CN112626103B - 一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母工程菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母工程菌及其构建与应用。本发明首先提供一种基因在柠檬烯生产中的应用，所述基因具体为YALI0F19492p，Genbank编号为2907674，所述YALI0F19492p基因对柠檬烯的生产具有显著的调控作用。本发明提供一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述菌株是在解脂耶氏酵母宿主细胞中过表达YALI0F19492p基因并表达柠檬烯合酶所得，发酵生产柠檬烯产量提高8倍左右，提高产量的同时为柠檬烯生产菌株的研究提供思路。

Description

一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母工程菌及应用
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母工程菌及其构建与应用。
背景技术：
解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是一种具有典型代表性的非常规酵母。该酵母无致病性，最高生长温度一般在34℃以下，并且已经被认定为(generally regarded assafe,GRAS)安全级微生物。与酿酒酵母不同，该酵母为严格好氧菌，并具有二型性生长的特点，碳源、氮源、pH等生长条件都会影响该菌的菌落形态，因此它成为了研究酵母及真菌菌丝分化的模式菌株。该酵母的另外一个显著优点是它广泛存在于各类食物和各种生存环境中，这是因为其可以利用的碳源类型极为广泛，包括有机酸、烷烃、烯烃、油类、醇类、酯类等。此外，解脂耶氏酵母在其代谢过程中能够产生和分泌多种代谢产物，包括蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、赖氨酸、γ-癸内酯、柠檬酸、异柠檬酸和α-酮戊二酸等。由于解脂耶氏酵母具有以上这些生理、代谢特征和独特优势，因此它也成为了生物化学品等各种产品生产的潜在微生物细胞工厂。
早期的研究工作主要是利用解脂耶氏酵母发酵生产各种代谢产物。随着分子生物学的发展，解脂耶氏酵母的全基因组测序工作已经完成，基因表达载体和遗传转化方法也相继建立并不断发展完善。这些都为新型酵母表达系统—解脂耶氏酵母表达系统的开发奠定了良好基础。利用代谢工程和合成生物学技术对解脂耶氏酵母进行改造来改进自身代谢产物的生产以及合成新的目标产物，已成为目前的一个研究热点。
柠檬烯是一种植物来源的天然活性化合物，具有很高的市场价值。柠檬烯属于单环单萜类化合物，化学式为C10H16，有左旋体(L型)、右旋体(D型)和外消旋体三种异构体。D-柠檬烯有类似柠檬或甜橙的悦人香味，并且已经被认定为(generally regarded as safe,GRAS)一般认为安全化合物，因此作为优质香精香料被广泛应用于食品、饮料、化妆品、化学和医药工业中；L-柠檬烯则有类似松油和松脂的气味，也具有芳香添加用途。D-柠檬烯还是一种天然、绿色、环保的工业清洗剂，被广泛应用于印刷、机械、航空、电子和电器工业部件的清洗。在农业上，D-柠檬烯还作农作物被用的生物杀虫剂。L-柠檬烯和D-柠檬烯还是极具潜力的新型生物燃料和生物材料。此外，以L-柠檬烯和D-柠檬烯作为前体物，可以转化合成多种具有高附加值的工业产品。最新的研究表明L-柠檬烯和D-柠檬烯都有很好的药用价值，例如D-柠檬烯具有抑菌抗菌活性，可以作为良好的天然抗菌活性物质；D-柠檬烯还具有抗癌活性、促进消化和减肥作用。利用解脂耶氏酵母生成这些植物来源的天然产物具有独特优势，也引起了越来越多研究者的关注，但是，产量并不高，难以实现工业化。
转录组学(transcriptomic)是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科，也就是说，转录组学是从RNA水平来研究基因的表达情况。转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。新一代测序技术和转录分析的最新进展在代谢工程和宿主工程中起着相当重要的作用。这些技术的应用为发现和分析关键赋耐受性基因和转运基因提供了便利。当微生物细胞暴露于外源胁迫或被改造成生产生物燃料时，内源性转运蛋白或赋予耐受性的基因被激活，以缓解细胞毒性和出口有毒化合物。因此，可以通过转录组分析来挖掘工程菌株内源赋予耐受性的基因和转运基因。然而，在基因组序列比对中表现出高差异表达的候选基因不一定提高耐受性，耐受性的增加不一定伴随着产量的增加，因此，大多数候选基因在提高耐受性和产量方面的作用还有待进一步研究。本研究主要是通过利用转录组学的手段对影响解脂耶氏酵母中柠檬烯生产的相关基因进行筛选，以提高菌株对柠檬烯的耐受性，进而进一步的提高产量。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种基因在柠檬烯生产中的应用，所述基因具体为YALI0F19492p，Genbank编号为2907674；
在外源添加1000mg/L柠檬烯进行胁迫培养时，YALI0F19492p过表达菌株与野生型菌株相比，延滞期明显缩短；并且，当YALI0F19492p与柠檬烯合酶基因(dLS)在解脂耶氏酵母中共表达时，以仅表达dLS基因的菌株作为对照，柠檬烯的产量明显提升；此外，当在解脂耶氏酵母中敲除YALI0F19492p基因时，柠檬烯的产量降低了1.8倍。可见，所述YALI0F19492p基因对柠檬烯的生产具有显著的调控作用。
本发明提供一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，所述菌株是在解脂耶氏酵母宿主细胞中过表达YALI0F19492p基因并表达柠檬烯合酶所得；
优选地，所述宿主可以是Y.lipolytica Po1g、Y.lipolytica Po1f、Y.lipolyticaCLIB122或Y.lipolytica Po1d等；
更优选地，所述宿主为解脂耶氏酵母Po1g△KU70；
优选地，所述过表达采用的载体为pYLEX1质粒；
优选地，所述柠檬烯合酶的编码基因GenBank ID:AF514289；
本发明还提供上述基因工程菌在生产柠檬烯中的应用；
具体地，采用上述基因工程菌发酵生产柠檬烯的方法为：
将种子液按OD600为0.01-4接种至含6％-12％正十二烷的YPD培养基中，在温度15℃-30℃、pH3-10、转速100-250r/min条件下发酵4-6d。
有益效果：
本发明筛选的YALI0F19492p基因以及构建的基因工程菌能够在柠檬烯胁迫下产生正向反应，延滞期明显缩短8h作用，柠檬烯产量提高8倍，提高产量的同时为柠檬烯生产菌株的研究提供思路。
附图说明：
图1 Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p转化子验证
其中，M：DL5000 DNA marker；泳道1：PYL-F/R对YALI0F19492p基因的验证；
图2 3％DMSO对菌株生长影响；
图3柠檬烯(D型)对菌株生长的影响；
图4 dLS单基因过表达的验证图
其中，M：DL5000 DNA marker；泳道1：PYL-F/R对dLS基因的验证；
图5 dLS和YALI0F19492p组合表达验证图
其中，M：DL5000 DNA marker；泳道1：PYL-F/R对dLS和YALI0F19492p基因的验证。
图6 YALI0F19492p基因敲除盒构建片段图
其中，M：DL5000 DNA marker；泳道1：YALI0F19492p基因上同源臂，泳道2：YALI0F19492p基因下同源臂，泳道3：HPH基因表达盒；
图7 YALI0F19492p基因敲除盒酵母转化验证图
其中，M：DL5000 DNA marker；泳道1：引物YALI0F19492p-F/R验证，泳道2：引物QCH-S-F、QCH-X-R验证。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本申请为了筛选解脂耶氏酵母内源与柠檬烯生产相关的基因，以正常的YPD培养基为对照组，含有浓度为1000mg/L D-柠檬烯的YPD培养基为处理组，将初始OD600＝0.1的解脂耶氏酵母Po1g△KU70接种在3种培养基中培养至对数期做转录组测序。
根据测序结果，将log2(处理组FPKM/对照组FPKM)＞2的基因进行分析筛选，最终对其中的20个相关基因进行过表达，以野生型解脂耶氏酵母Po1g△KU70菌株作为对照，通过发酵培养测定，根据生长曲线，筛选出1个与柠檬烯耐受相关的基因-YALI0F19492p，基于这一筛选结果，进行后续的进一步验证及菌株构建。
YALI0F19492p基因核苷酸序列：
1 atgcccgacgaccaccgagagtctggccacgaccaccccgtcgaggtggaggatctccag
61 agacactaccagatcaagctgatcaagctacaccccattgagaatgcaatcttcattgct
121 aagttcttcattgtgggtctctacttctactacacattcaagattgactaccagtactac
181 gttgcgtcgtacggctgggaattggcggctccaattggtgcgctagcccttgaatggatc
241 acctatcctgttgccttcgtgctgcaatatacccaggagactggtcgacagaagtaccag
301 tacattcgactggcagccagtgtggtggcttggattattcgattcaccttctacggtaga
361 tacgaagttagacgcgaggttttcattgttgttgctgtggccatttcctccattattctg
421 tggtttgcaaagtggcgagttgctctccaccagcgagccattcagcgttcttttaacaga
481 gccgttgatgttgatcctgagcaacaataa
本发明所使用的解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Po1g△KU70为现有技术，是在解脂耶氏酵母Po1g菌株中敲除KU70基因获得的，其构建方法参考文献Geneticengineering of an unconventional yeast for renewable biofuel and biochemicalproduction.Journal of Visualized Experiments,2016,115,e54371。所述解脂耶氏酵母Po1g菌株购买自中国台湾的Yeastern Biotech Co.公司。
以下将结合具体实施例作进一步地解释说明。
实施例1菌株Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p的构建
构建过程如下：
(1)以解脂耶氏酵母工程菌株Po1g△KU70基因组DNA为模板，用引物YALI0F19492p-F/R扩增出YALI0F19492p基因；
YALI0F19492p-F：
ATACAACCACACACATCCACAATGCCCGACGACCACCGAGAG
YALI0F19492p-R：
TGGATCCTTAGTTTCGGGTTCCTTATTGTTGCTCAGGATCAACATC
PCR反应条件：95℃5min；95℃15s；55℃15s；72℃30s，30个循环；72℃10min，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
PCR反应体系(20μL，Vazyme，Nanjing，2×Phanta Max Master Mix P515试剂盒)
模板DNA 上、下游引物 2×Phanta Max Master Mix ddH<sub>2</sub>O 总体积
1.0μL 各1.0μL 10μL 7μL 20μL
(2)将pYLEX1质粒用Pml1进行单酶切，将YALI0F19492p基因片段与酶切后的pYLEX1质粒连接，得到重组质粒pYLEX1-YALI0F19492p。
(3)将(2)中重组质粒pYLEX1-YALI0F19492p用SpeI酶切线性化后，用醋酸锂转化法将线性化片段转化入Po1g△KU70中，在亮氨酸缺陷板YNB上筛选得到重组后的解脂耶氏酵母菌株Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p。提取转化子Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p的基因组DNA，并以此为模板，进行PCR验证。以实验设计的上、下游引物PYL-F和PYL-R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段(图1)，转化子Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p基因组扩增出了901bp大小条带，PCR产物大小与预期一致。结果说明线性化重组质粒已经成功整合到出发菌株的染色体基因组上，即得所述工程菌株Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p。
PYL-F：CCTCGATCCGGCATGCACTGATCACG
PYL-R：TAGGCAACAGCGTTGGGAGAGCCCTTGAGG
(4)对(3)中所得的工程菌株的生长情况进行测定。
实施例2测定重组后的工程菌株生长曲线
(1)测定50mlYPD培养基中加入3％二甲基亚砜(DMSO)对解脂耶氏酵母工程菌株Po1g△KU70生长的影响，结果如图2所示，证明加入3％二甲基亚砜(DMSO)对菌株的生长没有影响；
(2)以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，将柠檬烯(D型)溶解后加入到含50ml YPD培养基的250ml三角瓶中，培养基中D-柠檬烯终浓度为1000mg/L，培养基中DMSO的终浓度为3％；
(3)取重组后的基因工程菌Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p一环，以野生型菌株Po1g△KU70为对照，接种于含5mL YPD培养基的试管中，30℃，225r/min，振荡培养24h后，以初始OD600＝0.1接种于步骤2)中的培养基中，取不同的时间点测定生长曲线；
(4)根据图3显示，与野生型菌株Po1g△KU70相比，重组后的工程菌株Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p在柠檬烯胁迫下产生正向反应，延滞期明显缩短8h左右，即证明上述基因能够明显提高工程菌株对柠檬烯的耐受性
实施例3测定重组后的工程菌株柠檬烯的产量
(1)根据Genbank中的dLS基因序列交由基因合成公司合成，基因合成来自柠檬(C.limon)的D-柠檬烯合酶基因(dLS,GenBank ID:AF514289)。
(2)将pYLEX1质粒用Pml1进行单酶切，将dLS基因片段与酶切后的pYLEX1质粒连接，得到重组质粒pYLEX1-dLS。
(3)从重组质粒pYLEX1-dLS上使用引物BDH-F/R进行PCR扩增出dLS表达盒，然后将dLS表达盒克隆到经过NruI酶切后的线性化质粒pYLEX1-YALI0F19492p上，得到重组质粒pYLEX1-YALI0F19492p-dLS。
BDH-F：ccatccagcctcgcgtcgGTTAACTATCCTAGGGTGCATGCTGAG
BDH-R：acgtcttgctggcgttcgcgaTCATCGATGATAAGCTGTCAAACA
(4)将(2)、(3)中重组质粒pYLEX1-dLS、pYLEX1-YALI0F19492p-dLS用SpeI酶切线性化后，用醋酸锂转化法分别将线性化片段转化入Po1g△KU70中，在亮氨酸缺陷板YNB上筛选分别得到重组后的解脂耶氏酵母菌株Po1g△KU70-pYLEX1-dLS、Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p-dLS。提取转化子Po1g△KU70-pYLEX1-dLS、Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p-dLS的基因组DNA，并以此为模板，进行PCR验证。以实验设计的上下游通用引物PYL-F/R引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，转化子Po1g△KU70-pYLEX1-dLS、Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p基因组分别扩增出了1966bp(图4)和901bp、1966bp(图5)大小的条带，PCR产物大小与预期一致。结果说明线性化重组质粒已经成功整合到出发菌株的染色体基因组上，即得到表达D-柠檬烯合酶基因(dLS)的工程菌Po1g△KU70-pYLEX1-dLS，和同时表达檬烯合酶基因(dLS)和YALI0F19492p的工程菌Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p-dLS。
(5)对(4)中所得的工程菌株进行发酵：取所述重组后的基因工程菌各一环，接种于含5mL YPD培养基的试管中，30℃，225r/min，振荡培养24h，得到一级种子。按1％接种量将一级种子液接种到装有50mL YPD培养基的三角瓶中，28℃、225r/min培养16h至对数中期。然后，将二级种子按以初始OD600＝0.1的接种量接种到50mL YPD培养基中并添加10％的正十二烷作为萃取剂，20℃、250r/min条件下发酵5天，用GC-MS检测柠檬烯的含量。
结果如表1所示，与对照菌株相比，YALI0F19492p的过表达将柠檬烯的产量提升了8倍。
表1
菌株 产量
Po1g△KU70-pYLEX1-dLS 0.64mg/L
Po1g△KU70-pYLEX1-YALI0F19492p-dLS 5.11mg/L
实施例4测定YALI0F19492p基因的敲除对工程菌株柠檬烯产量的影响(1)根据在Y.lipolytica的全基因组序列分别使用引物QCH-S-F/R、QCH-X-F/R对YALI0F19492p基因上、下游各1000bp左右的碱基进行PCR扩增，分别得到片段YALI0F19492p-S、YALI0F19492p-X；同时，使用引物HPH-F/R在质粒pSH69上使用PCR扩增出潮霉素抗性基因的表达盒(BDH-HPH)(图6)。
QCH-S-F：GAAGATGTCACCATCCTCTTCTCG
QCH-S-R：tctttatcgtacaccaacaaaGACATGGAGGCCCAGAATACC
QCH-X-F：tcgctatactgGCAAACTGGGAGGTCAATTGAC
QCH-X-R：AACACAAAAGCTAGGAAGTCCATAAG
HPH-F：tattctgggcctccatgtcTTTGTTGGTGTACGATAAAGAAGAATAG
HPH-R：tcgctatactgGCAAACTGGGAGGTCAATTGAC
(2)对(1)中得到的三个片段，即片段1：YALI0F19492p-S、片段2：BDH-HPH、片段3：YALI0F19492p-X进行融合，上述序列彼此均有同源序列，因此经过两步融合PCR之后能够得到一条3715bp大小的条带，切胶回收，也即YALI0F19492p的敲除盒；
融合PCR反应条件1：95℃5min；95℃15s；55℃15s；72℃2min，30个循环；72℃10min，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物；
①PCR反应体系1(50μL)
片段1 片段2 片段3 2×Phanta Max Master Mix ddH<sub>2</sub>O 总体积
2.0μL 2.0μL 2.0μL 25μL 19μL 50μL
PCR反应体系2(50μL)
①中产物 上、下游引物 2×Phanta Max Master Mix ddH<sub>2</sub>O 总体积
2.0μL 各2.0μL 25μL 19μL 50μL
(3)将(2)中得到的产物用醋酸锂转化法将片段转化入Po1g△KU70中，采用同源重组的方法对工程菌株Po1g△KU70的YALI0F19492p基因进行敲除，在潮霉素抗性板YPDH上筛选得到敲除后的解脂耶氏酵母菌株Po1g△KU70-△YALI0F19492p。提取转化子Po1g△KU70-△YALI0F19492p的基因组DNA，并以此为模板，进行PCR验证。以实验设计的上、下游引物QCH-S-F、QCH-X-R和引物YALI0F19492p-F/R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，引物QCH-S-F、QCH-X-R扩增出3715bp的条带，而引物YALI0F19492p-F/R没有扩增出条带(图7)，PCR产物大小与预期一致，则证明敲除盒替换掉了YALI0F19492p基因。得到敲除菌株Po1g△KU70-△YALI0F19492p
(4)采用与实施例3中相同的方法将dLS基因转入敲除菌株Po1g△KU70-△YALI0F19492p中，得到重组菌株Po1g△KU70-pYLEX1-△YALI0F19492p-dLS。
(5)对(4)中所得的工程菌株进行发酵：取所述重组后的基因工程菌一环，接种于含5mL YPD培养基的试管中，30℃，225r/min，振荡培养24h，得到一级种子。按1％接种量将一级种子液接种到装有50mLYPD培养基的三角瓶中，28℃、225r/min培养16h至对数中期。然后，将二级种子按以初始OD600＝0.1接种到50mLYPD培养基中并添加10％的正十二烷作为萃取剂，20℃、250r/min条件下发酵5天，用GC-MS检测柠檬烯的含量。
结果证明，与对照菌株相比，重组菌株Po1g△KU70-pYLEX1-△YALI0F19492p-dLS的柠檬烯产量降低了1.8倍。即YALI0F19492p基因的缺失对柠檬烯的产量产生了影响。
菌株 产量
Po1g△KU70-pYLEX1-dLS 0.64mg/L
Po1g△KU70-pYLEX1-△YALI0F19492p-dLS 0.35mg/L
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母工程菌及应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 510
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母工程菌株Po1g△KU70
<400> 1
atgcccgacg accaccgaga gtctggccac gaccaccccg tcgaggtgga ggatctccag 60
agacactacc agatcaagct gatcaagcta caccccattg agaatgcaat cttcattgct 120
aagttcttca ttgtgggtct ctacttctac tacacattca agattgacta ccagtactac 180
gttgcgtcgt acggctggga attggcggct ccaattggtg cgctagccct tgaatggatc 240
acctatcctg ttgccttcgt gctgcaatat acccaggaga ctggtcgaca gaagtaccag 300
tacattcgac tggcagccag tgtggtggct tggattattc gattcacctt ctacggtaga 360
tacgaagtta gacgcgaggt tttcattgtt gttgctgtgg ccatttcctc cattattctg 420
tggtttgcaa agtggcgagt tgctctccac cagcgagcca ttcagcgttc ttttaacaga 480
gccgttgatg ttgatcctga gcaacaataa 510

Claims (7)

1.YALI0F19492p基因在解脂耶氏酵母中生产柠檬烯的应用，其特征在于，所述基因的Genbank编号为2907674；所述解脂耶氏酵母为解脂耶氏酵母Po1gΔKU70。
2.一种生产柠檬烯的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在解脂耶氏酵母宿主细胞中过表达权利要求1所述的YALI0F19492p基因并表达柠檬烯合酶所得。
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主是解脂耶氏酵母Po1gΔKU70。
4.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述过表达采用的载体为pYLEX1质粒。
5.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述柠檬烯合酶的编码基因GenBankID:AF514289。
6.权利要求2所述的基因工程菌在生产柠檬烯中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵生产柠檬烯的方法为：将种子液按OD600为0.01-4接种至含6％-12％正十二烷的YPD培养基中，在温度15℃-30℃、pH3-10、转速100-250r/min条件下发酵4-6d。
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