CN113388560A - 合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法。该基因工程菌的构建具体为将Deinococcus xibeiensis R13类胡萝卜素合成途径中的关键酶基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO，与表达载体连接构建重组质粒，然后转化到大肠杆菌中，获得合成类胡萝卜素的新型基因工程菌。本发明构建的工程菌可用来生产类胡萝卜素，最终类胡萝卜素产量得到显著提升，具有良好的应用前景。

Description

合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法
技术领域
本申请属于基因工程技术，具体涉及一种合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法。
背景技术
类胡萝卜素是一大类萜类化合物，广泛存在于自然界中，根据结构中氧原子的存在与否，可分为不含氧胡萝卜素类(如番茄红素和β-胡萝卜素)和含氧叶黄素类(如虾青素和玉米黄质)。类胡萝卜素除了是常见的食用色素外，还具有多种生理功能，如防止DNA损伤、保证正常的视觉功能、防癌和抗癌、预防心血管疾病的发生以及防止骨质疏松和风湿性关节炎等。类胡萝卜素的生产方法包括植物提取、化学合成和微生物发酵，与步骤繁琐、副产物多、安全性差、生产成本高的植物提取法和化学合成法相比，微生物发酵法具有生物资源广泛、技术成熟、操作简便、成本低、安全高效和易于产业化的优势，逐渐成为研究的热点。目前，可通过微生物发酵法来生产类胡萝卜素的菌株分为两种：一是自身合成类胡萝卜素的菌株，如三孢布拉霉、卷枝毛霉、黏红酵母、耐辐射奇球菌和粘质沙雷氏菌等；二是基因工程菌株，即利用DNA重组技术和合成生物学技术将类胡萝卜素合成关键基因导入微生物体内，实现基因的异源表达，该方法已经成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、解酯耶氏酵母、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌等。随着类胡萝卜素市场需求的逐渐增加，探索一种高产类胡萝卜素的菌株十分必要。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术中存在的技术问题，本申请提供了一种定向合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法。
技术方案：本申请所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌，是在大肠杆菌中表达来源于Deinococcus xibeiensis R13菌株类胡萝卜素合成途径中的关键酶。
其中，所述关键酶是牻牛儿牻牛儿焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素β-环化酶、C1',2'-水合酶、C3',4'-脱氢酶和C4-酮基化酶，分别由基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO编码。
上述关键酶基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-7所示。
所述合成类胡萝卜素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)将关键酶基因crtE、crtB和crtI依次与表达载体pET Duet-1连接，得到重组载体pET-EBI，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；
(2)将关键酶基因crtLm、cruF、crtD和crtO依次与表达载体pRSF Duet-1连接，得到重组载体pRSF-LmFDO，转化到步骤(1)含pET-EBI的重组菌中，构建得到基因工程菌EBILmFDO。
利用上述基因工程菌合成类胡萝卜素的方法为，将合成类胡萝卜素的新型基因工程菌进行发酵培养，然后对发酵培养物进行分离提取得到类胡萝卜素。
进一步的，所述发酵培养的培养基中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加量为0-1mM，总氮浓度在1-2g/L，总碳浓度在0.2-0.6g/L。
其中，利用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化铵或硫酸铵作为氮源，以葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、淀粉、乙酸盐或甘油为碳源。
进一步的，所述发酵培养时间为30-72h，温度25-37℃，pH 5-9。
所述类胡萝卜素的分离提取方法包括以下步骤：
(1)发酵培养结束后，于4℃、5000-10000rpm离心10-15min，收集菌体；
(2)用蒸馏水洗涤1-2次，冷冻干燥获得干菌体，置于-20℃环境中保存；
(3)称取干菌体，加入3mol/L盐酸溶液，置于摇床振荡1-2h；
(4)沸水浴煮3-5min，接着冰浴4-6min，离心弃上清液；
(5)蒸馏水洗涤1-2次，加入1-2ml含1％2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的丙酮溶液，振荡至菌体无色；
(6)离心取上清液，经有机膜过滤，获得类胡萝卜素提取液。
具体的，所述类胡萝卜素的分离提取方法包括以下步骤：
S1发酵培养结束后，分两次取20-30ml菌液到50ml离心管中，于4℃，5000-10000rpm离心10-15min，菌体收集在一个离心管中；
S2将上述收集的菌体用蒸馏水洗涤1-2次后，冷冻干燥获得干菌体，称重记录并置于-20℃环境中保存；
S3称取0.05g干菌体，加入3-5mL盐酸(3mol/L)溶液，置于25℃摇床中振荡1-2h；
S4沸水浴煮3-5min，接着冰浴4-6min，离心弃上清液；
S5蒸馏水洗涤1-2次，加入1-2ml含1％2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的丙酮溶液，于25℃振荡至菌体无色；
S6离心取上清液，经0.22μM有机膜过滤，获得类胡萝卜素提取液。
本申请发现从新疆极端环境分离出的耐辐射奇异球菌新种Deinococcusxibeiensis R13能够抵御γ射线和紫外线辐射，并具有类胡萝卜素合成能力。在此基础上，对Deinococcus xibeiensis R13基因组进行测序，鉴定并获得了基因组上类胡萝卜素合成关键酶基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO，对这些基因进行人工设计，然后连接到表达载体上，得到重组质粒，再将其转化到大肠杆菌中，构建获得能够定向合成类胡萝卜素的新型基因工程菌。目前，尚未发现利用Deinococcus xibeiensis R13及Deinococcus属细菌中类胡萝卜素合成的关键酶基因在大肠杆菌中构建类似的基因工程菌。
有益效果：本申请将Deinococcus xibeiensis R13中类胡萝卜素合成基因簇导入大肠杆菌中，使类胡萝卜素合成中的关键酶基因实现异源表达，构建了能高效定向合成类胡萝卜素的重组菌EBILmFDO。通过本申请基因工程菌制备类胡萝卜素的方法简单，发酵生产所使用的培养基成分简单、价格低廉。另外，利用本申请构建的基因工程菌生产的类胡萝卜素中含有耐辐射奇球菌中的特殊类胡萝卜素(2R)-2,1’-二羟-3’,4’-二脱氢-1’,2’-二氢-β,ψ-胡萝卜素-4-酮(Deinoxanthin)，且最终类胡萝卜素产量和产率均较高。因此，本申请所构建的重组菌及类胡萝卜素的生产方法具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是Deinococcus xibeiensis R13基因组琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2是关键酶基因PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图3是重组质粒pET-EBI和pRSF-LmFDO的构建流程；
图4是IPTG添加量对类胡萝卜素合成的影响；
图5是培养时间对类胡萝卜素合成的影响；
图6是碳源对类胡萝卜素合成的影响；
图7是氮源对类胡萝卜素合成的影响；
图8是培养温度对类胡萝卜素合成的影响；
图9是pH对类胡萝卜素合成的影响；
图10是基因工程菌EBILmFDO、D.xibeiensis R13和D.radiodurans R1类胡萝卜素产量的比较；
图11是UPLC-MS分析类胡萝卜素粗提液组分：(a)液相图；(b)峰1质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请Deinococcus xibeiensis R13菌株保藏登记号为CGMCC 1.8885T。
实施例1Deinococcus xibeiensis R13类胡萝卜素关键酶基因的确定
1)基因组的提取
将-80℃冰箱中保藏的菌种Deinococcus xibeiensis R13接种至TGY固体培养基(酵母浸粉3g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖1g/L和琼脂粉2％)，30℃培养3–4d后，挑取平板上单菌落接种至TGY液体培养基(酵母浸粉3g/L、蛋白胨5g/L和葡萄糖1g/L)，30℃、200rpm培养72h，按照细菌基因组提取试剂盒操作步骤提取基因组，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图1，其中，Lane 1:15000DNA Marker；Lane 2-10：Deinococcus xibeiensis R13基因组。
2)基因组测序
对Deinococcus xibeiensis R13基因组进行高通量测序，采用IlluminaHiSeq2000测序技术对基因组DNA进行paired-end(PE)测序。获得基因组全序列，对基因组进行分析。
3)关键酶基因的确定
根据Deinococcus xibeiensis R13的相似菌株耐辐射奇异球菌Deinococcusradiodurans R1基因组信息(GenBank accession no.AE000513)中类胡萝卜素合成关键酶基因DR1395(crtE)、DR0862(crtB)、DR0861(crtI)、DR0801(crtLm)、DR0091(cruF)、DR2250(crtD)和DR0093(crtO)，与Deinococcus xibeiensis R13基因组测序结果进行比对，确定了与之对应的Deinococcus xibeiensis R13基因组上类胡萝卜素合成关键酶基因，如表1所示。R13基因组上类胡萝卜素合成关键酶基因与R1相比基因和氨基酸相似性在77.42-93.84％，低于95％，显示了其存在较大差异，因此R13基因组上类胡萝卜素合成关键酶可能是与R1的关键酶具有不同功能的存在。R13基因组上类胡萝卜素合成关键酶基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-7所示。
表1菌株R13和R1中类胡萝卜素合成关键酶基因及氨基酸序列的比较
Figure BDA0003075279190000051
实施例2类胡萝卜素基因工程菌的构建
1)关键酶基因的PCR扩增与纯化
以上述提取的基因组DNA为模板，根据R13基因组上确定的类胡萝卜素基因序列，采用Vector NTI 11.0设计扩增引物，所设计引物序列见表2。利用表2中的引物进行扩增。PCR体系为：2.5μL 10×PCR Buffer、2.5μL MgSO4(25mmol/L)、3.0μL dNTPs(10mmol/L)、0.5μL基因组DNA模板、1.0μL正向引物(10μmol/L)、1.0μL反向引物(10μmol/L)和1.0μL DNA聚合酶。用无菌ddH2O补至反应体系至25μL，充分混匀后放入PCR仪进行扩增反应。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，M为2000DNA Marker，crtE、SD-crtB、crtI、crtLm、SD-cruF、crtD和SD-crtO为正确的目的条带。按照DNA凝胶回收试剂盒对目的条带进行纯化回收。上述SD序列为5’-TAATATAAGAAGGAGATATA-3’。
2)关键酶基因共表达质粒的构建
根据引入的不同的限制内切酶酶切位点，分别对纯化后获得的PCR片段与质粒载体进行双酶切，构建流程如图3所示。具体操作如下：利用限制性内切酶NcoI和EcoRI双酶切crtE片段和pETDuet-1，酶切产物纯化后进行连接，得到pET-E；用EcoRI和HindIII双酶切SD-crtB片段和pET-E，酶切产物纯化后进行连接，得到pET-EB；用NdeI和XhoI双酶切crtI和pET-EB，酶切产物纯化后进行连接，得到pET-EBI；用NcoI和EcoRI双酶切crtLm和pRSFDuet-1，酶切产物纯化后进行连接，得到pRSF-Lm；用EcoRI和HindIII双酶切SD-cruF和pRSF-Lm，酶切产物纯化后进行连接，得到pRSF-LmF；用NdeI和KpnI双酶切crtD和pRSF-LmF，酶切产物纯化后进行连接，得到pRSF-LmFD；用KpnI和XhoI双酶切SD-crtO和pRSF-LmFD，酶切产物纯化后进行连接，得到pRSF-LmFDO。
3)重组菌转化
利用酶切和测序验证多基因共表达载体pET-EBI和pRSF-LmFDO的连接是否成功。利用热激法((42℃水浴90s))将验证正确的pET-EBI转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，然后将pRSF-LmFDO转化到含pET-EBI的重组菌中构建基因工程菌EBILmFDO。转化产物涂布于含氨苄青霉素(100mg/mL)和卡那霉素(50mg/mL)的LB固体培养基上，过夜培养后挑取转化子单克隆，然后接种于含氨苄青霉素和卡那霉素的LB液体培养基中培养。最后，采用质粒提取试剂盒提取质粒，分别利用表2中引物对质粒进行PCR扩增和酶切筛选验证，再利用测序进一步验证。
表2类胡萝卜素基因扩增引物序列
Figure BDA0003075279190000071
实施例3类胡萝卜素工程菌发酵条件的优化
种子培养基：由胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、氨苄青霉素100mg/mL和卡那霉素50mg/mL组成的LB液体培养基。
发酵培养基：由胰蛋白胨5g/L、酵母粉3g/L、葡萄糖1g/L、硫酸铵1g/L、氨苄青霉素100mg/mL和卡那霉素50mg/mL组成的TGY液体培养基(总氮浓度1.16g/L，总碳浓度0.4g/L)。
1)IPTG添加量对类胡萝卜素合成的影响
将工程菌EBILmFDO接种至种子培养基，37℃，200rpm振荡培养14-16h。次日按2％的接种量，接种至新鲜的发酵培养基中，37℃继续培养2-3h至OD600为0.8-1.0时，加入不同浓度的IPTG(0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM)，诱导培养21-22h。离心收集菌体，提取类胡萝卜素，定量分析IPTG添加量对类胡萝卜素合成的影响。如图4所示，在不添加IPTG的情况下，类胡萝卜素产量最高，具体为5.18mg/g。
2)培养时间对类胡萝卜素合成的影响
将工程菌EBILmFDO接种至种子培养基，37℃，200rpm振荡培养14-16h。次日按2％的接种量，分别接种至新鲜的发酵培养基中37℃、200rpm培养12h、24h、36h、48h、60h和72h。离心收集菌体，提取类胡萝卜素，定量分析培养时间对类胡萝卜素合成的影响。如图5所示，培养时间为36h的类胡萝卜素产量最高，具体为7.03mg/g。
3)氮源
将工程菌EBILmFDO接种至种子培养基，37℃，200rpm振荡培养14-16h。次日按2％的接种量，分别接种至以胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、氯化铵和硫酸铵为氮源的发酵培养基(总氮浓度1.16g/L)中，37℃、200rpm培养36h。离心收集菌体，提取类胡萝卜素，定量分析氮源对类胡萝卜素合成的影响。如图6所示，胰蛋白胨作为氮源时，类胡萝卜素产量为8.86mg/g，分别是大豆蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化铵和硫酸铵的1.29倍、1.57倍、2.13倍、2.3倍和2.24倍。
4)碳源
将工程菌EBILmFDO接种至种子培养基，37℃，200rpm振荡培养14-16h。次日按2％的接种量，分别接种至以葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、淀粉、乙酸钠和甘油作为碳源的发酵培养基(胰蛋白胨作氮源总氮浓度为1.16g/L，总碳浓度0.4g/L)中，37℃、200rpm培养36h。离心收集菌体，提取类胡萝卜素，定量分析碳源对类胡萝卜素合成的影响。如图7所示，在添加果糖的培养基中类胡萝卜素产量为9.55mg/g，分别是添加了葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉、乙酸盐和甘油的1.08、1.23、1.39、1.17、1.7和1.2倍。
5)培养温度对类胡萝卜素合成的影响
将工程菌EBILmFDO接种至种子培养基，37℃，200rpm振荡培养14-16h。次日按2％的接种量，接种至新鲜的发酵培养基(胰蛋白胨作氮源总氮浓度为1.16g/L，果糖作碳源总碳浓度0.4g/L)中，分别在25℃、30℃和37℃培养36h。离心收集菌体，提取类胡萝卜素，定量分析培养温度对类胡萝卜素合成的影响。如图8所示，在30℃时类胡萝卜素产量相对较高，具体为11.76mg/g。
6)pH对类胡萝卜素合成的影响
将工程菌EBILmFDO接种至种子培养基，37℃，200rpm振荡培养14-16h。次日按2％的接种量，接种至含相应的抗生素的具有不同pH值(pH5、pH6、pH7pH8和pH9)的发酵培养基(胰蛋白胨作氮源总氮浓度为1.16g/L，果糖作碳源总碳浓度0.4g/L)中30℃培养36h后，离心收集菌体，提取类胡萝卜素，定量分析诱导pH对类胡萝卜素合成的影响。如图9所示，类胡萝卜素产量和细胞生物量均在pH 7条件下达到最大值，分别为12.3mg/g和10.98g/L。
实施例4摇瓶发酵生产类胡萝卜素
将基因工程菌EBILmFDO在上述的最优条件(胰蛋白胨作氮源总氮浓度为1.16g/L，果糖作碳源总碳浓度0.4g/L的pH 7的培养基中30℃培养36h)进行发酵培养，离心收集菌体，提取类胡萝卜素。
将Deinococcus xibeiensis R13和Deinococcus radiodurans R1接种TGY液体培养基中，在30℃下振荡培养36h得到种子液。再按照2％接种量将种子液接种至新鲜TGY液体培养基中，在30℃下振荡培养48h离心收集菌体，提取类胡萝卜素。
定量分析结果如图10所示，基因工程菌EBILmFDO的类胡萝卜素产量和细胞生物量分别是12.3mg/g和10.98g/L，Deinococcus xibeiensis R13的是5.54mg/g和4.2g/L，Deinococcus radiodurans R1的是2.98mg/g和4.5g/L。一方面基因工程菌EBILmFDO的类胡萝卜素产量高，分别是R13和R1的2.22倍和4.13倍；另一方面基因工程菌EBILmFDO的类胡萝卜素产率高，可以达到0.34mg/(g.h)，分别是R13和R1的2.95倍和5.48倍。
实施例5类胡萝卜素的提取与检测
1)干菌体的制备
菌株培养结束后，于4℃、5000rpm条件下离心10min收集菌体，蒸馏水洗涤两次，冷冻干燥获得干菌体，置于-20℃冰箱中保存。
2)类胡萝卜素的提取
称取0.05g干菌体，加入3mL盐酸(3mol/L)溶液，置于25℃摇床中振荡1h。接着沸水浴煮沸4min，再冰浴5min，于4℃、5000rpm离心10min弃上清。再用蒸馏水洗涤两次后，加入2ml丙酮溶液(含1％BHT)，25℃摇床中振荡至菌体无色，4℃、5000rpm条件下离心10min小心取上清液。最后经0.22μM有机膜过滤，即可获得类胡萝卜素提取液。
3)类胡萝卜素的检测
采用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)初步分析类胡萝卜素提取液，UPLC-MS检测条件为：类胡萝卜素粗提液的有机溶剂为乙腈：甲醇(8:2)；流动相：乙腈100％；流速：1mL/min；柱温：30℃；ACQUITY UPLC BEH-C18柱(2.1×100mm，1.7μm)；检测波长：472nm。
采用分光光度法测定类胡萝卜素含量，计算公式为：
类胡萝卜素含量(μg/g干菌体)＝A475×D×V÷(0.16×W)
式中，A475为粗提液在475nm处的吸光值；D为色素提取液的稀释倍数；V为提取时所用有机溶剂总体积(mL)；0.16为类胡萝卜素的摩尔消光系数；W为菌体质量(g)。
检测结果如图11所示，a图表明类胡萝卜素粗提液存在4个主要峰，1号峰最高，推测是主要的类胡萝卜素产物。结合图b质谱数据分析可知，1号峰对应的质谱数据中出现了[M]+m/z 582.4和[M+H]+583.4的分子量，因此可初步认为利用本发明构建的新型基因工程菌EBILmFDO生产的类胡萝卜素中含有耐辐射奇球菌中的特殊类胡萝卜素Deinoxanthin。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 合成类胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 990
<212> DNA
<213> Deinococcus xibeiensis R13
<400> 1
atgcgtcccg aactgctgtc ccgcgccctg tcgctgctgc ccgagcgcag cgccacgccc 60
gaactcgccc gcttctacgg gctgctgcgc gcctacccgc agcgcggcgg caagggcgtc 120
cgttcggagc tgctgctcgc cagcgcccgc gcccacgggc tgcgcgacac tgaccccggc 180
tgggaacgcg ccctgtggct ggcgacggcg ctggaactgt ttcagaactg ggtgctgatt 240
cacgacgaca tcgaggacga ctcggaggaa cgccgggggc agcccgcgct gcaccgcctg 300
tgcggggtgc cggtcgccat caacgtgggc gacgcgctgc acgcctacat gtgggccgcc 360
gtgggaaggg cggacgtgcc cggcgccttc gaggagttcc tgaccatgat tcaccgcacc 420
gccgagggcc agcacctcga cctcgcgtgg gtggagggcc gcgagtggaa cctcgccccc 480
gccgattacc tgcagatggt ggagctgaaa accgcgcact acacggtcat cgttccgctg 540
cggctggggg cgctggcggc gggcgtcatc cccagcgagg ccctgacccc ggcgggcctg 600
gcgctgggca ccgcctttca gattcgcgac gacgtgctca acctcgcggg cgacccggtg 660
aagtacggca aggaaatcgg cggcgacctg ctggaaggca agcggacgct gatcgtgctg 720
cactggctgg gggcggcccc ggagagccag aaggccgcct ttctggacca gatgcgccgg 780
gaccgcgccg acaaggaccc ggcggcgatt gaccggattc accgctggct gctggacagc 840
ggcagcgtgc agcacgccca ggactacgcc caggcccagg ccaccgaggg actgaagctg 900
ctggagcggg cgctggccgg ggcgccggac ccgcaggccg ccgccgcgct gctcaccagc 960
gtgcgggaac tggcgacgcg ggagaagtga 990
<210> 2
<211> 927
<212> DNA
<213> Deinococcus xibeiensis R13
<400> 2
gtgacggaat tttcgcctgc cctgcccagc accgaactgt gccgcccccc actggcacag 60
gcggtgcagt tttgccggga cctgacgcgc caccacagca agaccttcta cctggggtcg 120
cgcctgtttt ctccgcccga gcgggccgcc gtgtgggcgg tgtacgccgc ctgccgcgcc 180
ggggacgaca tcgtggacga agcgggcagc ggggacagcg ggcacgaact gcgcgagtgg 240
cgcggccgca tcgacgcggc gttcgcgggg cacccggcag acgaccccat cagccgggcg 300
ctggcctggg cggtggccca ctaccccatt ccgcacagcg cctttgccga actgcacgag 360
ggcctgaaca tggacctgcg cggccacgag taccacgagc tggacgacct gctgctctac 420
tgccggcggg tggccggggt ggtgggcttc atggtcgcgc ccatcagcgg ctaccggggc 480
ggcgccgaaa cccttcacta cgccctgcaa ctcgggcagg cgatgcagct caccaatgtc 540
ctgcgcgacg tgggcgagga cctgggacgg gggcgggtct acctgccgca gagcctgctg 600
gccgagtacg gcctgtcccg cgccgcgctc gaacgctgcc gccagggtga acccctcggc 660
cccggctacc gcgccctgat gcggcacctc ggcgacctgg cccgcgaggg gtacgccgag 720
ggccgcgccg ggattccccg gctggaagga cgcggcccgc tggcggtgct gaccgccgcc 780
cgcgcctacg agggcattct cgacgacctg gagcgtgccg gatacgacaa ctttggtcgc 840
cgcgcctacg tgagcggacg gcgcaagctg ctgatgccgc cgcaggcgtg gtgggaactg 900
cggacgctgg acgccgccca cggctga 927
<210> 3
<211> 1647
<212> DNA
<213> Deinococcus xibeiensis R13
<400> 3
atgacatccc ctcttccctg gcctgctcct tcgccctaca cccgccgcaa gacggccctg 60
gtcgtcgggt cgggcttcgg cggcctcgcg ctcggtatcc ggctgcaaag cctgggcttc 120
gacaccacga ttctggaacg gctggacggg ccggggggcc gcgcctacca gaagcgcacg 180
cctgacggtt acgtgttcga catggggccg acggtcatca ccgtgccgca ctttatcgag 240
gaattgttcg cgctggagcg ggaccgcgcc cacctggacg cccccgacta cccgccggag 300
gtgctgagcg gcgagcgggt cagggggggc gtgagcggtg gcccccgcac gagcgagtac 360
gtcaccctgg tgccgatttt gcccttctac cgcatcgtgt ttcacgacgg cacctttttc 420
gactacgacg gcgaccccga cagcacccgg cgccagattg ccgaactcgc gccgcaggac 480
ctcgcgggct acgagcgctt tcatgccgac gccgaggcca tcttccggcg tggctttctg 540
gaactggggt acacccactt cggcgacgtg cccaccatgc tgcgggtggt gccggacctg 600
ctgaaactcg acgcggtgcg gacgctgttt tcctttacgt ccaaatattt ccagtcggac 660
aagatgcggc aagtcttttc cttcgagacg ctgctggtgg gcggcaaccc gctgaacgtg 720
cccgccatct acgcgatgat tcactttgtc gagaaaacct ggggcattca ctacgccctc 780
ggcggcaccg gggcgctggt gcgcgggctg gtgcgcaagt tcggggaact cggtgggacc 840
attcggtacg gggccggggt gaaggagatt gtggtggacg gccgcttgcc cggccagcgg 900
acggcgcggg gcgtgcggct cgaaagcggc gaggagcttg aggccgacct cgtggcgagc 960
aacggcgact gggccaacac ctacctcaag cgggttccgg cgcgggcgcg gctggtcaat 1020
tccgacctgc gggtgcgggc ggcgcggcag agcatgggcc agctggtggt gtacttcggc 1080
ttccggggcg gggacgagtt gccgctcaag caccacaaca ttctgctggg accgcgctac 1140
gaggcgctgc tcacggagat tttcggcaaa aaggtgctgg gcgaggactt cagccagtac 1200
ctgcatgtgc ccacactcac cgacccggac ctcgctcccg ccggacacca cgccgcctac 1260
accctggttc ctgtgccgca caacggcagc gggattgact ggaaggtgga agggccgagg 1320
ctggccgacg ccgcgctggc cgacatcgag gcgcgggggc tgattccggg gctgcgcggg 1380
cggctgaccc acttcgagtt cgtcacgccc gactatttcg aaggcacgct cgacagctac 1440
ctgggcaacg ccttcgggcc ggagccgcaa ctggtccaaa gcgccttttt ccgcccccac 1500
aaccgcagcg aggacgtgcg caacctctac ctcgtcggcg cgggggcgca gccgggcgcg 1560
ggcaccccca gcgtgatgat gtcggccaag atgacggcgc ggctcatcgc cgaggacttc 1620
ggtattcacg ccgacatccg gcgctga 1647
<210> 4
<211> 1248
<212> DNA
<213> Deinococcus xibeiensis R13
<400> 4
atggcgcccc tttcttcccc ttcctgcgac gtgctggtca tcggcggcgg accgggcggc 60
actgccctga gcgccgaact cgccgcgcgg gggctatccg tgcggcaagt cgcgccccat 120
ccgccccggc cctttcccgc cacctacggg gcctggctgg gcgagctgcc cgcctgggcg 180
cagggctgcg ccgaacaggt ctggaccgac gtgcgggtgt acaccggctc ccccgtgaca 240
ccgctcggac agccctacgc cctgctggac aatgccgcgc tgctgcggac cctgcgcggg 300
cgggcggact ggacctggac ccagggccgg gccatgcacg ccgagcggcg cggcacgggc 360
tggaccgtag ggggcgagag cggcgcggtc tggcacgccc ggctgatcgt ggacgccagc 420
gggcacgggg cgctcgtctc ctccgtccgc tttcccggtg gtccggcact tcagacggcc 480
tatggggtgg tggcccgctt tcgccgcccg cccgtcacgg ccggcagcat ggtgtggatg 540
gactaccgca cgcccgcgcc ggagctgcgc cggggcgaag cgaccttcct gtacgccatg 600
cacctcggcg cagaccgcta cttcgtggaa gaaacgagcc tgattgcccg gcccgcgccc 660
acccgtgacg agttgcgccg ccgcctgctg gcccggctgg acgcccaggg cacgccgcca 720
cgcggcatcg agagcgagga gtgggtggcc tttcccatga acgcgcaggc ccccgcgccc 780
ggccccgtgc tcgcctacgg cgcggcggcg ggccgggtcc accccgtcag cgggtttcag 840
gtggccgggg cgctggccga cgcgccgggc gtggccgacg ccgtgaccgc cgcccttcgc 900
cggagcgagg acagcctcgg cgacgacgcg gcagcggcag gctgggccgc cctgtggccc 960
cccgagcgcc gcgccgcccg cgaggtgcat ctgctgggtg tgggggcgct gctgggcctg 1020
gaccgcagca cgctgccgca cttcttcagg acattttttg acctgccccc ccgcgagtgg 1080
accgccttct tgcacccggg caccgacgcg ggcagcctgg cacgcaccat gctgcgggtg 1140
ttcgcacaga ccgggggccg ggttcggctg ccgctggccc gcgccgccct cgcgcaccct 1200
gccgtgagca gccgggcgct ggccgccgcc gcggggctga aggtttga 1248
<210> 5
<211> 939
<212> DNA
<213> Deinococcus xibeiensis R13
<400> 5
ttgattcccc cccaactcct gcgctggggc ctcgcctttg ccgcgctcgg cctcgccttt 60
ctgggagcgc tcctggtgat gagaggcggc gatttcggct ggagactgat tgcgctgggg 120
ctgccgctct ccggcatcat ggcgctggca ggagacgcgc tgggcgggga ttttagcgcc 180
actctggcga agcgctggcg tgccctgttg acccacacgg caccctggct gtggtggctg 240
gccctgtcgg tggccctcaa aatccctgtt ccgctgtggc cggagggctt ttcgctgctg 300
ggcctcctca gcacggcggc cctgttcgcc tcggccctga cgttcgcggc ggggcgggtg 360
ggctgggcgc gggcgggggc tatggcggtg ttcgcctgcc tgaccgggct gggcgtcgaa 420
gtgctgggca gtcaaaccgg gattcccttc gggcagtatt cctacgccac gtcgccgccg 480
ccgaccatct tcaccgtgcc gctcatcgtg ccgctgggct ggttcgcttt cacgctggcg 540
gggctgctgc tctcgggcgg gcggccctgg ctggcggggc tgctcatcat gctctgggac 600
gtggggctag agccgctgat gaccgcgcag cgctactggc gctggagcga cccccagccg 660
ctgtgggcag gcgcacccct ccagaacttt ctgggctggt gggcggtggg cacggcgatt 720
gcctggggca tgaagcgtct ggcgccgggg ctgttcgcgg cgagcaagga gcacggaaaa 780
gaaggctttt ccccgtcatt ttcgctggcc tacttcaccg aggctttttt tctgccgggc 840
ggactggtgc tggtcgggcg gctggcggaa gcggcggtga ccctcgcggc gatgatgctg 900
ggggcgctgc tggcgcgggc ggtgcggcgt ggccgttag 939
<210> 6
<211> 1404
<212> DNA
<213> Deinococcus xibeiensis R13
<400> 6
atgacccagg tggcggtcat cggagcgggc ttcgcgggac tggcggcggc gctgcggctg 60
gcgcgggcag gggcgcaggt gacggtcctc gacgcgctcg accgaccggg aggcaaggcg 120
gcgctggggt acgccgactt ttccagcggt cccaccgtcg tgaccatgcc gcagattttt 180
gcggcgctgc acgcccgcct cgggtggaac gtgcccgacc tgactccagc gcacccgacc 240
accacctacc acgccctgaa tggccggacc ttcgcccccg aagcgctcaa tgtggtcggc 300
agtctcgaac ccacgctggc ccagctttcc ccctcggagg ggcgacgtta ccgccaactg 360
ctgctcgccg cccggcagat gtacagcggc gcggcgggca cctttctttt tgcgcctcca 420
cccggcgcgg cgcagctcgc ccgctacgcc ttcaaagccg ggcggcaagc cgcgcccctg 480
accccactcg cccggtatgt gcgctcgggg ccgtttctga cccccttctg gctgcgcttc 540
gccacctatc tgggggccga cccctaccgg gcacccgccg tgctgcacaa cattacctgg 600
gtcgaactcg gtgacggcat ctggcacctg cccggtggcc tgctggccct ggccgagcgc 660
ctgtaccggg aagctctgag acaccatgtc cgcttcgagt tcggcacccg cgtgcagcat 720
ctcagcaccc acggggggag ggtgctgggc gcccacacca gccggggcgc ttttgccgcc 780
gaccactggg tgagcgccgc cgaccgcgcc ctgacactgg gctggctggg acaggcggcg 840
tccccttccc cccggggcgt cagtggcttt gccctgcaac tgcgtctccg tgaggacctg 900
ggccaggggc accacatttt ctggcctgcc gactatgccc gtgaatggca tgacatccgg 960
gccggtcgcc tgcctgccga cccgaccctc tacctccacc tcgacggccc acgggccttt 1020
ctgctggtca acgcgccacc cgacccggcg ctgggccatt cccccgagag caagaacgac 1080
tatgcccgcc acctgctcgg gcgtctccag gcacgtttcc ctttgccggt ggcggcgtgg 1140
caggccctgg cccccgccga ctacgcccgc accgggctgg gcggcgccct gtacggccgg 1200
gcgcctcatg gcctgctcgg cagcctgcgc ccgggctggc agctgcccca ggcccgcaac 1260
ctcgtgcagg tgggcggcac cgttcaccca gggggagggg tgccactttc tctgctgtcg 1320
ggctggaatg gagcggggca gttgcttcac cttgactacg actccttgaa cggcgaacat 1380
cccttccaga gcgcggccaa ataa 1404
<210> 7
<211> 1512
<212> DNA
<213> Deinococcus xibeiensis R13
<400> 7
atgggcgcgg gccacaacgc gctggtgact gctgcctacg ccgcccgggc gggcctgaaa 60
gtcggcgtgt tcgagcggcg gcacctcgtc ggcggggcgg tcagcaccga ggaactggtg 120
cccggttacc gcttcgacta cggcggcagc gcccacatcc tgattcggat gacgcccatc 180
gtgcgcgagc tcgaactcac gcggcacggg ctgcattacc tcgaagtgga ccccatgttt 240
cactgctcgg acggcgaaac gccctggttt attcaccgcg accccgcccg aaccatccgt 300
gagttggaag aaaagtttcc ggggcagggc gacgcctacg ggcgctttct cgacgattgg 360
acacccttca cgcgcgccgt ggccgacctg ttcaactcgg cgccggggcc gctcgacctg 420
ggcaaaatgg tgatgcgcag cggccagggc aaggactgga acgagcagct cccgcgcatc 480
ctgcggccct acggcgacgt ggcgcgcgaa tacttcaccg acgagcgcgt gcgggcgccg 540
ctggtctgga tggcggccca gagcggcccc ccgccctcgg acccgctcag cgcccctttt 600
ttgctgtggc acccgctgta tcacgaaggc ggcgtagccc ggcccaaagg cgggagcggt 660
gggctgacca aagccttgcg ccgggccatc gaagccgagg gcggcgaggt cttcaccgac 720
gcgcccgtca aagaaatttt ggtcagggac ggccaggcgc agggtatccg gctggagaac 780
ggcgagacgt acaccgcccg cgccgtcgtg tcgggcacgc acgtcctgac cacggctgcc 840
gcgctgcccg acgaatacgt ccccgccgcc gccaaaaatg tgcgcgtggg caacggcttc 900
ggcatgattt tgcgtctggc cctgagtgaa aaggtcaagt accgccacca caccgaaccc 960
gactcgcgcg tgggcctcgg cctgctggtc aagaacgaac gccagattat gcagggctac 1020
ggcgaatatc tggccggaca gcccaccacc gacccgccgc tggtcgccat gagtttcagc 1080
gcggtggacg actctctcgc tcccccgcag ggcgacgtgt tgtggctgtg ggcgcagtat 1140
taccccttcg aactcgccag cggctcatgg gaaacgcgca ccgccgaggc gcgggaaaac 1200
attctgcggg ccttcgagca ctatgccccc ggcacccgcg acaccatcgt gggcgaactg 1260
gtgcagactc cgcagtggct ccacgaccat ctcggcctac accggggcaa cgtgatgcac 1320
ctggaaatgt ccttcgacca gatgttttcc ttccgcccct ggatgaaggc cagccagtac 1380
cgctggccgg gcatcagggg gctgtatctc accggcgcga gcacccaccc cggcggcggc 1440
atcatgggcg cgagcgggcg caacgcggcg cgggtgattg tcaaagacct gacgcggcga 1500
ggctggcggt ga 1512

Claims (9)

1.一种合成类胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌中表达来源于Deinococcus xibeiensis R13菌株类胡萝卜素合成途径中的关键酶。
2.根据权利要求1所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述关键酶是牻牛儿牻牛儿焦磷酸合成酶、八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素β-环化酶、C1',2'-水合酶、C3',4'-脱氢酶和C4-酮基化酶，分别由基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO编码。
3.根据权利要求2所述的合成类胡萝卜素的基因工程菌，其特征在于，所述关键酶基因crtE、crtB、crtI、crtLm、cruF、crtD和crtO的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1-7所示。
4.权利要求1-3中任一所述合成类胡萝卜素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将关键酶基因crtE、crtB和crtI依次与表达载体pET Duet-1连接，得到重组载体pET-EBI，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；
(2)将关键酶基因crtLm、cruF、crtD和crtO依次与表达载体pRSF Duet-1连接，得到重组载体pRSF-LmFDO，转化到步骤(1)含pET-EBI的重组菌中，构建得到基因工程菌EBILmFDO。
5.利用权利要求1所述基因工程菌合成类胡萝卜素的方法，其特征在于，将合成类胡萝卜素的新型基因工程菌进行发酵培养，然后对发酵培养物进行分离提取得到类胡萝卜素。
6.根据权利要求5所述的类胡萝卜素的生产方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)添加量为0-1mM，总氮浓度在1-2g/L，总碳浓度在0.2-0.6g/L。
7.根据权利要求5所述的类胡萝卜素的生产方法，其特征在于，利用胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化铵或硫酸铵作为氮源，以葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、淀粉、乙酸盐或甘油为碳源。
8.根据权利要求5所述的类胡萝卜素的生产方法，其特征在于，所述发酵培养时间为30-72h，温度25-37℃，pH 5-9。
9.根据权利要求5所述的类胡萝卜素的生产方法，其特征在于，所述类胡萝卜素的分离提取方法包括以下步骤：
(1)发酵培养结束后，于4℃、5000-10000rpm离心10-15min，收集菌体；
(2)用蒸馏水洗涤1-2次，冷冻干燥获得干菌体，置于-20℃环境中保存；
(3)称取干菌体，加入3mol/L盐酸溶液，置于摇床振荡1-2h；
(4)沸水浴煮3-5min，接着冰浴4-6min，离心弃上清液；
(5)蒸馏水洗涤1-2次，加入1-2ml含1％2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的丙酮溶液，振荡至菌体无色；
(6)离心取上清液，经0.22μM有机膜过滤，获得类胡萝卜素提取液。
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