CN110106209B - 一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，是在解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径的乙酰辅酶A硫解酶、HMG‑CoA合成酶和HMG‑CoA还原酶超表达并定位至过氧化物酶体，获得工程菌MP1；在工程菌株MP1的基础上，表达α‑法呢烯合成途径，获得工程菌FP1；或表达β‑胡萝卜素合成途径，获得工程菌CP1；或表达芳樟醇合成途径，获得工程菌LP1；使菌株FP1、CP1或LP1能够利用含脂肪酸或油脂的培养基在好氧条件下实现合成萜类化合物，比利用传统方法合成萜类化合物的产率更高。本发明方法可以利用脂肪酸、油脂和廉价的厨余用油来生产甲羟戊酸下游萜类化合物，具有可观的应用前景和经济价值。

Description

一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，属于微生物技术及发酵工程领域。

背景技术

萜类化合物是由甲戊二羟酸衍生、且分子骨架以异戊二烯单元为基本结构单元的化合物及其衍生物。萜类化合物是中草药中的一类比较重要的化合物，已经发现许多化合物是中草药中的有效成分，同时它们也是一类重要的天然香料，是化妆品和食品工业不可缺少的原料，一些化合物还是重要的工业原料。甲羟戊酸途径是一种十分重要的途径，广泛存在于真核生物细胞、古细菌、革兰氏阳性菌和高等植物细胞中。可以通过甲羟戊酸途径生成异戊烯焦磷酸(Isopentenyl diphosphate，IPP)，IPP进一步合成各种萜类化合物，如法呢烯、β-胡萝卜素和桦木酸。

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种重要的非常规产油酵母，具有安全性高、耐酸能力强、分泌多种代谢产物和能够利用多种碳水化合物等优点，它被视为潜在的生物技术工程菌株受到越来越多的关注。通过甲羟戊酸途径可以生产芳香分子芳樟醇和β-紫罗兰酮，但是它们的产量和产率仍然相对较低。解脂耶氏酵母主要通过利用葡萄糖合成萜类化合物，糖酵解产生乙酰辅酶A的过程不可避免地伴随着二氧化碳的释放，乙酰辅酶A是甲羟戊酸及下游萜类化合物的前体，进而导致解脂耶氏酵母利用葡萄糖生产萜类化合物的产率降低。

经检索，有关将甲羟戊酸合成途径的关键酶乙酰辅酶A硫解酶、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶和HMG-CoA还原酶过表达并定位至解脂耶氏酵母过氧化物酶体，再表达萜类化合物合成途径，利用含脂肪酸或油脂的培养基合成萜类化合物，即利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法目前还未见报道。

发明内容

针对解脂耶氏酵母通过糖酵解途径好氧发酵生产甲羟戊酸及下游萜类化合物过程中存在的理论产率低的缺陷，本发明提供了一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法。

本发明所述的利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：在解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径的关键酶乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶超表达并定位至过氧化物酶体，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1和AtoB-ePTS1基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为MP1；其中涉及的ePTS1为在蛋白质中添加的具有将蛋白质定位至过氧化物酶体内的功能的过氧化物酶体定位信号，命名为ePTS1；在工程菌株MP1的基础上，表达α-法呢烯合成途径，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和α-FS基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为FP1；或者在工程菌株MP1的基础上，表达β-胡萝卜素合成途径，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1、carB和carRP基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为CP1；或者在工程菌株MP1的基础上，表达芳樟醇合成途径，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和LIS基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为LP1；使获得的解脂耶氏酵母工程菌株FP1、CP1或LP1能够利用含脂肪酸或油脂的培养基在好氧条件下合成萜类化合物；

其中，所述利用含脂肪酸或油脂的培养基在好氧条件下合成萜类化合物的方法和条件是：将解脂耶氏酵母工程菌株FP1、CP1或LP1在培养温度为30±1℃，摇瓶培养转速120～220rpm，培养96～240h；所述含脂肪酸或油脂的培养基命名为改良YJX培养基，其配方是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，脂肪酸或油脂20～60g/L，吐温80 0.4～1.5g/L，余量为水，其中配方中所述脂肪酸或油脂选油酸、软脂酸、硬脂酸、亚油酸、三油酸甘油酯、棕榈油、大豆油、橄榄油、菜籽油、花生油、芝麻油或厨余用油；培养过程中，每隔12或24h取样，检测萜类化合物的含量；所述萜类化合物是指法呢烯、檀香烯、柠檬烯、法呢醇、番茄红素、β-胡萝卜素、异戊二烯、角鲨烯、麦角固醇、青蒿酸、青蒿素、瓦伦烯、大麻素、人参皂苷、紫杉醇、丹参酮、香紫苏醇、β-紫罗兰酮或芳樟醇。

进一步地，上述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法中，在解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径的关键酶乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶超表达并定位至过氧化物酶体，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1和AtoB-ePTS1基因的解脂耶氏酵母工程菌，并使该工程菌能够利用改良YJX培养基在好氧条件下生产甲羟戊酸的步骤是：

(1)以表达载体pKi-1构建pKi1-HMGR-ePTS1质粒，以表达载体pKi-2构建pKi2-HMGS-ePTS1-AtoB-ePTS1质粒，以解脂耶氏酵母Po1f菌株为出发菌，构建过表达添加增强型过氧化物酶体定位信号ePTS1的HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1和AtoB-ePTS1基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为MP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1；其中所述HMGR为来源于博代氏杆菌(Bordetella petrii)的HMG-CoA还原酶，HMGS为来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的HMG-CoA合成酶，AtoB是来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的乙酰辅酶A硫解酶；所述增强型过氧化物酶体定位信号ePTS1为蛋白质羧基端的LGRGRRSKL九个氨基酸序列；

(2)将工程菌株MP1在培养温度为30±1℃，摇瓶培养转速120～220rpm条件下，利用改良YJX培养基培养120～200h，获得含甲羟戊酸的培养液，取样检测甲羟戊酸的含量。

其中，优选的实施方式是：将工程菌株MP1在培养温度为30℃，摇瓶培养转速220rpm条件下，利用改良YJX培养基培养144h，获得含甲羟戊酸的培养液；其中所述改良YJX培养基配方是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L，余量为水。

进一步地，上述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法中，所述在工程菌株MP1的基础上，表达α-法呢烯合成酶，获得相关工程菌的方法是：

以表达载体JMP-hyg-GPD构建JMP-hyg-α-FS质粒，以解脂耶氏酵母工程菌株MP1为出发菌株，构建过表达HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和α-FS基因的工程菌，该菌株命名为FP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1α-FS；其中所述α-FS为来源于苹果(Malus x domestica)的α-法呢烯合成酶。

进一步地，上述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法中，在工程菌株MP1基础上，表达八氢番茄红素脱氢酶和番茄红素环化酶，获得相关工程菌的方法是：

以表达载体JMP-hyg-GPD构建JMP-hyg-carRP-carB质粒，以解脂耶氏酵母工程菌株MP1为出发菌株，构建过表达HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1、carB和carRP基因的工程菌，该菌株命名为CP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1carBcarRP；其中所述carB为来源于圆形根茎(Rhizomucor circinelloides)的八氢番茄红素脱氢酶，carRP为来源于圆形根茎(Rhizomucor circinelloides)的番茄红素环化酶。

进一步地，上述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法中，在工程菌株MP1基础上，表达芳樟醇合成酶，获得相关工程菌的方法是：

以表达载体JMP-hyg-GPD构建JMP-hyg-LIS质粒，以解脂耶氏酵母工程菌株MP1为出发菌株，构建过表达HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和LIS基因的工程菌，该菌株命名为LP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1LIS；其中所述LIS为来源于猕猴桃(Actinidia arguta)的芳樟醇合成酶。

上述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法中，所述利用含脂肪酸或油脂的培养基在好氧条件下合成萜类化合物的培养条件优选是：将解脂耶氏酵母工程菌株FP1、CP1或LP1在培养温度为30℃，摇瓶转速220rpm条件下，利用改良YJX培养基培养144h，获得含萜类化合物的培养液，取样检测萜类化合物的含量。

其中：所述萜类化合物优选是α-法呢烯、β-胡萝卜素或芳樟醇。

上述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法中，所述改良YJX培养基的配方优选是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，脂肪酸或油脂30～50g/L，吐温80 0.8～1.0g/L，余量为水；其中配方中所述脂肪酸或油脂选油酸、三油酸甘油酯、棕榈油或大豆油。

进一步地，所述改良YJX培养基的配方最优选是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L，余量为水。

本发明公开了一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，首次在严格好氧微生物解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径过表达并定位至过氧化物酶体并利用含脂肪酸或油脂的培养基合成萜类化合物。实验证实：工程菌株MP1利用油酸摇瓶发酵144h合成甲羟戊酸的产率可达0.072g/g油酸，而在胞质中过表达甲羟戊酸合成途径的对照工程菌株M1利用葡萄糖生产甲羟戊酸的产率仅为0.033g/g葡萄糖。在工程菌株MP1的基础上分别构建工程菌株FP1、CP1和LP1，同时分别构建对照工程菌株F1、C1和L1；测试显示：工程菌株FP1利用油酸摇瓶发酵144h合成α-法呢烯的产率为2.19mg/g油酸，而对照工程菌株F1利用葡萄糖生产α-法呢烯的产率仅为0.95mg/g葡萄糖；工程菌株CP1利用油酸摇瓶发酵144h合成β-胡萝卜素的产率为1.91mg/g油酸，而对照工程菌株C1利用葡萄糖生产β-胡萝卜素的产率仅为0.91mg/g葡萄糖；工程菌株LP1利用油酸摇瓶发酵144h合成芳樟醇的产率为0.43mg/g油酸，而对照工程菌株L1利用葡萄糖生产芳樟醇的产率仅为0.22mg/g葡萄糖；证实本发明的工程菌株FP1、CP1和LP1能够利用含脂肪酸或油脂的培养基高效合成萜类化合物。通过甲羟戊酸合成途径的过氧化物酶体定位并利用含脂肪酸或油脂的培养基合成甲羟戊酸及下游萜类化合物，使得解脂耶氏酵母合成甲羟戊酸及下游萜类化合物的产率大幅提高。

本发明通过甲羟戊酸合成途径的过氧化物酶体定位提高了萜类化合物合成的产率，并且所述工程菌株FP1、CP1和LP1可以充分利用含油酸或油脂的培养基高效合成萜类化合物。生活中油脂非常常见，本发明提供的工程菌株FP1、CP1和LP1可以利用油脂及廉价的厨余用油、工业废油来生产甲羟戊酸下游萜类化合物，极大地提高了所述菌株的应用附加值，有利用减少环境污染，具有可观的应用前景和经济价值。

附图说明

图1：表示将甲羟戊酸合成途径定位至解脂耶氏酵母过氧化物酶体后利用脂肪酸合成甲羟戊酸下游萜类化合物代谢模式图。

图2：工程菌株M1和MP1分别以葡萄糖和油酸作为碳源时摇瓶发酵144h的产率对比。

其中，M1为对照菌株，MP1为实验菌株。M1以Po1f为宿主在胞质表达了大肠杆菌来源的AtoB、解脂耶氏酵母来源的HMGS和博代氏杆菌来源HMGR；MP1以Po1f为宿主在解脂耶氏酵母过氧化物酶体中定位表达了AtoB-ePTS1、HMGS-ePTS1和HMGR-ePTS1。其中，h表示小时；Glu表示利用YPD培养基，以葡萄糖为碳源；Ole表示利用YJX培养基，以油酸为碳源；MVA表示甲羟戊酸；Titer表示产量，Yield表示产率，下图中的缩略词表示内容相同。

图3：分别以油酸(Oleic acid)、三油酸甘油酯(Triolein)、大豆油(Soybean oil)和棕榈油(Palm oil)作为碳源时利用工程菌株MP1合成甲羟戊酸。使用的改良YJX培养基配方为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，脂肪酸或油脂42g/L，吐温80 0.84g/L，余量为水；其中配方中所述脂肪酸或油脂选油酸、三油酸甘油酯、棕榈油和大豆油。

图4：工程菌株F1和FP1分别以葡萄糖和油酸作为碳源时摇瓶发酵144h的产率对比。其中F1为对照菌株，FP1为实验菌株。

图5：工程菌株C1和CP1分别以葡萄糖和油酸作为碳源时摇瓶发酵144h的产率对比。其中C1为对照菌株，CP1为实验菌株。

图6：工程菌株L1和LP1分别以葡萄糖和油酸作为碳源时摇瓶发酵144h的产率对比。其中L1为对照菌株，LP1为实验菌株。

图7：分别以油酸(Oleic acid)、三油酸甘油酯(Triolein)、大豆油(Soybean oil)和棕榈油(Palm oil)作为碳源时利用工程菌株FP1、CP1和LP1合成萜类化合物。使用的改良YJX培养基配方为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，脂肪酸或油脂42g/L，吐温80 0.84g/L，余量为水；其中萜类化合物指α-法呢烯、β-胡萝卜素和芳樟醇；其中配方中所述脂肪酸或油脂优选油酸、三油酸甘油酯、棕榈油或大豆油。

具体实施方式

本发明所涉及的解脂耶氏酵母原始菌株Po1f(ATCC编号MYA-2613；基因型MATAura3-302leu2-270xpr2-322axp2-deltaNU49XPR2::SUC2)购自ATCC。还涉及携带可回收筛选标记的过表达载体pKi-1、pKi-2、JMP-hygGPD和113-GPD-TEF，该表达载体构建见文献(Zhiyong Cui et al.,2019,Biotechnology and Bioengineering,Homology-independent genome integration enables rapid library construction for enzymeexpression and pathway optimization in Yarrowia lipolytica)。

YPG固体培养基配方：

酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，甘油20g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。

YNBG固体筛选培养基配方：

YNB(Yeast Nitrogen Base)6.7g/L，甘油20g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。

YPDC固体培养基配方：

酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，潮霉素0.5g/L，琼脂粉20g/L，余量为水。

实施例1构建在过氧化物酶体中定位表达甲羟戊酸合成途径的解脂耶氏酵母工程菌株MP1

1.1构建表达载体

(1)在来自博代氏杆菌的HMGR基因(AM902716.1)的终止密码子前添加增强型的过氧化物酶体定位信号ePTS1(蛋白质羧基端的LGRGRRSKL九个氨基酸序列)序列，命名为基因HMGR-ePTS1(SEQ No.1)，经密码子优化以后由通用生物系统(安徽)有限公司安排合成。以及同时根据表达载体pKi-1序列设计引物：

HMGR-ePTS1-F：

ATAAGAATCATTCAAAGGTTATGTCTACCGACGCCAAGAA

HMGR-ePTS1-R：

ACATAACTAATTACATGATTTTACAGCTTGGATCGTCGTC

以密码子优化合成的HMGR-ePTS1基因序列为模板，使用HMGR-ePTS1-F/HMGR-ePTS1-R引物PCR(聚合酶链式反应)扩增得到携带相应末端同源序列的HMGR-ePTS1组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi-1通过Bsp119I内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒(NewEngland Biolabs(NEB),England)对pKi-1酶切片段和HMGR-ePTS1组装片段进行组装，构建完成pKi1-HMGR-ePTS1质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

(2)在解脂耶氏酵母HMGS基因(CP028453.1)的终止密码子前添加增强型的过氧化物酶体定位信号ePTS1序列，命名为基因HMGS-ePTS1(SEQ No.2)。以及同时根据表达载体pKi-2序列设计引物：

HMGS-ePTS1-F：

ATCCACGTGGGAACCGCGATATGTCGCAACCCCAGAACGT

HMGS-ePTS1-R：

AGGCCATGGAGGTACGCGATTTACAGCTTGGATCGTCGTC

以解脂耶氏酵母Po1f基因组为模板，使用HMGS-ePTS1-F/HMGS-ePTS1-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的HMGS-ePTS1组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi-2通过AsiSI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对pKi-2酶切片段和HMGS-ePTS1组装片段进行组装，构建完成pKi2-HMGS-ePTS1质粒。

(3)在来自大肠杆菌的AtoB基因(CP037857.1)的终止密码子前添加增强型的过氧化物酶体定位信号ePTS1序列，命名为基因AtoB-ePTS1(SEQ No.3)，经密码子优化以后由通用生物系统(安徽)有限公司安排合成。以及同时根据表达载体pKi-2序列设计引物：

AtoB-ePTS1-F：

GCAGTACTAACCGCAGATTTATGAAGAACTGTGTCATCGT

AtoB-ePTS1-R：

ATAACTAATTACATGAATTTTTACAGCTTGGATCGTCGTC

以密码子优化合成的AtoB-ePTS1基因序列为模板，使用AtoB-ePTS1-F/AtoB-ePTS1-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的AtoB-ePTS1组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3.5min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi2-HMGS-ePTS1通过SwaI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对pKi2-HMGS-ePTS1酶切片段和AtoB-ePTS1组装片段进行组装，构建完成pKi2-HMGS-ePTS1-AtoB-ePTS1质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

1.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株MP1，步骤为：

(1)解脂耶氏酵母Po1f感受态细胞的制备

I.从甘油管取50μL Po1f菌液，涂布YPG平板，30℃过夜培养

II.刮取适量Po1f细胞，重悬悬于1mL TE Buffer中

III.10，000rpm离心1min，倒掉上清液

IV.细胞悬于600μL Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)，30℃水浴、静止培养1h

V.3000rpm离心2min，倒掉上清液

VI.用80-120μL的Lithium Acetate轻悬细胞。

(2)pKi1-HMGR-ePTS1和pKi2-HMGS-ePTS1-AtoB-ePTS1质粒酶切片段转化，筛选重组子

I.取40μL上步制得的Po1f感受态细胞，向其中各加4μL的pKi1-HMGR-ePTS1和pKi2-HMGS-ePTS1-AtoB-ePTS1质粒酶切片段，再加入2μL鲑鱼精DNA，30℃水浴培养15min

II.加350μL PEG 4000-Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)及16μL 1M DTT(40mM)，30℃水浴静止培养1h

III.加40μL DMSO(nearly 10％final)，39℃热击10min

IV.加600微升Lithium Acetate(0.1M pH 6.0)，室温放置15min

V.取200μL混合液涂布YNBG筛选平板，30℃培养2-3d。

VI.随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-pKi1-F：AGTCTGGAATCTACGCTTGT

Chrom-pKi1-R：GCCCTGACCTCGGAGTCGAG

Chrom-pKi2-F：ATGTCGCAACCCCAGAACGT

Chrom-pKi2-R：CTGCTTGATCTCGTACTTTC

测序进一步验证pKi1-HMGR-ePTS1和pKi2-HMGS-ePTS1-AtoB-ePTS1质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用YJX培养基进行发酵，优化得到一株甲羟戊酸产量最高的重组子，将获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1和AtoB-ePTS1基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为MP1，其基因型为Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1。

实施例2构建在胞质中表达甲羟戊酸途径的解脂耶氏酵母对照工程菌株M1

2.1构建表达载体

(1)根据优化合成的HMGR-ePTS1的基因序列以及同时根据表达载体pKi-1序列设计引物：

HMGR-F：

ATAAGAATCATTCAAAGGTTATGTCTACCGACGCCAAGAA

HMGR-R：

ACATAACTAATTACATGATTTTAGCCCTGACCTCGGAGTCGAG

以密码子优化合成的HMGR-ePTS1基因序列为模板，使用HMGR-F/HMGR-R引物PCR(聚合酶链式反应)扩增得到携带相应末端同源序列的HMGR组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi-1通过Bsp119I内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对pKi-1酶切片段和HMGR组装片段进行组装，构建完成pKi1-HMGR质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

(2)根据解脂耶氏酵母的HMGS基因序列以及表达载体pKi-2序列设计引物：

HMGS-F：

ATCCACGTGGGAACCGCGATATGTCGCAACCCCAGAACGT

HMGS-R：

AGGCCATGGAGGTACGCGATCTACTGCTTGATCTCGTACT

以解脂耶氏酵母Po1f基因组为模板，使用HMGS-F/HMGS-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的HMGS组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi-2通过AsiSI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对pKi-2酶切片段和HMGS组装片段进行组装，构建完成pKi2-HMGS质粒。

(3)根据优化合成的AtoB-ePTS1基因序列以及表达载体pKi-2序列设计引物：

AtoB-F：

GCAGTACTAACCGCAGATTTATGAAGAACTGTGTCATCGT

AtoB-R：

ATAACTAATTACATGAATTTTTAGTTCAGTCGCTCAATGACCA

以密码子优化合成的AtoB-ePTS1基因序列为模板，使用AtoB-F/AtoB-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的AtoB组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3.5min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

pKi2-HMGS通过SwaI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对pKi2-HMGS酶切片段和AtoB组装片段进行组装，构建完成pKi2-HMGS-AtoB质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

2.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株M1，步骤为：

(1)对上步得到的pKi1-HMGR和pKi2-HMGS-AtoB质粒酶切后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将pKi1-HMGR和pKi2-HMGS-AtoB质粒酶切片段转入菌株Po1f中，涂布于YNBG平板中，倒置于30℃培养箱中。

(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-pKi1-F：AGTCTGGAATCTACGCTTGT

Chrom-pKi1-R：GCCCTGACCTCGGAGTCGAG

Chrom-pKi2-F：ATGTCGCAACCCCAGAACGT

Chrom-pKi2-R：CTGCTTGATCTCGTACTTTC

测序进一步验证pKi1-HMGR和pKi2-HMGS-AtoB质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用YJX培养基进行发酵，优化得到一株甲羟戊酸产量最高的重组子，命名为M1，其基因型为Po1f HMGR HMGS AtoB。

实施例3工程菌株MP1和M1生产甲羟戊酸效率的比较

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)工程菌M1、MP1。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母M1、MP1分别划线接种于YPG固体平板，30℃培养30h。

将YPG固体平板上长出的M1、MP1菌落分别接入装有50ml的YPD液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：分别取1ml活化的培养液转接到装有50mL种子培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：分别取2mL活化的培养液转接到装有50mL发酵YPD培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖50g/L)和改良YJX培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L)的250mL三角瓶中，进行补料分批式发酵，30℃，220rpm好氧培养144h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值。

发酵144h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液10，000～12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的葡萄糖和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1mL发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6mL/min。

发酵液中的油酸采用气相色谱仪分析(GC)，检测前需要对发酵液中的油酸进行衍生化处理，使用1％硫酸-甲醇溶液酯化后，使用含有RTX-5色谱柱的气相色谱仪进行检测分析。

本发明将甲羟戊酸合成途径的三个关键基因AtoB、HMGS和HMGR过表达并定位至解脂耶氏过氧化物酶体，利用解脂耶氏酵母油酸代谢提高了甲羟戊酸合成的产率。其中，乙酰辅酶A硫解酶AtoB催化乙酰辅酶A生成乙酰乙酰辅酶A，HMG-CoA合酶HMGS催化乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A生成HMG-CoA，HMG-CoA还原酶HMGR催化HMG-CoA生成甲羟戊酸。由图2可知，摇瓶发酵144h，工程菌株MP1利用油酸合成甲羟戊酸的产量为2.725g/L，产率为0.072g/g油酸；工程菌株MP1利用葡萄糖合成甲羟戊酸的产量为0.336g/L，产率为0.004g/g葡萄糖；工程菌株M1利用油酸合成甲羟戊酸的产量为0.775g/L，产率为0.020g/g油酸；工程菌株M1利用葡萄糖合成甲羟戊酸的产量为2.723g/L，产率为0.031g/g葡萄糖。证实解脂耶氏酵母中甲羟戊酸合成途径的过氧化物酶体定位能够提高甲羟戊酸合成的产率。

实施例4分别以油酸、三油酸甘油酯、大豆油和棕榈油作为碳源利用工程菌株MP1合成甲羟戊酸

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)工程菌MP1。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母工程菌株MP1划线接种于YPG固体平板，30℃培养30h。

将YPG固体平板上长出的MP1单菌落接入装有50mL的YPO液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸20g/L，吐温80 0.4g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：取1mL活化的培养液转接到装有50mL种子培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸20g/L，吐温80 0.4g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：取2mL活化的培养液转接到装有50mL改良YJX培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸/三油酸甘油酯/大豆油/棕榈油42g/L，吐温80 0.84g/L)的250mL三角瓶中，在30℃，220rpm条件下好氧培养120h，发酵过程中不外源添加酸碱剂。

发酵120h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液10，000～12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1mL发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6mL/min。

为探究不同种类脂肪酸或油脂作为碳源时对工程菌株合成甲羟戊酸的影响，本发明分别选用了油酸、三油酸甘油酯、大豆油、棕榈油作为碳源作为对比发酵生产甲羟戊酸。由图3可知，工程菌株MP1均可高效利用不同种类脂肪酸或油脂，摇瓶发酵120h，利用油酸生产甲羟戊酸的产量为1.54g/L、OD₆₀₀值为54.33，利用三油酸甘油酯生产甲羟戊酸的产量为1.86g/L、OD₆₀₀值为60.54，利用大豆油生产甲羟戊酸的产量为1.56g/L、OD₆₀₀值为53.74，利用棕榈油生产甲羟戊酸的产量为1.82g/L、OD₆₀₀值为56.55。因为三油酸甘油酯水解产生甘油和油酸，培养基中的少量甘油对菌株的生长代谢有促进作用，与利用油酸作为碳源相比，工程菌株MP1利用三油酸甘油酯比利用油酸更加有利于甲羟戊酸的生产。

实施例5构建生产α-法呢烯的解脂耶氏酵母工程菌株FP1和对照工程菌株F1

5.1构建表达载体

(1)根据优化合成的编码α-法呢烯合成酶α-FS(NP_001280822.1)的基因α-FS序列(SEQ No.4)以及同时根据表达载体JMP-hyg-GPD序列设计引物：

α-FS-F：

AATTAAACACACATCAACAGATGGAATTCCGAGTGCACCT

α-FS-R：

GGACAGGCCATGGAGGTACGTTAGTTCACCAGAGGCTGGA

以密码子优化合成的α-FS基因序列为模板，使用α-FS-F/α-FS-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的α-FS组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

JMP-hyg-GPD通过SalI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对JMP-hyg-GPD酶切片段和α-FS组装片段进行组装，构建完成JMP-hyg-FS质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

5.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株FP1，步骤为：

(1)对上步得到的JMP-hyg-FS质粒酶切后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将JMP-hyg-FS质粒酶切片段转入工程菌株MP1中，最后涂布于YPDC平板中，倒置于30℃培养箱中。

(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-JMP-F：ACATCAGGTTACCCCAAGCC

Chrom-JMP-R：GGAAGAACACCGGTGTTGGA

测序进一步验证JMP-hyg-FS质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用改良YJX培养基进行发酵，优化得到一株α-法呢烯产量最高的重组子，将获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和α-FS基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为FP1，其基因型为Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1α-FS。

5.3使用醋酸锂转化法构建得到对照工程菌株F1，步骤为：

(1)对上步得到的JMP-hyg-FS质粒酶切后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将JMP-hyg-FS质粒酶切片段转入工程菌株M1中，最后涂布于YPDC平板中，倒置于30℃培养箱中。

(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-JMP-F：ACATCAGGTTACCCCAAGCC

Chrom-JMP-R：GGAAGAACACCGGTGTTGGA

测序进一步验证JMP-hyg-FS质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用改良YJX培养基进行发酵，优化得到一株α-法呢烯产量最高的重组子，将获得含HMGR、HMGS、AtoB和α-FS基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为F1，其基因型为Po1f HMGR HMGSAtoBα-FS。

实施例6构建生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母工程菌株CP1和对照工程菌株C1

6.1构建表达载体

(1)根据优化合成的carRP基因(AJ250827.1)序列(SEQ No.5)，以及同时根据表达载体JMP-hyg-GPD序列设计引物：

carRP-F：

AATTAAACACACATCAACAGATGCTGCTGACCTACATGGA

carRP-R：

GGACAGGCCATGGAGGTACGTTAGATGGTGTTCAGGTTTC

以密码子优化合成的carRP基因序列为模板，使用carRP-F/carRP-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的carRP组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

JMP-hyg-GPD通过SalI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对JMP-hyg-GPD酶切片段和carRP组装片段进行组装，构建完成JMP-hyg-carRP质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

(2)根据优化合成的carB基因(AJ238028.1)序列(SEQ No.6)。以及同时根据表达载体113-GPD-TEF序列设计引物：

carB-F：

GCAGTACTAACCGCAGATTTATGTCCAAGAAGCACATTGT

carB-R：

ATAACTAATTACATGAATTTTTAGATGACGTTAGAGTTGT

以密码子优化合成的carB基因序列为模板，使用carB-F/carB-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的carB组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

113-GPD-TEF通过SwaI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对113-GPD-TEF酶切片段和carB组装片段进行组装，构建完成113-GPD-TEF-carB质粒。

(3)以113-GPD-TEF-carB质粒为模板，使用carB-F2/carB-R2引物PCR扩增得到含有carB基因表达框的组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

carB-F2：

GAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCACAGAGACCGGGTTGGCGGC

carB-R2：

CGATCCACTAGTTCTAGAGCCCGCAAATTAAAGCCTTCGA

将含有carB基因表达框的组装片段回收后与JMP-hyg-carRP酶切片段利用Gibson组装克隆试剂盒进行组装，构建完成JMP-hyg-carRP-carB质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

6.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株CP1，步骤为：

(1)对上步得到的JMP-hyg-carRP-carB质粒酶切后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将JMP-hyg-carRP-carB质粒酶切片段转入工程菌株MP1中，最后涂布于YPDC平板中，倒置于30℃培养箱中。

(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-JMP-F：ACATCAGGTTACCCCAAGCC

Chrom-JMP-R：GGAAGAACACCGGTGTTGGA

测序进一步验证JMP-hyg-carRP-carB质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用YJX培养基进行发酵，优化得到一株β-胡萝卜素产量最高的重组子，将获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1、carB和carRP基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为CP1，其基因型为Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1carB carRP。

6.3使用醋酸锂转化法构建得到对照工程菌株C1，步骤为：

(1)对上步得到的JMP-hyg-carRP-carB质粒酶切后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将JMP-hyg-carRP-carB质粒酶切片段转入工程菌株M1中，最后涂布于YPDC平板中，倒置于30℃培养箱中。

(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-JMP-F：ACATCAGGTTACCCCAAGCC

Chrom-JMP-R：GGAAGAACACCGGTGTTGGA

测序进一步验证JMP-hyg-carRP-carB质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用YJX培养基进行发酵，优化得到一株β-胡萝卜素产量最高的重组子，将获得含HMGR、HMGS、AtoB、carB和carRP基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为C1，其基因型为Po1fHMGR HMGS AtoB carB carRP。

实施例7构建生产芳樟醇的解脂耶氏酵母工程菌株LP1和对照工程菌株L1

7.1构建表达载体

(1)根据优化合成的编码芳樟醇合酶LIS(GQ338153.1)的基因LIS序列(SEQ No.7)以及同时根据表达载体JMP-hyg-GPD序列设计引物：

LIS-F：

AATTAAACACACATCAACAGATGGCCTCTTTCAACCGATT

LIS-R：

GGACAGGCCATGGAGGTACGTCAGGAAGAAGAGTCGTACA

以密码子优化合成的LIS基因序列为模板，使用LIS-F/LIS-R引物PCR扩增得到携带相应末端同源序列的LIS组装片段。PCR反应条件：97℃预变性5min，94℃变性60s，56℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

JMP-hyg-GPD通过SalI内切酶消化后，回收纯化。利用Gibson组装克隆试剂盒对JMP-hyg-GPD酶切片段和LIS组装片段进行组装，构建完成JMP-hyg-LIS质粒。通过NotI内切酶消化后，回收纯化浓缩整合片断。

7.2使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株LP1，步骤为：

(1)对得到的JMP-hyg-LIS质粒酶切后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将JMP-hyg-LIS质粒酶切片段转入工程菌株MP1中，最后涂布于YPDC平板中，倒置于30℃培养箱中。

(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-JMP-F：ACATCAGGTTACCCCAAGCC

Chrom-JMP-R：GGAAGAACACCGGTGTTGGA

测序进一步验证JMP-hyg-LIS质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用YJX培养基进行发酵，优化得到一株芳樟醇产量最高的重组子，将获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和LIS基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为LP1，其基因型为Po1f HMGR-ePTS1HMGS-ePTS1AtoB-ePTS1LIS。

7.3使用醋酸锂转化法构建得到工程菌株L1，步骤为：

(1)对得到的JMP-hyg-LIS质粒酶切后进行纯化回收，使用醋酸锂转化法将JMP-hyg-LIS质粒酶切片段转入工程菌株M1中，最后涂布于YPDC平板中，倒置于30℃培养箱中。

(2)待长出单菌落后，随机挑选重组子，利用下列引物进行PCR验证

Chrom-JMP-F：ACATCAGGTTACCCCAAGCC

Chrom-JMP-R：GGAAGAACACCGGTGTTGGA

测序进一步验证JMP-hyg-LIS质粒酶切片段是否整合到基因组上，对不同的阳性重组子利用YJX培养基进行发酵，优化得到一株芳樟醇产量最高的重组子，将获得含HMGR、HMGS、AtoB和LIS基因的解脂耶氏酵母工程菌命名为L1，其基因型为Po1f HMGR HMGS AtoBLIS。

实施例8工程菌株FP1和对照工程菌株F1生产α-法呢烯效率的比较

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)工程菌FP1和F1。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母FP1和F1分别划线接种于YPG固体平板，30℃培养30h。

将YPG固体平板上长出的FP1和F1菌落分别接入装有50ml的YPD液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：分别取1ml活化的培养液转接到装有50mL种子培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：分别取2mL活化的培养液转接到装有50mL发酵YPD培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖50g/L)和改良YJX培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L)的250mL三角瓶中，进行补料分批式发酵，30℃，220rpm好氧培养144h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值。

发酵144h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液10，000～12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的葡萄糖和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1mL发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6mL/min。

发酵液中的油酸采用气相色谱仪分析(GC)，检测前需要对发酵液中的油酸进行衍生化处理，使用1％硫酸-甲醇溶液酯化后，使用含有RTX-5色谱柱的气相色谱仪进行检测分析。

测定α-法呢烯含量的方法：在刚进行摇瓶发酵的时候添加10％的十二烷，发酵至120h，将摇瓶静置几分钟，取上层有机相进行气相检测α-法呢烯的含量，使用trans-β-farnesene(购自sigma-aldrich公司)标准品制作标准曲线。

本发明将甲羟戊酸合成途径的三个关键基因AtoB、HMGS和HMGR过表达并定位至解脂耶氏过氧化物酶体，再表达α-法呢烯合成酶，利用解脂耶氏酵母油酸代谢提高了α-法呢烯合成的产率。由图4可知，摇瓶发酵144h，工程菌株FP1利用油酸合成α-法呢烯的产量为79.1mg/L，产率为2.19mg/g油酸；工程菌株FP1利用葡萄糖合成α-法呢烯的产量为4.7mg/L，产率为0.08mg/g葡萄糖；工程菌株F1利用油酸合成α-法呢烯的产量为21.8mg/L，产率为0.54mg/g油酸；工程菌株F1利用葡萄糖合成α-法呢烯的产量为74.4mg/L，产率为0.95mg/g葡萄糖。证实解脂耶氏酵母中甲羟戊酸合成途径的过氧化物酶体定位能够提高α-法呢烯合成的产率。

实施例9工程菌株CP1和对照工程菌株C1生产β-胡萝卜素效率的比较

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)工程菌CP1和C1。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母CP1和C1分别划线接种于YPG固体平板，30℃培养30h。

将YPG固体平板上长出的CP1和C1菌落分别接入装有50ml的YPD液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：分别取1ml活化的培养液转接到装有50mL种子培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：分别取2mL活化的培养液转接到装有50mL发酵YPD培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖50g/L)和改良YJX培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L)的250mL三角瓶中，进行补料分批式发酵，30℃，220rpm好氧培养144h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值。

发酵144h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液10，000～12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的葡萄糖和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1mL发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6mL/min。

发酵液中的油酸采用气相色谱仪分析(GC)，检测前需要对发酵液中的油酸进行衍生化处理，使用1％硫酸-甲醇溶液酯化后，使用含有RTX-5色谱柱的气相色谱仪进行检测分析。

测定β-胡萝卜素含量的方法：通过离心收获培养的细胞，重悬于0.7mL二甲基亚砜中，并在加入等体积丙酮后于55℃温育15分钟，然后在45℃温育15分钟。然后将样品以12,000×g离心5分钟。使用Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪分析含有β-胡萝卜素的上清液，该色谱仪配备450nm波长可变波长检测器和Agilent ZORBAX Eclipase XDB-C18色谱柱，在30℃使用1.0mL/min甲醇、乙腈和二氯甲烷(42:42:16)作为流动相检测。

本发明将甲羟戊酸合成途径的三个关键基因AtoB、HMGS和HMGR过表达并定位至解脂耶氏过氧化物酶体，再表达八氢番茄红素脱氢酶和番茄红素环化酶，利用解脂耶氏酵母油酸代谢提高了β-胡萝卜素合成的产率。由图5可知，摇瓶发酵144h，工程菌株CP1利用油酸合成β-胡萝卜素的产量为65.7mg/L，产率为1.91mg/g油酸；工程菌株CP1利用葡萄糖合成β-胡萝卜素的产量为5.1mg/L，产率为0.10mg/g葡萄糖；工程菌株C1利用油酸合成β-胡萝卜素的产量为19.1mg/L，产率为0.56mg/g油酸；工程菌株C1利用葡萄糖合成β-胡萝卜素的产量为62.8mg/L，产率为0.91mg/g葡萄糖。证实解脂耶氏酵母中甲羟戊酸合成途径的过氧化物酶体定位能够提高β-胡萝卜素合成的产率。

实施例10工程菌株LP1和对照工程菌株L1生产芳樟醇效率的比较

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)工程菌LP1和L1。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母LP1和L1分别划线接种于YPG固体平板，30℃培养30h。

将YPG固体平板上长出的LP1和L1菌落分别接入装有50ml的YPD液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：分别取1ml活化的培养液转接到装有50mL种子培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：分别取2mL活化的培养液转接到装有50mL发酵YPD培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖50g/L)和改良YJX培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L)的250mL三角瓶中，进行补料分批式发酵，30℃，220rpm好氧培养144h，发酵过程中不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值。

发酵144h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液10，000～12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

发酵液中的葡萄糖和有机酸等代谢物采用高压液相色谱仪(HPLC)分析。具体方法为取1mL发酵液室温下12,000rpm离心2min，取上清，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，用高效液相色谱检测有机酸和葡萄糖浓度。检测条件为：色谱柱为HPX-87H(BioRad Labs,300mm×7.8mm)，检测器为示差折光检测器RID-10A，柱温为65℃，流动相为5mM H₂SO₄溶液，流速为0.6mL/min。

发酵液中的油酸采用气相色谱仪分析(GC)，检测前需要对发酵液中的油酸进行衍生化处理，使用1％硫酸-甲醇溶液酯化后，使用含有RTX-5色谱柱的气相色谱仪进行检测分析。

测定芳樟醇含量的方法：在刚进行摇瓶发酵的时候添加10％的十二烷，收集十二烷层并使用配备有C18柱(Phenomenex Kinetex 5μm C18)和UV检测器的Shimadzu LC-20A(Shimadzu Co.,Kyoto,Japan)通过HPLC分析。波长为210nm，流动相为45％乙腈水溶液，流速为1mL/min，柱温为40℃。目标芳樟醇峰出现在约4.5分钟。芳樟醇标准品(购自MacklinBiotech)用于定量。

本发明将甲羟戊酸合成途径的三个关键基因AtoB、HMGS和HMGR过表达并定位至解脂耶氏过氧化物酶体，再表达芳樟醇合成酶，利用解脂耶氏酵母油酸代谢提高了芳樟醇合成的产率。由图6可知，摇瓶发酵144h，工程菌株LP1利用油酸合成芳樟醇的产量为5.5mg/L，产率为0.43mg/g油酸；工程菌株LP1利用葡萄糖合成芳樟醇的产量为0.6mg/L，产率为0.05mg/g葡萄糖；工程菌株L1利用油酸合成芳樟醇的产量为1.9mg/L，产率为0.15mg/g油酸；工程菌株L1利用葡萄糖合成芳樟醇的产量为5.4mg/L，产率为0.22mg/g葡萄糖。证实解脂耶氏酵母中甲羟戊酸合成途径的过氧化物酶体定位能够提高芳樟醇合成的产率。

实施例11分别以油酸、三油酸甘油酯、大豆油和棕榈油作为碳源利用工程菌株FP1、CP1和LP1合成萜类化合物

工程菌株：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)工程菌FP1、CP1和LP1。

冷冻甘油管保存的解脂耶氏酵母工程菌株FP1、CP1和LP1划线接种于YPG固体平板，30℃培养30h。

将YPG固体平板上长出的FP1、CP1和LP1单菌落分别接入装有50mL的YPO液体培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸20g/L，吐温80 0.4g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm转速振荡培养活化。

种子培养：取1mL活化的培养液转接到装有50mL种子培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸20g/L，吐温80 0.4g/L)的250mL三角瓶中，30℃，220rpm好氧培养24h。

发酵培养：取2mL活化的培养液转接到装有50mL改良YJX培养基(蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，油酸/三油酸甘油酯/大豆油/棕榈油42g/L，吐温80 0.84g/L)的250mL三角瓶中，30℃，在220rpm条件下好氧培养120h，发酵过程中不外源添加酸碱剂。

发酵120h取样，然后再600nm波长下检测菌液的光吸收值。即取1mL菌液10，000～12，000rpm转速离心2min。弃去上清，用等体积的H₂O重悬，稀释至合适倍数后使用分光光度计检测其光吸收值。

测定α-法呢烯含量的方法：在刚进行摇瓶发酵的时候添加10％的十二烷，发酵至120h，将摇瓶静置几分钟，取上层有机相进行气相检测α-法呢烯的含量，使用trans-β-farnesene(购自sigma-aldrich公司)标准品制作标准曲线。

测定β-胡萝卜素含量的方法：通过离心收获培养的细胞，重悬于0.7mL二甲基亚砜中，并在加入等体积丙酮后于55℃温育15分钟，然后在45℃温育15分钟。然后将样品以12,000×g离心5分钟。使用Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪分析含有β-胡萝卜素的上清液，该色谱仪配备450nm波长可变波长检测器和Agilent ZORBAX Eclipase XDB-C18色谱柱，在30℃使用1.0mL/min甲醇、乙腈和二氯甲烷(42:42:16)作为流动相检测。

测定芳樟醇含量的方法：在刚进行摇瓶发酵的时候添加10％的十二烷，收集十二烷层并使用配备有C18柱(Phenomenex Kinetex 5μm C18)和UV检测器的Shimadzu LC-20A(Shimadzu Co.,Kyoto,Japan)通过HPLC分析。波长为210nm，流动相为45％乙腈水溶液，流速为1mL/min，柱温为40℃。目标芳樟醇峰出现在约4.5分钟。芳樟醇标准品(购自MacklinBiotech)用于定量。

为探究不同种类脂肪酸或油脂作为碳源时对工程菌株FP1、CP1和LP1合成萜类化合物的影响，本发明分别选用了油酸、三油酸甘油酯、大豆油、棕榈油作为碳源作为对比发酵生产萜类化合物。由图7可知，工程菌株FP1均可高效利用不同种类脂肪酸或油脂生产α-法呢烯，摇瓶发酵120h，利用油酸生产甲羟戊酸的产量为80.3mg/L，利用三油酸甘油酯生产α-法呢烯的产量为89.1mg/L，利用大豆油生产α-法呢烯的产量为81.3mg/L，利用棕榈油生产α-法呢烯的产量为88.0mg/L。工程菌株CP1均可高效利用不同种类脂肪酸或油脂生产β-胡萝卜素，摇瓶发酵120h，利用油酸生产β-胡萝卜素的产量为64.9mg/L，利用三油酸甘油酯生产β-胡萝卜素的产量为72.3mg/L，利用大豆油生产β-胡萝卜素的产量为65.3mg/L，利用棕榈油生产β-胡萝卜素的产量为71.8mg/L。摇瓶发酵120h，工程菌株LP1利用油酸生产芳樟醇的产量为5.5mg/L，利用三油酸甘油酯生产芳樟醇的产量为5.9mg/L，利用大豆油生产芳樟醇的产量为5.4mg/L，利用棕榈油生产芳樟醇的产量为5.8mg/L。因为三油酸甘油酯水解产生甘油和油酸，培养基中的少量甘油对菌株的生长代谢有促进作用，与利用油酸作为碳源相比，工程菌株FP1、CP1和LP1利用三油酸甘油酯比利用油酸更加有利于萜类化合物的生产。

　　　序列表

　　　<110>山东大学

　　　<120>一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法

　　　<141>2019-4-29

　　　<160>7

　　　<210>1

　　　<211>1308

　　　<212>DNA

　　　<213>HMGR-ePTS1

　　　<400>1

atgtctaccg acgccaagaa ctctcgaatt tctggtttcc acaaggacga catccccacc 60

cgactggccc gagtcgccgc tttcgccggt ctggacgacg agaccgtgca gcacctggcc 120

aacatgggta acctggaccc ccagctggcc gaccgactga ttgagaacgt ggtggccacc 180

ctgaacgtcc ccattggcat cgccaccaac atgaaggtcg acggtgagga cgtgctggtc 240

cccatggcca ccgaggagtc ctccgtcgtg gccgctgtgt gcaacgccgc ccgacagtgt 300

tacgaccagg gcggtttcac cacctctatg tccggttccc tgatgattgc ccaggtccag 360

ctggtcgacg tccccgacgc cgctcacgct cgaatgcgaa ttctggagca caaggccgag 420

gtcaaggccc tgtgcgacga ctgtgacccc ctgctggtca agctgggtgg tggtctgcag 480

gacgtggagg tccgaatcgt cgacgccgcc ggtggtccca tggtggtcac ccacctgatc 540

gtggacaccc gagacgccat gggtgccaac gccgtcaact ccatggccga gaagctggcc 600

ccccacatcg agtcctggac cggcggtcga gtgtacctgc gaatcctgtc caacctggcc 660

gaccgacgac tggcccgagc ccgagctgtc tggacctgtg acgccatcgg tggcgcctct 720

gtgcgagacg gtattatctc cgcctaccga ttcgccgccg ccgaccctta ccgagccgct 780

actcacaaca agggtattat gaacggcgtg tccgccgtgg tgctggccac cggtaacgac 840

acccgagccg tggaggccgg cgctcatgct tacgccgccc gaaagggttg gtactcctct 900

ctgaccgact gggaggtcac cgccgagggc cacctggctg gaaccctgga gatgcccatg 960

gccgtgggtc tggtgggcgg tgctaccaag ctgcacccca ccgcccgagc ctgcctgaag 1020

atcctgggcg tgtccaccgc cgagcgactg gctcgactga tcgccgccgt cggcctggct 1080

cagaacttct ctgccctgaa ggccctggcc accaccggca ttcagaaggg tcacatgtcc 1140

ctgcacgccc agaacatcgc catgatggcc ggtgccgtgg gtgacgagat cgagcccgtc 1200

gccaaggccc tggtcgccca gggtgctgtc cgagtggacg tcgccgaggc cgagctggct 1260

cgactccgag gtcagggcct gggccgagga cgacgatcca agctgtaa 1308

　　　<210>2

　　　<211>1368

　　　<212>DNA

　　　<213>HMGS-ePTS1

　　　<400>2

atgtcgcaac cccagaacgt tggaatcaaa gccctcgaga tctacgtgcc ttctcgaatt 60

gtcaaccagg ctgagctcga gaagcacgac ggtgtcgctg ctggcaagta caccattggt 120

cttggtcaga ccaacatggc ctttgtcgac gacagagagg acatctattc ctttgccctg 180

accgccgtct ctcgactgct caagaacaac aacatcgacc ctgcatctat tggtcgaatc 240

gaggttggta ctgaaaccct tctggacaag tccaagtccg tcaagtctgt gctcatgcag 300

ctctttggcg agaacagcaa cattgagggt gtggacaacg tcaacgcctg ctacggagga 360

accaacgccc tgttcaacgc tatcaactgg gttgagggtc gatcttggga cggccgaaac 420

gccatcgtcg ttgccggtga cattgccctc tacgcaaagg gcgctgcccg acccaccgga 480

ggtgccggct gtgttgccat gctcattggc cccgacgctc ccctggttct tgacaacgtc 540

cacggatctt acttcgagca tgcctacgat ttctacaagc ctgatctgac ctccgagtac 600

ccctatgttg atggccacta ctccctgacc tgttacacaa aggccctcga caaggcctac 660

gctgcctaca acgcccgagc cgagaaggtc ggtctgttca aggactccga caagaagggt 720

gctgaccgat ttgactactc tgccttccac gtgcccacct gcaagcttgt caccaagtct 780

tacgctcgac ttctctacaa cgactacctc aacgacaaga gcctgtacga gggccaggtc 840

cccgaggagg ttgctgccgt ctcctacgat gcctctctca ccgacaagac cgtcgagaag 900

accttccttg gtattgccaa ggctcagtcc gccgagcgaa tggctccttc tctccaggga 960

cccaccaaca ccggtaacat gtacaccgcc tctgtgtacg cttctctcat ctctctgctg 1020

acttttgtcc ccgctgagca gctgcagggc aagcgaatct ctctcttctc ttacggatct 1080

ggtcttgctt ccactctttt ctctctgacc gtcaagggag acatttctcc catcgtcaag 1140

gcctgcgact tcaaggctaa gctcgatgac cgatccaccg agactcccgt cgactacgag 1200

gctgccaccg atctccgaga gaaggcccac ctcaagaaga actttgagcc ccagggagac 1260

atcaagcaca tcaagtctgg cgtctactac ctcaccaaca tcgatgacat gttccgacga 1320

aagtacgaga tcaagcagct gggccgagga cgacgatcca agctgtaa 1368

　　　<210>3

　　　<211>1212

　　　<212>DNA

　　　<213>AtoB-ePTS1

　　　<400>3

atgaagaact gtgtcatcgt gtccgccgtg cgaaccgcca tcggctcctt caacggttct 60

ctggcctcca cctccgccat tgacctgggc gccaccgtca ttaaggccgc catcgagcga 120

gccaagatcg actcccagca cgtggacgag gtcattatgg gtaacgtcct gcaggccggc 180

ctgggtcaga accccgctcg acaggccctg ctgaagtccg gcctggccga gaccgtctgt 240

ggtttcaccg tgaacaaggt gtgcggctcc ggtctgaagt ccgtcgccct ggccgcccag 300

gctatccagg ctggacaggc ccagtccatc gtggccggcg gaatggagaa catgtccctg 360

gccccctacc tgctggacgc caaggcccga tccggctacc gactgggcga cggtcaggtg 420

tacgacgtga ttctgcgaga cggtctgatg tgtgccaccc acggttacca catgggcatc 480

accgccgaga acgtcgccaa ggagtacggt atcacccgag agatgcagga cgagctggcc 540

ctgcactccc agcgaaaggc cgccgctgcc atcgagtccg gtgccttcac cgccgagatt 600

gtccccgtca acgtcgtgac ccgaaagaag accttcgtct tctcccagga cgagttcccc 660

aaggccaact ctaccgccga ggccctgggc gctctgcgac ctgctttcga caaggccggt 720

accgtgaccg ccggtaacgc ctccggtatt aacgacggcg ccgccgccct ggtcattatg 780

gaggagtccg ccgccctggc cgctggtctt acccctctgg cccgaatcaa gtcttacgcc 840

tctggtggcg tgccccccgc ccttatgggc atgggtcccg tgcccgccac ccagaaggcc 900

cttcagctgg ccggtctgca gctggccgac attgacctga tcgaggccaa cgaggccttc 960

gccgcccagt tcctggccgt cggaaagaac ctgggtttcg actctgagaa ggtcaacgtg 1020

aacggcggtg ccatcgccct gggccaccct atcggcgctt ccggagcccg aatcctggtc 1080

accctgctgc acgccatgca ggcccgagac aagaccctgg gcctggccac cctgtgtatt 1140

ggtggcggcc agggtattgc catggtcatt gagcgactga acctgggccg aggacgacga 1200

tccaagctgt aa 1212

　　　<210>4

　　　<211>1731

　　　<212>DNA

　　　<213>α-FS

　　　<400>4

atggaattcc gagtgcacct ccaggccgac aacgagcaga agattttcca gaaccagatg 60

aagcccgagc ctgaggcctc ttacctgatc aaccagcgac gatctgccaa ctacaagccc 120

aacatctgga agaacgactt tctggaccag tctctgatct ctaagtacga cggcgacgag 180

taccgaaagc tgtctgagaa gctgatcgag gaagtgaaga tctacatctc tgccgagact 240

atggacctgg tggccaagct ggaactgatc gactctgtgc gaaagctggg cctcgccaac 300

ctgttcgaga aggaaatcaa ggaagccctg gactctatcg ccgccatcga gtctgacaac 360

ctgggcaccc gagatgacct gtacggcacc gctctgcact tcaagatcct gcgacagcac 420

ggctacaagg tgtctcagga catcttcggc cgattcatgg acgagaaggg caccctcgag 480

aaccaccact tcgcccacct gaagggcatg ctcgagctgt tcgaggcctc caacctggga 540

tttgaaggcg aggacatcct ggacgaggcc aaggcctctc tgaccctggc tctgcgagac 600

tctggccaca tctgctaccc cgactctaac ctgtcgcgag atgtggtgca ctctctcgag 660

ctgccttctc accgacgagt gcagtggttc gacgtgaagt ggcagatcaa cgcctacgag 720

aaggacatct gccgagtgaa cgctaccctc ctcgagctgg ctaagctgaa cttcaacgtg 780

gtgcaggctc agctgcagaa gaacctgcga gaggcttctc gatggtgggc taacctgggc 840

ttcgccgaca acctgaagtt cgcccgagat cgactggtcg agtgcttctc ttgcgccgtg 900

ggcgtcgcct tcgagcccga gcactcttct ttccgaatct gcctgaccaa ggtgatcaac 960

ctggtgctga tcatcgacga cgtgtacgac atctacggct ctgaggaaga actgaagcac 1020

ttcaccaacg ccgtggaccg atgggactcc cgagagactg agcagctgcc cgagtgcatg 1080

aagatgtgct tccaggtgct gtacaacacc acctgtgaga ttgcccgaga gatcgaagag 1140

gaaaacggct ggaaccaggt tctgccccag ctcaccaagg tgtgggccga cttctgcaag 1200

gccctgctgg tcgaggccga gtggtacaac aagtctcaca tccccactct ggaagagtac 1260

ctgcgaaacg gctgtatctc ttcttctgtg tctgtgctgc tggtccactc tttcttctcg 1320

atcacccacg agggcaccaa ggaaatggct gacttcctgc acaagaacga ggacctgctc 1380

tacaacatct ctctgatcgt gcgactgaac aacgacctgg gaacctctgc cgccgagcaa 1440

gagcgaggcg actctccctc ttctatcgtg tgctacatgc gagaggtgaa cgcctccgag 1500

gaaaccgctc gaaagaacat caagggaatg atcgacaacg cctggaagaa ggtgaacggc 1560

aagtgtttca ctaccaacca ggtgcctttc ctgtcctctt tcatgaacaa cgccaccaac 1620

atggcccgag tggcccactc tctgtacaag gacggtgacg gcttcggcga ccaagagaag 1680

ggaccccgaa ctcacatcct gtctctgctg ttccagcctc tggtgaacta a 1731

　　　<210>5

　　　<211>1845

　　　<212>DNA

　　　<213>carRP

　　　<400>5

atgctgctga cctacatgga ggtccacctg tactacaccc tgcccgtcct gggcgtcctg 60

tcttggctgt cccgacccta ctacaccgcc accgacgccc tgaagttcaa gttcctgacc 120

ctggtggcct tcaccaccgc ctccgcttgg gacaactaca ttgtctacca caaggcctgg 180

tcctactgcc ccacctgcgt gaccgccgtc attggttacg tgcccctgga ggagtacatg 240

ttcttcatca ttatgaccct gctgaccgtg gccttcacta acctggtcat gcgatggcac 300

ctgcactctt tcttcatccg acccgagacc cccgtgatgc agtctgtcct ggtgcgactg 360

gtccccatca ccgccctgct gatcaccgcc tacaaggcct ggcacctggc cgtccctggt 420

aaacccctgt tctacggctc ttgcattctg tggtacgcct gccccgtgct ggcccttctg 480

tggttcggcg ctggcgagta catgatgcga cgacccctgg ccgtcctggt gtctattgcc 540

ctgcccaccc tgttcctgtg ctgggtcgac gtggtcgcca ttggcgccgg aacctgggac 600

atctccctgg ctacctccac cggcaagttc gtggtgcccc acctgcccgt ggaggagttc 660

atgttcttcg ccctgatcaa caccgtgctg gtgttcggta cctgcgccat cgaccgaacc 720

atggccattc tgcacctgtt caagaacaag tccccctacc agcgacccta ccagcactct 780

aagtccttcc tgcaccagat cctggagatg acctgggcct tctgtctgcc cgaccaggtc 840

ctgcactctg acaccttcca cgacctgtcc gtctcttggg acatcctgcg aaaggcctcc 900

aagtctttct acaccgcctc tgccgtcttc cccggcgacg ttcgacagga gctgggtgtc 960

ctgtacgcct tctgccgagc caccgacgac ctgtgcgaca acgagcaggt gcccgtccag 1020

acccgaaagg agcagctgat cctgacccac cagttcgtct ccgacctgtt cggccagaag 1080

acctccgccc ccaccgctat tgactgggac ttctacaacg accagctgcc cgcctcctgc 1140

atttccgcct tcaagtcctt cacccgactg cgacacgtcc tggaggccgg agctattaag 1200

gagctgctgg acggttacaa gtgggacctg gagcgacgat ccattcgaga ccaggaggac 1260

ctgcgatact actccgcctg cgtggcctcc tctgtcggcg agatgtgcac ccgaatcatt 1320

ctggcccacg ccgacaagcc cgcctcccga cagcagactc agtggatcat ccagcgagcc 1380

cgagagatgg gtctggtcct gcagtacacc aacatcgccc gagacattgt caccgactcc 1440

gaggagctgg gccgatgtta cctgccccag gactggctga ccgagaagga ggtggccctg 1500

atccagggcg gtctggctcg agagattggc gaggagcgac tgctgtctct gtctcaccga 1560

ctgatctacc aggccgacga gctgatggtc gtcgccaaca agggcattga caagctgccc 1620

tcccactgcc agggtggcgt gcgagctgct tgcaacgtct acgcctccat cggcaccaag 1680

ctgaagtcct acaagcacca ctacccctcc cgagcccacg tgggaaactc taagcgagtg 1740

gagatcgccc tgctgtctgt ctacaacctg tacaccgccc ccattgccac ctcttccacc 1800

acccactgtc gacagggtaa aatgcgaaac ctgaacacca tctaa 1845

　　　<210>6

　　　<211>1740

　　　<212>DNA

　　　<213>carB

　　　<400>6

atgtccaaga agcacattgt gatcattggc gccggtgtcg gcggcaccgc tactgctgct 60

cgactggctc gagagggctt caaggtgacc gtggtggaga agaacgactt cggtggtggt 120

cgatgctctc tgattcacca ccagggccac cgattcgacc agggcccttc cctgtacctg 180

atgcccaagt acttcgagga cgccttcgcc gacctggacg agcgaattca ggaccacctg 240

gagctgctgc gatgcgacaa caactacaag gtccacttcg acgacggtga gtccattcag 300

ctgtcctctg acctgacccg aatgaaggcc gagctggacc gagtcgaggg ccctcttggc 360

ttcggccgat tcctggactt catgaaggag acccacatcc actacgagtc cggtaccctg 420

atcgccctga agaagaactt cgagtctatc tgggacctga tccgaatcaa gtacgccccc 480

gagattttcc gactgcacct gttcggcaag atctacgacc gagcctccaa gtacttcaag 540

accaagaaga tgcgaatggc cttcaccttc cagaccatgt acatgggtat gtctccctac 600

gacgcccccg ccgtctactc tctgctgcag tacaccgagt tcgccgaggg catctggtac 660

ccccgaggtg gtttcaacat ggtggtccag aagctggagg ccatcgccaa gcagaagtac 720

gacgccgagt tcatctataa cgcccccgtc gccaagatca acaccgacga cgccaccaag 780

caggtcaccg gtgtcaccct ggagaacggt cacattatcg acgccgacgc cgtcgtctgc 840

aacgccgatc tggtctacgc ctaccacaac ctgctgcccc cctgtcgatg gacccagaac 900

accctggcct ccaagaagct gacctcctcc tccatctctt tctactggtc catgtccacc 960

aaggtccccc agctggacgt ccacaacatt ttcctggccg aggcctacca ggagtccttc 1020

gacgagatct tcaaggactt cggtctgccc tccgaggcct ccttctacgt caacgtcccc 1080

tctcgaatcg acccctccgc cgctcctgac ggaaaggact ctgtcatcgt cctggtgccc 1140

attggccaca tgaagtctaa gaccggtgac gcctctaccg agaactaccc cgccatggtc 1200

gacaaggccc gaaagatggt cctggccgtg attgagcgac gactgggcat gtccaacttc 1260

gccgacctca tcgagcacga gcaggtcaac gaccccgccg tgtggcagtc caagttcaac 1320

ctgtggcgag gttctattct gggtctgtct cacgacgtcc tgcaggtgct gtggttccga 1380

ccctccacca aggactccac cggccgatac gacaacctgt tcttcgtggg cgcctccacc 1440

caccccggta ctggtgttcc catcgtcctg gccggctcca agctgacctc tgaccaggtg 1500

gtcaagtctt tcggtaaaac ccccaagccc cgaaagatcg agatggagaa cacccaggcc 1560

cccctggagg agcctgacgc tgagtctacc ttccccgtct ggttctggct gcgagccgcc 1620

ttctgggtca tgttcatgtt cttctacttc ttcccccagt ctaacggtca gacccccgcc 1680

tctttcatca acaacctgct gcctgaggtg ttccgagtcc acaactctaa cgtcatctaa 1740

　　　<210>7

　　　<211>1725

　　　<212>DNA

　　　<213>LIS

　　　<400>7

atggcctctt tcaaccgatt ctgcgtgtcc tctctgctgg ctcccaacaa ctctccccag 60

atctctaacg ctccccgatc taccgctgtg ccctctatgc ccaccactca gaagtggtct 120

atcaccgagg acctggcctt catctctaac ccctctaagc agcacaacca ccagaccggc 180

taccgaatct tctctgacga gttctacctg aagcacgaga acaagctgaa ggacgtgcga 240

cgagccctgc gagaggtgga agagactccc ctggaaggcc tggtgatgat cgacaccctg 300

cagcgactgg gcatcgacta ccacttccag ggcgagatcg gcgccctgct gcagaagcag 360

cagcgaatct ctacctgcga ctaccccgag cacgacctgt tcgaggtgtc tacccgattc 420

cgactgctgc gacaagaggg ccacaacgtg cccgccgacg tgttcaacaa cttccgagac 480

aaggaaggcc gattcaagtc tgagctgtcc cgagacatcc gaggactgat gtctctgtac 540

gaggcctctc agctgtctat ccaaggcgag gacatcctgg accaggccgc cgacttctcg 600

tcccagctgc tgtctggctg ggccaccaac ctggaccacc accaggctcg actggtgcga 660

aacgccctga ctcaccccta ccacaagtct ctggccacct tcatggcccg aaacttcaac 720

tacgactgca agggccagaa cggctgggtg aacaacctgc aagagctggc caagatggac 780

ctgaccatgg tgcagtctat gcaccaaaag gaagtgctgc aggtttctca gtggtggaag 840

ggacgaggcc tggccaacga gctgaagctg gtccgaaacc agcctctgaa gtggtacatg 900

tggcccatgg ccgctctgac tgaccctcga ttctctgagg aacgagtcga gctgaccaag 960

cctatctctt tcatctacat catcgacgac atcttcgacg tgtacggcac cctggaagaa 1020

ctgaccctgt tcaccgacgc cgtgaaccga tgggagctga ccgccgtcga gcagctgcct 1080

gactacatga agatctgctt caaggccctg tacgacatca ccaacgagat cgcctacaag 1140

atctacaaga agcacggacg aaaccccatc gactccctgc gacgaacctg ggcctctctg 1200

tgcaacgcct tcctggaaga ggccaagtgg ttcgcctctg gcaacctgcc taaggccgag 1260

gaatacctga agaacggaat catctcttct ggcatgcacg tggtgaccgt gcacatgttc 1320

tttctgctcg gcggctgctt caccgaagag tctgtgaacc tggtggacga gcacgccggc 1380

atcacctctt ctatcgccac catcctgcga ctgtctgacg acctgggctc tgctaaggac 1440

gaggaccagg acggctacga cggctcttac ctggaatgtt acctgaagga ccacaagggc 1500

tcctctgtcg agaacgcccg agaagaggtc atccgaatga tctctgacgc ctggaagcga 1560

ctgaacgagg aatgtctgtt ccccaaccct ttctctgcta ccttccgaaa gggctctctg 1620

aacattgccc gaatggtgcc cctgatgtac tcctacgacg acaaccacaa cttgcccatc 1680

cttgaggaac acatgaagac tatgctgtac gactcttctt cctga 1725

Claims (9)

1.一种利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：在解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径的关键酶乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶超表达并定位至过氧化物酶体，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1和AtoB-ePTS1基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为MP1；其中涉及的ePTS1为在蛋白质中添加的具有将蛋白质定位至过氧化物酶体内的功能的过氧化物酶体定位信号，命名为ePTS1，其氨基酸序列为LGRGRRSKL；在工程菌株MP1的基础上，表达α-法呢烯合成途径，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和α-FS基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为FP1；或者在工程菌株MP1的基础上，表达β-胡萝卜素合成途径，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1、carB和carRP基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为CP1；或者在工程菌株MP1的基础上，表达芳樟醇合成途径，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和LIS基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为LP1；使获得的解脂耶氏酵母工程菌株FP1、CP1或LP1能够利用含脂肪酸或油脂的培养基在好氧条件下合成萜类化合物；

其中， HMGR为来源于博代氏杆菌（Bordetella petrii）的HMG-CoA还原酶，HMGS为来源于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的HMG-CoA合成酶，AtoB是来源于大肠杆菌（Escherichia coli）的乙酰辅酶A硫解酶；α-FS为来源于苹果（Malus x domestica）的α-法呢烯合成酶；carB为来源于圆形根茎（Rhizomucor circinelloides）的八氢番茄红素脱氢酶，carRP为来源于圆形根茎（Rhizomucor circinelloides）的番茄红素环化酶；LIS为来源于猕猴桃（Actinidia arguta）的芳樟醇合成酶；

其中，所述利用含脂肪酸或油脂的培养基在好氧条件下合成萜类化合物的方法和条件是：将解脂耶氏酵母工程菌株FP1、CP1或LP1在培养温度为30±1℃，摇瓶培养转速120~220rpm，培养96~240h；所述含脂肪酸或油脂的培养基命名为改良YJX培养基，其配方是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，脂肪酸或油脂20~60g/L，吐温80 0.4~1.5g/L，余量为水，其中配方中所述脂肪酸或油脂选自油酸、三油酸甘油酯、棕榈油或大豆油；培养过程中，每隔12或24h取样，检测萜类化合物的含量；所述萜类化合物是α-法呢烯、β-胡萝卜素或芳樟醇。

2.根据权利要求1所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：在解脂耶氏酵母中将甲羟戊酸合成途径的关键酶乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶和HMG-CoA还原酶超表达并定位至过氧化物酶体，获得含HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1和AtoB-ePTS1基因的解脂耶氏酵母工程菌，并使该工程菌能够利用改良YJX培养基在好氧条件下生产甲羟戊酸的步骤是：

（1）以表达载体pKi-1构建pKi1-HMGR-ePTS1质粒，以表达载体pKi-2构建pKi2-HMGS-ePTS1-AtoB-ePTS1质粒，以解脂耶氏酵母Po1f菌株为出发菌，构建过表达添加增强型过氧化物酶体定位信号ePTS1的HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1和AtoB-ePTS1基因的解脂耶氏酵母工程菌，该菌株命名为MP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1 HMGS-ePTS1 AtoB-ePTS1；其中所述增强型过氧化物酶体定位信号ePTS1为蛋白质羧基端的LGRGRRSKL九个氨基酸序列；

（2）将工程菌株MP1在培养温度为30±1℃，摇瓶培养转速120~220rpm条件下，利用改良YJX培养基培养120~200h，获得含甲羟戊酸的培养液，取样检测甲羟戊酸的含量。

3.根据权利要求2所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：将工程菌株MP1在培养温度为30℃，摇瓶培养转速220rpm条件下，利用改良YJX培养基培养144h，获得含甲羟戊酸的培养液；其中所述改良YJX培养基配方是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L，余量为水。

4.根据权利要求1所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：所述在工程菌株MP1的基础上，表达α-法呢烯合成酶，获得相关工程菌的方法是：

以表达载体JMP-hyg-GPD构建JMP-hyg-α-FS质粒，以解脂耶氏酵母工程菌株MP1为出发菌株，构建过表达HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和α-FS基因的工程菌，该菌株命名为FP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1 HMGS-ePTS1 AtoB-ePTS1 α-FS。

5.根据权利要求1所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：在工程菌株MP1基础上，表达八氢番茄红素脱氢酶和番茄红素环化酶，获得相关工程菌的方法是：

以表达载体JMP-hyg-GPD构建JMP-hyg-carRP-carB质粒，以解脂耶氏酵母工程菌株MP1为出发菌株，构建过表达HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1、carB和carRP基因的工程菌，该菌株命名为CP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1 HMGS-ePTS1 AtoB-ePTS1 carBcarRP。

6.根据权利要求1所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：在工程菌株MP1基础上，表达芳樟醇合成酶，获得相关工程菌的方法是：

以表达载体JMP-hyg-GPD构建JMP-hyg-LIS质粒，以解脂耶氏酵母工程菌株MP1为出发菌株，构建过表达HMGR-ePTS1、HMGS-ePTS1、AtoB-ePTS1和LIS基因的工程菌，该菌株命名为LP1，其基因型是Po1f HMGR-ePTS1 HMGS-ePTS1 AtoB-ePTS1 LIS。

7.根据权利要求1所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：所述利用含脂肪酸或油脂的培养基在好氧条件下合成萜类化合物的培养条件是：将解脂耶氏酵母工程菌株FP1、CP1或LP1在培养温度为30℃，摇瓶转速220 rpm条件下，利用改良YJX培养基培养144 h，获得含萜类化合物的培养液，取样检测萜类化合物的含量。

8.根据权利要求1所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：所述改良YJX培养基的配方是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，油酸、三油酸甘油酯、棕榈油或大豆油30~50g/L，吐温80 0.8~1.0g/L，余量为水。

9.根据权利要求8所述利用解脂耶氏酵母途径定位合成萜类化合物的方法，其特征是：所述改良YJX培养基的配方是：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，油酸42g/L，吐温80 0.84g/L，余量为水。

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