CN112300972B - 以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌。所述的基因工程菌为将红球菌中的粘糠酸环化异构酶、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除，并插入原儿茶酸脱羧酶基因和原儿茶酸脱羧酶辅酶基因的基因工程菌。本发明通过将微生物中粘糠酸降解途径敲除使菌株能够利用木质素生产粘糠酸，随后敲除粘糠酸前体物质—邻苯二酚的代谢支路途径使得更多的代谢流流向粘糠酸，并敲除菌株的原儿茶酸降解途径以阻断原儿茶酸的代谢途径，最后导入外源原儿茶酸脱羧酶基因和异戊二烯化辅因子酶基因连接原儿茶酸到邻苯二酚的代谢路径以扩大菌株的底物谱。本发明的基因工程菌可以利用木质素生产粘糠酸，实现木质素的高值化利用。

Description

以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌。
背景技术
木质纤维素类生物质，如农业秸秆、林业废弃物等属于可再生资源，是化石资源最可能的替代者。木质纤维素主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素和半纤维素通过预处理技术、酶水解技术、微生物发酵技术已经可以较为高效地转化为乙醇、油脂等产品(孙明荣,刘晓欣,谢文华,等.生物炼制经济的发展思路和展望[J].化工进展,2017,36(09):3250-3256.)。但由于木质素结构复杂、难以被降解利用的特点，至今为止还没有一种高效的木质素利用方式，其多是被焚烧用来供给热能，既造成了能源的极大浪费而且破坏了环境。
木质素主要由三种芳香物单体组成，分别是芥子醇(S型木质素单体)、松柏醇(G型木质素单体)、对香豆醇(H型木质素单体)。这三种木质素单体通过复杂的化学键(例如，β-O-4、β-5、β-β、5-5/β-O-4等)形成了木质素大分子结构。由于木质素自身结构的复杂性和稳定性，木质素的降解遇到较大的障碍。目前木质素可以使用热化学的方法进行降解，例如热解、氢解、化学氧化、超临界条件下水解等(Li C,Zhao X,Wang A,et al.Catalytictransformation of lignin for the production of chemicals and fuels[J].Chemical reviews,2015,115(21):11559-11624)。这些方法在很大程度上推动了木质素的转化利用，但是获得的木质素裂解液成分复杂并且单种类化合物浓度低，很多情况下并不适合进行单一化合物的分离和提取。除了木质素定向裂解的相关研究外，具有丰富的代谢途径的微生物可以将木质素及木质素形成的复杂芳香类混合产物通过代谢途径进行整合，最终形成一种或几种主要产物，实现木质素到相关产品的转化。
粘糠酸是一系列芳香族化合物降解过程中天然就存在的中间代谢产物，木质素及许多木质素衍生的芳香族化合物在降解过程中均以粘糠酸为代谢中间产物，例如硫酸盐木质素、碱木质素、苯甲酸、苯酚、邻苯二酚、香草醛、对-香豆酸、苯等(Bugg T D H,Ahmad M,Hardiman E M,et al.Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi[J].Natural product reports,2011,28(12):1883-1896；Eggeling L,SahmH.Degradation of coniferyl alcohol and other lignin-related aromaticcompounds by Nocardia sp.DSM 1069[J].Archives of Microbiology,1980,126(2):141-148)。同时粘糠酸也是一种重要的化工原料前体，可以用来合成尼龙-6,6等化学品。但由于在木质素的微生物降解过程中，生成的粘糠酸会快速被相关酶催化进行后续的反应，因此粘糠酸几乎不能进行累积。
发明内容
针对现有木质素高值化利用存在的问题，本发明提供一种以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌。
实现本发明目的的技术方案如下：
以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌，为将红球菌(Rhodococcus)中的粘糠酸环化异构酶、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除，并插入原儿茶酸脱羧酶基因和原儿茶酸脱羧酶辅酶基因的基因工程菌。
具体地，在本发明具体实施例中，采用的红球菌为Rhodococcus opacus PD630，得到的基因工程菌为R.opacus PD630-MA4。
本发明还提供上述基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
步骤1，用于敲除基因的pk18mob-pheS骨架质粒的构建：合成引物PCR扩增红球菌基因组中包含苯丙氨酰-tRNA合成酶基因(AHK32253.1)及其自身启动子的核苷酸片段，将含有自身启动子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和pk18mob质粒连接，获得pk18mob-pheS骨架质粒；
步骤2，苯丙氨酰-tRNA转运蛋白基因突变体的自杀质粒载体pK18mob-pheS*的构建：采用反向PCR技术将pk18mob-pheS骨架质粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中编码329位丙氨酸的核苷酸突变为编码甘氨酸的核苷酸，然后限制性内切酶Dpn I酶切后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得自杀质粒载体pK18mob-pheS*；
步骤3，粘糠酸环化异构酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的粘糠酸环化异构酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-MC，再转入到红球菌中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因的菌株R.-MA1；
步骤4，邻苯二酚2,3双加氧酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的邻苯二酚2,3双加氧酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-C23D，再转入到R.-MA1中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因和邻苯二酚2,3双加氧酶基因的菌株R.-MA2；
步骤5，原儿茶酸3,4双加氧酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的原儿茶酸3,4双加氧酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-PD，再转入到R.-MA2中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因的菌株R.-MA3；
步骤6，原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因的插入：采用重叠PCR方法，将原儿茶酸脱羧酶基因、辅酶基因连接后插入到pK18mob-pheS*中并生成pK18mob-pheS*-aroy-ecdB基因插入型质粒，再转入到R.-MA3中获得敲除粘糠酸环化异构酶基因、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除并插入原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因的菌株R.-MA4。
进一步地，本发明提供上述基因工程菌在生产粘糠酸中的应用，具体为在培养基中加入木质素单体或木质素，接种基因工程菌，发酵生产粘糠酸。
优选地，在上述应用过程中，所述的木质素可以为未处理木质素、或经过酸和碱预处理的生物质，所述的生物质可以是玉米秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆、硬木类或软木类含木质素类林木。
所述的木质素单体可以是邻苯二酚、苯甲酸、苯酚、反式肉桂酸、愈创木酚、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇、香草醛、香草醇、松柏醇、对香豆酸、阿魏酸等。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明采用基因编辑手段敲除代谢粘糠酸的粘糠酸环化异构酶基因，使菌株可以初步累积粘糠酸，然后敲除邻苯二酚2,3双加氧酶基因，迫使更多的代谢流量流向粘糠酸，再对菌株自身的原儿茶酸代谢途径进行敲除，以此阻断原儿茶酸的下游代谢途径，最后将原儿茶酸脱羧酶基因和其辅酶基因插入到微生物基因组中，扩大木质素生产粘糠酸的底物谱。
(2)本发明的基因工程菌可以利用木质素及其衍生的芳香族化合物生产粘糠酸，在较为粗放的预处理木质素条件下可以生成1.63g/L的粘糠酸，不仅可以解决木质素的利用问题，而且可以生成粘糠酸这种重要的化工原料，实现木质素的高值化利用。
附图说明
图1为本发明的以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌的构建流程示意图。
图2为基因工程菌R.opacus PD630-MA4以不同浓度的木质素衍生芳香族化合物(邻苯二酚、苯酚、苯甲酸、愈创木酚)为底物产粘糠酸图。
图3为基因工程菌R.opacus PD630-MA4以不同浓度的木质素衍生芳香族化合物(原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、香草酸)为底物产粘糠酸图。
图4为基因工程菌R.opacus PD630-MA4以不同浓度的市售木质素为底物工程菌株产粘糠酸图。
图5为基因工程菌R.opacus PD630-MA4以预处理的玉米秸秆木质素为底物产粘糠酸图，图中箭头所指为补料时间，每次补充500g/L的预处理木质素2mL。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。下述实施例中，红球菌以Rhodococcus opacus PD630为例。
实施例1
(1)自杀质粒骨架pk18mob-pheS的构建
提取Rhodococcus opacus PD630基因组，并设计特异性引物将包含苯丙氨酰-tRNA合成酶基因(AHK32253.1)及其自身启动子的核苷酸片段进行克隆，其中上游引物为SEQ ID NO:1：TACCCGGGGATCCTCTAGATGCGGTCCTCGACAGCATCAGCG；下游引物为SEQ ID NO:2：AACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATTGCGCTACTCGCACGTCTGC，根据以下体系进行PCR反应：
5×Reaction buffer 10.0μL
dNTPs(10mM) 1.0μL
上游引物SEQ ID NO:1(10μM) 1.0μL
下游引物SEQ ID NO:2(10μM) 1.0μL
Rhodococcus opacus PD630基因组 1.0μL
Taq酶(5U/μL) 1.0μL
ddH2O 35.0μL
总体系 50μL
反应体系照如下程序进行：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。
使用组装试剂盒将含有自身启动子序列的野生型苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和pk18mob质粒进行连接。将连接液转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含50μg/mlKanamycin的LB固体培养基上，过夜培养挑取阳性单菌落并提取质粒，测序得到pk18mob-pheS骨架质粒。
(2)苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体构建
使用反向PCR技术将构建好的野生型苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中编码329位丙氨酸的核苷酸突变为编码甘氨酸的核苷酸，其特异性引物：上游SEQ ID NO:3：GTACACCGGGTTCGGGTTCGGCATGGG；下游SEQ ID NO:4：CCCATGCCGAACCCGAACCCGGTGTAC，根据以下体系进行PCR反应：
5×Reaction buffer 10.0μl
dNTPs(10mM) 1.0μl
上游引物SEQ ID NO:3(10μM) 1.0μl
下游引物SEQ ID NO:4(10μM) 1.0μl
pk18mob-pheS质粒 1.0μl
Taq酶(5U/μL) 1.0μl
ddH2O 35.0μl
总体系 50μl
反应体系照如下程序进行：95℃预变性3min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环；72℃终延伸5min。
将PCR体系经过限制性内切酶Dpn I酶切后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含50ng/ml Kanamycin的LB固体培养基上，过夜培养挑取阳性单菌落并提取质粒，测序验证获得含有反筛选标记的pk18mob-pheS*质粒。
(3)敲除Rhodococcus opacus PD630中粘糠酸环化异构酶基因。
提取R.opacus PD630基因组并设计特异性引物将粘糠酸环化异构酶基因两端同源臂克隆到包含苯丙氨酰-tRNA合成酶基因的自杀质粒载体pk18mob-pheS*上。设计特异性引物：SEQ ID NO:5：ACGAATTCGAGCTCGGTACCTACCCCAGCTTCTGCAGGGTG；SEQ ID NO:6：GTGCCATCGGGTGGTGTGCTCCCGGATCACTTTCTCTACGGGTGG；SEQ ID NO:7：CCACCCGTAGAGAAAGTGATCCGGGAGCACACCACCCGATGGCAC；SEQ ID NO:8：GCCTGCAGGTCGACTCTAGACACCCAGCTGGCCATCTGCG。采用重叠PCR方法将粘糠酸环化异构酶基因两端核苷酸片段连接在一起，然后将该核苷酸片段插入到构建好的含苯丙氨酰-tRNA合成酶基因突变体为反向筛选标记的自杀型质粒pK18mob-pheS*-MC。
使用电击转化法将pK18mob-pheS*-MC转入到R.opacus PD630中并涂布于含有50μg/ml Kanamycin的LB固体培养基上，并在30℃下培养48h长出阳性单菌落。将阳性菌落接种于LB液体培养基中培养24h，将培养后的菌液涂布于含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上培养48h后长出阳性单菌落，并通过PCR及基因测序确定粘糠酸环化异构酶基因被成功敲除的菌株R.opacus PD630-MA1。
(4)敲除R.opacus PD630-MA1中邻苯二酚2,3双加氧酶基因
提取R.opacus PD630基因组并设计特异性引物，通过PCR获得邻苯二酚2,3双加氧酶基因两端同源臂的核苷酸片段。其中使用特异性引物如下：SEQ ID NO:9：ACGAATTCGAGCTCGGTACCGGCCAACGGCGTGAAGCCGGC；SEQ ID NO:10：CAGGCCCCCACACCGAGGACAACTCGACACGGGACGCACCGTCGAAAGGGAC；SEQ ID NO:11：GTCCCTTTCGACGGTGCGTCCCGTGTCGAGTTGTCCTCGGTGTGGGGGCCTG；SEQ ID NO:12：TGTCGAGGACCGCATCTAGAGAGCGGGACGACCTCCTGCTGCG。采用重叠PCR方法将邻苯二酚2,3双加氧酶基因两端核苷酸片段连接在一起，然后将该核苷酸片段插入到pk18mob-pheS*中并生成pK18mob-pheS*-C23D。
使用电击转化法将pK18mob-pheS*-C23D质粒载体转入到R.opacus PD630-MA1中并涂布于含有50μg/ml Kanamycin的LB固体培养基上，并在30℃下培养48h长出阳性单菌落。将阳性菌落接种于LB液体培养基中培养24h，将培养后的菌液涂布于含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上培养48h后长出阳性单菌落，并通过PCR及基因测序确定邻苯二酚2,3双加氧酶基因被成功敲除的菌株R.opacus PD630-MA2。
(5)敲除R.opacus PD630-MA2中原儿茶酸3,4双加氧酶基因
提取R.opacus PD630基因组并设计特异性引物通过PCR获得原儿茶酸3,4双加氧酶基因两端同源臂的核苷酸片段。其中使用特异性引物如下：SEQ ID NO:13：ACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGCCCGACCCCGAGGATGC；SEQ ID NO:14：GCGCGACACCTTTCTGGGTTGTGACCGAGGAAAAAGATCCTCACGTTCTCGATGTGAACAGTC；SEQ ID NO:15：GACTGTTCACATCGAGAACGTGAGGATCTTTTTCCTCGGTCACAACCCAGAAAGGTGTCGCGC；SEQ ID NO:16：GCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCGCGACGGCTCCGCCGG。采用重叠PCR方法将原儿茶酸3,4双加氧酶基因两端核苷酸片段连接在一起，然后将该核苷酸片段插入到pk18mob-pheS*中并生成pK18mob-pheS*-PD自杀型质粒。
使用电击转化法将pK18mob-pheS*-PD质粒载体转入到R.opacus PD630-MA2中并涂布于含有50μg/ml Kanamycin的LB固体培养基上，并在30℃下培养48h长出阳性单菌落。将阳性菌落接种于LB液体培养基中培养24h，将培养后的菌液涂布于含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上培养48h后长出阳性单菌落，并通过PCR及基因测序确定原儿茶酸3,4双加氧酶基因被成功敲除的菌株R.opacus PD630-MA3。
(6)插入原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因的质粒构建
原儿茶酸脱羧酶基因(Genbank:ADF61496)和其辅酶基因(Genbank:ADF63617)来源于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae subsp.cloacae ATCC 13047)，经南京金斯瑞生物科技有限公司对其进行密码子优化并合成。采用重叠PCR方法将原儿茶酸脱羧酶基因、辅酶基因连接后插入到pK18mob-pheS*中并生成pK18mob-pheS*-aroy-ecdB基因插入型质粒。
使用电击转化法将pK18mob-pheS*-aroy-ecdB转入到R.opacus PD630-MA3中并涂布于含有50μg/ml Kanamycin的LB固体培养基上，并在30℃下培养48h长出阳性单菌落。将阳性菌落接种于LB液体培养基中培养24h，将培养后的菌液涂布于含有15mM对氯苯丙氨酸的LB的固体培养基上培养48h后长出阳性单菌落，并通过PCR及基因测序确定原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因被成功敲入的菌株R.opacus PD630-MA4。
(7)以木质素衍生的芳香族化合物为底物进行粘糠酸的生产
分别以不同木质素单体邻苯二酚、苯酚、苯甲酸、愈创木酚、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、香草酸为底物进行工程菌株发酵产粘糠酸的实验，发酵实验中采用M9培养基，所述的M9培养基具体组成为(g/L)：Na2HPO4·12H2O 13.56，K2HPO4 6，NaCl 1，NH4Cl 2，MgSO4·7H2O 0.492CaCl2 0.111，10mL Hoagland trace element缓冲液。发酵时向培养基中加入10mM葡萄糖作为细胞生长的碳源和一定量的木质素单体进行粘糠酸的发酵。图2和图3所示是以不同浓度的木质素衍生芳香族化合物(邻苯二酚、苯酚、苯甲酸、愈创木酚、原儿茶酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、香草酸)为底物产粘糠酸图。发酵结果表明以上述方法构建的菌株R.opacus PD630-MA4可以将不同浓度的木质素单体，包括邻苯二酚、苯酚、苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对香豆酸、香草酸、阿魏酸完全转化为粘糠酸，其转化率均接近100％，原儿茶酸则在72h内可以将约90％的底物转化为粘糠酸。
实施例2以市售木质素为底物转化产粘糠酸
以M9培养基中添加10mM葡萄糖为发酵培养基，在发酵时以1、2、5g/L浓度的市售木质素为底物转化粘糠酸，接种R.opacus PD630-MA4菌株，如图4所示，发酵结果表明在96h内其粘糠酸最高产量分别为0.023、0.040、0.078g/L。
实施例3以酸+碱联合处理的木质素为底物转化粘糠酸
1.木质素处理步骤为：(1)将50g玉米秸秆加入500mL质量分数为1％的硫酸溶液中，用高压灭菌锅在120℃处理30min，随后用真空抽滤泵将液体抽出；(2)测量剩余固体的干重，以干物和总质量比为1：10的比例加入到质量分数为1％的NaOH溶液中，随后用高压灭菌锅在120℃处理60min；(3)收集处理后的液体在121℃灭菌15min用于工程菌发酵黏糠酸的底物；(4)通过在60℃加热浓缩并用M9培养基将木质素母液调至浓度为500g/L，并以此为补料液进行木质素产粘糠酸的发酵。
2.以预处理后的木质素为底物进行菌株产粘糠酸的发酵
发酵实验中采用M9培养基，并向其中加入10mM葡萄糖作为细胞生长的碳源和经过预处理的玉米秸秆木质素。发酵过程中，根据葡萄糖消耗向培养基中补加葡萄糖和木质素，葡萄糖维持在1.8g/L左右，木质素每次补加2mL，以预处理后木质素为底物并进行及时的补料，如图5所示，发酵结果表明以上述方法构建的菌株R.opacus PD630-MA4产粘糠酸最高产量可达1.63g/L。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌
<141> 2019-08-02
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacccgggga tcctctagat gcggtcctcg acagcatcag cg 42
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgacggcc agtgccaagc ttattgcgct actcgcacgt ctgc 44
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtacaccggg ttcgggttcg gcatggg 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccatgccga acccgaaccc ggtgtac 27
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgaattcga gctcggtacc taccccagct tctgcagggt g 41
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgccatcgg gtggtgtgct cccggatcac tttctctacg ggtgg 45
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccacccgtag agaaagtgat ccgggagcac accacccgat ggcac 45
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcctgcaggt cgactctaga cacccagctg gccatctgcg 40
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgaattcga gctcggtacc ggccaacggc gtgaagccgg c 41
<210> 10
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caggccccca caccgaggac aactcgacac gggacgcacc gtcgaaaggg ac 52
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtccctttcg acggtgcgtc ccgtgtcgag ttgtcctcgg tgtgggggcc tg 52
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtcgaggac cgcatctaga gagcgggacg acctcctgct gcg 43
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgaattcga gctcggtacc cggcccgacc ccgaggatgc 40
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcgcgacacc tttctgggtt gtgaccgagg aaaaagatcc tcacgttctc gatgtgaaca 60
gtc 63
<210> 15
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gactgttcac atcgagaacg tgaggatctt tttcctcggt cacaacccag aaaggtgtcg 60
cgc 63
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcctgcaggt cgactctaga gcgcgacggc tccgccgg 38

Claims (6)

1. 以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，为将红球菌Rhodococcus opacus PD630中的粘糠酸环化异构酶、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除，并插入原儿茶酸脱羧酶基因和原儿茶酸脱羧酶辅酶基因的基因工程菌，所述的原儿茶酸脱羧酶基因的Genbank登录号为 ADF6149，原儿茶酸脱羧酶辅酶基因的Genbank:登录号为ADF63617，所述的基因工程菌为R. opacus PD630-MA4，通过以下步骤构建：
步骤1，用于敲除基因的pk18mob-pheS骨架质粒的构建：合成引物PCR扩增红球菌基因组中包含GenBank：AHK32253.1的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因及其自身启动子的核苷酸片段，其中上游引物为SEQ ID NO:1：tacccggggatcctctagaTGCGGTCCTCGACAGCATCAGCG；下游引物为SEQ ID NO:2：aacgacggccagtgccaagcttATTGCGCTACTCGCACGTCTGC，将含有自身启动子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和pk18mob质粒连接，获得pk18mob-pheS骨架质粒；
步骤2，苯丙氨酰-tRNA转运蛋白基因突变体的自杀质粒载体pK18mob-pheS*的构建：采用反向PCR技术将pk18mob-pheS骨架质粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中编码329位丙氨酸的核苷酸突变为编码甘氨酸的核苷酸，其特异性引物：上游SEQ ID NO:3：GTACACCGGGTTCGGGTTCGGCATGGG；下游SEQ ID NO:4：CCCATGCCGAACCCGAACCCGGTGTAC，然后限制性内切酶Dpn I酶切后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得自杀质粒载体pK18mob-pheS*；
步骤3，粘糠酸环化异构酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的粘糠酸环化异构酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物：SEQ ID NO:5：acgaattcgagctcggtaccTACCCCAGCTTCTGCAGGGTG；SEQ ID NO:6：gtgccatcgggtggtgtgctccCGGATCACTTTCTCTACGGGTGG；SEQ ID NO:7：ccacccgtagagaaagtgatccgGGAGCACACCACCCGATGGCAC；SEQ ID NO:8：gcctgcaggtcgactctagaCACCCAGCTGGCCATCTGCG，获得自杀型质粒 pK18mob-pheS*-MC，再转入到红球菌Rhodococcus opacus PD630中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因的菌株R.-MA1；
步骤4，邻苯二酚2,3双加氧酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的邻苯二酚2,3双加氧酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物如下：SEQ ID NO:9：acgaattcgagctcggtaccGGCCAACGGCGTGAAGCCGGC，SEQ ID NO:10：caggcccccacaccgaggacaactcGACACGGGACGCACCGTCGAAAGGGAC，SEQ ID NO:11：gtccctttcgacggtgcgtcccgtgtcGAGTTGTCCTCGGTGTGGGGGCCTG，SEQ ID NO:12：tgtcgaggaccgcatctagaGAGCGGGACGACCTCCTGCTGCG，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-C23D，再转入到R.-MA1中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因和邻苯二酚2,3双加氧酶基因的菌株R.-MA2；
步骤5，原儿茶酸3,4双加氧酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的原儿茶酸3,4双加氧酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物如下：SEQ ID NO:13：acgaattcgagctcggtaccCGGCCCGACCCCGAGGATGC；SEQ ID NO:14：gcgcgacacctttctgggttgtgaccgaGGAAAAAGATCCTCACGTTCTCGATGTGAACAGTC；SEQ ID NO:15：gactgttcacatcgagaacgtgaggatctttttccTCGGTCACAACCCAGAAAGGTGTCGCGC；SEQ ID NO:16：gcctgcaggtcgactctagaGCGCGACGGCTCCGCCGG，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-PD，再转入到R.-MA2中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因的菌株R.-MA3；
步骤6，原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因的插入：采用重叠PCR方法，将原儿茶酸脱羧酶基因、辅酶基因连接后插入到pK18mob-pheS*中并生成pK18mob-pheS*-aroy-ecdB基因插入型质粒，再转入到R.-MA3中获得敲除粘糠酸环化异构酶基因、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除并插入原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因的菌株R. opacus PD630-MA4。
2.根据权利要求1所述的构建方法在生产粘糠酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体为在培养基中加入木质素单体或木质素，接种基因工程菌，发酵生产粘糠酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的木质素为未处理木质素、或经过酸和碱预处理的生物质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生物质可以是玉米秸秆、小麦秸秆、高粱秸秆、硬木类或软木类含木质素类林木。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的木质素单体为邻苯二酚、苯甲酸、苯酚、反式肉桂酸、愈创木酚、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲醇、香草醛、香草醇、松柏醇、对香豆酸或阿魏酸。
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