CN117210526A - 强抗氧化叶黄素及其人工合成的方法和核酸片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种叶黄素的制备方法，其包括将叶黄素工程菌在培养基中进行培养，然后收集培养产物；所述叶黄素为1’,3‑二羟基‑1’,2’‑二氢‑圆酵母素‑4‑酮。本发明还提供了核酸片段和所述核酸片段在增强宿主的抗逆功能上的应用以及一种新的叶黄素。本发明合成的叶黄素抗氧化能力相比于现有技术中存在的类胡萝卜素，其自由基清除能力显著提升，具有较强的抗氧化功能，在生物抗氧化领域有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学领域，具体地，涉及一种人工合成强抗氧化叶黄素的方法、一种核酸片段、核酸片段在增强宿主的抗逆功能上的应用和一种强抗氧化叶黄素。
背景技术
类胡萝卜素是一类主要由8个类异戊二烯单位组成的C40类萜类化合物及其衍生物，通常呈红色、橙红色或黄色，大多存在两侧对称的多个双键结构，因此具有较强抗氧化能力。
叶黄素类类胡萝卜素是归属于类胡萝卜素的一类含氧化合物。叶黄素类类胡萝卜素结构上还包括双环氧化物和单环氧化物。叶黄素类类胡萝卜素分子中的羟基、酮基、环氧基相邻的碳原子都带着正电荷，说明这些基团位点都是类胡萝卜素的活性部位。异常球菌叶黄素是具有最强电离辐射抗性和氧化抗性的生物耐辐射异常球菌合成一种单环叶黄素类类胡萝卜素。现有研究发现异常球菌叶黄素能够保护DNA、蛋白质等细胞组分免受活性氧自由基的损伤，相比番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素和虾青素具有更强的抗氧化能力。但天然微生物的叶黄素类类胡萝卜素产量较低。因此，目前通过人工构建工程菌合成类胡萝卜素提高宿主细胞抗氧化能力已成为类胡萝卜素类萜类化合的主要研究方向。CN113388560A提供了一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法。该基因工程菌的构建具体为将Deinococcus xibeiensisR13类胡萝卜素合成途径中的关键酶基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO，与表达载体连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌中，获得合成类胡萝卜素的新型基因工程菌。
但本领域现已发现的叶黄素工程菌合成的叶黄素产量低、叶黄素抗氧化性能较弱。因此，亟需一种能够合成强抗氧化性叶黄素的方法，以及一种具有较强抗氧化能力的叶黄素，以实现强抗氧化性叶黄素的有效应用。
发明内容
本发明的目的是合成抗氧化能力强、产量高的叶黄素类类胡萝卜素，以及其工程菌的合成方法，并将该方法应用到食品、医疗等多种领域。
为了实现上述目的，本发明利用合成生物学方法，设计抗氧化类胡萝卜素组装合成的基因线路，并在大肠杆菌底盘中进行诱导表达合成，以实现强抗氧化叶黄素的合成和应用。
本发明第一方面提供了一种人工合成强抗氧化叶黄素的方法，所述方法包括：将叶黄素工程菌在培养基中进行培养，然后收集培养产物；
所述强抗氧化叶黄素为1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮；
所述叶黄素工程菌中具有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、类胡萝卜素1’,2’-水合酶、类胡萝卜素3-羟基化酶和类胡萝卜素酮基化酶的表达。
优选地，所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶、所述番茄红素环化酶和所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶来自耐辐射异常球菌；
所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶来自嗜热异常球菌；
所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶来自短波单胞菌。
优选地，所述叶黄素工程菌通过基因编辑在宿主基因组中插入一段线性DNA后得到，所述线性DNA包括牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、类胡萝卜素1’,2’-水合酶、类胡萝卜素3-羟基化酶和类胡萝卜素酮基化酶的表达框；
优选所述线性DNA为包括第一表达框、第二表达框和启动子的核酸片段；
所述第一表达框由所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶依次串联组成；
所述第二表达框由所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶依次串联组成；
所述第一表达框、所述第二表达框和所述启动子的基因间通过核糖体结合序列RBS连接。
优选地，所述线性DNA包括SEQ ID NO.1所示的核酸序列；
所述第一表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1的1-6163位所示；所述第二表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1的6164-10136位所示；所述启动子序列如SEQ ID NO.1的1位-285位和6164位-6329位所示；
所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶的核酸序列依次如SEQ ID NO.1的319-1308位、1332-2309位、2410-4056位、4080-5312位所示；
所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶的核酸序列依次如SEQ ID NO.1的6363-7286位、7310-8782位、8806-9291位、9315-10049位所示。
优选地，所述基因编辑的操作包括：在所述线性DNA的上下游上分别连接第一同源臂和第二同源臂后与pREDCas9质粒和pGRB-sgRNA重组质粒电击转化到同一宿主；所述pGRB-sgRNA重组质粒包括sgRNA编码核酸和pGRB载体核酸序列，所述sgRNA编码核酸如SEQID NO.2的122位-141位所示；
优选所述pGRB-sgRNA重组质粒的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pREDCas9质粒的核酸序列如SEQ ID NO.13所示。
可选地，所述线性DNA通过包括如下步骤的方法进行扩增；将所述线性DNA连接到克隆载体后得到克隆质粒，将所述克隆质粒转化到克隆菌株中进行克隆，得到扩增后的克隆质粒，将所述克隆质粒进行酶切得到扩增后的所述线性DNA；所述限制性内切酶为XhoI和XbaI；
所述克隆载体为pJET载体，所述克隆菌株为大肠杆菌DH5α。
优选地，选择大肠杆菌假基因yghX作为插入位点。
本发明第二方面提供了一种核酸片段，所述核酸片段为包括牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、类胡萝卜素1’,2’-水合酶、类胡萝卜素3-羟基化酶和类胡萝卜素酮基化酶的表达框的核酸片段；
优选所述核酸片段为包括第一表达框和第二表达框和启动子的核酸片段；
所述第一表达框由所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶依次串联组成；
所述第二表达框由所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶依次串联组成；
所述第一表达框、所述第二表达框和所述启动子的基因间通过核糖体结合序列RBS连接；
优选所述核酸片段的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
本发明第三方面提供了上述核酸片段在增强宿主的抗逆功能上的应用。
本发明第四方面提供了一种强抗氧化叶黄素，所述强抗氧化叶黄素的分子式为：C40H54O3，所述叶黄素的结构式如式A所示：
式A：
。
通过上述技术方案，本发明提供的方法人工合成强抗氧化叶黄素的基因路线，合成了一种强抗氧化叶黄素：1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮。本发明合成的叶黄素抗氧化能力相比于现有技术中存在的其他类型的类胡萝卜素，其自由基清除能力显著提升，具有较强的抗氧化功能，在生物抗氧化领域有良好的应用前景。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1 为工程菌株E.coli-AOX的产物的HPLC-MS鉴定结果。
图2 为工程菌株E.coli-AOX的产物的13C-NMR核磁鉴定结果。
图3 为工程菌株E.coli-AOX合成产物AOX的DPPH自由基清除能力分析结果。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明第一方面提供了一种人工合成强抗氧化叶黄素的方法，所述方法包括：
将叶黄素工程菌在培养基中进行培养，然后收集培养产物；
所述强抗氧化叶黄素为1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮；
所述叶黄素工程菌中具有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、类胡萝卜素1’,2’-水合酶、类胡萝卜素3-羟基化酶和类胡萝卜素酮基化酶的表达。
在本实施方式中，所述叶黄素工程菌需在阿拉伯糖诱导下才能表达并合成叶黄素，代谢产物中的叶黄素经高效液相色谱-质谱和核磁鉴定后，确定其分子式及组成并进行了命名。本发明通过从NCBI数据库中筛选得到参与叶黄素类类胡萝卜素合成的功能酶，并设计和组装了一种叶黄素合成的基因线路。
在一种优选的实施方式中，所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶、所述番茄红素环化酶和所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶来自耐辐射异常球菌；
所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶来自嗜热异常球菌；
所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶来自短波单胞菌。
在一种优选的实施方式中，所述叶黄素工程菌通过基因编辑在宿主基因组中插入一段线性DNA后得到，所述线性DNA包括牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、类胡萝卜素1’,2’-水合酶、类胡萝卜素3-羟基化酶和类胡萝卜素酮基化酶的表达框；
优选所述线性DNA包括第一表达框、第二表达框和启动子的核酸片段；
所述第一表达框由所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶依次串联组成；
所述第二表达框由所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶依次串联组成；
所述第一表达框、所述第二表达框和所述启动子的基因间通过核糖体结合序列RBS连接。
在上述优选的实施方式中，本发明利用筛选的功能酶基因设计构建了多基因串联表达单元，组建了包括胡萝卜素骨架功能模块CSMAOX（Carotenoid Synthesis Module）和紫罗酮环修饰功能模块IRMAOX（Ionone Ring Module）和阿拉伯糖启动子功能元件的组合模块，所述基因串联表达单元包括两段启动子序列，分别启动所述胡萝卜素骨架功能模块CSMAOX和所述紫罗酮环修饰功能模块IRMAOX的表达，基因间通过核糖体结合序列RBS连接，所述基因串联表达单元的基因通过同源重组试剂盒进行连接。
在一种优选的实施方式中，所述线性DNA包括SEQ ID NO.1所示的核酸序列；
所述第一表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1的1-6163位所示；所述第二表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1的6164-10136位所示；所述启动子序列如SEQ ID NO.1的1-285位和6164-6329位所示；
所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶的核酸序列依次如SEQ ID NO.1的319-1308位、1332-2309位、2410-4056位、4080-5312位所示；
所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶的核酸序列依次如SEQ ID NO.1的6363-7286位、7310-8782位、8806-9291位、9315-10049位所示。
在一种优选的实施方式中，所述基因编辑的操作包括：在所述线性DNA的上下游上分别连接第一同源臂和第二同源臂后与pREDCas9质粒和pGRB-sgRNA重组质粒电击转化到同一宿主；所述pGRB-sgRNA重组质粒包括sgRNA编码核酸和pGRB载体核酸序列，所述sgRNA编码核酸如SEQ ID NO.2的122位-141位所示；
优选所述pGRB-sgRNA重组质粒的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pREDCas9质粒的核酸序列如SEQ ID NO.13所示。
在上述优选的实施方式中，本发明选择大肠杆菌假基因yghX作为插入位点，扩增上下游500bp序列作为同源臂在两侧分别连接功能模块CSMAOX和IRMAOX以及阿拉伯糖启动子，得到用于基因组整合的线性DNA片段。将选定的sgRNA与pGRB载体连接构建pGRB-sgRNA重组质粒，将得到的pGRB-sgRNA重组质粒、pREDCas9编辑载体质粒和线性DNA片段一同转入大肠杆菌BW25113中，诱导基因编辑，挑取单菌落进行测序验证，确定插入序列正确，将含有目的基因的大肠杆菌命名为E.coli-AOX。
在一种可选的实施方式中，所述线性DNA通过包括如下步骤的方法进行扩增；将所述线性DNA连接到克隆载体后得到克隆质粒，将所述克隆质粒转化到克隆菌株中进行克隆，得到扩增后的克隆质粒，将所述克隆质粒进行酶切得到扩增后的所述线性DNA；所述限制性内切酶为XhoI和XbaI；
所述克隆载体为pJET载体，所述克隆菌株为大肠杆菌DH5α。
在一种优选的实施方式中，选择大肠杆菌假基因yghX作为插入位点。
本发明第二方面提供了一种核酸片段，所述核酸片段为包括牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、类胡萝卜素1’,2’-水合酶、类胡萝卜素3-羟基化酶和类胡萝卜素酮基化酶的表达框的核酸片段；
优选所述核酸片段为包括第一表达框和第二表达框和启动子的核酸片段；
所述第一表达框由所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶依次串联组成；
所述第二表达框由所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶依次串联组成；
所述第一表达框、所述第二表达框和所述启动子的基因间通过核糖体结合序列RBS连接；
优选所述核酸片段的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
本发明第三方面上述核酸片段在增强宿主的抗逆功能上的应用。
在本优选的实施方式中，将所述核酸片段插入到宿主细胞中，利用阿拉伯糖诱导重组质粒中插入序列的表达，合成强抗氧化叶黄素，提高清除宿主细胞内的活性氧自由基，保护细胞免受氧化损伤，显著增强宿主的抗氧化能力。
本发明第四方面提供了一种强抗氧化叶黄素，所述强抗氧化叶黄素的分子式为：C40H54O3，所述叶黄素的结构式如式A所示：
式A：
。
在本优选的实施方式中，所述强抗氧化叶黄素的结构式为：C40H54O3，分子量为：582.87，本发明合成的强抗氧化叶黄素为一种新型叶黄素，由于所述叶黄素羟基基团位置的改变，使得合成的叶黄素抗氧化能力显著提高，清除能力是虾青素的5.12倍、是β-隐黄素的6.18倍、是叶黄素的9.73和番茄红素的10.35倍。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1 构建叶黄素工程菌E.coli-AOX。
pREDCas9质粒和pGRB质粒购自淼灵生物，商品号为P2838和P47219；大肠杆菌工程菌株BW25113购自淼灵生物 T0035；耐辐射异常球菌R1购自ATCC，商品号为ATCC13939；嗜热异常球菌购自DSM，商品号为DSM11300。
从NCBI数据库中筛选得到参与叶黄素类类胡萝卜素合成的功能酶，分别是来自耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合成酶（crtE，NCBIGeneID为：1798690）八氢番茄红素合成酶（crtB，NCBI GeneID为：1799223），八氢番茄红素脱氢酶（crtI，NCBI GeneID为：1800387），番茄红素环化酶(crtLm，NCBI GeneID为：69517046)，类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶（crtD，NCBI GeneID为：1800084）；来自嗜热异常球菌（Deinococcus geothermalis）的类胡萝卜素1’,2’-水合酶（cruF，NCBI ProteinID为：ABF46601.1）；来自短波单胞菌（Brevundimonas sp.）的类胡萝卜素3-羟基化酶（crtZ，NCBIProteinID为：WP_227976050.1）和类胡萝卜素酮基化酶（crtW，NCBI ProteinID为：AHM24029.1）。
根据筛选得到的8个目的基因序列设计5对PCR特异性引物，通过PCR从耐辐射异常球菌R1基因组DNA中扩增出crtE、crtB、crtI、crtLm、crtD；其中，crtB和crtI基因在耐辐射异常球菌R1基因组DNA中为连续基因片段，利用crtBI引物对可以同时扩增出连接的crtB和crtI基因片段；从嗜热异常球菌基因组DNA中扩增出cruF，化学合成的crtZ和crtW。
其中，crtE对应的扩增引物序列为crtE-F（如SEQ ID NO. 3所示）和crtE-R（如SEQID NO. 4所示），crtB和crtI为染色体上的连续序列，利用同一对引物扩增，对应的扩增引物序列为crtBI-F（如SEQ ID NO.5所示）和crtBI-R（如SEQ ID NO. 6所示），crtLm对应的扩增引物序列为crtLm-F（如SEQ ID NO. 7所示）和crtLm-R（如SEQ ID NO. 8所示），cruF对应的扩增引物序列为cruF-F（如SEQ ID NO. 9所示）和cruF-R（如SEQ ID NO. 10所示），crtD对应的扩增引物序列为crtD-F（如SEQ ID NO. 11所示）和crtD-R（如SEQ ID NO. 12所示）。
引物扩增的反应条件包括：95℃变性5 分钟，然后进行95℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟的30个循环，最后72℃延伸10分钟。
上述扩增出的crtE、crtB、crtI、crtLm、crtD、cruF和化学合成的crtZ和crtW以及核糖体结合序列RBS和阿拉伯糖诱导型启动子通过同源重组试剂盒连接成多基因串联表达单元的核酸片段（SEQ ID NO.1所示）。
选择大肠杆菌假基因yghX作为插入位点，扩增上下游500bp序列作为同源臂。在多基因串联表达单元的核酸片段的两端分别连接上述同源臂，然后插入到克隆载体pJET中得到克隆质粒，将所述克隆质粒转化到大肠杆菌DH5α中进行克隆，得到扩增后的克隆质粒，将所述克隆质粒进行酶切得到扩增后的用于基因组整合的线性DNA片段。
将选定的sgRNA编码核酸与pGRB空质粒连接构建重组质粒pGRB-sgRNA，将构建好的pGRB-sgRNA重组质粒（pGRB-sgRNA重组质粒核酸序列如SEQ ID NO.2所示）、pREDCas9质粒（如序列SEQ ID NO.13所示）和线性DNA片段一起电击转化到同一株大肠杆菌BW25113中，进行基因编辑，挑取单菌落进行测序验证，确定插入序列正确，将基因组中插入有多基因串联表达单元的大肠杆菌菌株命名为E.coli-AOX。
实施例2 叶黄素工程菌E.coli-AOX的产物鉴定。
使用实施例1构建的叶黄素工程菌E.coli-AOX，并利用L-阿拉伯糖作为诱导剂诱导插入了多基因串联表达单元的工程菌的表达：
以1%的接种量将3mL叶黄素工程菌E.coli-AOX的种子液转接到300 mL LB液体培养基中，在37℃，220 rpm条件下避光振荡培养。培养至菌液的OD600值达到0.8时，向菌液中加入300μL的L-阿拉伯糖，使其终浓度为2‰，诱导叶黄素工程菌E.coli-AOX表达，之后于37℃，220 rpm条件下避光振荡培养过夜。
合成产物检测分析：
将过夜培养的叶黄素工程菌E.coli-AOX的菌液以8,000×g，离心10 分钟；倒掉上清液，收集菌体。诱导后菌体颜色由米白色变为红色，利用有机溶剂萃取获得菌株的红色合成产物，将菌体利用丙酮和乙酸乙酯交替萃取色素，最后将萃取的色素蒸干后溶于色谱级甲醇，得到待测样品。将待测样品保存于-80℃中，后续用于高效液相检测。
参考图1和图2，将制备的待测样品用高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)进行分析。具体的分析条件包括：
使用安捷伦1260高效液相色谱仪和规格为4.6×250nm×5μm 的Kromasil-C18色谱柱进行检测；流动相包括HPLC级甲醇、乙腈和水，其中，甲醇：乙腈：水的体积比为80:15:5，扫描波长范围为200 nm-600 nm，检测波长包括440 nm、450 nm、470 nm和478 nm。流动相的流速为1mL/min，色谱柱的柱温为25℃，待测样品的进样量为10μL。
使用LC-QTOF液相色谱-质谱联用仪进行液质联用检测。分析条件包括：采用大气压化学电离源（APCI）并利用正离子模式[M+H]+进行检测，采用一级质谱检测和二级质谱检测分别分析样品，收集产物峰进行核磁13C-NMR鉴定。
结果与现有技术已知的异常球菌叶黄素（1’,2-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮）进行比对，结果显示，叶黄素工程菌株E.coli-AOX的叶黄素产物的HPLC特征峰仅有一个主要产物峰且位于13 min处，13C-NMR核磁位于delta值 68和44偏差处的碳谱显示紫罗酮环上的羟基化位于3位上，显著不同于文献中已知的异常球菌叶黄素的碳谱，证明了叶黄素工程菌E.coli-AOX的叶黄素产物结构中具有3-羟基，与人工设计的叶黄素AOX结构一致，并根据其结构命名为1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮。
实施例3 人工合成的叶黄素与叶黄素类化合物的自由基清除能力对比。
使用实施例2得到的人工合成的叶黄素1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮；和本实验室保存的类胡萝卜素：虾青素、异常球菌叶黄素、叶黄素、玉米黄质、角黄素、β-隐黄素、β-胡萝卜素和番茄红素进行对比；
DPPH乙醇溶液呈紫红色，利用分光光度计对DPPH乙醇溶液进行检测，在519nm处具有最大吸收波长，因此DPPH乙醇溶液在519nm处的吸光度值，可以反映其浓度。配制浓度为0.0788 g/mL的DPPH乙醇溶液避光保存备用。使用购自索莱宝生物的商品号为D8370的DMSO分别溶解人工合成的叶黄素1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮、虾青素、异常球菌叶黄素、叶黄素、玉米黄质、角黄素、β-隐黄素、β-胡萝卜素和番茄红素得到上述叶黄素类化合物的溶液，制备储存液，然后稀释得到终浓度为0.15 mg/mL的上述叶黄素类化合物的溶液。
取20μL类胡萝卜素化合物溶液与180μL DPPH乙醇溶液混合均匀作为待测溶液，使用酶标仪在519 nm的波长下测定吸光值。对照组以相同体积的乙醇代替DPPH乙醇溶液，空白组以相同体积的DMSO代替样品。
使用本发明人工合成的叶黄素1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮与虾青素、异常球菌叶黄素（1’,2-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮）、叶黄素、玉米黄质、角黄素、β-隐黄素、β-胡萝卜素和番茄红素进行DPPH自由基清除能力实验。结果参考图3，结果显示人工合成的叶黄素1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮的自由基清除能力显著高于其他类胡萝卜素，其自由基清除能力是虾青素的5.12倍、是β-隐黄素的6.18倍、是叶黄素的9.73以及番茄红素的10.35倍，该人工合成的叶黄素的自由基清除能力也优于超强抗氧化的极端环境微生物耐辐射异常球菌合成的抗氧化异常球菌叶黄素，是异常球菌叶黄素的1.21倍。证明了本发明人工合成的叶黄素1’,3 -二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮具有更强的抗氧化功能。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种人工合成强抗氧化叶黄素的方法，其特征在于，所述方法包括：
将叶黄素工程菌在培养基中进行培养，然后收集培养产物；
所述强抗氧化叶黄素为1’,3-二羟基-1’,2’-二氢-圆酵母素-4-酮；
所述叶黄素工程菌中具有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、类胡萝卜素1’,2’-水合酶、类胡萝卜素3-羟基化酶和类胡萝卜素酮基化酶的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶、所述番茄红素环化酶和所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶来自耐辐射异常球菌；
所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶来自嗜热异常球菌；
所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶来自短波单胞菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述叶黄素工程菌通过基因编辑在宿主基因组中插入一段线性DNA后得到，
所述线性DNA为包括第一表达框、第二表达框和启动子的核酸片段；
所述第一表达框由所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶依次串联组成；
所述第二表达框由所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶依次串联组成；
所述第一表达框、所述第二表达框和所述启动子的基因间通过核糖体结合序列RBS连接。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述线性DNA包括SEQ ID NO.1所示的核酸序列；
所述第一表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1的1-6163位所示；所述第二表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1的6164-10136位所示；所述启动子序列如SEQ ID NO.1的1-285位和6164-6329位所示；
所述牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶、所述八氢番茄红素合成酶、所述八氢番茄红素脱氢酶和所述番茄红素环化酶的核酸序列依次如SEQ ID NO.1的319-1308位、1332-2309位、2410-4056位、4080-5312位所示；
所述类胡萝卜素3’,4’-脱氢酶、所述类胡萝卜素1’,2’-水合酶、所述类胡萝卜素3-羟基化酶和所述类胡萝卜素酮基化酶的核酸序列依次如SEQ ID NO.1的6363-7286位、7310-8782位、8806-9291位、9315-10049位所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述基因编辑的操作包括：在所述线性DNA的上下游上分别连接第一同源臂和第二同源臂后与pREDCas9质粒和pGRB-sgRNA重组质粒电击转化到同一宿主；
所述pGRB-sgRNA重组质粒的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pREDCas9质粒的核酸序列如SEQ ID NO.13所示。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述线性DNA通过包括如下步骤的方法进行扩增：
将所述线性DNA连接到克隆载体后得到克隆质粒，将所述克隆质粒转化到克隆菌株中进行克隆，得到扩增后的克隆质粒，将所述克隆质粒进行酶切得到扩增后的所述线性DNA；所述酶切使用的限制性内切酶为Xho I和Xba I；
所述克隆载体为pJET载体，所述克隆菌株为大肠杆菌DH5α。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，选择大肠杆菌假基因yghX作为插入位点。
8.一种核酸片段，其特征在于，
所述核酸片段的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
9.权利要求8所述的核酸片段在增强宿主的抗逆功能上的应用。
10.一种强抗氧化叶黄素，其特征在于，所述强抗氧化叶黄素的分子式为：C40H54O3，所述强抗氧化叶黄素的结构式如式A所示：
式A：
。
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