CN113201466B

CN113201466B - 酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用

Info

Publication number: CN113201466B
Application number: CN202110494864.3A
Authority: CN
Inventors: 元英进; 李炳志; 张仁宽
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2041-05-07
Also published as: CN113201466A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在敲除了ADH6、ADH7、BDH2基因的酿酒酵母的基础上，转入外源基因4CL、ECH、vdh、vanA、vanB、metf1、ligM中的至少一种；过表达内源基因MET6；和/或，敲除内源基因MHT1、SAM4中的至少一种，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，该路径通过以上基因的改造调控四氢叶酸代谢强化菌株脱甲基作用促进香草酸转化合成原儿茶酸，实现了利用木质素单体及木质素合成原儿茶酸。不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以生成原儿茶酸这种重要的化工原料，实现木质素的高值化利用。

Description

酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。

背景技术

木质素是第二种天然聚合物，在大多数陆地植物中含量为干重的15％至40％(Ragauskas et al.，2014)。全球制浆造纸工业木质素年产量约5000万吨。然而，98％的木质素用于能源生产的燃烧或填埋场的处置，对环境造成严重威胁(Garlapati等人，2020)。在自然界中，存在着一些能够降解木质素的微生物，这些微生物可以将木质素转化利用，生产各种产品。最近，通过降解和转化木质素，在工程木质素降解微生物中产生了诸如黏康酸(MA)和聚羟基烷酸酯(PHA)和油脂等化学品(Kosa&Ragauskas，2013；Lin et al.，2016；Liuet al.，2019；Mycroft et al.，2015；Salvachúa et al.，2018)。然而，如果木质素的苯环结构得不到有效利用，会造成资源的浪费。通过木质素苯环结构的转化，不同木质素单体底物可以转化为重要的芳香产物，，如原儿茶酸或儿茶酚的生物合成。原儿茶酸，作为药物，在临床上可用于治疗慢性气管炎、烧伤、小儿肺炎、菌痢、急性盂肾炎、急性胰腺炎及某种溃疡病的治疗。另外，其具有一定的抗氧化抗菌作用，对金黄葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌等有抑制作用。原儿茶酸是一种关键的代谢中间体，可以进一步转化为许多化学物质，如己二酸，吡啶2,4-二羧酸等。此外，在最近的研究中，原儿茶酸可以用做合成聚合物的单体。因此原儿茶酸具有广阔的应用前景。由木质素合原儿茶酸进行了初步的研究，木质素单体阿魏酸通过表达棒状杆菌NBRC100395的香草酸O-脱甲基酶基因(vanAB)在谷氨酸梭菌中产生原儿茶酸(Okai等人，2017)。然而，原儿茶酸通常通过多种木质素降解途径被木质素降解微生物同化为碳源(Clarkson et al.，2017)。因此，对木质素降解菌进行代谢工程研究，减少原儿茶酸的降解是十分必要的。敲除Rhodococcus jostii RHA1中的pcaHG可在6天培养中从木质素中产生原儿茶酸(Ramachandran et al.，2020)。除木质素降解微生物外，模式生物大肠杆菌表达香兰素脱氢酶(ligV)、香兰素O-脱甲基酶(ligM)和原儿茶酸脱羧酶(aroY)，它们从木质素解聚产物的香兰素中产生原儿茶酸和儿茶酚(Wu et al.，2017；Wu et al.，2018)。然而，工程大肠杆菌菌株在转化过程中大量积累了中间香草醛酸。这表明香草酸O-脱甲基酶是脱甲基过程中的一个瓶颈，需要对其进行优化以尽量减少香草酸的积累提高木质素转化效率。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本发明在酿酒酵母菌株的基础上进行基因改造，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，获得的酿酒酵母工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物制备原儿茶酸，明显提高了原儿茶酸的含量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供的酿酒酵母工程菌，以酿酒酵母菌株为底盘菌株，并进行如下改造：

a)转入外源基因4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)、ECH(烯酰CoA水合酶)vdh(香草醛脱氢酶)、vanA、(香草酸脱甲氧基酶亚基A)vanB(香草酸脱甲氧基酶亚基B)、metf1(5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶)、ligM(香草酸脱甲氧基酶)中的至少一种；

b)过表达内源基因MET6；

c)敲除内源基因MHT1、SAM4中的至少一种。

本发明中，所述底盘菌株以酿酒酵母菌株作为出发菌，敲除ADH6、ADH7、BDH2基因。所述底盘菌可以选择任意一株酿酒酵母菌作为出发菌株，敲除以上四种基因。

一些具体实施例中，所述底盘菌株的出发菌株为酿酒酵母菌株BY4742，即，所述底盘菌株为敲除了ADH6、ADH7、BDH2基因的酿酒酵母菌株BY4742，本文将该底盘菌株命名为菌株ZR01。

本发明在菌株ZR01的基础上进一步敲除MHT1基因，获得了菌株ZR02。

在菌株ZR02的基础上进一步敲除SAM4基因，获得了菌株ZR03。

本发明对于敲除基因的方法没有特殊限定，可以是CRISPR技术，也可是同源重组技术。

本发明具体实施例中，底盘菌株ZR01通过CRISPR技术对ADH6、ADH7、BDH2基因进行敲除。底盘菌株ZR01的构建方法具体为：

以酿酒酵母BY4742为模板，PCR获取酿酒酵母ADH6基因(genbank号为：NM_001182831.3)的左右各400bp序列，命名为ADH6L、ADH6R，进行overlap，获取ADH6-LR作为donor DNA。根据ADH6序列构建gRNA质粒，将gRNA，cas9，donor DNA导入酿酒酵母BY4742中，按照以上相同的方法依次敲除ADH7、BDH2基因。其中ADH7的donor DNA为ADH7基因(genbank号为：NM_001178812.1)左右各400bp；BDH2的donor DNA为BDH2基因(genbankNM_001178203.1号为)左右各400bp。

一些具体实施例中，所述酵母工程菌对底盘菌进行如下改造：

a1)转入外源基因4CL、ECH、vdh、vanA、vanB、ligM和metf1；且

b1)过表达内源基因MET6；

将获得的工程菌株命名为PCA10。

a2)转入外源基因metf1和ligM；且

b2)过表达内源基因MET6；

其中，所述底盘菌为所述底盘菌株为ADH6、ADH7、BDH2基因被敲除的酿酒酵母菌株；

外源基因metf1包括Ndbn-20来源的metf1和鞘氨醇菌来源的metf1；

将过表达Ndbn-20来源的metf1获得的工程菌株命名为PCA8，过表达鞘氨醇菌来源的metf1获得的工程菌株命名为PCA9。

一些具体实施例中，所述酵母工程菌对底盘菌进行如下a3)的改造、a3)～b3)的改造、或a3)～c3)的改造：

a3)转入外源基因ligM；

b3)过表达内源基因MET6；

c3)敲除内源基因MHT1，或敲除MHT1和SAM4；

其中，所述底盘菌为所述底盘菌株为ADH6、ADH7、BDH2基因被敲除的酿酒酵母菌株。

具体地，将经a3)的改造后的酵母工程菌命名为PCA4。

经a3)～b3)改造后的酵母工程菌命名为PCA5。

c3)为敲除内源基因MHT1，经a3)～c3)改造后的酵母工程菌命名为PCA6。

c3)为敲除内源基因敲除MHT1和SAM4，经a3)～c3)改造后的酵母工程菌命名为PCA7。

本发明中，所述外源基因4CL基因来源于欧芹(Petroselinum crispum)。一些具体实施例中，所述香芹来源的4CL基因的登录号为KF765780.1，本领域技术人员也可以根据酿酒酵母的密码子偏好性对相关序列进行优化。本发明具体实施例中，欧芹来源的4CL基因为优化后的序列，优化后的4CL基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

所述外源基因ECH(登录号AAN68962.1)、vdh(登录号AAN68961.1)、vanA(登录号AAN69332.1)、vanB(登录号AAN69333.1)均来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。一些具体实施例中，具体来源为恶臭假单胞菌KT2440。

具体地，各基因的扩增引物如下：

Pp-ECH-F:ATGAGCAAATACGAAGGCCG(SEQ ID NO：2)；

Pp-ECH-R:TCAGCGCTTGTAGGCCTGC(SEQ ID NO：3)；

Pp-VDH-F:ATGTTGCAGGTGCCTTTGCT(SEQ ID NO：4)；

Pp-VDH-R:CTAGATGGGATAGTGACGCGGG(SEQ ID NO：5)；

Pp-VanA-F：ATGTACCCCAAAAACACCTGGT(SEQ ID NO：6)；

Pp-VanA-R:TCAGGCAGGGTTGGCGCT(SEQ ID NO：7)；

Pp-VanB-F:ATGATCGATGCCGTAGTGGTA(SEQ ID NO：8)；

Pp-VanB-R:TCAGATGTCCAGCACCAGCA(SEQ ID NO：9)。

metf1基因来源于Ndbn-20菌株或鞘氨醇单胞菌(Sphingobium paucimobilis)SYK-6。所述Ndbn-20菌株来源的metf1基因(登录号ATE65736.1)，其扩增引物的序列如SEQID NO：10～11所示，登录号为ATE65736.1。所述鞘氨醇菌来源的metf1基因(登录号BAK65950.1)，其扩增引物的序列如SEQ ID NO：12～13所示。具体地，各基因的扩增引物如下：

Rd-metf1-F:ATGGGCTCGCCCGTTATG(SEQ ID NO：10)；

Rd-metf1-R:TCAGTGCTTTCGAGCGTAG(SEQ ID NO：11)；

Sp-metf1-F:ATGGCTACTGCAACGCTC(SEQ ID NO：12)；

Sp-metf1-R:TCAGATGCCCTGCTTCCC(SEQ ID NO：13)。

ligM来源于鞘氨醇单胞菌(登录号BAD61059.1)，其扩增引物的核苷酸序列如SEQID NO：14～15所示。具体序列如下：

LigM-F：ATGTCGACACCTACCAATCTTGA(SEQ ID NO：14)；

LigM-R:TCAGGCCGTGACGGCAGC(SEQ ID NO：15)。

本发明提供所述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：构建启动子-外源基因/内源基因-终止子的表达模块，将所述表达模块与线性化骨架载体转化底盘菌株。

本发明中，所述转化方法为醋酸锂转化法。

所述骨架载体为PRS415。

本发明中，所述内源基因、外源基因中每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子。

其中，所述启动子为酿酒酵母内源启动子。一些具体实施例中，所述酿酒酵母内源启动子为P_TPI1P、P_FBA1、P_ENO2、P_GPM1、P_TDH3、P_ACT1或P_TEF1。

本发明对终止子的来源没有特殊限定，本领域常用的终止子均可。本发明中，所述终止子为酿酒酵母内源终止子，具体为T_TPI1P、T_FBA1、T_ENO2、T_HXT7、T_PGI1、T_CYC1、T_TEF1、T_ADH1或T_GPM1，终止子的具体种类包括但不仅限于此。

本发明还提供了所述的酿酒酵母工程菌在制备原儿茶酸中的应用。

本发明还提供一种原儿茶酸的制备方法，利用本发明所述的酵母工程菌进行发酵。

本发明所述发酵的培养基包含阿魏酸、香草酸或木质素水解液。

本发明在敲除ADH6、ADH7、BDH2的酿酒酵母菌株ZR01的基础上，转入外源基因4CL、ECH、vdh、vanA、vanB、Ndbn-20、metf1中的至少一种；和/或，过表达底盘菌株的内源基因MET6，在酵母体内构建了一种新的木质素生物转化路径，该路径通过调控四氢叶酸代谢强化菌株脱甲基作用促进香草酸转化合成原儿茶酸，实现了利用木质素单体及木质素合成原儿茶酸。实验表明，本发明的基因工程菌可以充分利用木质素及其衍生的芳香族化合物制备原儿茶酸，不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以生成原儿茶酸这种重要的化工原料，实现木质素的高值化利用。

附图说明

图1示PCA1 PCA2菌株以阿魏酸为底物培养24h后香草酸和香草醛的产量；

图2示PCA3菌株以阿魏酸为底物培养24h后原儿茶酸及香草酸的产量；

图3示四氢叶酸调控示意图；

图4示为不同菌株转化香草酸合成原儿茶酸的产量；

图5示PCA10菌株阿魏酸转化合成原儿茶酸的产量；

图6示PCA10菌株以木质素为底物合成原儿茶酸的产量。

具体实施方式

本发明提供了酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、构建菌株ZR01～ZR03：PCR获取酿酒酵母ADH6左右各400bp序列，命名为ADH6L、ADH6R，进行overlap，获取ADH6LR作为donor DNA。根据ADH6序列构建gRNA质粒，将gRNA，cas9，donor DNA导入酿酒酵母BY4742中，涂布SC筛选平板，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证及测序。根据上述方式，依次敲除ADH7、BDH2，命名为ZR01，进一步敲除MHT1，命名为ZR02。在ZR02基础上敲除SAM4，命名为ZR03。

2、酵母工程菌PCA1、PCA2、PCA3的构建：

PCA1(ZR01中转入外源基因4CL、ppech)：通过PCR扩增酵母启动子P_TPI1P终止子T_GPM1，与基因4CL基因进行overlap，获得模块P_TPI1P-4CL-T_GPM1。通过PCR扩增酵母启动子P_FBA1,终止子T_PGI1与基因ppech，进行overlap，获得模块,P_FBA1-ppech-T_PGI1。利用XhoI，BamI限制性内切酶酶切pRS415质粒，线性化载体PRS415与模块P_TPI1P-4CL-T_GPM1，P_FBA1-ppech-T_PGI1,利用醋酸锂转化法转化ZR01菌株中，通过载体左、右同源序列与载体发生重组而整合到载体上，转化后采用SD-LEU固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为PCA1。

PCA2(ZR01中转入外源基因4CL、ppech、vdh)：PCR扩增酵母启动P_ENO2终止子T_ENO2与基因vdh进行overlap，获得模P_ENO2-vdh-T_ENO2。利用上述方式将利用XhoI，NotI酶切pRS415质粒，将线性化载体PRS415分别与P_TPI1P-4CL-T_GPM1，P_FBA1-ppech-T_PGI1P_ENO2-vdh-T_ENO2导入酵母ZR01中进行同源重组，获得PCA2。

PCA3(ZR01中转入外源基因4CL、ppech、vdh、vanA、vanB)：PCR扩增酵母启动P_TEF1终止子T_CYC1与基因vanA进行overlap获得模块P_TEF1-vanA-T_CYC1。PCR扩增启动子P_TDH3终止子T_TDH3与基因vanB扩增获得模块P_TDH3-vanB-T_TDH3。利用XhoI，NotI酶切pRS415质粒，将线性化载体PRS415分别与模块P_TPI1P-4CL-T_GPM1，P_FBA1-ppech-T_PGI1,P_ENO2-vdh-T_ENO2,T_HXT7-P_TEF1-vanA，T_CYC1-P_TDH3-vanB-T_TDH3同源重组获得PCA3。

3、酵母工程菌PCA4、PCA5、PCA6、PCA7的构建

PCR获取启动子P_TEF1，终止子T_CYC1与基因ligM进行overlap,获得模块P_TEF1-ligM-T_CYC1。利用XhoI，BamI限制性内切酶酶切pRS415质粒，线性化载体PRS415与模块P_TEF1-ligM-T_CYC1利用醋酸锂转化法转让ZR01菌株中，通过载体左、右同源序列与载体发生重组而整合到载体上，转化后采用SD-LEU固体板进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为PCA4。

PCR获取启动子P_GPM1终止子T_TEF1与基因MET6，通过overlap获得模块P_TEF1-ligM-T_CYC1。利用NotI限制性内切酶酶切pRS413质粒，线性化载体PRS413与模块P_GPM1-MET6-T_TEF1利用醋酸锂转化法转让ZR01菌株中，通过载体左、右同源序列与载体发生重组而整合到载体上，转化后采用SD-HIS-LEU固体板进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为PCA5。

利用上述方式将线性化载体RS415与模块P_TEF1-ligM-T_CYC1，线性化载体PRS413与模块P_GPM1-MET6-T_TEF1,分别导入ZR02,ZR03，获得工程酵母PCA6、PCA7。

4、酵母工程菌PCA8、PCA9的构建：PCR获取启动子P_ACT1和终止子T_ADH1，与基因ssMETF1,rdMETF1,通过overlap获得模块P_ACT1-ssmetf1-T_ADH1,P_ACT1-rdmetf1-T_ADH1利用NotI限制性内切酶酶切pRS416质粒，线性化载体PRS416与模块P_ACT1-ssmetf1-T_ADH1,P_ACT1-rdmetf1-T_ADH1利用醋酸锂转化法转入PCA7菌株，通过载体左、右同源序列与载体发生重组而整合到载体上，转化后采用SD-LEU-HIS-URA固体板进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证，对验证正确的重组菌株保存甘油菌并命名为PCA8、PCA9。

5、酵母工程菌PCA10的构建：采用醋酸锂法将片段P_TPI1P-4CL-T_GPM1，P_FBA1-ppech-T_PGI1,P_ENO2-vdh-T_ENO2,T_HXT7-P_TEF1-vanA，T_CYC1-P_TDH3-vanB-T_TDH3转化酿酒酵母ZR1，通过左、右同源序列与酵母基因组上HO位点发生重组而整合到基因组上，将模块P_TEF1-ligM-T_CYC1，P_GPM1-MET6-T_TEF1，P_ACT1-rdmetf1-T_ADH1通过左、右同源序列与酵母基因组上detal15位点发生重组而整合到基因组上,获得稳定遗传的酵母菌株PCA10。

实施例2不同菌株合成原儿茶酸的能力

将实施例1构建的菌株PCA1 PCA2在初始添加100mg/L阿魏酸的SC-LEU(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L)培养基下培养24h，分析其香草酸和香草醛的产量，结果见图1。

将实施例1构建的菌株PCA3在初始添加100mg/L阿魏酸的SC-LEU(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L)培养基下培养24h原儿茶酸及香草酸产量(图2)。

将实施例1构建的菌株PCA4,PCA5,PCA6,PCA7,PCA8,PCA9在100mg/L在初始添加100mg/L香草酸的相应缺陷的SC培养基下培养24h原儿茶酸及香草酸产量(图4)。上述具体实施方式1构建的菌株PCA10在初始添加100mg/L阿魏酸SC培养基下，原儿茶酸及香草酸产量(图5)。

将实施例1构建的菌株PCA10，加入0.5X木质素水解液的YPD培养基中发酵，测定原儿茶酸的含量，结果见图6。

图1可知，构建的PCA1菌株可以将阿魏酸转化为香草酸。PCA2通过表达香草醛氧化酶vdh，提高了香草酸产量最终获得72mg/L香草酸。

图2可知，将香草酸脱甲氧基酶vanAB插入酵母PCA2菌株中获得PCA3,该菌株转化100mg/L阿魏酸产生了5mg/L原儿茶酸。

图4将在ZR01菌株中表达ligM获得PCA4菌株。该菌转化100mg/L香草酸获得了12mg/L香草酸。过表达met6，强化5-甲基四氢叶酸的甲基转移到高丝氨酸上，进一步敲除MHT1和SAM4强化了该过程。进一步过表达来源于Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20和Sphingobium sp.SYK-6 metf1将5-甲基四氢叶酸转化为5，10-甲基四氢叶酸，强化了ligM脱甲基过程。最终获得60mg/L的原儿茶酸。

由图5和图6可知，本发明通过转入外源基因4CL、ppech、vdh、vanA、vanB、ligM和metf1且过表达内源基因MET6构建的酵母工程菌PCA10能够分别以木质素或木质素单体阿魏酸为底物合成原儿茶酸。其中，可将木质素最大限度的转化为原儿茶酸，产量高达120mg/L。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 天津大学

<120> 酿酒酵母工程菌及其在制备原儿茶酸中的应用

<130> MP21005898

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggtgact gtgttgctcc aaaggaagac ttaattttta gatctaagtt gcctgatatc 60

tatatcccaa agcatttgcc tttacacaca tactgtttcg aaaacatctc taaggttggt 120

gacaagtcat gcttaattaa cggtgccacc ggtgaaactt ttacttactc tcaagtagaa 180

ttgttgtcca gaaaagttgc aagtggtttg aataagttag gtatccaaca aggtgacaca 240

attatgttgt tattgccaaa ctcacctgaa tatttctttg ctttcttggg tgcatcctac 300

agaggtgcca taagtacaat ggctaatcca tttttcacct ccgctgaagt tatcaaacaa 360

ttaaaggcta gtcaagcaaa gttgatcatc actcaagcat gttacgtcga taaagtaaag 420

gactacgctg cagaaaagaa tatccaaatc atctgtatcg atgacgctcc acaagattgc 480

ttgcatttct ctaagttgat ggaagcagac gaatcagaaa tgcctgaagt tgtcattaac 540

tccgatgacg tagttgcttt accatactct tcaggtacta caggtttgcc taaaggtgtt 600

atgttaaccc acaagggttt ggttactagt gtcgcacaac aagtagatgg tgacaaccca 660

aacttataca tgcattctga agatgttatg atctgcatat tgcctttgtt ccacatctat 720

tcattgaatg ccgtcttatg ttgcggtttg agagctggtg taactatctt gatcatgcaa 780

aagttcgata tcgttccatt cttggaattg atccaaaagt acaaggtcac aataggtcca 840

ttcgttccac ctatagtctt agctatcgca aaatcccctg tcgttgataa gtacgacttg 900

tccagtgtaa gaaccgttat gagtggtgcc gctccattgg gtaaagaatt ggaagatgcc 960

gttagagcta aatttcctaa cgctaagtta ggtcaaggtt atggtatgac tgaagcaggt 1020

ccagttttag ccatgtgttt ggccttcgct aaagaacctt acgaaattaa atctggtgca 1080

tgcggtaccg ttgtcagaaa tgccgaaatg aagatagttg atccagaaac taacgcttca 1140

ttgcctagaa accaaagagg tgaaatttgt ataagaggtg accaaatcat gaagggttat 1200

ttgaacgacc cagaatcaac tagaaccact attgatgaag aaggttggtt gcatacaggt 1260

gacatcggtt ttattgatga cgatgacgaa ttattcattg tcgatagatt gaaggaaata 1320

atcaaataca agggttttca agttgcacca gccgaattgg aagctttgtt gttgactcat 1380

ccaacaatct ctgatgcagc cgtagttcct atgatagacg aaaaagctgg tgaagtacct 1440

gttgcatttg tcgtaagaac aaatggtttc acaaccactg aagaagaaat taaacaattc 1500

gtttccaagc aagttgtctt ttataagaga atattcagag tctttttcgt agatgctata 1560

ccaaagtctc cttcaggtaa aatcttgaga aaggatttga gagcaagaat tgcctctggt 1620

gacttgccaa aatag 1635

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagcaaat acgaaggccg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagcgcttg taggcctgc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgttgcagg tgcctttgct 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagatggga tagtgacgcg gg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtacccca aaaacacctg gt 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcaggcaggg ttggcgct 18

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgatcgatg ccgtagtggt a 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcagatgtcc agcaccagca 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggctcgc ccgttatg 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcagtgcttt cgagcgtag 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggctactg caacgctc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcagatgccc tgcttccc 18

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgtcgacac ctaccaatct tga 23

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcaggccgtg acggcagc 18

Claims

1.酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母菌株为底盘菌株，并进行如下改造：

a1）转入外源基因4CL、ppech、vdh、vanA、vanB、ligM和metf1；且

b1）过表达内源基因MET6; 敲除MHT1和SAM4；

或进行如下改造：

a2）转入外源基因metf1和ligM；且

b2）过表达内源基因MET6; 且

c2）敲除内源基因MHT1和SAM4；

或进行如下a3）的改造、a3）~b3）的改造、或a3）~c3）的改造：

a3）转入外源基因ligM；

b3）过表达内源基因MET6;

c3）敲除内源基因MHT1，或敲除MHT1和SAM4；

所述外源基因中，4CL基因来源于欧芹； ECH来源于恶臭假单胞菌； vdh、vanA、vanB基因来源于恶臭假单胞菌； metf1基因来源于Rhizorhabdus dicambivorans Ndbn-20菌株或鞘氨醇单胞菌，ligM基因来源于鞘氨醇单胞菌；所述酿酒酵母菌株的ADH6、ADH7、 BDH2基因被敲除。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述底盘菌株的出发菌株为酿酒酵母菌株BY4742。

3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述内源基因、外源基因中每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述启动子为酿酒酵母内源启动子P_TPI1P、P _FBA1、P_ENO2、P _GPM1、P _TDH3、P_ACT1或P_TEF1。

5.权利要求1~4任一项所述的酿酒酵母工程菌在制备原儿茶酸中的应用。

6.权利要求1~4任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括：

构建启动子-外源基因/内源基因-终止子的表达模块，将所述表达模块与线性化的骨架载体转化底盘菌株。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述骨架载体为pRS415。

8.一种原儿茶酸的制备方法，其特征在于，利用权利要求1~4任一项所述的酵母工程菌进行发酵。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养基包含阿魏酸、香草酸或木质素水解液。