",所述术语可以互换使用,并且是指用于本发明的甲基单胞菌菌株(甲基单胞菌种16a ATCC PTA-2402)。
此处用到的术语"CrtN1"是指由crtN1基因编码的酶,其在甲基单胞菌种16a的天然类胡萝卜素生物合成途径中是有活性的。该基因位于包含crtN2和ald的操纵子中。
此处用到的术语"ALD"是指由ald基因编码的酶,其在甲基单胞菌种16a的天然类胡萝卜素生物合成途径中是有活性的。该基因位于包含crtN1和crtN2的操纵子中。
此处用到的术语"CrtN2"是指由crtN2基因编码的酶,其在甲基单胞菌种16a的天然类胡萝卜素生物合成途径中是有活性的。该基因位于包含crtN1和ald的操纵子中。
此处用到的术语"CrtN3"是指由crtN3基因编码的酶,其影响甲基单胞菌种16a的天然类胡萝卜素生物合成途径。该基因不是位于crt基因簇中,而是位于甲基单胞菌基因组的不同位置。
此处用到的术语"MWM1200(Δcrt簇启动子+ΔcrtN3)"或"MWM1200"是指甲基单胞菌种16a的突变菌株,其中crt簇启动子和crtN3基因被破坏。天然C30类胡萝卜素生物合成途径的破坏导致对C40类胡萝卜素生产进行工程化的合适背景(无色素)。甲基单胞菌MWM1200菌株是以前建立的,其是合适的类胡萝卜素生产宿主(US10/997844;在此引入作为参考)。术语“无色素”或“白色突变体”是指甲基单胞菌种16a,其中不产生天然的粉色色素(如C30类胡萝卜素)。因此,细菌细胞看起来是白色的,而不是粉色。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带了不属于细胞中枢代谢部分的基因,并且通常为环状双链DNA分子形式的额外染色体元件。这种元件可能是任意来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线型或环状的单或双链DNA或RNA,其中的许多核苷酸序列已被加入或重组进独特构建体中,该独特构建体能够将用于选定的基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3’非翻译序列一起导入细胞。“转化盒”指除了含有外源基因之外还含有有利于转化特定宿主细胞的其它元件的特异性载体。“表达盒”指除了含有外源基因之外还含有可增强该基因在外源宿主内的表达的其它元件的特异性载体。
术语“改变的生物学活性”指与微生物核苷酸序列编码的蛋白有关并可通过分析方法测定的活性,且该活性高于或低于天然序列的相关活性。“增强的生物学活性”指经过改变后比天然序列的相关活性高的活性。“降低的生物学活性”指经过改变后比天然序列的相关活性低的活性。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的所有计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可通过商业渠道或自主研发获得。典型的序列分析软件包括但不限于:GCG系列程序(WisconsinPackage Version 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI),BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul et al.,J.MoI.Biol.215:403-410(1990);和DNASTAR(DNASTAR,Inc.1228 S.Park St.Madison,WI53715 USA);以及编入Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20.Editor(s):Suhai,Sandor.Publisher:Plenum,New York,NY),Vector NTI(Informax,Bethesda,MD)和Sequencher(TM)v.4.05。应当理解的是,在本申请的上下文中,如无另外指明,序列分析软件均被用于分析,且分析结果将基于上述程序的“默认值”。本文所用的“默认值”指软件制造商最初在软件首次初始化时便加载的所有数值或参数组。
本发明提供了从泡囊短波单胞菌DC263(US 11/015433)分离的、新发现的CrtZ类胡萝卜素羟化酶。此外,本发明中将来自Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700728的假定蛋白( ZP_00094836.1;SEQ ID NO:20)的功能表征为具有类胡萝卜素羟化酶活性。证明了两种类胡萝卜素羟化酶都通过本发明的方法生产羟化类胡萝卜素。本发明的序列可以体外和体内用于重组宿主中,以便从环状的类胡萝卜素化合物生产羟化类胡萝卜素。
泡囊短波单胞菌DC263 crtZ核苷酸碱基和推导的氨基酸序列与公共数据库的比较发现最相似的已知序列与此处报道的氨基酸序列在161个氨基酸的长度上具有大约51%的同一性,所述同一性是用BLASTP检索的BLOSUM62矩阵确定的(表3)。用Vector NTI中的Align X获得表4中报道的成对比较值。因此,优选的氨基酸片段与此处的序列具有至少约80%的同一性,更优选的氨基酸序列与此处报道的氨基酸片段具有至少约90%的同一性,甚至更优选的氨基酸序列与此处报道的氨基酸片段具有至少约95%的同一性,最优选的氨基酸序列与此处报道的氨基酸片段具有至少约99%的同一性。
类似地,优选的crtZ基因包含编码活性蛋白,并且与此处报道的本发明的核酸序列具有至少80%同一性的核酸序列。更优选的crtZ核酸分子与此处的核酸序列具有至少90%的同一性。甚至更优选的crtZ核酸分子与此处的核酸序列具有至少95%的同一性。最优选的crtZ核酸分子与此处报道的核酸分子具有至少99%的同一性。
同源物的分离
本发明的核酸分子可被用于分离编码来源于相同或其它微生物物种的同源蛋白的基因。利用序列依赖性方案分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性方案的实例包括,但不限于:核酸杂交法和可通过核酸扩增技术的多种应用进行示例的DNA和RNA扩增法(例如聚合酶链反应(PCR),Mullis et al,US 4,683,202);连接酶链反应(LCR),Tabor,S.et al.,Proc.Acad.Sci.USA 82:1074(1985));或链置换扩增(SDA,Walker,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89:392(1992))。
例如,通过利用本领域技术人员熟知的方法,并以本发明核酸分子或其部分作为DNA杂交探针筛选任意来自需要的细菌的文库,便可直接分离编码与本发明的蛋白或多肽相似的蛋白或多肽的基因。基于本发明核酸序列的特异性寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法设计并合成(Maniatis,同上)。此外,通过采用本领域技术人员已知的方法(例如随机引物DNA标记、切口翻译、末端标记技术),可将该完整序列直接用于合成DNA探针,或者是通过利用可获得的体外转录系统将其用于合成RNA探针。此外,可设计特异性引物并将其用于扩增本发明所述序列的一部分或其全长。所获扩增产物可在扩增反应期间被直接标记,或是在扩增反应后被标记,并被用作探针,以在合适的严格条件下分离全长DNA片段。
在PCR型扩增技术中,引物典型地具有不同序列,并且彼此不互补。根据预期的试验条件,应对引物序列进行设计,以有效并可靠地复制靶核酸。PCR引物的设计方法是本领域技术人员常用并熟知的(Thein and Wallace,"The use of oligonucleotide as specifichybridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders",HumanGenetic Diseases:A Practical Approach,K.E.Davis Ed.,(1986)pp.33-50IRL Press,Herndon,Virginia);Rychlik,W.(1993)White,B.A.(ed.),Methods in Molecular Biology.Vol.15,pages31-39,"PCRProtocols:Current Methods and Applications",Humania Press,Inc.,Totowa,NJ.)。
本发明所述序列的两个短片段通常可被应用在聚合酶链反应方案中,以扩增编码DNA或RNA来源的同源基因的较长核酸片段。聚合酶链反应还可基于克隆核酸片段的文库进行,其中一种引物的序列来源于本发明所述的核酸片段,另一种引物的序列则利用编码微生物基因的mRNA前体的3’末端存在的聚腺苷酸束。在缺乏聚腺苷酸化mRNA的微生物基因的情况下,可以使用随机引物。随机引物也可以用于DNA扩增。
或者,第二种引物序列可基于克隆载体来源的序列。例如,技术人员可遵循RACE程序(Frohman et al.,PNAS USA 85:8998(1988)),通过PCR扩增介于转录物中的单个位点与3’或5’末端之间的特定区域的拷贝,生成cDNAs。由本发明所述序列可设计出以3’和5’方向定向的引物。可利用商业可提供的3’RACE或5’RACE系统(BRL,Gaithersburg,MD)分离特定3’或5’cDNA片段(Ohara et al.,PNASUSA 86:5673(1989);Loh et al.,Science 243:217(1989))。
或者,本发明的序列可作为杂交试剂被用于鉴定同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、疑似含有目的基因或基因片段的样品以及特异性杂交方法。本发明的探针典型地是与待检核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检核酸序列是“可杂交的”。探针长度的变化范围是5个到数万个碱基,这将取决于待进行的特定实验。典型的合适探针长度为大约15到大约30个碱基。该探针分子只需要一部分与待检核酸序列互补。此外,探针与靶序列之间无需完全互补。不完全互补分子之间杂交的结果是杂交区内某一部分的碱基与正确互补碱基不配对。
业已明确定义了杂交方法。探针和样品典型地必须在允许核酸杂交的条件下混合。这包括使探针和样品在合适的温度和合适浓度的无机或有机盐存在条件下接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间,以使该探针和样品核酸之间所有可能的杂交均可发生。混合物中的探针或靶的浓度决定发生杂交所需的时间。探针或靶的浓度越高,所需的杂交温育时间越短。可任选地加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性使核酸稳定。此外,离液剂可使短寡核苷酸探针在室温下实现灵敏和严格杂交(Van Ness and Chen,Nucl.Acids Res.19:5143-5151(1991))。合适的离液剂包括氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。离液剂的终浓度典型地为大约3M。如果需要,可将甲酰胺加入杂交混合物中,其浓度典型地为30-50%(v/v)。
可应用多种杂交溶液。这些溶液典型地包括大约20-60%体积,优选30%体积的极性有机溶剂。常用杂交溶液应用了大约30-50%v/v甲酰胺,大约0.15-1M氯化钠、大约0.05-0.1M缓冲剂(例如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围大约6-9))、大约0.05-0.2%去污剂(例如十二烷基硫酸钠),或0.5-20mM EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(大约300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(大约250-500kdal)和血清白蛋白。典型杂交溶液还可包括大约0.1-5mg/mL的未标记载体核酸、片段化的核DNA(例如小牛胸腺或鲑鱼精子DNA或酵母RNA),并任选地含有重量体积比约为0.5-2%的甘氨酸。还可包括其它添加剂,诸如体积排阻剂,包括多种极性水溶性或可膨胀剂(例如聚乙二醇)、阴离子聚合物(例如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖聚合物(例如硫酸葡聚糖)。
核酸杂交可适用于多种试验形式。其中一种最适形式是夹心试验。夹心试验尤其适用于非变性条件下的杂交。夹心型试验的主要成分是固相支持物。该固相支持物通过吸附或共价偶联方式固定了未被标记并与所述序列的一部分互补的核酸探针。
本发明所述核苷酸和推导氨基酸序列的可获得性有利于对DNA表达文库的免疫学筛选。可以合成代表本发明所述氨基酸序列的若干部分的合成肽。这些肽可被用于使动物免疫,以生成对包括该氨基酸序列的肽或蛋白具有特异性的多克隆或单克隆抗体。接着,这些抗体便可被用于筛选DNA表达文库,进而分离被关注的全长DNA克隆(Lerner,R.A.Adv.Immunol.36:1(1984);Maniatis,同上)。重组表达-微生物表达
可以在异源宿主细胞,特别是在微生物宿主细胞中制备本发明的序列的基因和基因产物。在重组微生物宿主中的表达可以用于表达多种途径中间体,用于调节宿主中已经存在的途径,或用于合成用所述宿主至今不能合成的新产物。
用于本发明基因和核酸分子的优选的异源宿主细胞是微生物宿主,这些宿主可以存在于真菌或细菌家族,并且能够在大范围的温度,pH值,和溶剂耐受性条件下生长。例如,考虑任何细菌、酵母和丝状真菌将是表达本发明核酸分子的合适宿主。由于无论细胞原料如何,转录、翻译和蛋白生物合成装置都是相同的,因此无论用于产生细胞生物量的碳原料如何,都表达功能基因。大规模的微生物生长和功能基因表达可以使用多种简单的或复杂的碳水化合物,有机酸和醇(即甲醇),并且对于光合或化学自养宿主来说还可以使用诸如甲烷或二氧化碳的饱和烃。不过,所述功能基因可以通过特殊的生长条件进行调节、阻抑或抑制,该条件包括氮,磷,硫,氧,碳或任何微量微营养成分(包括小的无机离子)的形式和数量。另外,功能基因的调控可以通过特殊调节分子的存在或缺乏实现,所述分子被添加到培养物中,并且通常不被认为是营养物或能源。生长速度可能同样是基因表达的重要调节因子。合适的宿主菌株的例子包括,但不局限于真菌或酵母物种,如曲霉属、木霉属、糖酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属,或细菌物种,如沙门氏菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、发酵单胞菌属、土壤杆菌属、赤杆菌属、绿菌属、着色菌属、黄杆菌属、噬纤维菌属、红细菌属、红球菌属、链霉菌属、短杆菌属、棒杆菌属、分枝杆菌属、异常球菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、泛菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基微菌属、甲基孢囊菌属、产碱菌属、集胞蓝细菌属、聚球蓝细菌属、鱼腥蓝细菌属、硫杆菌属、甲烷杆菌属、克氏杆菌属和粘球菌属。优选的宿主菌株包括埃希氏菌属、芽孢杆菌属和甲基单胞菌属。最优选的细菌宿主菌株包括甲基单胞菌种16a及其衍生物(即衍生自甲基单胞菌种16a ATCC PTA-2402的突变体)。
包括能指导外源蛋白高水平表达的调节序列的微生物表达系统和表达载体为本领域技术人员所熟知。可以将任何这样的系统和载体用于构建嵌合基因,以便表达本发明的类胡萝卜素羟化酶。然后可以通过转化将所述嵌合基因导入合适的微生物,以便提供所述酶的高水平表达。
因此,预计例如将编码本发明的细菌酶的嵌合基因导入合适启动子的控制下,将证明增加的或改变的羟化类胡萝卜素生产。考虑其可以用于在天然宿主细胞和异源宿主种表达本发明的基因。将本发明的crtZ基因导入天然宿主,将导致羟化类胡萝卜素生产的水平改变。此外,本发明的基因也可以导入非天然宿主细菌,其中可以操作存在的类胡萝卜素途径。
通过本发明的生产的特定的羟化类胡萝卜素包括但不限于玉米黄素、虾青素、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、3′-羟基海胆酮、adonirubin、adonixanthin、四羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮、四羟基-β,β′-胡萝卜素-4-酮、眉藻黄素、erythroxanthin、nostoxanthin、屈曲黄素、3-羟基-γ-胡萝卜素、3-羟基-4-酮基-γ-胡萝卜素、细菌玉红黄素、bacteriorubixanthinal和黄体素。特别感兴趣的是虾青素和玉米黄素的生产,其合成示于图1。本发明的CrtZ酶的特异性底物是具有至少一个β-芷香酮型环的环状类胡萝卜素。环状类胡萝卜素是本领域公知的,并且可以商购。优选的CrtZ羟化酶底物包括但不限于β-胡萝卜素、角黄素、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、3′-羟基海胆酮、海胆酮、adonirubin、γ-胡萝卜素、4-酮基-γ-胡萝卜素、脱氧-屈曲黄素和α-胡萝卜素。
可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒为本领域所熟知。通常,所述载体或盒包括指导相关基因转录或翻译的序列,选择标记,使得能够自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括位于所述基因5′的区,它具有转录起始控制,以及位于DNA片段的3′的区,由它控制转录终止。当这两个控制区来自与转化过的宿主细胞同源的基因时是最优选的,不过,可以理解的是,这些控制区不一定来自被选择用作生产宿主的特定物种的天然基因。
用于驱动本发明的ORF在需要的宿主细胞中表达的起始控制区或启动子是多种多样的,并且为本领域技术人员所熟知。基本上能够驱动所述基因的任何启动子都是适用于本发明的,包括,但不局限于CYC1,HIS3,GAL1,GAL10,ADH1,PGK,PHO5,GAPDH,ADC1,TRP1,URA3,LEU2,ENO,TPI(用于在糖酵母属中表达);AOX1(用于在毕赤酵母属中表达);和lac,ara,tet,trp,IPL,IPR,T7,tac,和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及amy,apr,npr启动子和可用于在芽孢杆菌属中表达的各种噬菌体启动子,以及用于在甲基单胞菌属中表达的分离自nrtA,glnB,moxF,glyoxll,htpG和hps基因的启动子(US SN 10/689200;在此引入作为参考)。此外,诸如氯霉素抗性基因启动子(Pcat)的启动子也可以用于在甲基单胞菌属中表达。
终止控制区还可以来自所述优选宿主的各种天然基因。任选地,终止位点可能是不必要的,不过,最优选的是包括这样的位点。
对本发明基因的序列的了解可以用于在具有类胡萝卜素生物合成途径的任何生物中操作该途径,所述生物特别是甲基单胞菌种16a和大肠杆菌。操作遗传途径的方法是常见的,并且是本领域公知的。特定途径中的选定的基因可以被多种方法上调或下调。此外,可以通过基因破坏和相似的技术消除或提纯竞争途径生物。
一旦鉴定了关键的遗传途径并且进行了测序,就可以上调特定基因,并且增加途径的输出。例如,可以将额外拷贝的被靶定的基因导入宿主细胞中的多拷贝质粒,如pBR322上。任选地,可以通过染色体表达多种编码CrtZ羟化酶的基因,以增加类胡萝卜素的产量。但是,多种crtZ基因的稳定染色体表达通常需要采用的基因的编码序列包含彼此具有低到中度序列特异性的核苷酸序列。本发明的类胡萝卜素羟化酶基因与所有以前报道的crtZ基因相比表现出相对低到中度的核苷酸序列同一性。
或者,可以修饰靶基因,以便使其处于非天然启动子的控制下。当需要在细胞周期中的特定点或在发酵过程中操作一种途径时,可以用受调节或诱导型启动子代替靶基因的天然启动子。类似地,在某些情况下,可以修饰天然或内源启动子,以增加基因表达。例如,可以通过突变、缺失和/或取代而体内改变内源启动子(参见Kmiec,US5,565,350;Zarling et al.,PCT/US93/03868)。
或者,可能需要减少或消除靶途径或竞争途径中某些基因的表达,所述竞争途径可能导致能量或碳的竞争性减少。可以采用为此目的进行的下调基因的方法。当要破坏的基因的序列已知时,最优有效的基因下调方法之一是被靶定的基因的破坏,其中将外源DNA插入结构基因,以便破坏转录。这可以通过建立基因盒而实现,所述基因盒包含要插入的DNA(通常是遗传标记),其侧翼是与要破坏的基因的一部分具有高度同源性的序列。所述盒在宿主细胞中的导入导致了外源DNA通过细胞的天然DNA复制机制导入了结构基因中(Hamilton etal.,J.Bacteriol.,171:4617-4622(1989);Balbas et al.,Gene,136:211-213(1993);Gueldener et al.,Nucleic Acids Res.,24:2519-2524(1996);和Smith et al.,Methods Mol.Cell.Biol.,5:270-277(1996))。
当靶基因序列已知时,反义技术是另一种下调基因的方法。该方法的实现是通过克隆需要的基因的核酸片段,并将其与启动子可操作连接,从而得以转录RNA的反义链。接着将该构建体导入宿主细胞中,生成RNA的反义链。反义RNA通过阻止编码目的蛋白的mRNA的累积而抑制了基因表达。本领域技术人员将了解的是,为了降低特定基因的表达所需考虑的特殊因素与反义技术的应用有关。例如,反义基因的合适表达水平可能需要利用不同的嵌合基因,其中应用到本领域技术人员已知的不同调节元件。
虽然靶定的基因破坏和反义技术提供了当序列已知时有效下调基因的方法,人们仍然研发了另一些特异性较差并且不以序列为基础的方法。例如,可使细胞暴露于UV辐射,接着筛选需要的表型。用化学剂进行的诱变还有助于生成突变体,通常采用的物质包括可影响非复制型DNA的化学制剂(例如HNO2和NH2OH),以及可影响复制型DNA的试剂(例如可导致移码突变的吖啶染料)。本领域有文献详细记录了利用放射或化学试剂产生突变体的特定方法。参见例如ThomasD.Brock在Sinauer Associates:Sunderland,MA出版的第二版Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology(1989)(下文称作“Brock”)中的报道;或Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)(下文称作"Deshpande")。
另一种非特异性的基因破坏方法是利用可转座元件或转座子。转座子是可被随机插入DNA但稍后可基于序列将其重新获得并从而确定其插入位置的遗传因子。体内和体外转座方法均是已知的。这两种方法均包括将可转座元件与转座酶结合应用。当可转座元件或转座子在转座酶存在条件下与核酸分子接触时,可转座元件将被随机插入该核酸分子中。该技术有助于随机诱变和基因分离,因为可以基于可转座元件的序列鉴定已破坏的基因。用于体外转座的试剂盒可通过商业渠道获得(参见例如:可获得自Perkin Elmer Applied Biosystems,Branchburg,NJ的以酵母Ty1元件为基础的Primer IslandTransposition试剂盒;可获得自New England Biolabs,Beverly,MA的以细菌转座子Tn7为基础的Genome Priming System;和可获得自Epicentre Technologies,Madison,WI的以Tn5细菌转座因子为基础的EZ::TN Transposon Insertion Systems)。
作为微生物宿主的甲基营养生物和甲基单胞菌种16a
尽管从重组微生物来源(如用于生产番茄红素的大肠杆菌和产朊假丝酵母(Farmer,W.R.and Liao,L.C.,Biotechnol.Prog.,17:57-61(2001);Wang.et al.,Biotechnol Prog.,16:922-926(2000);Misawa,N.and Shimada,H.,J.Biotechnol.,59:169-181(1998);Shimada,H.et al.Appl.Environm.Microbiol.64:2676-2680(1998));用于生产β-胡萝卜素的大肠杆菌、产朊假丝酵母和Pfaffia rhodozyma(Albrecht,M.et al.,Biotechnol.Lett.21:791-795(1999);Miura,Y.et al.,Appl.Environm.Microbiol.64:1226-1229(1998);US5,691,190);用于生产玉米黄素的大肠杆菌和产朊假丝酵母(Albrecht,M.et al.,同上文;Miura,Y.et al.,同上文);用于生产虾青素的大肠杆菌和Pfaffia rhodozyma(US5,466,599;US 6,015,684;US 5,182,208;US 5,972,642);也参见US5,656,472,US 5,545,816,US 5,530,189,US 5,530,188,US 5,429,939和US6,124,113)生产了多种类胡萝卜素,但这些用不同crt基因的多种组合生产类胡萝卜素的方法的缺点是低产率和依赖于相对昂贵的原料。因此,需要鉴定在微生物宿主中从便宜的原料,如甲烷和甲醇生产较高产率的类胡萝卜素的方法。
存在许多利用单碳底物作为它们的唯一能量源的微生物。所述微生物在此称作“C1代谢者”。这些生物的特征在于它们利用缺乏碳-碳键的碳底物作为唯一的能量和生物量来源的能力。这些碳底物包括甲烷、甲醇、甲酸盐、甲醛、甲酸、甲基化的胺(如单胺、二胺和三甲胺)、甲基化硫醇、二氧化碳和多种其它的缺乏碳-碳键的还原的碳化合物。优选的底物包括甲烷和/或甲醇。
所有C1代谢微生物通常分类为甲基营养生物。甲基营养生物可以定义为能够氧化不含碳-碳键的有机化合物的任何生物。但是,兼性甲基营养生物、专性甲基营养生物和专性甲烷营养生物都是甲基营养生物的各种亚型。具体地:
-兼性甲基营养生物具有氧化不含碳-碳键的有机化合物的能力,但也可以利用其它碳底物,如糖类和复合碳水化合物得到能量和生物量。兼性甲基营养细菌存在于许多环境中,但最常见是从土壤、垃圾和废物处理站分离。大多数兼性甲基营养生物是泛菌的β和γ亚族的成员(Hanson et al.,Microb.Growth C1 Compounds.,[Int.Symp.],7th(1993),pp 285-302.Murrell,J.Collin and Don P.Kelly,Eds.Intercept:Andover,UK;Madigan et al.,Brock Biology of Microorganisms,8thed.,Prentice Hall:UpperSaddle River,NJ(1997))。
-专性甲基营养生物是限于利用不含碳-碳键的有机化合物来产生能量的生物。
-专性甲烷营养生物是具有氧化甲烷的独特能力的专性甲基营养生物。
此外,利用单碳底物的能力不限于细菌,也延伸到酵母和真菌。许多酵母属都能够利用单碳底物作为除更复杂物质之外的能量源(即甲基营养酵母)。
尽管已知大量的所述甲基营养生物,这些微生物中只有很少数在物质合成的工业过程中被成功利用。并且,尽管单碳底物是经济的能量源,但这些微生物的遗传操作的困难以及关于它们的遗传机制的信息缺乏将它们的用途主要限制在了天然产物的合成。
尽管有这些困难,很多甲烷营养生物含有固有的类异戊二烯途径,使得这些生物能够合成色素,并且提供了预计将这些微生物工程化而用于生产多种非内源类异戊二烯化合物的潜能。由于甲烷营养生物能够利用单碳底物(即甲烷和/或甲醇)作为能量源,以低成本在这些生物中生产类胡萝卜素是可能的。将甲烷营养生物工程化以生产β-胡萝卜素的一个这样的实例描述于US 09/941947,在此引入作为参考。
提供了用于在能够利用单碳底物作为唯一能量源的微生物中表达参与类胡萝卜素化合物生物合成的基因的方法。宿主微生物可以是具有合成法呢基焦磷酸(FPP)作为类胡萝卜素的代谢前体的能力的任何C1代谢者。更具体地,适于本发明的兼性甲基营养细菌包括但不限于嗜甲基菌属、甲基菌属、甲基杆菌属、生丝微菌属、黄色杆菌属、芽孢杆菌属、副球菌属、诺卡氏菌属、节杆菌属、红假单胞菌属和假单胞菌属。用于本发明的具体甲基营养酵母包括但不限于:假丝酵母属、汉逊氏酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属和红酵母属。示例的甲烷营养生物包括但不限于甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基孢囊菌属、甲基微菌属和甲烷单胞菌属。
本发明特别感兴趣的是具有能量上有利的碳流途径的高生长专性甲烷营养生物。例如,具有一些途径特征的甲烷营养生物的特定菌株使其特别适用于碳流操作。该菌株称作甲基单胞菌16a(ATCC PTA2402)(US 6689601)。这种特定菌株和其它相关的甲基营养生物是用于表达本发明的基因产物的优选微生物(即用于生产C40类胡萝卜素)。
已经建立了甲基单胞菌种16a的优化形式,并且命名为甲基单胞菌种16a MWM1200(US 10/997844;在此引入作为参考)。敲除内源性C30类胡萝卜素途径(Δcrt簇启动子+ΔcrtN3),建立C40类胡萝卜素生产的优化平台。负责内源性crt簇(crtN1-ald-crtN2簇)表达的启动子的缺失得到了无颜色的菌株(野生型菌株通常是粉色的,这是因为其天然生产C30类胡萝卜素)。该优化宿主中C40类胡萝卜素生物合成基因的表达增加了所需C40类胡萝卜素的产量。
C1代谢菌的转化
已经将电穿孔成功地用于转化:扭脱甲基杆菌AM1(Toyama,H.,et al.,FEMS Microbiol.Lett.166:1-7(1998))、食甲基嗜甲基菌AS1(Kim,C.S.,and T.K.Wood.,Appl.Microbiol.Biotechnol.48:105-108(1997))和甲基菌种菌株12S(Yoshida,T.et al.,Biotechnol.Lett.,23:787-791(2001))。从一种特定的C1代谢利用生物的特定电穿孔参数外推另一种生物的该参数可能是困难的。
依赖于供体和受体细胞的直接接触的细菌接合对于将基因转移到C1代谢菌中通常是更容易控制的。简单地,该细菌接合过程涉及将彼此紧密接触的“供体”和“受体”细胞混合在一起。通过在供体和受体细菌之间形成细胞质连接发生接合,并且直接将新合成的供体DNA转移到受体细胞中。如本领域公知的,接合中的受体定义为可以通过从供体细菌水平转移而接受DNA的任何细胞。接合转移中的供体是含有接合质粒、接合转座子或可代谢质粒的细菌。供体质粒的物理转移可以以下述两种方式之一进行:
1.在某些情况下,接合仅仅需要供体和受体。当要转移的质粒是可接合和可代谢的可自我传送的质粒(即,携带tra基因和编码Mob蛋白的基因)时发生这种情况。概言之,该过程涉及以下步骤:1)在oriT中的特定位点对双链质粒DNA进行切口;2)通过孔或菌毛结构将单链DNA释放到受体中;3)DNA松弛酶将在oriT上将双链DNA裂解,并且结合于释放的5’末端(形成作为中间结构的松弛体(relaxosome));和4)随后,在oriT组装辅助蛋白的复合体,以促进DNA转移过程。
2.或者,需要“三亲株”接合来将供体质粒转移到受体。在这种类型的接合中,有供体细胞、受体细胞和“辅助”质粒的参与。供体细胞携带可代谢的质粒或接合转座子。可代谢的载体包含oriT,即一种编码切口酶的基因,并且具有编码Mob蛋白的基因;但是,单独的Mob蛋白不足以实现基因组的转移。因此,可代谢的质粒不能够促进它们自身的转移,除非由辅助质粒提供合适的接合系统(位于供体中或“辅助”细胞中)。交配对的形成和DNA转移需要接合质粒,因此质粒编码参与孔或菌毛形成的转移蛋白(Tra)。
涉及C1代谢菌的成功接合的实例包括以下工作:Stolyar et al.(Mikrobiologiya64(5):686-691(1995));Motoyama,H.et al.(Appl.Micro.Biotech.42(1):67-72(1994));Lloyd,J.S.et al.(Archives ofMicrobiology 171(6):364-370(1999));和Odom,J.M.et al.(US10/997308,US 10/997844和US 09/941947;在此引入作为参考)。
工业生产
当需要商业化生产环状的羟化类胡萝卜素化合物时,采用本发明的crtZ基因,多种培养方法都是适用的。例如,可以通过分批和连续培养方法进行从重组微生物宿主超量表达的特定基因产物的大规模生产。
经典的分批培养方法是封闭的系统,其中,培养基的组成是在培养开始时设定的,并且在培养过程中不进行人为改变。因此,在培养过程开始时,用需要的生物接种所述培养基,并且在不向该系统中添加任何物质的前提下进行生长或代谢活动。不过,通常,"分批"培养是针对碳源的添加而言的批次,并且尝试控制因子,如pH和氧气浓度。在分批系统中,所述系统的代谢物和生物量组成恒定地改变,直到所述培养终止。在分批培养中,细胞通过静止停滞期发展到快速生长的对数期,并最终达到静止期,此时,生长速度降低或停止。如果不处理,处在静止期的细胞会最终死亡。处在对数期的细胞通常决定最终产物的总产量或在某些系统中决定中间产物。在其他系统中,可以获得稳定期或指数后期生产。
标准分批系统的一种变化形式是补料-分批系统。补料-分批培养过程同样适用于本发明,并且包括典型的分批系统,所不同的是,底物是随着培养的进行以增量的形式添加的。当代谢物抑制倾向于抑制细胞的代谢作用,并且希望在培养基中具有有限数量的底物时,补料-分批系统是有用的。测定补料-分批系统中的实际底物浓度是困难的,因此,是根据可检测的因素,如pH,溶解的氧,以及诸如二氧化碳的废气的分压的变化估算的。分批和补料-分批培养方法是常见的,并且为本领域所熟知,其例子可以参见Brock(同上文)和Deshpande(同上文)。
类胡萝卜素的商业化生产还可以通过连续培养实现。连续培养是一种开放系统,其中,将确定的培养基连续添加到生物反应器中,同时将等量的条件培养基排出用于处理。连续培养通常能将细胞保持在恒定的高液相密度状态下,其中,细胞主要处在对数期生长。另外,连续培养可以用固定化的细胞进行,其中,连续地添加碳和氮,并且将有价值的产物,副产物或废弃物连续地从细胞团中排出。细胞固定化可以通过使用由天然和/或合成材料的多种固体支持物进行。
连续或半连续培养允许对影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或多种因素中的任一种因素进行调控。例如,一种方法能将限制性的营养诸如碳源和氮水平保持在固定的比例上,并且可以对所有其他的参数进行调控。在其他系统中,能影响生长的多种因素可以连续地改变,同时,通过培养基浊度衡量的细胞浓度保持恒定。连续系统致力于保持稳态生长条件,因此,由于排出培养基而导致的细胞减少必须与培养物中细胞生长速度平衡。在连续培养过程中用于调控养分和生长因子的方法以及用于加快产物形成速度的技术为工业微生物学领域所熟知,并且多种方法披露于Brock的文献中,同上。
本发明的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可以包括,但不限于:单糖(例如葡萄糖和果糖)、二糖(例如乳糖或蔗糖)、多糖(例如淀粉或纤维素或它们的混合物)、和可再生原料(例如干酪乳清透过物、玉米浆、甜菜糖浆和大麦芽)的未纯化的混合物。此外,碳底物也可以是一碳底物,如二氧化碳、甲烷或甲醇,已经证明了其代谢转化为关键的生化中间体。除了一碳和二碳底物,也已知甲基营养生物利用许多其它的含碳化合物,如甲胺、葡糖胺和多种用于代谢活性的氨基酸。例如,已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳,以形成海藻糖或甘油(Bellion et al.,Microb.Growth C1 Compd.,[Int.Symp.],7th(1993),415-32.Editor(s):Murrell,J.Collin;Kelly,Don P.Publisher:Intercept,Andover,UK)。类似地,假丝酵母的多个物种将代谢丙氨酸或油酸(Suiter et al.,Arch.Microbiol.,153:485-489(1990))。因此,考虑本发明中利用的碳源可以包括多种含碳的底物,并且仅仅受到生物选择的限制。
重组表达-植物
也已知植物和藻类生产类胡萝卜素化合物。本发明的核酸分子可以用于建立具有表达微生物蛋白能力的转基因植物。优选的植物宿主将是支持本发明蛋白的高生产水平的任何物种。合适的绿色植物将包括,但不限于大豆、油菜籽(Brassica napus,B.campestris)、胡椒、向日葵(Helianthus annus)、棉花(Gossypium hirsutum)、玉米、烟草(Nicotiana tabacum)、苜蓿(Medicago sativa)、小麦(Triticum sp)、大麦(Hordeum vulgare)、燕麦(Avena sativa,L)、高梁(Sorghum bicolor)、稻(Oryza sativa)、拟南芥、十字花科植物(嫩茎花椰菜、花椰菜、甘蓝、欧洲防风等)、甜瓜、胡萝卜、芹菜、欧芹、番茄、马铃薯、草莓、花生、葡萄、草籽作物、甜菜、甘蔗、豆科植物、豌豆、黑麦、亚麻、阔叶树、针叶树和饲料草。藻类物种包括但不限于商业上重要的宿主,如Spirulina、Haemotacoccus和Dunalliela。可以通过以下步骤实现类胡萝卜素化合物的生产:首先构建本发明的嵌合基因,其中将编码区与能够指导基因在处于需要的发育阶段的需要的组织中表达的启动子。为了方便,嵌合基因可以包含启动子序列和来自相同基因的翻译前导序列。也必须提供编码转录终止信号的3’非编码序列。本发明的嵌合基因也可以包含一个或多个内含子,以便促进基因表达。
能够诱导编码区的任何启动子和任何终止子的任何组合都可以用于嵌合基因序列中。启动子和终止子的一些合适的实例包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的那些。可以使用的一种类型的有效植物启动子是高水平的植物启动子。所述与本发明的基因序列可操作性连接的启动子应该能够促进本发明基因产物的表达。可以用于本发明的高水平植物启动子包括例如来自大豆的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(ss)的启动子(Berry-Lowe et al.,J.Molecular and App.Gen.,1:483-4981982))和叶绿体a/b结合蛋白的启动子。已知这两种启动子在植物细胞中都是光诱导型(参见,例如Genetic Engineering of Plants,an Agricultural Perspective,A.Cashmore,Plenum,NY(1983),29-38页;Coruzzi,G.et al.,The Journalof Biological Chemistry,258:1399(1983),和Dunsmuir,P.et al.,Journalof Molecular and Applied Genetics,2:285(1983))。
然后可以构建包含本发明的嵌合基因的质粒载体。质粒载体的选择依赖于用于转化宿主植物的方法。本领域技术人员充分了解必须存在于质粒载体上的遗传元件,以便成功转化、选择和繁殖含有嵌合基因的宿主细胞。本领域技术人员也了解,不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(Jones et al.,EMBO J.,4:2411-2418(1985);DeAlmeida et al.,Mol.Gen.Genetics,218:78-86(1989))。因此,必须筛选多个事件,以获得展示需要的表达水平和模式的细胞系。可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern,J.Mol.Biol.,98:503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek,J.Chromatogr.Biomed.Appl.,618(1-2):133-145(1993))、蛋白表达的Western分析或表型分析完成所述筛选。
对于一些应用,引导本发明的蛋白到不同的细胞区室也是有用的。因此,认为可以通过以下方法进一步补充上述嵌合基因:添加合适的细胞内导向序列,如转运序列(Keegstra,K.,Cell,56:247-253(1989))、信号序列或编码内质网定位的序列(Chrispeels,J.J.,Ann.Rev.Plant Phys.Plant MoI.Biol.,42:21-53(1991)),或核定位信号(Raikhel,N.,Plant Phys.,100:1627-1632(1992))和/或除去已经存在的导向序列,从而改变编码酶的序列。尽管引用的参考文献给出了其实例,但该列表不是穷举性的,并且以后可能会发现更多可以用于本发明的有用的导向信号。
蛋白质工程
认为本发明的核苷酸可以用于制备具有增强或改变的活性的基因产物。已知多种方法可以用于使天然基因序列突变,以制备具有改变或增强的活性的基因产物,所述方法包括但不限于易错PCR(Melnikov et al.,Nucleic Acids Research,Vol.27(4):1056-1062(1999));定点诱变(Coombs et al.,Proteins,259-311,Editors):Angeletti,RuthHogue.Publisher:Academic,San Diego,CA(1998))和“基因改组”(US5,605,793;US 5,811,238;US 5,830,721;US 5,837,458;和US10/374366,在此引入作为参考)。
由于容易实施和高速诱变以及容易筛选,基因改组方法特别有吸引力。基因改组的过程涉及在额外DNA区群体的存在下将目的基因用内切核酸酶限制性切割为特定大小的片段,所述DNA区与目的基因具有相似性或差异。然后使该片段集合变性,并且重新退火,以产生突变的基因。然后筛选活性改变的突变基因.
可以使本发明的微生物序列进行突变,然后通过该方法筛选改变或增强的活性。所述序列应该是双链的,并且可以是从50bp-10kb的各种长度。可以用本领域公知的限制性内切核酸酶将所述序列随机消化为大约10bp-1000bp的片段(Maniatis,同上文)。除了本发明的微生物序列,可以加入与所有或部分微生物序列可杂交的片段群体。类似地,也可以加入与本发明的序列不可杂交的片段群体。典型地,以与总核酸相比大约10-20倍过量加入这些额外的片段群体。正常情况下,如果进行该过程,混合物中不同的特定核酸片段的数目将是大约100-大约1000。对随机核酸片段的混合群体进行变性,形成单链核酸片段,然后重新退火。仅仅是具有与其它单链核酸片段同源的区域的单链核酸片段将重新退火。可以通过加热使随机核酸片段变性。本领域技术人员可以确定使双链核酸完全变性所必须的条件。优选地,温度是80℃-100℃。可以通过冷却使核酸片段重新退火。优选地,温度是20℃-75℃。可以通过加入聚乙二醇("PEG")或盐而加速复性。合适的盐浓度可以是0mM-200mM。然后在核酸聚合酶和dNTP(即dATP,dCTP,dGTP和dTTP)存在下温育退火的核酸片段。核酸聚合酶可以是克列诺片段、Taq聚合酶或本领域公知的任何其它DNA聚合酶。可以在退火前、与退火同时或在退火后将聚合酶加入随机核酸片段。将聚合酶存在下的变性、复性和温育循环重复需要的次数。优选地,重复该循环2-50次,更优选地,重复该顺序10-40次。得到的核酸是更大的约50bp-约100kb的双链多核苷酸,并且可以通过标准克隆和表达方案(Maniatis,同上文)筛选表达。
此外,可以通过用基因改组(外显子改组)方法进行的功能结构域融合而组装杂合蛋白(Nixon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,94:1069-1073(1997))。本发明基因的功能结构域可以与其它基因的功能结构域组合,以产生具有所需催化功能的新酶。可以用PCR重叠延伸法构建杂合酶,并且用本领域技术人员公知的技术克隆到多种表达载体中。
参与类胡萝卜素生产的基因
可以方便地将参与类胡萝卜素生物合成的酶途径视为两部分,即上游类异戊二烯途径,其提供丙酮酸和甘油醛-3-磷酸向法呢基焦磷酸(FPP)的转化,和下游类胡萝卜素生物合成途径,其提供八氢番茄红素的合成和所有随后生产的类胡萝卜素。上游途径普遍存在于很多非类胡萝卜素生产微生物中,在这些情况下其仅仅对于导入包含所需类胡萝卜素生物合成的下游途径的基因是必须的。两个途径之间的关键划分涉及法呢基焦磷酸的合成。当天然存在FPP时,仅仅需要下游类胡萝卜素途径的元件。但是。可以理解,对于在类胡萝卜素的生产中有效的下游途径类胡萝卜素基因,宿主细胞必须具有合适的细胞内FPP水平。当宿主细胞不提供FPP合成时,必须导入生产FPP所必须的基因。下面将详细讨论这些途径中的每一个。
上游类异戊二烯途径
类异戊二烯生物合成是通过以下两个途径之一进行的,产生共有的C5异戊二烯亚基,即异戊烯基焦磷酸(IPP)。首先,IPP可以通过公知的乙酸/甲羟戊酸途径合成。但是,最近的研究证明,甲羟戊酸依赖性途径不在所有活生物中起作用。已经在细菌和绿藻以及高等植物中鉴定了IPP生物合成的一种替代的甲羟戊酸非依赖性途径(Horbach etal.,FEMS Microbiol.Lett.,111:135-140(1993);Rohmer et al.,Biochem.,295:517-524(1993);Schwender et al.,Biochem.,316:73-80(1996);和Eisenreich et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:6431-6436(1996))。
甲羟戊酸非依赖性途径类异戊二烯途径是已知的。例如,Cole et al.(Nature,393:537-544(1998))已经在结核分枝杆菌中研究了导致产生IPP的替代途径的起始步骤。该途径的第一步涉及两个3碳分子(丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸)的缩合,得到称作D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸的5-碳化合物。该反应是通过dxs基因编码的DXS酶发生的。随后,D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸的异构化和还原产生2-C-甲基D-赤藓糖醇-4-磷酸。参与异构化和还原过程的酶之一是由基因dxr(ispC)编码的D-1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)。随后,2-C-甲基D-赤藓糖醇-4-磷酸由未标注的基因ygbP编码的酶在CTP依赖性反应中转化为4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇。但是,最近ygbP基因被重新命名为ispD,作为isp基因簇的一部分(SwissProtein编号Q46893)。
随后,可以通过ychB基因编码的酶在ATP依赖性反应中将4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇的第2位的羟基磷酸化。YchB将4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇磷酸化,得到4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇2-磷酸。将ychB基因重新命名为ispE,其也是isp基因簇(SwissProtein编号P24209)的一部分。YgbB以CTP依赖性方式将4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤藓糖醇2-磷酸转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸。最近也对该基因进行了重新命名,其属于isp基因簇。具体地,ygbB基因的新名称是ispF(SwissProtein编号P36663)。
认为由gcpE(ispG)和lytB(ispH)基因(也许还有其它基因)编码的酶参与导致形成异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的反应。IPP也可以通过IPP异构酶异构为DMAPP,该异构酶由idi基因编码。但是,该酶不是存活所必须的,并且可能不存在于利用2C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径的一些细菌中。最近的证据表明,MEP途径在IPP之前分支,并且独立地经过lytB基因产物产生IPP和DMAPP。除了在补加了IPP和DMAPP的培养基中,LytB敲除突变在大肠杆菌中是致死的。
FPP的合成是通过IPP异构为二甲基烯丙基焦磷酸而发生的。该反应之后是由ispA催化的一系列的两个异戊二烯基转移酶反应,导致产生香叶基焦磷酸(GPP;一种10碳分子)和法呢基焦磷酸(FPP;一种15碳分子)。
已知编码上游途径的元件的基因来源于多种植物、动物和细菌来源,如表1所示。
表1
编码上游类异戊二烯途径的基因的来源
基因 | Gen Bank编号和来源的生物 |
dxs(D-1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶) | AF035440,大肠杆菌Y18874,聚球蓝细菌PCC6301AB026631,链霉菌种CL190AB042821,Streptomyces griseolosporeusAF111814,恶性疟原虫AF143812,番茄AJ279019,黄水仙AJ291721,烟草 |
dxr(ispC)(1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶) | AB013300,大肠杆菌AB049187,Streptomyces griseolosporeusAF111813,恶性疟原虫AF116825,辣薄荷AF148852,拟南芥AF182287,黄花蒿AF250235,长春花AF282879,铜绿假单胞菌AJ242588,拟南芥AJ250714,运动发酵单胞菌株ZM4AJ292312,肺炎克氏杆菌AJ297566,玉米 |
ygbP(ispD)(2-C-甲基I-D-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰基转移酶) | AB037876,拟南芥AF109075,艰难梭菌AF230736,大肠杆菌AF230737,拟南芥 |
ychB(ispE)(4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶) | AF216300,大肠杆菌AF263101,番茄AF288615,拟南芥 |
ygbB(ispF)(2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶) | AB038256,大肠杆菌mecs基因AF230738,大肠杆菌AF250236,长春花(MECS)AF279661,恶性疟原虫AF321531,拟南芥 |
gcpE(ispG)(1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶) | O67496,Aquifex aeolicusP54482,枯草芽孢杆菌Q9pky3,Chlamydia muridarumQ9Z8H0,肺炎支原体O84060,砂眼衣原体P27433,大肠杆菌P44667,流感嗜血杆菌Q9ZLL0,幽门螺杆菌J99O33350,结核分枝杆菌S77159,集胞蓝细菌种Q9WZZ3,海栖热袍菌O83460,苍白密螺旋体Q9JZ40,脑膜炎奈瑟氏菌Q9PPM1,空肠弯曲杆菌Q9RXC9,耐放射异常球菌AAG07190,铜绿假单胞菌Q9KTX1,霍乱弧菌 |
lytB(ispH) | AF027189,不动杆菌种BD413AF098521,炎鼻疽伯克霍尔德氏菌AF291696,肺炎链球菌AF323927,恶性疟原虫基因M87645,枯草芽孢杆菌U38915,集胞蓝细菌种X89371,空肠弯曲杆菌O67496 |
IspA(FPP合酶) | AB003187,藤黄微球菌AB016094,细长聚球蓝细菌AB021747,法呢基二磷酸合酶的稻FPPS1基因AB028044,炎球红细菌AB028046,荚膜红细菌AB028047,嗜硫小红卵菌AF112881和AF136602,黄花蒿AF384040,辣薄荷D00694,大肠杆菌D13293,B.stearothermophilusD85317,稻X75789,拟南芥Y12072,G.arboreumZ49786,H.brasiliensisU80605,拟南芥法呢基二磷酸合酶前体(FPS1)mRNA,完整cds X76026,法呢基二磷酸合成酶的K.Lacitis FPS基因,bc1复合体的QCR8基因,亚基VIII |
X82542,法呢基二磷酸合酶(FPS1)的P.argentatummRNAXB2543,法呢基二磷酸合酶(FPS2)的P.argentatummRNABC010004,人,法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶,二甲基烯丙基转移酶,香叶基转移酶),克隆MGC15352 IMAGE,4132071,mRNA,完整cdsAF234168,Dictyostelium discoideum法呢基二磷酸合酶(Dfps)L46349,拟南芥法呢基二磷酸合酶(FPS2)mRNA,完整cdsL46350,拟南芥法呢基二磷酸合酶(FPS2)基因,完整cdsL46367,拟南芥法呢基二磷酸合酶(FPS1)基因,可变产物,完整cdsM89945,大鼠法呢基二磷酸合酶基因,外显子1-8NM_002004,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶,二甲基烯丙基转移酶,香叶基转移酶)(FDPS),mRNA,U36376,黄花蒿法呢基二磷酸合酶(fps1),mRNA,完整cdsXM_001352,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶,二甲基烯丙基转移酶,香叶基转移酶)(FDPS),mRNAXM_034497,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶,二甲基烯丙基转移酶,香叶基转移酶)(FDPS),mRNAXM_034498,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶,二甲基烯丙基转移酶,香叶基转移酶)(FDPS),mRNAXM_034499,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶,二甲基烯丙基转移酶,香叶基转移酶)(FDPS),mRNAXM_0345002,人法呢基二磷酸合酶(法呢基焦磷酸合成酶,二甲基烯丙基转移酶,香叶基转移酶)(FDPS),mRNA |
下游类胡萝卜素生物合成途径
上游类异戊二烯途径和下游类胡萝卜素生物合成途径的区分某种程度上是主观的。由于FPP合成在生产类胡萝卜素和不生产类胡萝卜素的细菌中是共有的,下游类胡萝卜素生物合成途径的第一个步骤被认为是以将法呢基焦磷酸(FPP)转化为香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的异戊烯基转移酶反应而开始的。编码GGPP合成酶的crtE基因负责该异戊烯基转移酶反应,该反应将IPP添加到FPP,以产生20碳分子GGPP。两个分子的GGPP的缩合反应形成八氢番茄红素(PPPP),即下游类胡萝卜素生物合成途径的第一个40碳分子。该酶促反应由编码八氢番茄红素合酶的crtB催化。
番茄红素是通过4个连续的脱氢反应从八氢番茄红素制备的,所述反应除去8个氢原子,该反应是由基因crtl(编码八氢番茄红素去饱和酶)催化的。该反应的中间体是六氢番茄红素、ζ-胡萝卜素和链孢红素。
番茄红素环化酶(crtY)将番茄红素转化为β-胡萝卜素。但是,可以用其它基因生产多种其它类胡萝卜素。例如,通过来自β-胡萝卜素羟化酶(由crtZ基因编码)的活性的羟化反应将β-胡萝卜素转化为玉米黄素。β-隐黄素是该反应的中间体。
可以通过crtW、bkt或crtO基因编码的β-胡萝卜素酮酶将β-胡萝卜素转化为角黄素。海胆酮典型地是该反应的中间体。然后可以通过crtZ基因编码的β-胡萝卜素羟化酶将角黄素转化为虾青素。Adonbirubrin是该反应的中间体。
可以将玉米黄素转化为玉米黄素-β-二葡糖苷。该反应是由玉米黄素葡糖基转移酶(crtX)催化的。
已知编码下游类胡萝卜素生物合成途径的元件的基因来源于多种植物、动物和细菌来源,如表2所示。
表2
编码下游类胡萝卜素生物合成途径的基因的来源
基因 | GenBank编号和来源的生物 |
crtE(GGPP合酶) | AB000835,拟南芥AB016043和AB019036,人AB016044,小鼠AB027705和AIB027706,胡萝卜AIB034249,Croton sublyratusAB034250,野甘草AF020041,向日葵AF049658,黑翅果蝇信号识别颗粒19kDa蛋白(srp19)基因,部分序列;和香叶基香叶基焦磷酸合酶(quemao)基因,完整cdsAF049659,黑翅果蝇香叶基香叶基焦磷酸合酶mRNA,完整cdsAF139916,扩展短杆菌AF279807,蕈青霉香叶基香叶基焦磷酸合酶(ggs1)基因,完整cdsAF279808,蕈青霉二甲基烯丙基色氨酸合酶(paxD)基因,部分cds;和细胞色素P450单加氧酶(paxQ),细胞色素P450单加氧酶(paxP),PaxC(paxC),单加氧酶(paxM),香叶基香叶基焦磷酸合酶(paxG),PaxU(paxU)和代谢物转运蛋白(paxT)基因,完整cdsAJ010302,类球红细菌AJ133724,金色分枝杆菌AJ276129,香叶基香叶基焦磷酸合酶的Mucorcircinelloides f.Lusitanicus carG基因,外显子1-6D85029,香叶基香叶基焦磷酸合酶的拟南芥mRNA,部分cdsL25813,拟南芥L37405,灰色链霉菌香叶基香叶基焦磷酸合酶(crtB),八氢番茄红素去饱和酶(crtE)和八氢番茄红素合酶(crtl)基因,完整cdsU15778,白羽扇豆香叶基香叶基焦磷酸合酶(ggps1)mRNA,完整cdsU44876,拟南芥香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPS2)mRNA,完整cdsX92893,长春花X95596,灰色链霉菌X98795,白色链霉菌Y15112,Paracoccus marcusii |
crtX(玉米黄素转葡糖基酶) | D90087,噬夏孢欧文氏菌M87280和M90698,成团泛菌 |
crtY(番茄红素-β- | AF139916,扩展短杆菌 |
环化酶) | AF152246,辣薄荷AF218415,慢生根瘤菌种ORS278AF272737,灰色链霉菌株IF013350AJ133724,金色分枝杆菌AJ250827,番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶的Rhizomucor circinelloides f.LusitanicuscarRP基因,外显子1-2AJ276965,番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶的布拉氏须霉carRA基因,外显子1-2D58420,Agrobacterium aurantiacumD83513,长赤细菌L40176,拟南芥番茄红素环化酶(LYC)mRNA,完整cdsM87280,成团泛菌U50738,拟南芥番茄红素ε环化酶mRNA,完整cdsU50739,拟南芥番茄红素环化酶mRNA,完整cdsU62808,黄杆菌ATC021588X74599,番茄红素环化酶的聚球蓝细菌种1cy基因X81787,编码番茄红素环化酶的烟草Crtl-1基因X86221,C.annuumX86452,番茄红素β-环化酶的L.esculentum mRNAX95596,灰色链霉菌X98796,黄水仙 |
crtl(去饱和酶) | AB046992,八氢番茄红素去饱和酶的温州蜜柑CitPDS1 mRNA,完整cdsAF039585,玉米八氢番茄红素去饱和酶(pds1)基因启动子区和外显子1AF049356,稻八氢番茄红素去饱和酶前体(Pds)mRNA,完整cdsAF139916,扩展短杆菌AF218415,慢生根瘤菌种OR8278AF251014,万寿菊AF364515,葡萄柚D58420,Agrobacterium aurantiacumD83514,长赤细菌L16237,拟南芥L37405,灰色链霉菌香叶基香叶基焦磷酸合酶(crtB),八氢番茄红素去饱和酶(crtE)和八氢番茄红素合酶(crtl)基因,完整cdsL39266,玉米八氢番茄红素去饱和酶(Pds)mRNA,完整cdsM64704,大豆八氢番茄红素去饱和酶M88683,番茄八氢番茄红素去饱和酶(pds)mRNA,完整cds |
S71770,类胡萝卜素基因簇U37285,玉米U46919,毛茄八氢番茄红素去饱和酶(pds)基因,部分cdsU62808,黄杆菌ATCC21588X55289,八氢番茄红素去饱和酶的聚球蓝细菌pds基因X59948,L.esculentumX62574,八氢番茄红素去饱和酶的集胞蓝细菌种pds基因X68058,八氢番茄红素去饱和酶的C.annuumpds1mRNAX71023,八氢番茄红素去饱和酶的番茄pds基因X78271,番茄(Ailsa Craig)PDS基因X78434,布拉氏须霉(NRRL1555)carB geneX78815,黄水仙X86783,H.pluvialisY14807,Dunaliella bardawilY15007,Xanthophyllomyces dendrorhousY15112,Paracoccus marcusiiY15114,Anabaena PCC7210 crtP基因Z11165,R.capsulatus | |
crtB(八氢蕃茄红素合酶) | AB001284,Spirulina platersisAB032797,八氢番茄红素合酶的Daucus carotaPSY mRNA,完整cdsAB034704,Rubrivivax gelatinosusAB037975,温州蜜柑AF009954,拟南芥八氢番茄红素合酶(PSY)基因,完整cdsAF139916,扩展短杆菌AF152892,葡萄柚AF218415,慢生根瘤菌种ORS278AF220218,温州蜜柑八氢番茄红素合酶(PSY1)mRNA,完整cdsAJ010302,红细菌AJ133724,金色分枝杆菌AJ278287,番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶的布拉氏须霉carRA基因AJ304825,八氢番茄红素合酶的向日葵mRNA(psy基因)AJ308385,八氢番茄红素合酶的向日葵mRNA(psy基因)D58420,Agrobacterium aurantiacumL23424,番茄八氢番茄红素合酶(PSY2)mRNA,完整cdsL25812,拟南芥L37405,灰色链霉菌香叶基香叶基焦磷酸合酶(crtB),八氢番茄红素去饱和酶(crtE)和番茄八氢 |
番茄红素合酶(crtl)基因,完整cdsM38424,成团泛菌八氢番茄红素合酶(crtE)基因,完整cdsM87280,成团泛菌S71770,类胡萝卜素基因簇U32636,玉米八氢番茄红素合酶(Y1)基因,完整cdsU62808,黄杆菌ATCC21588U87626,Rubrivivax gelatinosusU91900,Dunaliella bardawilX52291,荚膜红细菌X60441,八氢番茄红素合酶的番茄GTom5基因X63873,八氢番茄红素合酶的聚球蓝细菌PC07942pys基因X68017,八氢番茄红素合酶的C.annuum psy1mRNAX69172,八氢番茄红素合酶的集胞蓝细菌种pys基因X78814,黄水仙 | |
crtZ(β-胡萝卜素羟化酶) | D58420,Agrobacterium aurantiacumD58422,产碱菌种D90087,噬夏孢欧文氏菌M87280,成团泛菌U62808,黄杆菌ATCC21588Y15112,Paracoccus marcusjj |
crtW(β-胡萝卜素酮酶) | AF218415,慢生根瘤菌种ORS278D45881,Haematococcus pluvialisD58420,Agrobacterium aurantiacumD58422,产碱菌种X86782,HpluvialisY15112,Paracoccus marcusii |
非crtZ类胡萝卜素基因的优选来源是斯氏泛菌(ATCC 8199;WO02/079395)、成团泛菌DC404(US 10/808807;在此引入作为参考)、肠杆菌DC260(US 10/808979;在此引入作为参考)、泡囊短波单胞菌DC263(US 11/015433;在此引入作为参考),和Sphingomonas melonisDC18(US 11/015433;在此引入作为参考)。采用本发明的方法生产羟化类胡萝卜素的优选crtZ基因来源是泡囊短波单胞菌DC263(SEQ IDNO:16)或Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278(SEQID NO:19)。
通过采用表2所示基因和本发明的优选crtZ基因的组合,可以用本发明的方法制备多种不同的类胡萝卜素和类胡萝卜素衍生物,前提是宿主生物中存在足够的FPP来源。例如,基因簇crtEXYIB使得能够生产β-胡萝卜素。将crtZ加入crtEXYIB,使得能够生产玉米黄素。
实施例
下述实施例进一步定义了本发明。应当理解的是,这些实施例虽然指出了本发明的优选实施方案,但仅用于例证。通过上文的论述和这些实施例,本领域技术人员可确定本发明的基本特征,并且在不背离本发明精神和范畴的前提下,可对其进行多种改变和改进,使其适用于多种用途和条件。
通用方法
应用在实施例中的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的,并且描述于Maniatis(同上文)和T.J.Silhavy,M.L.Bennan,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)以及Ausubel,F.M.et al.,Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience(1987)。
适用于细菌培养的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下述实施例的技术可参见Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips,eds),American Society for Microbiology,Washington,DC.(1994)),或Brock(同上文)或Deshpande(同上文)。如无另外指明,用于细菌细胞的生长和维持的所有试剂、限制酶和材料获自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、DIFCO Laboratories/BD Diagnostics(Sparks,MD)、Promega(Madison,WI)、New England Biolabs(Beverly,MA)、GIBCO/BRL Life Technologies(Carlsbad,CA)或Sigma ChemicalCompany(St.Louis,MO)。
用Sequencher程序进行序列编辑和比对。nr数据库中的序列检索用采用BLOSUM62矩阵的BLASTP进行。用Vector NTI中的AlignX进行核苷酸和氨基酸序列的逐对序列比对。当在这些或其它程序中未提示程序参数时,使用默认值。
缩写词的含义如下:“h”指小时、“min”指分钟、“sec”指秒、“d”指天、“mL”指毫升、“μL”指微升、“L”指升、“g”指克、“mg”指毫克、“μg”指微克、“ng”指纳克、“ppm”指每百万的份数。
实施例1
生产类胡萝卜素的细菌菌株的分离和表征
本实施例描述了两种细菌菌株,即泡囊短波单胞菌DC263和Sphingomonas melonis DC 18的分离和它们的天然类胡萝卜素的初步分析。
菌株分离和分型
为了分离天然的类胡萝卜素生产菌株,从环境样品的集合中分离了有颜色的微生物。将来自Wilmington,Delaware的一个院子的大约1g的表面土壤重悬于10mL自来水中。将10μL满环的水划线到Luria-Broth(LB)板上,将板在30℃下温育。挑选具有不同菌落外观的有颜色的细菌,并且划线两次到在LB板上均匀,在30℃下温育。在这些菌落中,形成橙色-粉色菌落的一个菌落被命名为菌株DC263(US11/015433)。从宾夕法尼亚的溪流中分离了菌株DC18。将含水样品的系列稀释液(10-2,10-4和10-6)铺板到具有富含胰化蛋白胨和酵母的基本培养基的大245 x 245mm15%琼脂板上。基本培养基的成分(每升)是:NH4Cl0.8g,KH2PO40.5g,MgCl26H2O 0.2g,CaCl22H2O 0.1g,NaNO3 1.3g,和Na2SO4 0.5g。储液1的成分是(每升):次氮基三乙酸12.8g,FeCl2.4H2O 0.3g,CuCl2.2H2O 0.0254g,MnCl2.4H2O 0.1g,CoCl2.6H2O 0.312g,ZnCl2 0.1g,H3BO3 0.01g,Na2MoO4.2H2O 0.01g和NiCl2.6H2O 0.184g。将10毫升储液1加入每1升基本培养基。用浓度为10g/L的胰化蛋白胨和5g/L的酵母提取物补充培养基。将培养基pH调节为7。在室温下温育平板,将单菌落划线到相同平板上两次。选择形成橙色菌落的一个菌株,命名为菌株DC18(US 11/015433)。
用DC263和DC18进行16S rRNA基因测序。具体地,用引物HK12:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO:1)和JCR14:5′-ACGGGCGGTGTGTAC-3′(SEQ ID NO:2),通过PCR扩增菌株的16SrRNA基因。根据制造商的说明书(Qiagen,Valencia,CA),用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化扩增的16S rRNA基因,并且在自动化的ABI测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上测序。用引物HK12、JCR14和JCR15:5’-GCCAGCAGCCGCGGTA-3’(SEQ ID NO:3)起始测序反应。将DC263的组装的1268bp16S rRNA基因序列(SEQ ID NO:4)和DC18的1291 bp 16S rRNA基因序列(SEQ ID NO:5)用作对进行的BLASTN检索(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997))的询问序列。DC263的16S rRNA基因序列表现出与短波单胞菌株的基因序列的同源性,最高命中为与泡囊短波单胞菌的99%同一性。该菌株命名为泡囊短波单胞菌DC263。DC18的16SrRNA基因序列表现出与鞘氨醇单胞菌株的同源性,最高命中为与Sphingomonas melonis的98%同一性。因此将该菌株命名为Sphingomonas melonis DC18。
类胡萝卜素分析
按照对菌株分离的描述,使泡囊短波单胞菌DC263在100mL LB中生长。使Sphingomonas melonis DC18在100mL相同培养基中生长。使两种菌株都在30℃振荡下生长过夜。通过4000g离心15分钟使细胞沉淀,用10mL丙酮提取细胞沉淀。将提取物在氮气中干燥,重新溶解于1-2mL丙酮中。用 CR25mm注射过滤器(PallCorporation,Ann Arbor,MI)过滤提取物。然后将其在0.1mL10%丙酮+90%乙腈中浓缩,以便用Agilent Series 1100 LC/MSD SI(Agilent,Foster City,CA)进行HPLC分析。
将样品(20μL)加入150mm×4.6mm ZORBAX C18(3.5μm颗粒)柱(Agilent Technologies,Inc.)。柱温保持在40℃。流速是1mL/min,而采用的溶剂运行程序是
0-2min:95%缓冲液A和5%缓冲液B;
2-10min:从95%缓冲液A和5%缓冲液B到60%缓冲液A和40%缓冲液B的线性梯度;
10-12min:从60%缓冲液A和40%缓冲液B到50%缓冲液A和50%缓冲液B的线性梯度
12-18min:50%缓冲液A和50%缓冲液B,以及
18-20min:95%缓冲液A和5%缓冲液B。
缓冲液A是95%乙腈和5%dH2O;缓冲液B是100%四氢呋喃。
图2显示分别在DC263和DC18中生产的类胡萝卜素的HPLC图谱。LC-MS分析确定了DC263中的主要类胡萝卜素的分子量是628,DC18中的主要类胡萝卜素的分子量是614。基于HPLC洗脱时间、吸收谱和分子量,预测DC263中的主要类胡萝卜素是四羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮。预测DC18中的主要类胡萝卜素是四羟基-β,β′-胡萝卜素-4-酮。确定了DC263和DC18中的主要类胡萝卜素的性质,与文献中对这些类胡萝卜素报道的性质一致(Yokoyama et al.,Biosci.Biotech.Biochem.,60:200-203(1996);Kleinig et al,Helvetica Chimica Acta,60:254-258(1977))。
实施例2
构建β-胡萝卜素合成质粒
在此应用中采用两种β-胡萝卜素合成质粒。质粒pDCQ329用作筛选小的插入片段文库的报道质粒,以克隆羟化酶基因。该质粒含有分离自类胡萝卜素生产菌株DC260(US 10/808979)的crtEXYIB基因簇。从肠杆菌菌株DC260分离类胡萝卜素基因簇和构建质粒pDCQ329以前描述于US 10/808979;在此引入作为参考。
用质粒pDCQ330证实新基因的类胡萝卜素羟化酶活性。该质粒其含有分离自成团泛菌DC404的crtEidiYIB基因簇。从成团泛菌菌株DC404分离类胡萝卜素基因簇和构建质粒pDCQ330以前描述于US10/808807;在此引入作为参考。
DC260和DC404是从Wilmington,Delaware的环境中分离的类胡萝卜素生产菌株。从住宅房屋朝西的墙上的一块砖的表面分离了肠杆菌菌株DC260。从住宅的菜园中的土壤分离了成团泛菌菌株DC404。洗涤样品,将10μL满环的重悬液划线到Luria-Broth(LB)板上,将板在30℃下温育。挑选具有不同菌落外观的有颜色的细菌,并且划线两次到在LB板上均匀,在30℃下温育。从这些菌落中,分离了形成浅黄色光滑透明菌落的DC260和DC404。
从DC260和DC404构建粘粒文库,以便按照制造商的说明用Epicentre(Madison,WI)的pWEB粘粒克隆试剂盒克隆β-胡萝卜素合成基因。经过注射器针头剪切基因组DNA。使剪切的DNA末端修复,通过与40kB标准物比较,在低熔点琼脂糖凝胶上进行大小选择。纯化大小为大约40kB的DNA片段,连接到平端化的cloning-ready pWEB粘连载体中。用超高效MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts(Epicentre Technologies,Madison,WI)对文库进行包装,铺到EPI100大肠杆菌细胞上。从每个粘粒文库鉴定了两个黄色菌落,在此称作pWEB-260(含有crtEXYIBZ基因簇;SEQ ID NO:6)和pWEB-404。
对两个粘粒上的类胡萝卜素基因簇进行测序,并且亚克隆到pBHR1载体(MoBiTec,Goettingen,Germany)上。用引物pWEB260F:5′-GAATTCACCAACCATGGATAGCCATTATGAC-3′(SEQ ID NO:7)和pWEB260R:5′-GAATTCAACGAGGACGCTGCCACAGA-3′(SEQ IDNO:8)从pWEB-260扩增含有crtEXYIB基因的片段。用引物pWEB404F:5′-GAATTCACTAGTCGAGACGCCGGGTACCAACCAT-3′(SEQ ID NO:9)和pWEB404R:5′-GAATTCTAGCGCGGGCGCTGCCAGA-3’(SEQ ID NO:10)从pWEB-404扩增含有crtEidiYIB基因(SEQ ID NO:11)的片段。用PfuTurbo聚合酶(Stratagene,La Jolla,CA)进行PCR,采用以下热循环仪条件:92℃(5min);94℃(1min),60℃(1min),72℃(9min)进行25个循环;和72℃(10min)。将Taq聚合酶(Perkin Elmer)用于10分钟的72℃反应,以将额外的3’腺苷核苷酸加入片段,以便克隆到(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。转化到大肠杆菌TOP10细胞后,一些菌落表现出黄色,表明它们生产类胡萝卜素化合物。然后将基因簇亚克隆到宽宿主范围的载体pBHR1中,并且电穿孔到大肠杆菌10G细胞(Lucigen,Middletown,WI)中。在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上选择含有各个得到的质粒,即pDCQ329或pDCQ330的转化体。通过限制酶消化证实这些转化体,并且显示出生产β-胡萝卜素。
实施例3
从泡囊短波单胞菌DC263和Sphingomonas melonisDC18分离类胡萝卜素酮酶基因
本实施例描述了从细菌菌株泡囊短波单胞菌DC263和Sphingomonas melonis DC18构建小插入片段文库,并且从每种菌株克隆酮酶基因(参见US 11/015433)。
文库构建和筛选
按照实施例1的描述生长DC263和DC18的细胞。利用Qiagen基因组DNA制备试剂盒从细胞制备基因组DNA。通过随机剪切方法制备菌株DC263和DC18的小插入片段文库。经过291/2 G胰岛素注射器(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)约300次,以剪切DC263和DC18的基因组DNA,在0.8%琼脂糖凝胶上分离。从凝胶上切下4-6kb的级分,用Qiagen MinEluteTM Gel-Extraction试剂盒(Qiagen)提取。用Lucigen 修复试剂盒修复提取的DNA的末端。用pEZSeqTM Blunt克隆试剂盒(Lucigen)将修复的DNA插入片段连接到pEZseqTM载体中。将连接混合物电穿孔到新制备的大肠杆菌10G感受态细胞,该细胞含有β-胡萝卜素生产质粒pDCQ329(US 10/808979)。将转化体铺板到含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB板上。从每个文库获得大约50,000-100,000个转化体。从每个文库的数万个黄色菌落中鉴定一些橙色菌落。这些阳性克隆鉴定为可能含有将β-胡萝卜素转化为酮基类胡萝卜素的酮酶基因。
类胡萝卜素酮酶基因的分离
通过选择氨苄青霉素抗性和卡那霉素敏感克隆,从β-胡萝卜素报道质粒分离基于pEZ的质粒。通过用EZ-TN<TET-1>试剂盒(Epicentre,Madison,WI)和/或引物步移进行随机转座子插入,对基于pEZ的质粒上的插入片段进行测序。用SequencherTM程序(Gene codes Corp.,AnnArbor,MI)组装序列。通过进行BLAST(Basic Local Alignment SearchTool;Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1993))鉴定编码CrtW酮酶的基因,所述BLAST可检索与BLAST"nr"数据库(包含所有非冗余的 CDS翻译,来源于三维结构BrookhavenProtein Data Bank,SWISS-PROT蛋白序列数据库,EMBL和DDBJ数据库的序列)中含有的序列的相似性。来自泡囊短波单胞菌DC263和Sphingomonas melonis DC18的crtW基因的编码序列分别列为SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:13。
实施例4
类胡萝卜素羟化酶基因的分离
本实施例描速了从两个细菌菌株,即泡囊短波单胞菌DC263和Novosphingobinm aromaticivorans ATCC No.700278(以前命名为Sphingomonas aromaticivorans)分离类胡萝卜素羟化酶基因。从泡囊短波单胞菌DC263分离类胡萝卜素羟化酶基因
对含有来自DC263的crtW基因(SEQ ID NO:12)的基于pEZ的质粒进行测序,在基于pEZ的质粒的3kb插入片段上没有鉴定出类胡萝卜素羟化酶基因。为了对侧翼区的更多区域进行测序,按照上文对DC263的描述,按照制造商的说明,用来自Epicentre(Madison,WI)的pWEB粘粒克隆试剂盒构建了粘粒文库。在微量滴定板中的100μL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB中生长大约600个粘粒克隆。30℃下700rpm振荡下将板温育24小时。采用围绕基于pEZ的质粒的crtW区设计的引物pEZ263-F:5′-GTTCGAACTGGGGAAAACGGAC-3′(SEQ ID NO:14)和pEZ263-R:5′-CAAAGGCGTGAACCGAAATCCG-3′(SEQ ID NO:15),通过PCR筛选粘粒文库。分离含有延伸通过crtW区的大约40kb插入片段的阳性粘粒克隆F3-4。制备粘粒DNA,采用EZ-TN<TET-1>试剂盒(Epicentre,Madison,WI)和/或引物步移,通过随机转座子插入进行测序。用SequencherTM程序v4.05(Gene CodesCorp.,Ann Arbor,MI)组装序列。
通过进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1993))鉴定编码crtZ羟化酶基因的序列(SEQ ID NOs:16),所述BLAST可检索与BLAST"nr"数据库(包含所有非冗余的 CDS翻译,来源于三维结构BrookhavenProtein Data Bank,SWISS-PROT蛋白序列数据库,EMBL和DDBJ数据库的序列)中含有的序列的相似性。用国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法分析序列与"nr"数据库中含有的所有公共可获得的DNA序列的相似性。在所有读框中翻译DNA序列,并且用NCBI提供的BLASTX算法(Gish,W.and States,D.J.,Nature Genetics,3:266-272(1993))比较与nr"数据库中含有的所有公共可获得的蛋白序列的相似性。BLAST分析鉴定了与β-胡萝卜素具有同源性的ORF。最高命中是与来自产碱菌种的β-胡萝卜素羟化酶编号Q44262)具有51%的氨基酸同一性。表3显示了基于BLASTXnr算法的数据,其中具有以预期值报道的值。
也分离了Sphingomonas melonis DC18的含有crtW的粘粒,并且按照上文对泡囊短波单胞菌DC263的描述相似地测序。但是,在含有Sphingomonas melonis DC18 crtW的粘粒中没有发现DC18的crtZ羟化酶基因。
从Novosphingobium aromaticivorans ATCC 700278分离类胡萝卜素羟化酶基因
为了鉴定更多的类胡萝卜素羟化酶基因,检索了Novosphingobiumaromaticivorans ATCC No.700278的部分基因组序列数据库。将来自Agrobacterium aurantiacum(SEQ ID NO:18)的β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)用于对Novosphingobium aromaticivorans的基因组数据库进行BLAST检索。鉴定出来自Novosphingohium aromaticivorans的假定蛋白(蛋白编号No.ZP_00094836.1;SEQ ID NOs.19和20)表现出与土壤杆菌CrtZ的52%氨基酸同一性。然后将该假定蛋白用于对nr数据库进行BLAST检索。最高命中是与Pantoea agglomerans pv.Milletiae的CrtZ具有57%同一性。BLAST分析的大量其它“命中”是与来自其它生物的β-胡萝卜素羟化酶的同一性。分析了来自Novosphingobium aromaticivorans的假定蛋白的β-胡萝卜素羟化酶活性。
也采用Vector NTI中的多序列比对算法将此处鉴定的两种CrtZ类胡萝卜素羟化酶的核苷酸和氨基酸序列与一些已知的类胡萝卜素羟化酶基因进行的比较。表4显示了逐对比较的核苷酸序列同一性和氨基酸序列同一性的百分比。分离的两种crtZ基因仅仅与已知crtZ基因具有低到中度同源性,并且彼此是非常趋异的。
实施例5
证实类胡萝卜素羟化酶功能
本实施例描述了新的类胡萝卜素羟化酶基因在生产β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中的表达。通过将β-胡萝卜素转化为玉米黄素,证明了每种羟化酶基因的功能。
用于该研究中的生产β-胡萝卜素的菌株是含有质粒pDCQ330的大肠杆菌菌株。通过PCR扩增来自两种细菌菌株的推定的羟化酶基因。用引物crtZ-DC263_F:5’-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGTCCTGGCCGACGATGATC′(SEQIDNO:21)和crtZ-DC263_R:5′-TAGATCAGGCGCCGTTGCTGGATGA-3′(SEQ IDNO:22)扩增来自泡囊短波单胞菌DC263的crtZ。用引物41ZSPH_F:5′-ACTAGTTCTAGATAAGGAGGAATAAACCATGCAGACGCTTGCCGCG-3’(SEQ ID NO:23)和SPH_ZR:5′-GCTAGCCCTAGGTTAGCCGTCCACTGCCTC-3′(SEQ ID NO:24)扩增来自ATCC 700278的crtZ。将PCR产物克隆到(Invitrogen)载体中,筛选含有正向插入物的克隆。这得到了表达来自DC263的crtZ基因的pDCQ370TA和表达来自Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278的crtZ基因的pTrcHis2-ZS(Sphingo)。将这些构建体转化到含有pDCQ330的积累β-胡萝卜素的大肠杆菌菌株中。按照实施例1的描述,通过HPLC(图3)分析转化体中的类胡萝卜素。在5.96min洗脱的占优势的峰具有(456nm,480nm)的吸收谱和569的分子量m/z,这与玉米黄素合成标准物相同。玉米黄素标准物购自CaroteNature(Lupsingen,Switzerland)。玉米黄素的合成明确证明了两种新的crtZ基因的羟化酶功能。
实施例6
生产虾青素的质粒的克隆
本实施例描述了通过表达来自泡囊短波单胞菌DC263或Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278的crtZ基因,以及crtW基因和β-胡萝卜素合成基因簇而构建生产虾青素的质粒。
克隆含有来自泡囊短波单胞菌DC263的crtZ的生产虾青素的质粒
首先,通过除去crtX基因,从pDCQ329构建β-胡萝卜素合成基因簇crtEYIB。为了促进克隆,也除去了crtY基因末端的EcoRI位点。用引物crt-260_F:5′-GAATTCACTAGTACCAACCATGGATAGCCATTATG-3′(SEQ ID NO:25)和crt-260SOE_R:5′-ATCAGGTCGCCTCCGCCAGCACGACTTTCAGTTGAATATCGCTAGCTGTTG-3′(SEQ ID NO:26)扩增crtE基因。用引物crt-260SOE_F:5′-CAACAGCTAGCGATATTCAACTGAAAGTCGTGCTGGCGGAGGCGACCTGAT-3′(SEQ ID NO:27)和crt-260RI_R:5′-CATTTTTTCTTCCCTGGTTCGACAGAGTTCAACAGCGCGCGCAGCGCTT-3′(SEQ ID NO:28)扩增crtY基因。用替代性AAC密码子代替EcoRI位点中的AAT密码子,以除去EcoRI位点。采用引物crt-260_F和crt-260RI_R,通过SOEing PCR将crtEY基因连接在一起。用引物crt-260RI_F:5′-AAGCGCTGCGCGCGCTGTTGAACTCTGTCGAACCAGGGAAGAAAAAATG-3′(SEQ ID NO:29)和crt-260_R:5′-GAATTCAACGAGGACGCTGCCACAGA-3′(SEQ ID NO:30)扩增crtIB片段。采用引物crt-260_F和crt-260_R,通过另一次SOEing PCR将crtEYIB基因连接在一起。将含有crtEYIB基因的4.5kb EcoRI片段克隆到pBHR1的EcoRI位点,得到pDCQ340。证明了含有pDCQ340的大肠杆菌生产β-胡萝卜素。
然后,将来自DC263的crtW和crtZ基因克隆到pDCQ340上的crtEYIB簇的上游。用引物crtW-263_F:5′-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGCGGCAAGCGAACAGGATG-3′(SEQID NO:31)和crtW-263_R:5′-TCTAGACTAGCTGAACAAACTCCACCAG-3′(SEQ ID NO:32)扩增来自DC263的crtW。用引物crtZ-263_F2:5′-TCTAGAAAGGAGGAATAAACCATGTCCTGGCCGACGATGATC-5′(SEQID NO:33)和crtZ-263_R2:5′-ACTAGTCAGGCGCCGTTGCTGGATGA-3′(SEQ IDNO:34)扩增来自DC263的crtZ。将PCR产物克隆到pTrcHis2-载体中,分别得到pDCQ342TA和pDCQ352。将含有crtW的来自pDCQ342TA的0.8kb SpeI-XbaI片段克隆到pDCQ340的SpeI位点中。得到的pDCQ342含有crtEYIB基因簇上游的crtW。然后将含有crtZ的来自pDCQ352的0.5kb XbaI-SpeI片段克隆到pDCQ342上的crtW上游的SpeI位点。这得到了生产虾青素的质粒pDCQ344,其含有从pBHR1载体上的氯霉素抗性基因启动子(Pcat)表达的crtZWEYIB基因簇。
克隆含有来自Novosphinpobium aromaticivorans ATCC No.700278的crtZ的生产虾青素的质粒
来自Novosphingobium aromaticivorans的crtZ与来自Sphingomonas melonis DC18的crtW在内源性甲基单胞菌启动子Phps1(US 10/689200;在此引入作为参考)控制下共表达。用上游引物5′-CCATGGGCTAGCTAAGGATTGGGGTGCGT-3′(SEQ ID NO:35)和下游引物5′-CCATGGACTAGTGTGATGTGCTCCGAAAGT-3′(SEQID NO:36)从甲基单胞菌种16a基因组DNA扩增Phps1启动子。将含有Phps1的288bp NcoI片段克隆到pBHR1的NcoI位点,得到pDCQ363。用来自pTrcHis2-ZS(Sphingo)的SpeI和NheI消化来自Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278的crtZ,克隆到pDCQ363的SpeI位点中,得到pDCQ364。用引物crtW_sphingo_F5′-ACTAGTAAGGAGGAATAAACCATGACCGTCG-3′(SEQ IDNO:37)和crtW_sphingoR 5′-ATCTAGATTACCGGTCTTTGCTTAACGACCG-3′(SEQIDNO:38)扩增来自Sphingomonas melonis DC18的crtW。将含有crtW的SpeI-XbaI片段克隆到pDCQ364的SpeI和XbaI位点中。在得到的构建体pDCQ365中,来自Sphingomonas melonis DC18的crtW和来自Novosphingobium aromaticivorans ATCC No.700278的crtZ在内源性甲基单胞菌启动子Phps1的控制下作为一个转录单位共表达。然后将含有该crtWZ转录单位的NcoI片段克隆到β-胡萝卜素合成质粒pDCQ330的NcoI位点,得到生产虾青素的质粒pDCQ366。
实施例7
在大肠杆菌和甲基单胞菌中生产虾青素
本实施例描述了用于将生产虾青素的质粒转化到两种不相关的微生物宿主细胞,如大肠杆菌和甲基单胞菌种16a(ATCC PTA-2402)中的方法,以基于以前报道的方法生产虾青素(US 10/997844;在此引入作为参考)。
简言之,通过三亲株接合交配(US 10/997844)将质粒转移到甲基单胞菌16a中。在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中使含有pRK2013(ATCC No.37159)的大肠杆菌辅助菌株和含有质粒pDCQ344或pDCQ366的大肠杆菌10G或DH10B供体菌株生长过夜,在LB中洗涤三次,重悬于代表最初培养体积的大约60倍浓度的体积的LB中。
甲基单胞菌种16a MWM1200菌株含有crtN1aldcrtN2基因簇的双交换敲除,其破坏天然C30类胡萝卜素的合成(US 10/997844)。采用US09/941947中描述的通用条件,使MWM1200菌株作为受体生长。简言之,30℃下持续振荡下在血清塞Wheaton瓶(Wheaton Scientific,Wheaton IL)中使甲基单胞菌种16a MWM1200菌株生长,其中采用至少8:1的气/液比(即160mL总体积中的20mL硝酸盐液体"BTZ-3"培养基)。
甲基单胞菌16A的硝酸盐培养基
硝酸盐液体培养基,在此也称作“确定的培养基”或"BTZ-3"培养基,包含多种与下文所示溶液1混合的盐(表5和6),或其中指出硝酸盐被15mM氯化铵代替。溶液1提供了痕量矿物质的100倍浓缩的储液的组成。
表5
溶液1*
MW 浓度 g/L(mM) | |
次氮基乙酸CuCl2×2H2OFeCl2×4H2OMnCl2×4H2OCoCl2×6H2OZnCl2H3BO3Na2MoO4×2H2ONiCl2×6H2O | 191.1 66.9 12.8170.48 0.15 0.0254198.81 1.5 0.3197.91 0.5 0.1237.9 1.31 0.312136.29 0.73 0.161.83 0.16 0.01241.95 0.04 0.01237.7 0.77 0.184 |
*将上述克数在900mL H2O中混合,调节到pH=7,添加H2O到终体积1L。保持冷冻
表6
硝酸盐液体培养基(BTZ-3)**
MW 浓度 g/L(mM) | |
NaNO3KH2PO4Na2SO4MgCl2×6H2OCaCl2×2H2O1M HEPES(pH7)溶液1 | 84.99 10 0.85136.09 3.67 0.5142.04 3.52 0.5203.3 0.98 0.2147.02 0.68 0.1238.3 50mL10mL |
**溶解于900mL H2O中。调节到pH=7,添加H2O到1L。对于琼脂板:在1L培养基中加入15g琼脂,高压灭菌,冷却到50℃,混合,铺板。
用于培养的标准气相在空气中含有25%甲烷。在这些条件下在BTZ-3培养基中培养甲基单胞菌种16a MWM1200受体菌株48h,在BTZ-3中洗涤3次,重悬于代表最初培养体积的150倍浓度的体积的BTZ-3中。
以1:1:2的比例在含有0.5%(w/v)酵母提取物的BTZ-3琼脂板表面混合供体细胞、辅助细胞和受体细胞糊。30℃下将琼脂板在25%甲烷中维持16-72小时,以发生接合,此后收集细胞糊,重悬于BTZ-3中。将稀释液铺板在含有卡那霉素(50μg/mL)的BTZ-3琼脂上,30℃下在25%甲烷中温育最多1周。将橙色-红色转接合子划线到含有卡那霉素(50μg/mL)的BTZ-3琼脂上。
为了分析类胡萝卜素组成,在24孔板(Qiagen)上培养甲基单胞菌转接合子,每孔含有1mL含有卡那霉素(50μg/mL)的BTZ-3。用AirporeTM膜(Qiagen)覆盖板,在添加25%甲烷作为唯一碳源的AnaeroPackTM系统(Mitsubishi Gas Chemical Co.,Inc.,Japan)上温育。30℃下以250rpm将AnaeroPackTM振荡2-3天。30℃下250rpm振荡条件下将含有虾青素质粒的大肠杆菌细胞在25ml含有卡那霉素(50μg/mL)的LB中生长2-3天。通过离心收获细胞,提取沉淀,如实施例1所述通过HPLC分析类胡萝卜素含量。
来自含有pDCQ344的大肠杆菌10G或甲基单胞菌16a MWM 1200的提取物的HPLC分析如图4所示。虾青素占含有pDCQ344的大肠杆菌或甲基单胞菌生产的总类胡萝卜素的大约80%。在5.2-5.3min洗脱的虾青素峰在480nm具有最大吸收,并且具有597的分子量m/z,这与虾青素的合成标准物相同。在5.8-5.9min洗脱的最小峰在464nm具有最大吸收,并且具有583的分子量m/z,这与adonixanthin的合成标准物相同。虾青素和adonixanthin标准物购自CaroteNature(Lupsingen,Switzerland)。来自含有pDCQ366的大肠杆菌DH10B或甲基单胞菌16aMWM 1200的HPLC分析如图5所示。从大肠杆菌和甲基单胞菌生产了虾青素,作为在该程序中4.4-4.6min时洗脱的占优势的类胡萝卜素。除了一些小峰,在11.2min洗脱的峰占甲基单胞菌中总类胡萝卜素的10%。该峰在448nm、474nm、504nm具有最大吸收,并且具有536的分子量m/z,这与血清素生物合成的中间体番茄红素符合。
序列表
<110>E.I.DuPont de Nemours and Company
<120>类胡萝卜素羟化酶
<130>CL2676 PCT
<150>us 560/601947
<151>2004-08-16
<160>38
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<213>泡囊短波单胞菌 DC263
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<213>Sphingomonas melonis DC18
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<213>肠杆菌 DC260
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<213>成团泛菌 DC404
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<213>泡囊短波单胞菌 DC263
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<213>Sphingomonas melonis DC18
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<213>Agrobacterium aurantiacum
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<213>Novosphingobium aromaticivorans ATCC 700278
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<213>Novo5phingobium aromaticivorans ATCC 700278
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<223>引物
<400>38
Claims (25)
1.编码类胡萝卜素羟化酶的分离的核酸分子,其选自:
(a)编码SEQ ID NO:17所示氨基酸的分离的核酸分子;
(b)包含第一核苷酸序列的分离的核酸分子,所述第一核苷酸序列编码与包含SEQ ID NO:17所示氨基酸的多肽具有至少95%同一性的类胡萝卜素羟化酶;
(c)在以下杂交条件下与(a)杂交的分离的核酸分子:0.1X SSC,0.1%SDS,65℃和用2X SSC,0.1% SDS洗涤,然后用0.1X SSC,0.1% SDS洗涤;和
(d)与(a)、(b)或(C)互补的分离的核酸分子。
2.权利要求1的分离的核酸分子,如SEQ ID NO:16所示。
3.由权利要求1的分离的核酸分子编码的多肽。
4.嵌合遗传构建体,包含与合适的调节序列可操作性连接的权利要求1或2的分离的核酸分子。
5.转化的宿主细胞,包含权利要求4的嵌合遗传构建体。
6.权利要求5的转化的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自细菌、酵母、丝状真菌、藻类和绿色植物。
7.权利要求6的转化的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自曲霉属、木霉属、糖酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、发酵单胞菌属、土壤杆菌属、赤杆菌属、绿菌属、着色菌属、黄杆菌属、噬纤维菌属、红细菌属、红球菌属、链霉菌属、短杆菌属、棒杆菌属、分枝杆菌属、异常球菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、泛菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基微菌属、甲基孢囊菌属、产碱菌属、集胞蓝细菌属、聚球蓝细菌属、鱼腥蓝细菌属、硫杆菌属、甲烷杆菌属、克氏杆菌属和粘球菌属。
8.权利要求6的转化的宿主细胞,其中所述宿主细胞选自大豆、油菜籽、胡椒、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高梁、稻、拟南芥、十字花科植物、甜瓜、胡萝卜、芹菜、欧芹、番茄、马铃薯、草莓、花生、葡萄、草籽作物、甜菜、甘蔗、豆科植物、豌豆、黑麦、亚麻、阔叶树、针叶树和饲料草。
9.获得编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子的方法,该方法包括:
(a)合成至少一种相应于SEQ ID NO:16所示序列的一部分的寡核苷酸引物;和
(b)用步骤(a)的寡核苷酸引物扩增存在于克隆载体中的插入片段;
其中扩增的插入片段编码类胡萝卜素羟化酶。
10.生产羟化类胡萝卜素化合物的方法,该方法包括:
(a)提供生产具有至少一个β-芷香酮型环的环状类胡萝卜素的宿主细胞;
(b)用编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子转化(a)的宿主细胞,所述核酸分子选自:
(i)权利要求1或2的核酸分子;和
(ii)编码SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的核酸分子;和
(c)在合适的条件下使(b)的转化的宿主细胞生长,从而生产羟化类胡萝卜素。
11.权利要求10的方法,其中所述羟化类胡萝卜素选自虾青素、玉米黄素、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、3′-羟基海胆酮、adonirubin、adonixanthin、四羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮、四羟基-β,β′-胡萝卜素-4-酮、眉藻黄素、erythroxanthin、nostoxanthin、屈曲黄素、3-羟基-γ-胡萝卜素、3-羟基-4-酮基-γ-胡萝卜素、细菌玉红黄素、bacteriorubixanthinal和黄体素。
12.权利要求10的方法,其中所述环状类胡萝卜素选自β-胡萝卜素、角黄素、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、3′-羟基海胆酮、海胆酮、adonirubin、γ-胡萝卜素、4-酮基-γ-胡萝卜素、脱氧-屈曲黄素和α-胡萝卜素。
13.权利要求10的方法,其中所述转化的宿主细胞选自细菌、酵母、丝状真菌、藻类和绿色植物。
14.权利要求13的方法,其中所述转化的宿主细胞选自曲霉属、木霉属、糖酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属、发酵单胞菌属、土壤杆菌属、赤杆菌属、绿菌属、着色菌属、黄杆菌属、噬纤维菌属、红细菌属、红球菌属、链霉菌属、短杆菌属、棒杆菌属、分枝杆菌属、异常球菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、泛菌属、假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基微菌属、甲基孢囊菌属、产碱菌属、集胞蓝细菌属、聚球蓝细菌属、鱼腥蓝细菌属、硫杆菌属、甲烷杆菌属、克氏杆菌属和粘球菌属。
15.权利要求13的方法,其中所述转化的宿主细胞选自大豆、油菜籽、胡椒、向日葵、棉花、玉米、烟草、苜蓿、小麦、大麦、燕麦、高梁、稻、拟南芥、十字花科植物、甜瓜、胡萝卜、芹菜、欧芹、番茄、马铃薯、草莓、花生、葡萄、草籽作物、甜菜、甘蔗、豆科植物、豌豆、黑麦、亚麻、阔叶树、针叶树和饲料草。
16.权利要求13的方法,其中所述转化的宿主细胞是甲基营养生物。
17.权利要求16的方法,其中所述甲基营养生物是甲烷营养生物。
18.权利要求17的方法,其中所述甲烷营养生物是甲基单胞菌16a(ATCC PTA 2402)。
19.调节生物中环状的羟化类胡萝卜素生物合成的方法,该方法包括:
(a)提供包含类胡萝卜素生物合成途径的宿主细胞,所述宿主细胞生产具有至少一个β-芷香酮型环的环状类胡萝卜素;
(b)用编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子转化(a)的宿主细胞,所述核酸分子选自:
(i)权利要求1或2的核酸分子;和
(ii)编码SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的核酸分子;和
(c)使(b)的转化的宿主细胞在使羟化类胡萝卜素生物合成受到调节的条件下生长。
20.权利要求19的方法,其中编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子被上调。
21.权利要求20的方法,其中编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子在多拷贝质粒中超量表达。
22.权利要求21的方法,其中编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子与诱导型或受调节的启动子可操作性连接。
23.权利要求19的方法,其中编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子被下调。
24.权利要求19的方法,其中编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子以反义方向表达。
25.权利要求19的方法,其中通过将外源DNA插入编码区而破坏编码类胡萝卜素羟化酶的核酸分子。
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Cited By (12)
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CN102061289A (zh) * | 2009-11-13 | 2011-05-18 | 韩国生命工学研究院 | 增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途 |
CN102250958A (zh) * | 2011-07-08 | 2011-11-23 | 山东大学 | 一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法 |
CN102286593A (zh) * | 2011-07-08 | 2011-12-21 | 山东大学 | 一种提高八氢番茄红素脱氢酶体外反应速率的方法 |
CN103882048A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-06-25 | 宁波大学 | 一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法 |
CN105886518A (zh) * | 2016-05-09 | 2016-08-24 | 天津大学 | 基因、表达载体、宿主细胞及其应用,高产玉米黄质的重组菌株的构建方法 |
CN107142250A (zh) * | 2014-09-03 | 2017-09-08 | 武汉生物技术研究院 | 鞘氨醇单胞菌的β–胡萝卜素羟化酶及其编码基因与其在生产虾青素中的应用 |
CN113736720A (zh) * | 2021-08-10 | 2021-12-03 | 青岛农业大学 | 一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用 |
CN115093991A (zh) * | 2022-06-08 | 2022-09-23 | 中国科学院西北生态环境资源研究院 | 一种抗氧化节杆菌及其次级代谢产物的制备和应用 |
CN115261255A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-11-01 | 西北农林科技大学 | 一株新鞘氨醇杆菌及其用途 |
CN115747104A (zh) * | 2022-11-14 | 2023-03-07 | 云南大学 | 一种短波单胞菌在诱导少孢节丛孢产生捕食器官中的应用 |
CN117210526A (zh) * | 2023-11-08 | 2023-12-12 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 强抗氧化叶黄素及其人工合成的方法和核酸片段及其应用 |
CN117264865A (zh) * | 2023-11-21 | 2023-12-22 | 清华大学 | 重组红色红球菌及其在化合物合成中的应用 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10201458A1 (de) * | 2001-04-11 | 2002-10-17 | Adelbert Bacher | Intermediate und Enzyme des Mevalonat-unabhängigen Isoprenoidbiosyntheseweg |
US7163819B2 (en) | 2005-04-14 | 2007-01-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Bacterial hemoglobin genes and their use to increase carotenoid production |
JP5037906B2 (ja) * | 2006-11-10 | 2012-10-03 | キヤノン株式会社 | プローブ、プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法 |
JP5787341B2 (ja) * | 2009-11-19 | 2015-09-30 | 国立大学法人 千葉大学 | テルペン合成酵素遺伝子のスクリーニング方法 |
WO2014074886A1 (en) * | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Calysta Energy, Inc. | Compositions and methods for biological production of fatty acid derivatives |
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CN114752607B (zh) * | 2022-05-06 | 2023-06-20 | 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 | 香蕉MtLUT5基因、克隆方法、表达载体及应用 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US20030148319A1 (en) | 2001-08-15 | 2003-08-07 | Brzostowicz Patricia C. | Genes encoding carotenoid compounds |
DE60313631T2 (de) | 2002-09-27 | 2008-01-10 | Dsm Ip Assets B.V. | Produktion von zeaxanthin und beta-cryptoxanthin durch phaffia |
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JP4398431B2 (ja) | 2003-11-18 | 2010-01-13 | キリンホールディングス株式会社 | 新規なカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子及び水酸化されたカロテノイドの製造法及び新規なゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ遺伝子 |
JP4803739B2 (ja) * | 2004-06-04 | 2011-10-26 | キリンホールディングス株式会社 | カロテノイドケトラーゼ及びカロテノイドヒドロキシラーゼ遺伝子を利用したアスタキサンチンまたはその代謝物の製造法 |
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2005
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2007
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Cited By (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102061289A (zh) * | 2009-11-13 | 2011-05-18 | 韩国生命工学研究院 | 增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途 |
CN102061289B (zh) * | 2009-11-13 | 2013-01-23 | 韩国生命工学研究院 | 增加植物β-胡萝卜素含量的β-胡萝卜素羟化酶基因及其用途 |
CN102250958A (zh) * | 2011-07-08 | 2011-11-23 | 山东大学 | 一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法 |
CN102286593A (zh) * | 2011-07-08 | 2011-12-21 | 山东大学 | 一种提高八氢番茄红素脱氢酶体外反应速率的方法 |
CN102250958B (zh) * | 2011-07-08 | 2013-01-02 | 山东大学 | 一种体外酶反应生成的类胡萝卜素的快速提取方法 |
CN102286593B (zh) * | 2011-07-08 | 2013-03-13 | 山东大学 | 一种提高八氢番茄红素脱氢酶体外反应速率的方法 |
CN103882048A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-06-25 | 宁波大学 | 一种提高鱼腥藻中玉米黄质含量的方法 |
CN107142250B (zh) * | 2014-09-03 | 2019-09-10 | 武汉生物技术研究院 | 鞘氨醇单胞菌的β–胡萝卜素羟化酶及其编码基因与其在生产虾青素中的应用 |
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CN115261255B (zh) * | 2022-05-16 | 2023-06-16 | 西北农林科技大学 | 一株新鞘氨醇杆菌及其用途 |
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