JP2009539407A - 溶媒耐性微生物および単離方法 - Google Patents
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Abstract
ブタノールに対して増強された耐性を有する乳酸桿菌(Lactobacillus)が単離されている。この細菌はブタノールの発酵生成にとって有用である。ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)を単離するための新規な方法も提供される。
Description
本願は2006年6月15日出願の米国仮特許出願第60/813779号明細書の優先権を主張するものである。
本発明は工業微生物学の分野に関する。具体的には、アルコール、特にブタノールに高い耐性を示す微生物が単離されている。
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における化学物質原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤として有用な重要な工業化学物質である。毎年、100〜120億ポンドのブタノールが石油化学的手段により生産され、この汎用化学製品に対する需要は高まる可能性が高い。
ブタノールの化学合成方法は既知である。例えば1−ブタノールが、オキソプロセス、レッペ(Reppe)プロセス、またはクロトンアルデヒドの水素化を用いて生成可能である(「Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry」、第6版、2003年、ワイリーVCHフェアラーク(Wiley−VCHVerlag GmbH and Co.)、ドイツ国バインハイム(Weinheim)、第5巻、716−719頁)。2−ブタノールがn−ブテン水和を用いて生成可能である(「Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry」、第6版、2003年、ワイリーVCHフェアラーク(Wiley−VCHVerlag GmbH and Co.)、ドイツ国バインハイム(Weinheim)、第5巻、716−719頁)。さらに、イソブタノールが、オキソ合成、一酸化炭素の触媒水素化(「Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry」、第6版、2003年、ワイリーVCHフェアラーク(Wiley−VCHVerlag GmbH and Co.)、ドイツ国バインハイム(Weinheim)、第5巻、716−719頁)またはn−プロパノールによるメタノールのゲルベ(Guerbet)縮合(カーリニ(Carlini)ら、J.Molec.Catal.A:Chem.220:215−220頁(2004年))を用いて生成可能である。石油化学製品から誘導される出発原料を用いるこれらのプロセスは一般に高価であり、環境に優しいものではない。
発酵によりブタノールを生成する方法も既知であり、ここでは最も知られたプロセスによりアセトン、1−ブタノールおよびエタノールの混合物が生成され、それはABEプロセスと称される(ブラスチェック(Blaschek)ら、米国特許第6,358,717号明細書)。クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)によるアセトン−ブタノール−エタノール(ABE)発酵は最も古くから知られた工業用発酵の1つであり、これらの溶媒の生成を担う経路および遺伝子についての報告がされている(ガーバル(Girbal)ら、Trends in Biotechnology 16:11−16頁(1998年))。さらに、1−ブタノール生合成経路(ドナルドソン(Donaldson)ら、同時係属および共同所有の米国特許出願第11/527995号明細書)、2−ブタノール生合成経路(ドナルドソン(Donaldson)ら、同時係属および共同所有の米国仮特許出願第60/796,816号明細書、およびイソブタノール生合成経路(マッジオ−ホール(Maggio−Hall)ら、同時係属および共同所有の米国特許出願第11/586315号明細書)を発現する組換え微生物生成宿主についての記載がなされている。しかし、ブタノールの生物学的生成は、発酵において用いられる宿主微生物に対するブタノールの毒性により制限を受けると考えられる。
1−ブタノールに耐性があるクロストリジウム(Clostridium)の株が化学的突然変異誘発(ジェイン(Jain)ら、米国特許第5,192,673号明細書;およびブラスチェック(Blaschek)ら、米国特許第6,358,717号明細書)、例えばストレス応答タンパク質を発現する遺伝子の特定のクラスの過剰発現(パポウトサキス(Papoutsakis)ら、米国特許第6,960,465号明細書;およびトーマス(Tomas)ら、Appl.Environ.Microbiol.69(8):4951−4965頁(2003年))、ならびに連続濃縮(serial enrichment)(クラチュレイン(Quratulain)ら、Folia Microbiologica(Prague) 40(5):467−471頁(1995年);およびソウカイリェ(Soucaille)ら、Current Microbiology 14(5):295−299頁(1987年))により単離されている。デズモンド(Desmond)ら(Appl.Environ.Microbiol.70(10):5929−5936頁(2004年))は、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)およびラクトバチルス・パラカセイ(Lactobacillus paracasei)内でのストレス応答タンパク質GroESLの過剰発現により0.5%容量/容量(v/v)[0.4%重量/容量(w/v)]の1−ブタノールの存在下で成長可能な株が生成されたことを報告している。さらに、河口堆積物(サルデッサイ(Sardessai)ら、Current Science 82(6):622−623頁(2002年))および活性汚泥(ビーズキエヴィッツ(Bieszkiewicz)ら、Acta Microbiologica Polonica 36(3):259−265頁(1987年))からの1−ブタノール耐性株の単離についての記載がなされている。さらに、一部の乳酸桿菌種(Lactobacillus sp.)がエタノールに耐性があることが知られている(例えば、コウト(Couto)、ピナ(Pina)およびホッグ(Hogg) Biotechnology.Letter 19:487−490頁を参照)。イングラム(Ingram)およびブルケ(Burke)(1984年) Adv.Micribial.Physiol 25:253−300頁。しかし、当該技術分野で記載がなされている大部分の微生物においては、液体培地内、37℃で成長される場合、2.0%w/v未満の1−ブタノール濃度で成長が全面的に阻害される。さらに、2−ブタノールおよびイソブタノールに対する耐性を有する微生物株については当該技術分野で既知ではない。したがって、1−ブタノール、2−ブタノール、およびイソブタノールに対して高い耐性を有する微生物の同定が当該技術分野における先進性を示すことになると思われる。
さらに、2−ブタノンおよびエタノールは、微生物を用いる発酵により生成可能である貴重な化合物である。メチルエチルケトン(MEK)とも称される2−ブタノンは、汎用の溶媒であり、アセトンに次いで最も重要な商業生産されるケトンである。それは塗料、樹脂、および接着剤における溶媒とともに選択的抽出剤および酸化反応の活性化物質として使用される。2−ブタノンは、2−ブタノール生合成経路の最終ステップを省くことにより作製可能である(ドナルドソン(Donaldson)ら、同時係属および共同所有の米国仮特許出願第60/796816号明細書)。エタノールは代替燃料としての需要が高い。大腸菌(E.coli)の遺伝子組換え株がエタノール生成用の生体触媒として用いられている(アンダーウッド(Underwood)ら、(2002年) Appl.Environ.Microbiol.68:6263−6272頁)。エタノールの改善された生成を有する、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)の遺伝子組換え株が米国特許出願公開第2003/0162271A1号明細書に記載されている。2−ブタノンおよびエタノールに対する改善された耐性を有する微生物の同定がこれらの化合物の生成を促進することになると思われる。
したがって、ブタノールにより耐性がありかつブタノールの高力価に至る生物学的生成のために使用可能である微生物宿主株に対する需要がある。本発明は、ブタノール耐性微生物の発見およびそれを単離するための方法の開発を通じてのこの需要に対応する。さらに、発見された微生物は、2−ブタノンおよびエタノールに対して増強された耐性を有する。
本発明は、ブタノール耐性微生物、特に乳酸桿菌(Lactobacillus)属のメンバー、およびそれを単離するための方法に関する。微生物コンソーシアムは濃縮され、ブタノールに対する耐性について選択された。固体培地上、37℃で成長される場合、少なくとも2.5%w/vの1−ブタノールのブタノールの濃度に対する耐性を示す乳酸桿菌(Lactobacillus)の数種が単離された。
したがって、本発明は、ブタノール耐性微生物を単離するための方法であって、
a)微生物コンソーシアムを含有する微生物試料を提供するステップと、
b)前記微生物コンソーシアムを、発酵性炭素源を含有する成長培地と、前記微生物コンソーシアムのメンバーが成長するようになるまで接触させるステップと、
c)ステップ(b)の成長中の微生物コンソーシアムをブタノールと接触させるステップと、
d)ステップ(c)の生存可能なメンバーを単離するステップであって、ブタノール耐性微生物が単離されるステップと、
を含む、方法を提供する。
a)微生物コンソーシアムを含有する微生物試料を提供するステップと、
b)前記微生物コンソーシアムを、発酵性炭素源を含有する成長培地と、前記微生物コンソーシアムのメンバーが成長するようになるまで接触させるステップと、
c)ステップ(b)の成長中の微生物コンソーシアムをブタノールと接触させるステップと、
d)ステップ(c)の生存可能なメンバーを単離するステップであって、ブタノール耐性微生物が単離されるステップと、
を含む、方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法により単離されるブタノール耐性微生物を提供し、ここで好ましい微生物は乳酸桿菌(Lactobacillus)属である。
他の実施形態では、本発明は、ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)を単離するための方法であって、
a)微生物コンソーシアムを含む微生物試料を提供するステップと、
b)発酵性炭素源を含有する培地内で乳酸桿菌(Lactobacillus)の存在のために前記微生物コンソーシアムを濃縮し、乳酸桿菌(Lactobacillus)の濃縮された培養物を生成するステップであって、前記乳酸桿菌(Lactobacillus)の濃縮された培養物のメンバーが成長しているステップと、
c)ステップ(b)の成長中の乳酸桿菌(Lactobacillus)の濃縮された培養物をブタノールと接触させるステップと、
d)ステップ(c)の生存可能なメンバーを単離するステップであって、ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)が単離されるステップと、
を含む、方法を提供する。
a)微生物コンソーシアムを含む微生物試料を提供するステップと、
b)発酵性炭素源を含有する培地内で乳酸桿菌(Lactobacillus)の存在のために前記微生物コンソーシアムを濃縮し、乳酸桿菌(Lactobacillus)の濃縮された培養物を生成するステップであって、前記乳酸桿菌(Lactobacillus)の濃縮された培養物のメンバーが成長しているステップと、
c)ステップ(b)の成長中の乳酸桿菌(Lactobacillus)の濃縮された培養物をブタノールと接触させるステップと、
d)ステップ(c)の生存可能なメンバーを単離するステップであって、ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)が単離されるステップと、
を含む、方法を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法により単離されるブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)を提供し、ここではATCC PTA−8318(プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)PN0510)、ATCC PTA−8320(プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)PN0511)、ATCC PTA−7727(プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)PN0512)およびATCC PTA−8319(ラクトバチルス・アリゾネンシス(Lactobacillus arizonensis)PN0514)として同定された特定のブタノール耐性乳酸桿菌種(Lactobacillus sp.)が好ましい。
別の実施形態では、本発明は、ブタノールを生成するための方法であって、
a)ブタノール生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、本発明の方法により単離される乳酸桿菌(Lactobacillus)を提供するステップと、
b)ブタノールが生成される条件下でステップ(a)の前記乳酸桿菌(Lactobacillus)を成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
a)ブタノール生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、本発明の方法により単離される乳酸桿菌(Lactobacillus)を提供するステップと、
b)ブタノールが生成される条件下でステップ(a)の前記乳酸桿菌(Lactobacillus)を成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、2−ブタノンを生成するための方法であって、
c)2−ブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、本発明の方法により単離される乳酸桿菌(Lactobacillus)を提供するステップと、
d)2−ブタノンが生成される条件下でステップ(a)の前記乳酸桿菌(Lactobacillus)を成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
c)2−ブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、本発明の方法により単離される乳酸桿菌(Lactobacillus)を提供するステップと、
d)2−ブタノンが生成される条件下でステップ(a)の前記乳酸桿菌(Lactobacillus)を成長させるステップと、
を含む、方法を提供する。
生物寄託および配列記述の簡単な説明
本発明の様々な実施形態は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明、生物学的寄託、および添付の配列記述からより十分に理解されうる。
本発明の様々な実施形態は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明、生物学的寄託、および添付の配列記述からより十分に理解されうる。
本出願人は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認(International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)に関するブダペスト条約の条件下で以下の生物学的寄託を行った。
以下の配列は、米国特許施行規則第1.821〜1.825条(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を有する特許出願における要件−配列の規則(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に従い、かつ、世界知的所有権機関(WIPO)基準ST.25(1998年)ならびにEPOおよびPCTの配列表における要件(規則5.2および49.5(aの2)、ならびに実施細則の第208節および付録C)に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第1.822条に示される規則に従う。
配列番号39および40は、実施例1に記載のようにブタノール耐性株の16S rRNA遺伝子を増幅するのに用いられるプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号41〜44は、実施例1に記載のように単離されたブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)株の16S rRNA遺伝子のヌクレオチド配列である。
本発明は、アルコール、特にブタノール、ならびに2−ブタノンおよびエタノールに対して高い耐性を示す微生物を提供する。本発明の微生物は、固体培地上で2.5%w/v以上の1−ブタノールの存在下で成長可能である。さらに、本発明はブタノール耐性微生物を単離するための方法を提供する。これらのブタノール耐性微生物は、ブタノール生合成経路または2−ブタノン生合成経路を含むように遺伝子操作され、かつ高力価に至る1−ブタノール、2−ブタノール、イソブタノールまたは2−ブタノンの生物学的生成において使用可能である。
以下の定義および略語は、特許請求の範囲および本明細書の解釈のために用いられるものとする。
本明細書で用いられる「ブタノール」という用語は、1−ブタノール、2−ブタノール、イソブタノール、またはそれらの混合物を示す。
「ブタノール耐性微生物」および「耐性がある」という用語は、本発明の微生物を説明するのに用いられる場合、固体培地上、37℃で成長される場合での2.5%w/v以上の1−ブタノール、2−ブタノール、またはイソブタノールの存在下あるいは液体培地内、37℃で成長される場合での2.0%w/v以上の1−ブタノール、2−ブタノール、またはイソブタノールの存在下で成長を示す細菌または酵母を示す。
「微生物コンソーシアム」という用語は、異なる遺伝子型を有する微生物の異種グループを示す。例として、微生物コンソーシアムは、排水汚泥または土壌またはたい肥または汚染水試料などの環境試料、純粋な細菌株の化学的に突然変異が誘発された微生物集団、マルチコピー(multicopy)のプラスミドライブラリーを有する微生物株、または特定の株のトランスポゾンでタグ化された突然変異体の集団でありうる。
「環境試料」という用語は、環境から得られる試料を示す。特に環境試料は、排水汚泥またはブタノールおよび/または他の溶媒に暴露されている場合に環境から得られる他の試料でありうる。環境試料は微生物コンソーシアムを含有する。
微生物の培養および特に微生物コンソーシアムの培養に適用される「濃縮する」という用語は、コンソーシアムまたは微生物培養物の細胞に過剰な成長栄養素を供給し、細胞の成長を増強または促進することを示す。
「発酵性炭素源」、「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、同義的に用いられ、かつ微生物コンソーシアムにより容易に利用される炭素の供給源を示す。発酵性炭素源は、限定はされないが、単糖、オリゴ糖、多糖、および1炭素基質またはそれらの混合物を含む。好ましい発酵性炭素源の非限定的リストは、単糖、例えばグルコース、フルクトース、およびスクロース、ならびに脂肪酸、酪酸、および吉草酸などのカルボン酸を含む。
「好気性条件」という用語は酸素の存在下での成長条件を意味する。
「嫌気性条件」という用語は酸素の不在下での成長条件を意味する。
「微好気性条件」という用語は、低い酸素のレベル(すなわち標準の大気中の酸素レベル未満)での成長条件を意味する。
「ブタノール生合成経路」という用語は、1−ブタノール、2−ブタノール、またはイソブタノールを生成するための酵素経路を意味する。
「1−ブタノール生合成経路」という用語は、アセチル−補酵素A(アセチル−CoA)から1−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
「2−ブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から2−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
「イソブタノール生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩からイソブタノールを生成するための酵素経路を示す。
「2−ブタノン生合成経路」という用語は、ピルビン酸塩から2−ブタノンを生成するための酵素経路を示す。
「アセチル−CoAアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、アセチル−CoA2分子からアセトアセチル−CoAおよび補酵素A(CoA)への変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセチル−CoAアセチルトランスフェラーゼは、好ましくは短鎖アシル−CoAおよびアセチル−CoAといった基質を有する(順方向での反応)アセチル−CoAアセチルトランスフェラーゼであり、E.C.2.3.1.9として分類されるが[「Enzyme Nomenclature」 1992年、サンディエゴ(San Diego)のアカデミック・プレス(Academic Press)]、より広範な基質範囲を有する酵素(E.C.2.3.1.16)も同様に機能を果たすことになる。アセチル−CoAアセチルトランスフェラーゼは、多数の供給源、例えば大腸菌(Escherichia coli)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_416728、NC_000913;NCBI(国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information))アミノ酸配列、NCBIヌクレオチド配列)、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_349476.1(配列番号2)、NC_003030;NP_149242(配列番号4)、NC_001988)、枯草菌(Bacillus subtilis)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_390297、NC_000964)、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_015297、NC_001148)から入手可能である。
「3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素」という用語は、アセトアセチル−CoAから3−ヒドロキシブチリル−CoAへの変換を触媒する酵素を示す。3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素は、好ましくは(S)−3−ヒドロキシブチリル−CoAまたは(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAといった基質の場合に還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)に依存する場合があり、各々、E.C.1.1.1.35およびE.C.1.1.1.30として分類される。さらに、3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素は、好ましくは(S)−3−ヒドロキシブチリル−CoAまたは(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAといった基質の場合に還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)に依存する場合があり、各々、E.C.1.1.1.157およびE.C.1.1.1.36として分類される。3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素は、多数の供給源、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_349314(配列番号6)、NC_003030)、枯草菌(B.subtilis)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAB09614、U29084)、ラルストニア・ユウトロファ(Ralstonia eutropha)(ジェンバンク(GenBank)番号:ZP_0017144、NZ_AADY01000001、アルカリゲネス・ユウトロファス(Alcaligenes eutrophus)(ジェンバンク(GenBank)番号:YP_294481、NC_007347)、およびアルカリゲネス・ユウトロファス(A.eutrophus)(ジェンバンク(GenBank)番号:P14697、J04987)から入手可能である。
「クロトナーゼ(crotonase)」という用語は、3ヒドロキシブチリル−CoAからクロトニル−CoAおよびH2Oへの変換を触媒する酵素を示す。クロトナーゼは、好ましくは(S)−3−ヒドロキシブチリル−CoAまたは(R)−3−ヒドロキシブチリル−CoAといった基質を有する場合があり、各々、E.C.4.2.1.17およびE.C.4.2.1.55として分類される。クロトナーゼは、多数の供給源、例えば大腸菌(E.coli)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_415911(配列番号8)、NC_000913)、クロストリジウム・アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_349318、NC_003030)、枯草菌(B.subtilis)(ジェンバンク(GenBank)番号:CAB13705、Z99113)、およびアエロモナス・キャビエ(Aeromonas caviae)(ジェンバンク(GenBank)番号:BAA21816、D88825)から入手可能である。
トランス−エノイルCoAレダクターゼとも称される「ブチリル−CoA脱水素酵素」という用語は、クロトニル−CoAからブチリル−CoAへの変換を触媒する酵素を示す。ブチリル−CoA脱水素酵素はNADH依存性またはNADPH依存性である場合があり、各々、E.C.1.3.1.44およびE.C.1.3.1.38として分類される。ブチリル−CoA脱水素酵素は、多数の供給源、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_347102(配列番号10)、NC_003030)、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)(ジェンバンク(GenBank)番号:Q5EU90、AY741582)、ストレプトマイセス・コリヌス(Streptomyces collinus)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAA92890、U37135)、およびストレプトマイセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)(ジェンバンク(GenBank)番号:CAA22721、AL939127)から入手可能である。
「ブチルアルデヒド脱水素酵素」という用語は、共同因子としてNADHまたはNADPHを用い、ブチリル−CoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒する酵素を示す。NADHが好ましい場合のブチルアルデヒド脱水素酵素は、E.C.1.2.1.57として知られ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAD31841(配列番号12)、AF157306)およびクロストリジウム・アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_149325、NC_001988)から入手可能である。
「1−ブタノール脱水素酵素」という用語は、ブチルアルデヒドから1ブタノールへの変換を触媒する酵素を示す。1−ブタノール脱水素酵素はアルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。1−ブタノール脱水素酵素はNADH−またはNADPH依存性でありうる。1−ブタノール脱水素酵素は、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_149325、NC_001988;NP_349891(配列番号14)、NC_003030;およびNP_349892(配列番号16)、NC_003030)ならびに大腸菌(E.coli)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_417484、NC_000913)から入手可能である。
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」とも称される「アセト乳酸シンターゼ」という用語は、ピルビン酸2分子からα−アセト乳酸1分子への変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセト乳酸シンターゼ(EC2.2.1.6[従来は4.1.3.18]として知られる)(「Enzyme Nomenclature」 1992年、サンディエゴ(San Diego)のアカデミック・プレス(Academic Press))は、その活性については共同因子のチアミンピロリン酸に依存しうる。適切なアセト乳酸シンターゼ酵素は、多数の供給源、例えば枯草菌(Bacillus subtilis)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAA22222 NCBI(国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information))アミノ酸配列、L04470 NCBIヌクレオチド配列)、クレブシエラ・テリゲナ(Klebsiella terrigena)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAA25055、L04507)、およびクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAA25079(配列番号20)、M73842(配列番号19))から入手可能である。
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−アセト乳酸からアセトインへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。アセト乳酸デカルボキシラーゼは、EC4.1.1.5として知られ、例えば枯草菌(ジェンバンク(GenBank)番号:AAA22223、L04470)、クレブシエラ・テリゲナ(ジェンバンク(GenBank)番号:AAA25054、L04507)およびクレブシエラ・ニューモニエ(配列番号18(アミノ酸)、配列番号17(ヌクレオチド)から入手可能である。
「アセトインレダクターゼ」としても知られる「ブタンジオール脱水素酵素」という用語は、アセトインから2,3−ブタンジオールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ブタンジオール脱水素酵素はアルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。ブタンジオール脱水素酵素は、アルコール生成物中でR−またはS−立体化学の生成に対して特異性を有しうる。Sに特異的なブタンジオール脱水素酵素は、EC1.1.1.76として知られ、例えばクレブシエラ・ニューモニエ(ジェンバンク(GenBank)番号:BBA13085(配列番号22)、D86412)から入手可能である。Rに特異的なブタンジオール脱水素酵素は、EC1.1.1.4として知られ、例えばセレウス菌(Bacillus cereus)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_830481、NC_004722;AAP07682、AE017000)、およびラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAK04995、AE006323)から入手可能である。
「ジオールデヒドラターゼ」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」としても知られる「ブタンジオールデヒドラターゼ」という用語は、2,3−ブタンジオールからメチルエチルケトン(MEK)としても知られる2−ブタノンへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。ブタンジオールデヒドラターゼでは共同因子のアデノシルコバラミンが用いられうる。アデノシルコバラミン依存性酵素は、EC4.2.1.28として知られ、例えばクレブシエラ・オキシトカ(ジェンバンク(GenBank)番号:BAA08099(αサブユニット)(配列番号24)、BAA08100(βサブユニット)(配列番号26)、およびBBA08101(γサブユニット)(配列番号28)(3つの全サブユニットは活性に必要とされることに注意のこと)、D45071)から入手可能である。
「2−ブタノール脱水素酵素」という用語は、2ブタノンから2−ブタノールへの変換を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを示す。2−ブタノール脱水素酵素は、アルコール脱水素酵素の広範なファミリーのサブセットである。2−ブタノール脱水素酵素は、NADHまたはNADPH依存性でありうる。NADH依存性酵素は、EC1.1.1.1として知られ、例えばロドコッカス・ルバー(Rhodococcus ruber)(ジェンバンク(GenBank)番号:CAD36475(配列番号30)、AJ491307(配列番号29))から入手可能である。NADPH依存性酵素は、EC1.1.1.2として知られ、例えばパイロコッカス・フリオシス(Pyrococcus furiosus)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAC25556、AF013169)から入手可能である。
「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」または「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、電子供与体としてNADPH(還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)を用いるアセト乳酸の2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、EC番号1.1.1.86として知られ、配列が、限定はされないが、大腸菌(Escherichia coli)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_418222(配列番号32)、NC_000913(配列番号31))、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_013459、NC_001144)、メタノコッカス・マリパルディス(Methanococcus maripaludis)(ジェンバンク(GenBank)番号:CAF30210、BX957220)、および枯草菌(Bacillus subtilis)(ジェンバンク(GenBank)番号:CAB14789、Z99118)を含む、極めて多数の微生物から入手可能である。
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」という用語は、2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸のα−ケトイソ吉草酸への変換を触媒する酵素を示す。好ましいアセトヒドロキシ酸脱水酵素はEC番号4.2.1.9として既知である。これらの酵素は、限定はされないが、大腸菌(E.coli)(ジェンバンク(GenBank)番号:YP_026248(配列番号34)、NC_000913(配列番号33))、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_012550、NC_001142)、メタノコッカス・マリパルディス(M.maripaludis)(ジェンバンク(GenBank)番号:CAF29874、BX957219)、および枯草菌(B.subtilis)(ジェンバンク(GenBank)番号:CAB14105、Z99115)を含む、極めて多数の微生物から入手可能である。
「分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびCO2への変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼは、EC番号4.1.1.72として知られ、限定はされないが、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)(ジェンバンク(GenBank)番号:AAS49166、AY548760;CAG34226(配列番号36)、AJ746364)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_461346、NC_003197)、およびクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_149189、NC_001988)を含む多数の供給源から入手可能である。
「分岐鎖アルコール脱水素酵素」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒する酵素を示す。好ましい分岐鎖アルコール脱水素酵素は、EC番号1.1.1.265として知られるが、他のアルコール脱水素酵素(具体的にはEC1.1.1.1または1.1.1.2)下でも分類可能である。これらの酵素では、電子供与体としてNADH(還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)および/またはNADPHが用いられ、限定はされないが、サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_010656、NC_001136;NP_014051、NC_001145)、大腸菌(E.coli)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_417484(配列番号38)、NC_000913(配列番号37))、およびクロストリジウム・アセトブチリカム(C.acetobutylicum)(ジェンバンク(GenBank)番号:NP_349892、NC_003030)を含む多数の供給源から入手可能である。
「遺伝子」という用語は、場合によりコード配列の上流(5’非コード配列)および下流(3’非コード配列)の調節配列を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示し、天然に同時に見出されることのない調節およびコード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含みうるが、天然に見出されるものとは異なる様式で配列されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内のその天然の位置における天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されることはないが宿主生物に遺伝子導入によって導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。
本明細書で用いられる「コード配列」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を示す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流(5’非コード配列)、コード配列内、またはその下流(3’非コード配列)に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、RNAのプロセシングまたは安定性あるいは翻訳に作用する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能RNAの発現を制御可能なDNA配列を示す。一般に、コード配列はプロモーター配列の3’側に位置する。プロモーターは、その全体として天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されるか、またはさらに合成DNAセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種における、あるいは発生の異なる段階で、あるいは異なる環境または生理的状態に応答して遺伝子の発現を誘導可能であることが当業者により理解されている。大部分の細胞種内でほぼ常に遺伝子の発現を誘導するプロモーターが一般に「構成プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に限定されていないことから、異なる長さのDNA断片が同一のプロモーター活性を有しうることと理解されている。
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を受けるような核酸配列の単一の核酸断片上への結合を示す。例えば、プロモーターが、そのコード配列の発現に効果を及ぼすことが可能である(すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある)場合、コード配列に作動可能に連結されている。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結されうる。
本明細書で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス(mRNA)またはアンチセンスRNAの転写および安定な蓄積を示す。発現はmRNAのポリペプチドへの翻訳も示しうる。
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、核酸断片の宿主生物への転移を示し、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない、遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖DNA断片の形態である特別な染色体要素を示す。かかる要素は、任意の供給源に由来する直鎖状または環状の一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAにおける自己複製配列、ゲノム結合(integrating)配列、ファージまたはヌクレオチド配列である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が適切な3’未翻訳配列を有する選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびDNA配列を細胞に導入可能な固有の作成物に連結されるかまたは組換えられている。「形質転換ベクター」は、外来遺伝子を有し、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する、外来遺伝子に加わる要素を有する特定のベクターを示す。
本明細書で用いられる「コドン縮重」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」について十分理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現を意図して遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。
「コドンが最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換における核酸分子の遺伝子またはコード領域を示すとき、DNAによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドンの使用を反映するための核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を示す。
ここで用いられる標準の組換えDNAおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック J.(Sambrook J.)、フリッツ E.F.(Fritsch E.F.)およびマニアティス T.(Maniatis T.)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989年)(以後「マニアティス(Maniatis)」);シルハヴィ T.J.(Silhavy T.J.)、ベナン M.L.(Bennan M.L.)、およびエンキスト L.W.(Enquist L.W.)、「Experiments with Gene Fusions」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1984年);ならびにアウスベル F.M.(Ausubel F.M.)ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ・インターサイエンス(Greene Publishing Assoc. and Wiley−Interscience)発行(1987年)に記載されている。
本明細書で用いられる「発明(invention)」または「本発明(present invention)」という用語は、提示されるまたは後に補正および補足がなされる特許請求の範囲あるいは本明細書において記載の本発明のすべての実施形態に一般に適用することを意味する。
一実施形態では、本発明はブタノール耐性微生物を単離するための方法を提供する。方法は、下記に詳述されるように、微生物コンソーシアムを成長条件下で濃縮するステップと、濃縮されたコンソーシアムをブタノールと接触させるステップと、を含む。アルコール、特にブタノールに対して高い耐性を示す、本発明の方法により同定された微生物も提供される。これらの同定された微生物はまた、2−ブタノンおよびエタノールに対しても高い耐性を有する。これらのブタノール耐性微生物は、ブタノール生合成経路または2−ブタノン生合成経路を含むように遺伝子操作可能であり、かつ高力価に至る1−ブタノール、2−ブタノール、イソブタノール、または2−ブタノンの生物学的生成において使用可能である。
ブタノール耐性微生物の単離
ブタノール耐性微生物は、排水汚泥などの環境試料ならびにブタノールおよび/または他の溶媒に暴露される場合の他の環境から得られる試料から単離されうる。例えば、環境試料は化学プラントでの排水処理施設から入手可能である。産業排水用バイオリアクターは、様々な有機溶媒の存在下での長期間の成長が理由で、望ましい耐性の表現型を有する微生物の環境試料における特に適した供給源である(ブラムッチ(Bramucci)ら、Trends Biotechnol.18:501−505頁(2000年))。ブタノール耐性微生物は、同様に他の微生物試料から単離されうる。例えば、微生物試料は、純粋な細菌株の化学的に突然変異が誘発された微生物集団、マルチコピープラスミドライブラリーを有する微生物株、または特定の株のトランスポゾンでタグ化された突然変異体の集団でありうる。混合集団を含むこれらの微生物試料のいずれかが微生物コンソーシアムを含むといわれている。
ブタノール耐性微生物は、排水汚泥などの環境試料ならびにブタノールおよび/または他の溶媒に暴露される場合の他の環境から得られる試料から単離されうる。例えば、環境試料は化学プラントでの排水処理施設から入手可能である。産業排水用バイオリアクターは、様々な有機溶媒の存在下での長期間の成長が理由で、望ましい耐性の表現型を有する微生物の環境試料における特に適した供給源である(ブラムッチ(Bramucci)ら、Trends Biotechnol.18:501−505頁(2000年))。ブタノール耐性微生物は、同様に他の微生物試料から単離されうる。例えば、微生物試料は、純粋な細菌株の化学的に突然変異が誘発された微生物集団、マルチコピープラスミドライブラリーを有する微生物株、または特定の株のトランスポゾンでタグ化された突然変異体の集団でありうる。混合集団を含むこれらの微生物試料のいずれかが微生物コンソーシアムを含むといわれている。
本発明の一実施形態では、微生物試料は過剰な成長栄養素を有する成長培地内で培養されることにより、その中に含有される微生物コンソーシアムがコンソーシアムのメンバーが成長するようになるまで濃縮される。一実施形態では、培養物は対数期に成長している。成長培地は発酵性炭素源を含有し、適切なレベルの窒素、リン、硫黄、および塩を含有しうる。微生物コンソーシアムの成長にとって必要なこれらの栄養素の適切なレベルは当業者には周知であり、非限定的例が下記に提供される。発酵性炭素源は、限定はされないが、スクロース、フルクトース、グルコース、およびそれらの混合物を含む、微生物コンソーシアムのメンバーにより容易に代謝される任意の炭素源でありうる。発酵性炭素源はまた、脂肪酸、酪酸または吉草酸などのカルボン酸でありうる。炭素源は、典型的には約0.1%w/v(重量/容量)〜約1.5%w/vの濃度で存在する。窒素源は、限定はされないが、アンモニウム塩または酵母抽出物を含む任意の適切な窒素源でありうる。窒素源は、典型的には約10mMの濃度で成長培地内に存在する。リンはリン酸塩、例えばリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムの形態で培地内に存在する場合があり、典型的には約50mMの濃度で成長培地内に存在する。硫黄は硫酸塩、例えば硫酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムの形態で培地内に存在する場合があり、典型的には約10mMの濃度で成長培地内に存在する。さらなる塩が、限定はされないが、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化第二鉄、塩化第一鉄、塩化亜鉛、塩化第二銅、塩化コバルト、およびモリブデン酸ナトリウムを含む。これらの塩は、典型的には約1μM〜約2mMの濃度で成長培地内に存在する。成長培地は塩酸チアミンなどのビタミンも含有しうる。
濃縮培養物が、約25℃〜約60℃の温度で、試料中の微生物コンソーシアムのメンバーが成長を示すのに十分な時間、典型的には約12時間〜約24時間成長される。培養物は、撹拌の有無にかかわらず、嫌気性、微好気性、または好気性条件の下で成長可能である。当業者により容易に理解されるように、嫌気性条件は酸素を含まない条件であり、好気性条件は酸素を含む条件であり、かつ微好気性条件は酸素が空気中に見出されるレベル未満、すなわち21%未満で存在する場合の条件である。培養物の成長が、光学密度を典型的には600nmの波長で測定することにより監視可能である。
次いで、成長中の濃縮培養物はブタノールと接触される。この接触するステップは、濃縮培養物を、ブタノールを含有する新鮮成長培地で希釈することにより行われうる。それは濃縮培養物がこの時点で対数期に成長している場合に特に適切である。用いられるブタノール濃度は約0.8%w/v〜約3.0%w/v、好ましくは約0.8%w/v〜約2.0%w/vである。一実施形態では、ブタノールは主に1−ブタノールである。別の実施形態では、ブタノールは主に2−ブタノールである。別の実施形態では、ブタノールは主にイソブタノールである。本明細書で用いられるように、主にとはブタノール全体の少なくとも約90重量%を意味する。さらに、1−ブタノール、2−ブタノール、およびイソブタノールのうちの2つ以上の様々な組み合わせを含む混合物が使用可能である。培養物は、有意な成長が観察されるまでの時間にわたり成長される。場合により、有意な成長を示す培養物をブタノールと再び1回以上接触させることで、ブタノールに対する増強された耐性について選択することが可能である。各接触は、ブタノール濃度を漸増させなが
ら実施されうる。
ら実施されうる。
次いで、ブタノールと接触された微生物コンソーシアムは分離され、個々の株が単離される。細胞単離の複数の手段については当業者に既知であり、液体または固体培地のいずれかを含む。例えば、ブタノールと接触された微生物コンソーシアムは、ブタノールを含有する場合も含有しない場合もある固体培地、例えば栄養寒天培地、ルリア・ベルターニ(Luria Bertani)(LB)寒天、修飾されたLB寒天(すなわち発酵性炭素源および塩が補充されたLB寒天)、または寒天を有する最小濃縮培地の上にプレーティング可能である。ブタノールが固体培地内に存在する場合、その濃度は典型的には約1.2%w/v〜約3%w/vである。培養物はコロニーが形成されるまで成長される。次いで、コロニーは当該技術分野で既知の方法を用いて単離され、ブタノール耐性微生物がもたらされる。例えば、下記に記載のように、固体培地由来のコロニーは回収され、当該技術分野で既知の方法を用いて同定されうる。あるいは、固体培地由来のコロニーは、ブタノールを含有しない液体または固体のいずれかの成長培地(例えば最小濃縮培地)に接種可能である。細胞は、成長後に回収され、同定されうる。場合により、コロニー由来の細胞は、ブタノールの存在下、液体または固体成長培地(例えば最小濃縮培地)内のいずれかで成長されうる。典型的には、培地内のブタノール濃度は約1.2%w/v〜約3%w/vである。ブタノールの存在下で成長中の細胞は回収される。単離された微生物は、当該技術分野で既知の方法、例えば16SリボソームRNA(rRNA)遺伝子の配列決定、脂肪酸の特性分析、またはリボタイピングを用いて同定可能である。
本発明の方法により単離されたブタノール耐性微生物は、固体培地上、37℃で成長される場合には少なくとも2.5%のブタノール(すなわち、1−ブタノール、2−ブタノール、またはイソブタノール)、または液体培地内、37℃で成長される場合には少なくとも2.0%w/vのブタノールに耐性がある。微生物のブタノール耐性が典型的には液体培地上で成長される場合よりも固体培地上で成長される場合の方が高いことは注目されるべきである。さらに、微生物のブタノール耐性は成長温度に依存し、典型的にはより低い成長温度でより高い。濃縮された微生物コンソーシアムを1−ブタノールと接触させて単離された微生物は、一般に他のブタノールならびに2−ブタノンおよびエタノールにも耐性がある。例えば、1−ブタノールを用いて単離された微生物は2−ブタノールおよびイソブタノールにも耐性がある。
本方法を用いて単離された株の耐性は、添加される試験化学物質を含有する液体培地内での成長についてIC50値を判定することにより評価可能である。IC50値は50%の成長阻害を誘発する化学物質の濃度である。本明細書中の実施例1および2に示されるように、1−ブタノールにおける1.8%w/v、イソブタノールにおける2.4%w/v、2−ブタノールにおける3.1%w/v、2−ブタノンにおける4.5%w/vおよびエタノールにおける5.9%w/vというIC50値が選択された株内で判定された。同定された耐性株は、1−ブタノールを含有する固体培地上での株の成長、これらのIC50値および1−ブタノールに対する耐性と他の各試験化合物に対する耐性の間に見られる相関に基づくと、2.7%w/vのイソブタノール、3.9%w/vの2−ブタノール、5.0%w/vの2−ブタノン、または9.0%w/vのエタノールを含有する固体培地上で成長することが予想される。
濃縮培養物はまた、ケモスタットバイオリアクター内の連続培養物中で成長され、ブタノールと接触されうる。ケモスタットバイオリアクター内の細胞は、希釈率の適切な調節により様々な成長速度で成長可能である。ケモスタットの培養物における通気およびpHが正確に制御可能であることから、より高い細胞密度がもたらされる。さらに、ブタノールは供給組成物の調節により濃度増加において徐々に添加可能である。バイオリアクター内での濃縮培養物とブタノールとの接触後、ブタノール耐性微生物は上記のように単離され、同定される。
意外なことに、本明細書中の実施例において本発明の方法を用いて同定された多数のブタノール耐性微生物が乳酸桿菌(Lactobacillus)属に属する細菌であった。乳酸桿菌(Lactobacillus)は通性嫌気性、グラム陽性、非運動性、棒状体細胞である(「Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology」、第2巻、スニース(Sneath)ら編;メリーランド州ボルチモア(Baltimore)のウィリアムズ・アンド・ウィルキンス(Williams&Wilkins)、1986年、1063−1065頁)。ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)株は、16S rRNA遺伝子配列(配列番号41、42、43、および44)を決定することにより本明細書中でさらに特徴づけられ、それによりプランタラム菌(Lactobacillus plantarum)およびラクトバチルス・アリゾネンシス(Lactobacillus arizonensis)株であることが同定された。
ブタノール耐性微生物を単離するための本方法を改良することで、ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)の選択的単離が可能である。例えば、乳酸桿菌(Lactobacillus)は、Bacto Lactobacilli MRS寒天などの乳酸菌培地を用いる、乳酸桿菌(Lactobacilli)を培養するための標準的方法を用いて種々の環境から濃縮され、次いで1−ブタノールへの耐性についてスクリーニングされうる。
単離されたブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)株は、遺伝子操作によりブタノール生合成経路またはブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含みうるとともに、適切な条件下で成長されることでブタノールまたはブタノンの生成が可能である。ブタノール生合成経路は、1−ブタノール、2−ブタノール、またはイソブタノール生合成経路でありうる。
1−ブタノール生合成経路
1−ブタノールを生成するための生合成経路は、ドナルドソン(Donaldson)らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第11/527995号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に記載されている。この生合成経路は、
a)アセチル−CoAからアセトアセチル−CoAへ(例えば配列番号1または3として示される遺伝子によりコードされるアセチル−CoAアセチルトランスフェラーゼにより触媒される)、
b)アセトアセチル−CoAから3−ヒドロキシブチリル−CoAへ(例えば配列番号5として示される遺伝子によりコードされる3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素により触媒される)、
c)3−ヒドロキシブチリル−CoAからクロトニル−CoAへ(例えば配列番号7として示される遺伝子によりコードされるクロトナーゼにより触媒される)、
d)クロトニル−CoAからブチリル−CoAへ(例えば配列番号9として示される遺伝子によりコードされるブチリル−CoA脱水素酵素により触媒される)、
e)ブチリル−CoAからブチルアルデヒドへ(例えば配列番号11として示される遺伝子によりコードされるブチルアルデヒド脱水素酵素により触媒される)、および
f)ブチルアルデヒドから1−ブタノールへ(例えば配列番号13または15として示される遺伝子によりコードされる1−ブタノール脱水素酵素により触媒される)、
といった基質から生成物への変換を含む。
1−ブタノールを生成するための生合成経路は、ドナルドソン(Donaldson)らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第11/527995号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に記載されている。この生合成経路は、
a)アセチル−CoAからアセトアセチル−CoAへ(例えば配列番号1または3として示される遺伝子によりコードされるアセチル−CoAアセチルトランスフェラーゼにより触媒される)、
b)アセトアセチル−CoAから3−ヒドロキシブチリル−CoAへ(例えば配列番号5として示される遺伝子によりコードされる3−ヒドロキシブチリル−CoA脱水素酵素により触媒される)、
c)3−ヒドロキシブチリル−CoAからクロトニル−CoAへ(例えば配列番号7として示される遺伝子によりコードされるクロトナーゼにより触媒される)、
d)クロトニル−CoAからブチリル−CoAへ(例えば配列番号9として示される遺伝子によりコードされるブチリル−CoA脱水素酵素により触媒される)、
e)ブチリル−CoAからブチルアルデヒドへ(例えば配列番号11として示される遺伝子によりコードされるブチルアルデヒド脱水素酵素により触媒される)、および
f)ブチルアルデヒドから1−ブタノールへ(例えば配列番号13または15として示される遺伝子によりコードされる1−ブタノール脱水素酵素により触媒される)、
といった基質から生成物への変換を含む。
経路はATPを全く必要とせず、NAD+および/またはNADP+を生成することから、アセチル−CoAを生成する中央代謝経路と均衡する。
2−ブタノールおよび2−ブタノン生合成経路
2−ブタノールおよび2−ブタノンを生成するための生合成経路は、ドナルドソン(Donaldson)らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第11/741892号明細書および米国特許出願第11/741916号明細書(参照により本明細書中に援用される)の中に記載されている。1つの2−ブタノール生合成経路が、
a)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ(例えば配列番号19として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼにより触媒される)、
b)α−アセト乳酸からアセトインへ(例えば配列番号17として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒される)、
c)アセトインから2,3−ブタンジオールへ(例えば配列番号21として示される遺伝子によりコードされるブタンジオール脱水素酵素により触媒される)、
d)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ(例えば配列番号23、25、および27として示される遺伝子によりコードされるブタンジオールデヒドラターゼにより触媒される)、および
e)2−ブタノンから2−ブタノールへ(例えば配列番号29として示される遺伝子によりコードされる2−ブタノール脱水素酵素により触媒される)、
といった基質から生成物への変換を含む。
2−ブタノールおよび2−ブタノンを生成するための生合成経路は、ドナルドソン(Donaldson)らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第11/741892号明細書および米国特許出願第11/741916号明細書(参照により本明細書中に援用される)の中に記載されている。1つの2−ブタノール生合成経路が、
a)ピルビン酸塩からα−アセト乳酸へ(例えば配列番号19として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼにより触媒される)、
b)α−アセト乳酸からアセトインへ(例えば配列番号17として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸デカルボキシラーゼにより触媒される)、
c)アセトインから2,3−ブタンジオールへ(例えば配列番号21として示される遺伝子によりコードされるブタンジオール脱水素酵素により触媒される)、
d)2,3−ブタンジオールから2−ブタノンへ(例えば配列番号23、25、および27として示される遺伝子によりコードされるブタンジオールデヒドラターゼにより触媒される)、および
e)2−ブタノンから2−ブタノールへ(例えば配列番号29として示される遺伝子によりコードされる2−ブタノール脱水素酵素により触媒される)、
といった基質から生成物への変換を含む。
上記経路の最後のステップ(e)を省略することにより、メチルエチルケトン(MEK)としても知られる2−ブタノンを生成するための生合成経路が提供される。
イソブタノール生合成経路
イソブタノールを生成するための生合成経路は、マッジオ−ホール(Maggio−Hall)らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第11/586315号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に記載されている。1つのイソブタノール生合成経路が、
a)ピルビン酸塩からアセト乳酸塩へ(例えば配列番号19として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼにより触媒される)、
b)アセト乳酸から2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸へ(例えば配列番号31として示される遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒される)、
c)2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ(例えば配列番号33として示される遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒される)、
d)α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ(例えば配列番号35として示される遺伝子によりコードされる分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される)、および
e)イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ(例えば配列番号37として示される遺伝子によりコードされる分岐鎖アルコール脱水素酵素により触媒される)、
といった基質から生成物への変換を含む。
イソブタノールを生成するための生合成経路は、マッジオ−ホール(Maggio−Hall)らによる同時係属および共同所有の米国特許出願第11/586315号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に記載されている。1つのイソブタノール生合成経路が、
a)ピルビン酸塩からアセト乳酸塩へ(例えば配列番号19として示される遺伝子によりコードされるアセト乳酸シンターゼにより触媒される)、
b)アセト乳酸から2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸へ(例えば配列番号31として示される遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼにより触媒される)、
c)2,3−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へ(例えば配列番号33として示される遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼにより触媒される)、
d)α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへ(例えば配列番号35として示される遺伝子によりコードされる分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼにより触媒される)、および
e)イソブチルアルデヒドからイソブタノールへ(例えば配列番号37として示される遺伝子によりコードされる分岐鎖アルコール脱水素酵素により触媒される)、
といった基質から生成物への変換を含む。
ブタノールまたはブタノンを生成するための乳酸桿菌(Lactobacillus)宿主の作成
発酵性炭素基質をブタノールまたはブタノンに変換するための酵素経路の1つとして酵素をコードする必要な遺伝子を有する組換えブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)株は、当該技術分野で周知の技術を用いて作成されうる。プランタラム菌(L.plantarum)、サリバリウス菌(L.salivarius)、ラクトバチルス・サケイ(L.sakei)、ラクトバチルス・ジョンソニー(L.johnsonii)、アシドフィルス菌(L.acidophilus)およびブルガリア乳酸菌(L.delbrueckii)のゲノム配列は、既知であり(国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)データベース)、
・プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)WCFS1、完全ゲノム
gi|28376974|ref|NC_004567.1|[28376974]
・ラクトバチルス・サリバリウス・サブエスピー・サリバリウス(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)UCC118、完全ゲノム
gi|90960990|ref|NC_007929.1|[90960990]
・ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)株23K、完全ゲノム
gi|78609255|emb|CR936503.1|[78609255]
・ラクトバチルス・ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)NCC533、完全ゲノム
gi|42518084|ref|NC_005362.1|[42518084]
・アシドフィルス菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM、完全ゲノム
gi|58336354|ref|NC_006814.1|[58336354]
・ラクトバチルス・デルブレッキー・サブエスピー・ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC11842、完全ゲノム
gi|104773257|ref|NC_008054.1|[104773257]といったジェンバンク(genbank)(商標)の識別番号である。
発酵性炭素基質をブタノールまたはブタノンに変換するための酵素経路の1つとして酵素をコードする必要な遺伝子を有する組換えブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)株は、当該技術分野で周知の技術を用いて作成されうる。プランタラム菌(L.plantarum)、サリバリウス菌(L.salivarius)、ラクトバチルス・サケイ(L.sakei)、ラクトバチルス・ジョンソニー(L.johnsonii)、アシドフィルス菌(L.acidophilus)およびブルガリア乳酸菌(L.delbrueckii)のゲノム配列は、既知であり(国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)データベース)、
・プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)WCFS1、完全ゲノム
gi|28376974|ref|NC_004567.1|[28376974]
・ラクトバチルス・サリバリウス・サブエスピー・サリバリウス(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)UCC118、完全ゲノム
gi|90960990|ref|NC_007929.1|[90960990]
・ラクトバチルス・サケイ(Lactobacillus sakei)株23K、完全ゲノム
gi|78609255|emb|CR936503.1|[78609255]
・ラクトバチルス・ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)NCC533、完全ゲノム
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・アシドフィルス菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM、完全ゲノム
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・ラクトバチルス・デルブレッキー・サブエスピー・ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC11842、完全ゲノム
gi|104773257|ref|NC_008054.1|[104773257]といったジェンバンク(genbank)(商標)の識別番号である。
これらの細菌は32%〜49%の範囲のG+C含量を有する。
本発明では、上記のブタノールまたはブタノン生合成経路の一方の酵素をコードする遺伝子が様々な供給源から単離されうる(上記参照)。細菌ゲノムから所望の遺伝子を得る方法については一般的であり、かつ分子生物学分野で周知である。例えば、遺伝子の配列が既知である場合、プライマーを設計し、所望の配列をポリメラーゼ連鎖反応などの標準のプライマー特異的増幅方法(米国特許第4,683,202号明細書)を用いて増幅することで、形質転換ベクターへのクローニングに対して適量のDNAを得ることが可能である。既知の配列に対して異種の遺伝子が単離されることになる場合、適切なゲノムライブラリーが制限エンドヌクレアーゼ消化により生成され、所望の遺伝子配列に対して相補配列を有するプローブを用いてスクリーニングされうる。一旦配列が単離されると、DNAをポリメラーゼ連鎖反応などの標準のプライマー特異的増幅方法(米国特許第4,683,202号明細書)を用いて増幅することで発現ベクターへのクローニングに対して適量のDNAが得ることが可能であり、それは次いで適切な宿主細胞に形質転換される。
さらに、所望の酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列を仮定すると、コード配列はタンパク質配列の逆翻訳により確認されうる。コード配列を有するDNA断片が、合成的に調製され、発現ベクターにクローニングされ、次いで所望の宿主細胞に形質転換されうる。
コード配列を有する合成DNA断片の調製においては、この配列は標的宿主細胞内での発現に最適化されうる。異種宿主内での発現におけるコドン最適化のためのツールは容易に用いられうる。
一旦、関連の経路の遺伝子が同定されかつ単離されると、それらは当該技術分野で周知の手段により、ベクターに挿入され、ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)宿主に形質転換されうる。乳酸桿菌(Lactobacillus)の形質転換にとって有用なベクターについては既知である(下記参照)。典型的には、ベクターまたはカセットは、挿入されたDNA断片の転写および翻訳を誘導する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体組込みを可能にする配列を有する。適切なベクターは、転写開始制御を内在する挿入されたDNA断片の5’領域および転写終結を制御するDNA断片の3’領域を含む。両方の制御領域は形質転換宿主細胞に相同な遺伝子から誘導可能であるが、かかる制御領域が特定の生成宿主に対して天然でない遺伝子からも誘導可能であることが理解されるべきである。
開始制御領域またはプロモーターは、所望の乳酸桿菌(Lactobacillus)宿主細胞内での関連の経路をコードする領域の発現を駆動するのに有用であり、他の乳酸菌または他のグラム陽性生物から得ることが可能である。非限定例としてラクトコッカス(Lactococcus)由来のnisAプロモーターが挙げられる。終結制御領域は、好ましい宿主または関連の細菌に対して天然の様々な遺伝子からも得ることが可能である。場合により終結部位が不要である場合があるが、含まれる場合が最も好ましい。
乳酸桿菌(Lactobacillus)属はラクトバチルス目(Lactobacillales)ファミリーに属し、枯草菌(Bacillus subtilis)および連鎖球菌(Streptococcus)の形質転換において用いられる多数のプラスミドおよびベクターが乳酸桿菌(Lactobacillus)に用いられうる。適切なベクターの非限定例として、pAMβ1およびその誘導体(ルノー(Renault)ら、Gene 183:175−182頁(1996年);およびオサリバン(O’Sullivan)ら、Gene 137:227−231頁(1993年))、pMBB1およびpHW800、pMBB1の誘導体(ウィコッフ(Wyckoff)ら Appl.Environ.Microbiol.62:1481−1486頁(1996年));pMG1、複合プラスミド(タニモト(Tanimoto)ら、J.Bacteriol.184:5800−5804頁(2002年));pNZ9520(クレールベゼム(Kleerebezem)ら、Appl.Environ.Microbiol.63:4581−4584頁(1997年));pAM401(フジモト(Fujimoto)ら、Appl.Environ.Microbiol.67:1262−1267頁(2001年));ならびにpAT392(アーサー(Arthur)ら、Antimicrob.Agents Chemother.38:1899−1903頁(1994年))が挙げられる。プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)由来の数種のプラスミドも報告されており(ヴァン・クラネンバーグ R.(van Kranenburg R.)、ゴリック N.(Golic N.)、ボンジャース R.(Bongers R.)、レア R.J.(Leer R.J.)、デ・ボス W.M.(de Vos W.M.)、ジーゼン R.J.(Siezen R.J.)、クリーレベゼム M.(Kleerebezem M.) Appl.Environ.Microbiol.2005年3月;71(3):1223−1230頁)、それらは形質転換において用いられうる。
ブタノールまたはブタノン生合成経路用の様々な遺伝子は、例えば上記の任意の適切なベクターに構築可能である。コドンは、例えばプランタラム菌(Lactobacillus plantarum)またはラクトバチルス・アリゾネンシス(Lactobacillus arizonensis)における宿主株のゲノム配列から推定されるコドンインデックス(codon index)に基づいて発現のために最適化されうる。プラスミドは、クルス−ロッズ(Cruz−Rodz)ら、(Molecular Genetics and Genomics 224:1252−154頁(1990年))、ブリンゲル(Bringel)およびユベール(Hubert)(Appl.Microbiol.Biotechnol.33:664−670頁(1990年))、ならびにテレサ・アレグレ(Teresa Alegre)、ロドリゲス(Rodriguez)およびメサス(Mesas)(FEMS Microbiology letters
241:73−77頁(2004年))といった参考文献のいずれかに記載の当該技術分野で既知の方法、例えばエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入可能である。プラスミドは複合によりプランタラム菌(Lactobacillus plantarum)にも導入可能である(シュラゴ(Shrago)、シャッシー(Chassy)およびドブロゴス(Dobrogosz) Appl.Environ.Micro.52:574−576頁(1986年))。ブタノールまたはブタノン生合成経路遺伝子は、組込みベクターを用いて乳酸桿菌(Lactobacillus)の染色体に組込み可能である(ホルス(Hols)ら Appl.Environ.Micro.60:1401−1403頁(1990年);ジャン(Jang)ら、Micro.Lett.24:191−195頁(2003年))。
241:73−77頁(2004年))といった参考文献のいずれかに記載の当該技術分野で既知の方法、例えばエレクトロポレーションを用いて宿主細胞に導入可能である。プラスミドは複合によりプランタラム菌(Lactobacillus plantarum)にも導入可能である(シュラゴ(Shrago)、シャッシー(Chassy)およびドブロゴス(Dobrogosz) Appl.Environ.Micro.52:574−576頁(1986年))。ブタノールまたはブタノン生合成経路遺伝子は、組込みベクターを用いて乳酸桿菌(Lactobacillus)の染色体に組込み可能である(ホルス(Hols)ら Appl.Environ.Micro.60:1401−1403頁(1990年);ジャン(Jang)ら、Micro.Lett.24:191−195頁(2003年))。
発酵培地
ブタノールまたはブタノンを生成するための発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質は、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、砂糖液(sugar beet molasses)、および大麦モルト(barley malt)などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、およびさとうもろこし(Sweet sorghum)などの原料から入手可能である。グルコースおよびデキストロースは、とうもろこし、小麦、ライ麦、大麦、およびオート麦などの穀物を含むデンプンベースの原料の糖化を通じて得ることが可能である。
ブタノールまたはブタノンを生成するための発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質は、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、砂糖液(sugar beet molasses)、および大麦モルト(barley malt)などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。スクロースは、サトウキビ、甜菜、キャッサバ、およびさとうもろこし(Sweet sorghum)などの原料から入手可能である。グルコースおよびデキストロースは、とうもろこし、小麦、ライ麦、大麦、およびオート麦などの穀物を含むデンプンベースの原料の糖化を通じて得ることが可能である。
さらに、発酵性糖が、セルロース系およびリグノセルロース系のバイオマスから、例えば共同所有および同時係属の米国特許出願公開第20070031918A1号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に記載の前処理および糖化のプロセスを通じて得ることが可能である。バイオマスは、任意のセルロース系またはリグノセルロース系の原料を示し、セルロースを含有し、かつ場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および/または単糖をさらに含有する原料を含む。バイオマスは、追加成分、例えばタンパク質および/または脂質も含有しうる。バイオマスは単一の供給源から誘導されうるか、またはバイオマスは2つ以上の供給源から誘導される混合物を含有する可能性があり、バイオマスは、例えばとうもろこし穂軸(corn cob)およびコーンストーバーの混合物または草および葉の混合物を含有しうる。バイオマスは、限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、地方自治体の固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙から排出される汚泥、庭ごみ、廃材および林業廃棄物を含む。バイオマスの例として、限定はされないが、とうもろこし粒、とうもろこし穂軸、とうもろこしの皮などのとうもろこし残渣、コーンストーバー、草、小麦、麦かん(wheat straw)、大麦、麦かん(barley straw)、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、トウキビバガス、さとうもろこし、大豆、穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、シュラブおよびブッシュのミリングから得られる成分、野菜、果物、花ならびに家畜糞尿が挙げられる。
上記の炭素基質およびそれらの混合物のすべてが本発明において適すると考えられるが、好ましい炭素基質はグルコース、フルクトース、およびスクロースである。
発酵培地は、適切な炭素源に加え、ブタノールまたはブタノンの生成に必要な培養物の成長および酵素経路の促進に適する、当業者に既知の、適切なミネラル、塩、共同因子、
緩衝液および他の成分を含有する必要がある。
緩衝液および他の成分を含有する必要がある。
培養条件
典型的には、適切な培地内、約25℃〜約40℃の範囲内の温度で細胞が成長される。本発明における適切な成長培地は、Bacto Lactobacilli MRS培養液またはAgar(ディフコ(Difco))、ルリア・ベルターニ(LB)培養液、サブロー・デキストロース(Sabouraud Dextrose)(SD)培養液または酵母培地(YM)培養液などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定または合成された成長培地も用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適する培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン2’:3’−一リン酸の使用についても発酵培地に取り込まれうる。
典型的には、適切な培地内、約25℃〜約40℃の範囲内の温度で細胞が成長される。本発明における適切な成長培地は、Bacto Lactobacilli MRS培養液またはAgar(ディフコ(Difco))、ルリア・ベルターニ(LB)培養液、サブロー・デキストロース(Sabouraud Dextrose)(SD)培養液または酵母培地(YM)培養液などの一般的な商業的に調製された培地である。他の限定または合成された成長培地も用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適する培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン2’:3’−一リン酸の使用についても発酵培地に取り込まれうる。
発酵に適するpH範囲はpH5.0〜pH9.0であり、初期条件としてはpH6.0〜pH8.0が好ましい。
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、嫌気性または微好気性条件が好ましい。
工業用バッチおよび連続発酵
発酵のバッチ方法を用い、ブタノールまたはブタノンが生成可能である。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。標準のバッチシステムに対する変形がフェドバッチシステムである。フェドバッチ発酵プロセスは本発明においても適切であり、発酵の進行につれて基質が発酵プロセスごとに添加されること以外では典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や培地内に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。バッチおよびフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例がトーマス D.(Thomas D.)「Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology」、第2版(1989年) マサチューセッツ州サンダーランド(Sunderland)のシナウアー・アソシエーツ(Sinauer Associates,Inc.)またはデシュパンデ・ムクンド V.(Deshpande,Mukund V.)、Appl.Biochem.Biotechnol.、36:227頁(1992年)(参照により本明細書中に援用される)において見出されうる。
発酵のバッチ方法を用い、ブタノールまたはブタノンが生成可能である。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。標準のバッチシステムに対する変形がフェドバッチシステムである。フェドバッチ発酵プロセスは本発明においても適切であり、発酵の進行につれて基質が発酵プロセスごとに添加されること以外では典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や培地内に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。バッチおよびフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例がトーマス D.(Thomas D.)「Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology」、第2版(1989年) マサチューセッツ州サンダーランド(Sunderland)のシナウアー・アソシエーツ(Sinauer Associates,Inc.)またはデシュパンデ・ムクンド V.(Deshpande,Mukund V.)、Appl.Biochem.Biotechnol.、36:227頁(1992年)(参照により本明細書中に援用される)において見出されうる。
ブタノールまたはブタノンは、連続発酵方法を用いても生成可能である。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されかつ等量の条件培地が処理と同時に除去される開放系である。連続発酵では、細胞が主に対数期での成長の最中である場合、一般に一定の高密度で培養物が維持される。連続発酵では、細胞成長または最終生成物濃度に作用する1つの要素またはいくつかの要素の調節が可能になる。連続発酵プロセス用の栄養素および成長因子を調節する方法ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術については産業微生物学分野で周知であり、かつ種々の方法がBrock、上記で詳述されている。
ブタノールまたはブタノンの生成がバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスのいずれかを用いて実施可能であり、かつ発酵における既知のモードであればいずれであっても適することが考えられる。さらに、細胞が細胞触媒全体として基質上に固定化され、かつブタノールまたはブタノンの生成用の発酵条件に従いうることが考えられる。
ブタノールおよび2−ブタノンを発酵培地から単離するための方法
生物学的に生成されたブタノールは、ABE発酵分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる(例えば、デュレ(Durre)、Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639−648頁(1998年)、グルート(Groot)ら、Process.Biochem.27:61−75頁(1992年)、およびその中の参考文献を参照)。例えば、固体が遠心分離、濾過、デカンテーションなどにより発酵培地から除去されうる。次いで、ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。これらの同じ方法は、生物学的に生成された2−ブタノンの発酵培地からの単離に適合しうる。
生物学的に生成されたブタノールは、ABE発酵分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる(例えば、デュレ(Durre)、Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639−648頁(1998年)、グルート(Groot)ら、Process.Biochem.27:61−75頁(1992年)、およびその中の参考文献を参照)。例えば、固体が遠心分離、濾過、デカンテーションなどにより発酵培地から除去されうる。次いで、ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。これらの同じ方法は、生物学的に生成された2−ブタノンの発酵培地からの単離に適合しうる。
本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で示されることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な変更および改良を行うことで、本発明の様々な利用および条件への適合が可能である。
略語の意味は以下の通りである。「min」は分を意味し、「h」は時間を意味し、「s」は秒を意味し、「μL」はマイクロリットルを意味し、「mL」はミリリットルを意味し、「L」はリットルを意味し、「nm」はナノメートルを意味し、「mm」はミリメートルを意味し、「cm」はセンチメートルを意味し、「μm」はマイクロメートルを意味し、「mM」はミリモル濃度を意味し、「M」はモル濃度を意味し、「mmol」はミリモルを意味し、「μmole」はマイクロモルを意味し、「g」はグラムを意味し、「μg」はマイクログラムを意味し、「mg」はミリグラムを意味し、「rpm」は1分当たりの回転数を意味し、「w/v」は重量/容量を意味し、「OD」は光学密度を意味し、「OD600」は600nmの波長で測定された光学密度を意味し、「OD595」は595nmの波長で測定された光学密度を意味し、「IC50」は成長の50%の阻害を誘発するブタノールの濃度を意味し、「GCMS」はガスクロマトグラフィー−質量分析を意味し、かつ「HPLC」は高性能液体クロマトグラフィーを意味する。
一般的方法
本実施例で用いられる標準の組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、サムブルック J.(Sambrook,J.)、フリッツ E.F.(Fritsch,E.F.)およびマニアティス T.(Maniatis,T.)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989年)、T.J.シルハヴィ(T.J.Silhavy)、M.L.ベナン(M.L.Bennan)、およびL.W.エンキスト(L.W.Enquist)、「Experiments with Gene Fusions」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1984年)、ならびにアウスベル F.M.(Ausubel,F.M.)ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、ニューヨーク州のグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス(Greene Publishing Assoc. and Wiley−Interscience)(1987年)により記載されている。
本実施例で用いられる標準の組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、サムブルック J.(Sambrook,J.)、フリッツ E.F.(Fritsch,E.F.)およびマニアティス T.(Maniatis,T.)「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989年)、T.J.シルハヴィ(T.J.Silhavy)、M.L.ベナン(M.L.Bennan)、およびL.W.エンキスト(L.W.Enquist)、「Experiments with Gene Fusions」、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)のコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1984年)、ならびにアウスベル F.M.(Ausubel,F.M.)ら、「Current Protocols in Molecular Biology」、ニューヨーク州のグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス(Greene Publishing Assoc. and Wiley−Interscience)(1987年)により記載されている。
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法についても当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術が、「Manual of Methods for General Bacteriology」、フィリップ・ゲアハート(Phillipp Gerhardt)、R.G.E.マレイ(R.G.E.Murray)、ラルフ N.コスチロウ(Ralph N.Costilow)、ユージン W.ネスター(Eugene W.Nester)、ウィリス A.ウッド(Willis A.Wood)、ノエル R.クリーグ(Noel R.Krieg)およびG.ブリッグス・フィリップス(G.Briggs Phillips)編、ワシントンDC(Washington,DC.)のアメリカ微生物学会(American Society for Microbiology)、1994年、またはトーマス D.(Thomas D.)による「Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology」、第2版、マサチューセッツ州サンダーランド(Sunderland)のシナウアー・アソシエーツ(Sinauer Associates,Inc.)、1989年に見出されうる。細菌細胞の成長および維持に使用されるすべての試薬、制限酵素および材料は、他に特に規定がなければ、アルドリッチ・ケミカルズ(Aldrich Chemicals)(ウィスコンシン州ミルウォーキー(Milwaukee))、BDダイアグノスティック・システムズ(BD Diagnostic Systems)(メリーランド州スパークス(Sparks))、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)(メリーランド州ロックヴィル(Rockville))、またはシグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Company)(ミズーリ州セントルイス(St.Louis))から入手した。
実施例1
連続培養を用いるブタノール耐性菌株の単離
これらの実施例の目的は、ブタノール耐性菌株を単離することであった。環境試料をいくつかの排水処理場から得て、ケモスタットバイオリアクター内での連続培養で1−ブタノールの存在下で成長させた。数種の1−ブタノール耐性菌株を単離し、プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)またはラクトバチルス・アリゾネンシス(Lactobacillus arizonensis)として同定した。
連続培養を用いるブタノール耐性菌株の単離
これらの実施例の目的は、ブタノール耐性菌株を単離することであった。環境試料をいくつかの排水処理場から得て、ケモスタットバイオリアクター内での連続培養で1−ブタノールの存在下で成長させた。数種の1−ブタノール耐性菌株を単離し、プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)またはラクトバチルス・アリゾネンシス(Lactobacillus arizonensis)として同定した。
Applikon Fermentor(ニュージャージー州クリントン(Clinton)のアプリコン(Applikon Inc.))を嫌気性ケモスタットとして運転した。バイオリアクターシステムは、1Lの凹形底リアクター、Controller ADI 1032 P100、ならびにマリンおよびタービンインペラーを有する撹拌器ユニットからなるものであった。適切なセンサを備えるBio Controller ADI 1030 Z510300020でpH、溶解酸素、および温度を監視した。Cole Parmerポンプおよびポンプヘッド(イリノイ州バーノンヒルズ(Vernon Hills)のコールパーマー・インスツルメント(Cole Parmer Instrument Co.))を酸および塩基の添加用に用い、pH7.0を維持した。循環式水槽を用い、温度を37℃で維持した。培地(S20培地)は、5mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.0、10mM硫酸アンモニウム、0.1%酵母抽出物、0.1%カゼアミノ酸(caseamino acids)、100mM MOPS、2mM MgCl2、0.7mM CaCl2、0.05mM MnCl2、0.001mM ZnCl2、0.002mM塩酸チアミン、1.72μM CuCl2、2.53μM CoCl2、2.42μM Na2MoO4、25mMグルコース、12.5mMスクロース、および12.5mMフルクトースからなるものであった。バイオリアクター内では容量500mLのこの培地を用いた。バイオリアクターを0.1〜1.0mL/分の範囲内の供給速度でかつ撹拌器を50rpmの速度で運転した。
バイオリアクターにイー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー(E.I.du Pont de Nemours and Company)の数か所の敷地での異なる排水処理設備から得られた数種の排水汚泥試料の混合物を接種した。バイオリアクターを、バッチモードで短時間運転後、1−ブタノールを培地に濃度増加において徐々に添加する連続供給モードで運転した。培地の流速は0.1〜1.0mL/分の範囲内であった。
バイオリアクター内の細胞密度を600nmでの光学密度の測定により監視した。供給液内の1−ブタノールおよび廃液を、5973 Mass Detectorを備えるHP6890 Gas Chromatograph(デラウェア州ウィルミントン(Wilmington)のアジレント・テクノロジー(Agilent Technologies,Inc))を用い、GCMSにより測定した。GCカラムはDB−WAX、30m×内径0.32mm×0.25μmのカラム(カリフォルニア州フォルソム(Folsom)の(ジェイアンドダブリュー・サイエンティフィック(J&W Scientific,Inc.))であった。あるいは、試料を濾過し(Acrodisc CR PTFE、0.2μmのフィルタ)、Shodex(登録商標)SH−GガードカラムとともにShodex(登録商標)SH1011カラム(内径8mm×長300mm;コロラド州コロラド・スプリングス(Colorado Springs)のショーコー・アメリカ(Shoko America Inc.))を用い、HPLCにより分析した。移動相は0.01Nの硫酸であった。カラム温度は50℃であり、0.5mL/分の流速を用いた。検出においては、210nmでの光度検出器および屈折率検出器を用いた。試料注入容量は10μLであった。
初期調節期間後、供給液を通してバイオリアクターに入る1−ブタノールの量を2.5%w/vまで漸増させた。これと同じ期間内に、バイオリアクターの廃液中のグルコースの量を監視した。供給液内の1−ブタノールの量を増加させた結果、細胞密度が低下し、それに伴いグルコースの利用が低下した。それに続くインキュベーションの結果、細胞密度およびグルコースの利用がより高レベルの1−ブタノールへの適応後に再び増大した。例えば、1−ブタノールを1.6%に増加させた結果、グルコース利用の低下に対応し、細胞密度が1.5未満のOD600に低下した。しかし、それに続くインキュベーションの結果、グルコース消費の増大に対応し、細胞密度が2.3OD600に増加した。
このバイオリアクターからの1−ブタノール耐性菌の純粋株の単離を以下のように行った。バイオリアクターのウェイスト・ジャグ(waste jug)に由来する細胞の試料を連続希釈し、連続希釈物を、1−ブタノールを含有しないトリプチカーゼ大豆寒天(ディフコ(Difco);ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー(Bekton Dickinson and Company);カリフォルニア州サンノゼ(San Jose))上にプレーティングした。次いで、コロニーを、寒天培地から角形ウェルのマイクロタイタープレート(カリフォルニア州フラートン(Fullerton)のベックマン・コールター(Beckman Coulter Inc.);カタログ番号069681)のウェル内の1−ブタノールを含有しないS20培地1.2mLに接種した。角形ウェルのマイクロタイタープレートを粘着性カバー(adhesive cover)(ベックマン・コールター(Beckman Coulter Inc.);カタログ番号538619)で密封し、振とう下、37℃で最大で72時間インキュベートした。角形ウェルのマイクロタイタープレートを用い、マスタープレートを、培養物200μLを各角形ウェルから「U底」マイクロタイタープレート(ペンシルバニア州ウエスト・チェスター(West Chester)のVWRサイエンティフィック・プロダクツ(VWR Scientific Products);カタログ番号62409−052)内の対応するウェルに分注することにより作製した。マスタープレートからの単離物を、Nunc−TSP移動性固相スクリーニング系(イリノイ州ネーパーヴィル(Napersville)のナルジーン・ヌンク・インターナショナル(Nalgene Nunc International);カタログ番号445497)を用い、1.2%〜3.4%の1−ブタノールを含有するS20寒天またはTSA寒天プレート上に複製プレーティングした。耐性単離物を37℃で成長させて24〜72時間後に同定した。3%の1−ブタノールを含有する寒天培地上で成長させた数種の単離物をさらに特徴づけた。
以下のように、単離株のIC50値を37℃で判定した。単離物を、様々な量の1−ブタノールの不在下(対照)および存在下、S30L培地(すなわち、10mM硫酸アンモニウム、5mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.0、50mM MOPS、pH7.0、2mM MgCl2、0.7mM CaCl2、50μM MnCl2、1μM FeCl3、1μM ZnCl2、1.72μM CuCl2、2.53μM CoCl2、2.42μM Na2MoO4、2μM塩酸チアミン、0.01Mグルコース、および0.2%酵母抽出物)内、37℃で培養し、各培養に対する倍加時間を成長曲線の対数部分から計算した(倍加時間=0.693/成長速度)。試料フラスコ内で1−ブタノールによりもたらされる成長阻害パーセントを、100%から成長パーセント([対照フラスコの倍加時間/試料フラスコの倍加時間]×100)を差し引くことにより判定した。IC50は50%の成長阻害をもたらすブタノールの濃度であり、それをブタノール濃度対阻害パーセントのプロットにより判定した。結果を表4にまとめる。
単離物を、各単離物から抽出したDNA内の16S rRNA遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅から得られた産物の配列決定により同定した。DNAを1−ブタノール耐性株の各々から抽出した。各単離物を市販キット(カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad)のモー・バイオ・ラボラトリーズ(Mo Bio Laboratories,Inc)から入手されるUltraclean Microbial Genomic DNA Isolation Kit、部品番号12224−50)を用いて処理した。単離物の16S rRNA遺伝子を、配列番号39として示されるJCR14(ACGGGCGGTGTGTAC)および配列番号40として示されるJCR15(GCCAGCAGCCGCGGTA)といったプライマーを用い、HotStar Taq(カリフォルニア州バレンシア(Valencia)のキアゲン(Qiagen);カタログ番号203446)を用い、PCRにより増幅した。PCR条件は、95℃で15分間、次いで94℃で45秒間、55℃で1分間、および72℃で1分間での30サイクル、次いで72℃で10分間というものであった。PCR産物を精製し、配列決定した。各配列をジェンバンク(GenBank)のBLAST探索におけるクエリー配列として用い、最も類似性が高い、予め同定された16S rRNAの遺伝子配列を決定した。ブタノール耐性があるものとして選択した3種の株をプランタラム菌(Lactobacillus plantarum)として、かつ1種の株をラクトバチルス・アリゾネンシス(Lactobacillus arizonensis)として同定した(表4参照)。
実施例2
1−ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)の他の化合物に対する耐性
この実施例の目的は、1−ブタノールや、追加の化合物の2−ブタノール、イソブタノール、2−ブタノンおよびエタノールに対する耐性に基づいて単離した乳酸桿菌(Lactobacillus)株の耐性を試験することであった。これら化合物のIC50値を、1−ブタノールについて実施例1に記載したように、選択された1−ブタノール耐性プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)PN0512株について判定した。結果を表5にまとめる。
1−ブタノール耐性乳酸桿菌(Lactobacillus)の他の化合物に対する耐性
この実施例の目的は、1−ブタノールや、追加の化合物の2−ブタノール、イソブタノール、2−ブタノンおよびエタノールに対する耐性に基づいて単離した乳酸桿菌(Lactobacillus)株の耐性を試験することであった。これら化合物のIC50値を、1−ブタノールについて実施例1に記載したように、選択された1−ブタノール耐性プランタラム菌(Lactobacillus plantarum)PN0512株について判定した。結果を表5にまとめる。
同定された耐性株は、各化合物について判定したIC50値および1−ブタノールに対する耐性と他の各試験化合物に対する耐性の間に見られる相関に基づき、3.9%w/vの2−ブタノール、2.7%w/vのイソブタノール、5.0%w/vの2−ブタノン、または9.0%w/vのエタノールを含有する固体培地上で成長することが予想される。
Claims (57)
- ブタノール耐性微生物を単離するための方法であって、
a)微生物コンソーシアムを含有する微生物試料を提供すること、
b)上記微生物コンソーシアムを、発酵性炭素源を含有する成長培地と、微生物コンソーシアムのメンバーが成長するまで接触させること、
c)ステップ(b)の成長している微生物コンソーシアムをブタノールと接触させること、および
d)ステップ(c)の生存可能なメンバーを単離すること(ここでブタノール耐性微生物が単離される)、
を含む、方法。 - ステップ(b)の成長しているコンソーシアムが対数増殖期に成長している、請求項1に記載の方法。
- ステップ(c)後、コンソーシアムを固形培地上でプレーティングする、請求項1に記載の方法。
- 固体培地がブタノールを含有する、請求項3に記載の方法。
- ステップ(c)の接触ステップを1回以上繰り返す、請求項1に記載の方法。
- 接触ステップ(c)のブタノール濃度が約0.8%w/v〜約3.0%w/vである、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)の単離が、
i)ブタノールの非存在下液体培地でステップ(d)の生存可能なメンバーを成長させること(これにより生存可能なメンバーが増殖する)、
ii)ブタノールの存在下でステップ(i)の細胞を成長させること、および
iii)ブタノールの存在下で成長するステップ(ii)の細胞を回収すること(ここでブタノール耐性微生物が単離される)、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 発酵性炭素源が、スクロース、フルクトース、グルコース、酪酸、吉草酸およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- ブタノールが主に1−ブタノールである、請求項1に記載の方法。
- ブタノールが主に2−ブタノールである、請求項1に記載の方法。
- ブタノールが主にイソブタノールである、請求項1に記載の方法。
- コンソーシアムを嫌気性条件下で成長させる、請求項1に記載の方法。
- コンソーシアムを微好気性条件下で成長させる、請求項1に記載の方法。
- コンソーシアムを好気性条件下で成長させる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも2.5%w/vの1−ブタノールに耐性である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも3.9%w/vの2−ブタノールに耐性である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも2.7%w/vのイソブタノールに耐性である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも5.0%w/vの2−ブタノンに耐性である、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも9.0%w/vのエタノールに耐性である、請求項1に記載の方法。
- 微生物試料が環境試料である、請求項1に記載の方法。
- ブタノール耐性微生物が乳酸桿菌属の種である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により単離されるブタノール耐性微生物。
- 微生物が乳酸桿菌属の細菌である、請求項22に記載のブタノール耐性微生物。
- ブタノール耐性乳酸桿菌属を単離するための方法であって、
a)微生物コンソーシアムを含む微生物試料を提供すること、
b)発酵性炭素源を含有する培地で乳酸桿菌属が存在する微生物コンソーシアムを増菌し、乳酸桿菌の増菌培養物を生成させること(この中で乳酸桿菌属の増菌培養物のメンバーが成長している)、
c)ステップ(b)の成長している乳酸桿菌属の増菌培養物をブタノールと接触させること、および
d)ステップ(c)の生存可能なメンバーを単離すること(ここでブタノール耐性乳酸桿菌属が単離される)、
を含む、方法。 - ステップ(c)の成長している乳酸桿菌属が対数増殖期に成長している、請求項24に記載の方法。
- 微生物試料が環境試料である、請求項24に記載の方法。
- ステップ(c)後、コンソーシアムのメンバーを固形培地上でプレーティングする、請求項24に記載の方法。
- 固形培地がブタノールを含有する、請求項27に記載の方法。
- 固形培地がブタノールを含有する乳酸菌培地である、請求項28に記載の方法。
- ステップ(c)の接触ステップを1回以上繰り返す、請求項24に記載の方法。
- ステップ(c)の接触ステップが約0.8%w/v〜約3.0%w/vの濃度のブタノールを用いて行われる、請求項24に記載の方法。
- ステップ(d)の単離ステップが、
i)ブタノールの非存在下液体培地でステップ(d)の生存可能なメンバーを成長させること(これにより生存可能なメンバーが増殖する)、
ii)ブタノールの存在下でステップ(i)の細胞を成長させること、および
iii)ブタノールの存在下で成長するステップ(ii)の細胞を回収すること(ここでブタノール耐性微生物が単離される)、
を含む、請求項24に記載の方法。 - 発酵性炭素源がスクロース、フルクトース、グルコース、酪酸、吉草酸およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- ブタノールが主に1−ブタノールである、請求項24に記載の方法。
- ブタノールが主に2−ブタノールである、請求項24に記載の方法。
- ブタノールが主にイソブタノールである、請求項24に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも2.5%w/vの1−ブタノールに耐性である、請求項24に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも3.9%w/vの2−ブタノールに耐性である、請求項24に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも2.7%w/vのイソブタノールに耐性である、請求項24に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも5.0%w/vの2−ブタノンに耐性である、請求項24に記載の方法。
- ステップ(d)の生存可能なメンバーが、固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも9.0%w/vのエタノールに耐性である、請求項24に記載の方法。
- 請求項24に記載の方法により単離されるブタノール耐性乳酸桿菌属。
- 固形培地上で成長させる場合、少なくとも2.5%w/vのブタノールに耐性である、請求項42に記載のブタノール耐性乳酸桿菌属。
- 乳酸桿菌属が、
i)無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ii)グラム陽性であり、かつ
iii)非運動性であり、かつ
iv)桿状の細胞形態を有し、かつ
v)配列番号41、配列番号42、配列番号43、および配列番号44からなる群から選択される16S rRNA遺伝子配列を含む、
特性を有する、請求項42に記載のブタノール耐性乳酸桿菌属。 - i)無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ii)グラム陽性であり、かつ
iii)非運動性であり、かつ
iv)桿状の細胞形態を有し、かつ
v)固形培地上で成長させる場合、少なくとも2.5%w/vのブタノールに耐性である、
特性を有する、ブタノール耐性乳酸桿菌属。 - 配列番号41、配列番号42、配列番号43、および配列番号44からなる群から選択される16S rRNA遺伝子配列を含む、請求項45に記載のブタノール耐性乳酸桿菌属。
- ATCC PTA−8318(ラクトバチルス・プランタラムPN0510)、ATCC PTA−8320(ラクトバチルス・プランタラムPN0511)、ATCC PTA−7727(ラクトバチルス・プランタラムPN0512)およびATCC PTA−8319(ラクトバチルス・アリゾネンシスPN0514)からなる群から選択されるブタノール耐性乳酸桿菌属。
- ブタノールを生産するための方法であって、
a)i)無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ii)グラム陽性であり、かつ
iii)非運動性であり、かつ
iv)桿状の細胞形態を有し、かつ
v)固形培地上、37℃で成長させる場合、少なくとも2.5%w/vのブタノールに耐性である、
特性を有する、ブタノール生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む乳酸桿菌属を提供すること、および
b)ブタノールが生産される条件下でステップ(a)の乳酸桿菌属を成長させること、を含む、方法。 - ブタノールを生産するための方法であって、
a)ブタノール生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、請求項24に記載の方法により単離される乳酸桿菌属を提供すること、および
b)ブタノールが生産される条件下でステップ(a)の乳酸桿菌属を成長させること、を含む、方法。 - ブタノールが主に1−ブタノールである、請求項48または49に記載の方法。
- ブタノールが主に2−ブタノールである、請求項48または49に記載の方法。
- ブタノールが主にイソブタノールである、請求項48または49に記載の方法。
- 乳酸桿菌属が、ATCC PTA−8318(ラクトバチルス・プランタラムPN0510)、ATCC PTA−8320(ラクトバチルス・プランタラムPN0511)、ATCC PTA−7727(ラクトバチルス・プランタラムPN0512)およびATCC PTA−8319(ラクトバチルス・アリゾネンシスPN0514)からなる群から選択される、請求項48または49に記載の方法。
- ブタノールの生産において使用するためのブタノール耐性乳酸桿菌属。
- 2−ブタノンの生産において使用するための2−ブタノン耐性乳酸桿菌属。
- 2−ブタノンを生産するための方法であって、
a)i)無芽胞通性嫌気性菌であり、かつ
ii)グラム陽性であり、かつ
iii)非運動性であり、かつ
iv)桿状の細胞形態を有し、かつ
v)固形培地上で成長させる場合、少なくとも5.0%w/vの2−ブタノンに耐性である、
特性を有する、2−ブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む乳酸桿菌属を提供すること、
b)2−ブタノンが生産される条件下でステップ(a)の乳酸桿菌属を成長させること、
を含む、方法。 - 2−ブタノンを生産するための方法であって、
a)2−ブタノン生合成経路をコードする遺伝子コンストラクトを含む、請求項24に記載の方法により単離される乳酸桿菌属を提供すること、および
b)2−ブタノンが生産される条件下でステップ(a)の乳酸桿菌属を成長させること、
を含む、方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011115151A1 (ja) | 2010-03-17 | 2011-09-22 | 東レ株式会社 | ブタノールの製造方法 |
WO2021002449A1 (ja) * | 2019-07-03 | 2021-01-07 | 国立大学法人弘前大学 | 白神山地に生息するキハダ由来の新規乳酸菌 |
Families Citing this family (66)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9297028B2 (en) * | 2005-09-29 | 2016-03-29 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Fermentive production of four carbon alcohols |
US9303225B2 (en) | 2005-10-26 | 2016-04-05 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for the production of isobutanol by recombinant yeast |
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US8962298B2 (en) * | 2006-05-02 | 2015-02-24 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Recombinant host cell comprising a diol dehydratase |
WO2008006038A2 (en) * | 2006-07-06 | 2008-01-10 | Integrated Genomics, Inc. | Methods and compositions for butanol production |
US20090155869A1 (en) * | 2006-12-01 | 2009-06-18 | Gevo, Inc. | Engineered microorganisms for producing n-butanol and related methods |
NZ579780A (en) | 2007-04-18 | 2012-07-27 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Fermentive production of isobutanol using highly active ketol-acid reductoisomerase enzymes |
US8426174B2 (en) * | 2007-05-02 | 2013-04-23 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Method for the production of 2-butanol |
US8426173B2 (en) * | 2007-05-02 | 2013-04-23 | Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc | Method for the production of 1-butanol |
US20080274522A1 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-06 | Bramucci Michael G | Method for the production of 2-butanone |
KR101114918B1 (ko) * | 2007-08-09 | 2012-02-15 | 주식회사 엘지화학 | 재조합 미생물을 이용한 광학활성(s)-3-하이드록시부탄산 및(s)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 |
JP2011505490A (ja) | 2007-12-03 | 2011-02-24 | ジーヴォ,インコーポレイテッド | 再生可能組成物 |
EP2072621A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-24 | DSM IP Assets B.V. | Solvent tolerant microorganisms |
BRPI0821519A2 (pt) | 2007-12-27 | 2015-06-16 | Gevo Inc | Recuperação de alcoois superiores a partir de soluções aquosas diluída |
GB2469758A (en) * | 2008-02-28 | 2010-10-27 | Green Biologics Ltd | Process for producing butyric acid and other acids using electrochemical reactor |
US8188250B2 (en) * | 2008-04-28 | 2012-05-29 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Butanol dehydrogenase enzyme from the bacterium Achromobacter xylosoxidans |
US8389252B2 (en) * | 2008-05-12 | 2013-03-05 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Yeast strain for production of four carbon alcohols |
WO2009143455A2 (en) | 2008-05-22 | 2009-11-26 | Microbia, Inc. | Engineering resistance to aliphatic alcohols |
US8828695B2 (en) * | 2008-06-04 | 2014-09-09 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Method for producing butanol using two-phase extractive fermentation |
WO2009149270A2 (en) * | 2008-06-04 | 2009-12-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | A method for producing butanol using two-phase extractive fermentation |
US8227186B1 (en) | 2008-07-25 | 2012-07-24 | The Ohio State University Research Foundation | Methods and compositions relating to bioluminescent microorganisms |
BRPI0913552B1 (pt) | 2008-09-29 | 2020-09-29 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Método para produção de isobutanol e método para conversão de 2,3-dihidroxi isovalerato |
CA2735948A1 (en) * | 2008-09-29 | 2011-04-01 | Butamaxtm Advanced Biofuels Llc | Enhanced pyruvate to 2,3-butanediol conversion in lactic acid bacteria |
US8652823B2 (en) * | 2008-12-03 | 2014-02-18 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Strain for butanol production with increased membrane unsaturated trans fatty acids |
WO2010075504A2 (en) * | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Gevo, Inc. | Engineered microorganisms for the production of one or more target compounds |
WO2010083652A1 (en) * | 2009-01-23 | 2010-07-29 | Breeze Global, Inc. | Production of organic solvent by different combination of wastes |
JP2012518658A (ja) * | 2009-02-24 | 2012-08-16 | ジーヴォ,インコーポレイテッド | 再生可能なブタジエンおよび再生可能なイソプレンの製造方法 |
US8178329B2 (en) | 2009-04-01 | 2012-05-15 | Richard Allen Kohn | Process to produce organic compounds from synthesis gases |
CN102439162A (zh) * | 2009-04-13 | 2012-05-02 | 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 | 利用萃取发酵生产丁醇的方法 |
AU2010321564A1 (en) * | 2009-11-23 | 2012-05-10 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Method for producing butanol using extractive fermentation with electrolyte addition |
CN102666867A (zh) * | 2009-11-23 | 2012-09-12 | 布特马斯先进生物燃料有限责任公司 | 使用添加渗透物的萃取发酵生产丁醇的方法 |
MX2012007583A (es) | 2009-12-29 | 2012-07-30 | Butamax Tm Advanced Biofuels | Alcohol deshidrogenasas (adh) utiles para la produccion fermentativa de alcoholes alquilicos de cadena corta. |
EP2521705A4 (en) | 2010-01-08 | 2014-06-18 | Gevo Inc | INTEGRATED METHODS OF MANUFACTURING RENEWABLE CHEMICALS |
EP2536821B1 (en) | 2010-02-17 | 2018-06-13 | Butamax(TM) Advanced Biofuels LLC | Improving activity of fe-s cluster requiring proteins |
WO2011140560A1 (en) | 2010-05-07 | 2011-11-10 | Gevo, Inc. | Renewable jet fuel blendstock from isobutanol |
US9217183B2 (en) | 2010-05-14 | 2015-12-22 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Method for producing isopropanol and recombinant yeast capable of producing isopropanol |
JP5630501B2 (ja) | 2010-05-14 | 2014-11-26 | トヨタ自動車株式会社 | イソプロパノールの製造方法及びイソプロパノール生産能を有する組換え酵母 |
EP3269806B1 (en) | 2010-09-07 | 2020-05-27 | Butamax (TM) Advanced Biofuels LLC | Integration of a polynucleotide encoding a polypeptide that catalyzes pyruvate to acetolactate conversion |
BR112013024328A2 (pt) | 2011-03-24 | 2020-08-25 | Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc. | Células hospedeiras recombinantes, métodos para produzir isobutanol, composiçãofermentativa, métodos para produzir uma célula hospedeira recombinante, para reduzir oueliminar a conversão de isobutiraldeído, polipeptídeos, polinucleqtídeo, método paraconverter acetolactato, leveduras recombinantes, métodos para produzir butanol, paraaumentar a atividade e para aumentar a produtividade da enzima karl |
EP2699618A4 (en) | 2011-04-19 | 2014-12-17 | Gevo Inc | VARIATIONS OF A PRINS REACTION FOR THE PREPARATION OF 2,5-DIMETHYLHEXADIENE FROM ISOBUTANOL |
AU2012249389A1 (en) | 2011-04-29 | 2013-11-14 | Danisco Us Inc. | Production of mevalonate, isoprene, and isoprenoids using genes encoding polypeptides having thiolase, HMG-CoA synthase and HMG-CoA reductase enzymatic activities |
US9238828B2 (en) | 2011-07-28 | 2016-01-19 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Keto-isovalerate decarboxylase enzymes and methods of use thereof |
JP2015501643A (ja) | 2011-12-09 | 2015-01-19 | ビュータマックス・アドバンスド・バイオフューエルズ・エルエルシー | 発酵ブロスから生成物アルコールを取り出す方法 |
WO2013102084A2 (en) | 2011-12-30 | 2013-07-04 | Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc | Fermentative production of alcohols |
AU2013235391A1 (en) | 2012-03-23 | 2014-09-04 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Acetate supplemention of medium for butanologens |
WO2013166458A1 (en) | 2012-05-04 | 2013-11-07 | Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for alcohol production and recovery |
EP2847326A2 (en) | 2012-05-11 | 2015-03-18 | Butamax Advanced Biofuels LLC | Ketol-acid reductoisomerase enzymes and methods of use |
GB201209425D0 (en) | 2012-05-28 | 2012-07-11 | Lucite Int Uk Ltd | Process for production of methyl methacrylate |
US9605281B2 (en) | 2012-09-12 | 2017-03-28 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the fermentative production of alcohols |
WO2014031831A1 (en) | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Production of fermentation products |
US9109196B2 (en) | 2012-09-12 | 2015-08-18 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Processes and systems for the production of fermentation products |
US9840724B2 (en) | 2012-09-21 | 2017-12-12 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Production of renewable hydrocarbon compositions |
US9512408B2 (en) | 2012-09-26 | 2016-12-06 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Polypeptides with ketol-acid reductoisomerase activity |
US9273330B2 (en) | 2012-10-03 | 2016-03-01 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Butanol tolerance in microorganisms |
WO2014106107A2 (en) | 2012-12-28 | 2014-07-03 | Butamax (Tm) Advanced Biofuels Llc | Dhad variants for butanol production |
HUE045200T2 (hu) | 2013-03-14 | 2019-12-30 | Du Pont | Glicerin-3-foszfát dehidrogenáz butanol elõállítására |
US9771602B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-09-26 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Competitive growth and/or production advantage for butanologen microorganism |
WO2014151190A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Dhad variants and methods of screening |
CA2957920A1 (en) | 2014-08-11 | 2016-02-18 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Yeast preparations and methods of making the same |
WO2016210384A2 (en) | 2015-06-25 | 2016-12-29 | Synlogic, Inc. | Bacteria engineered to treat metabolic diseases |
CA2995378A1 (en) * | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Monsanto Technology Llc | High-throughput methods for obtaining seed treatment-tolerant microorganisms |
BE1023643B1 (nl) * | 2016-03-21 | 2017-06-01 | Yun NV | Vaginale preparaten voor het onderhouden en / of herstellen van een gezonde vrouwelijke microbiota |
FR3115988A1 (fr) | 2020-11-06 | 2022-05-13 | Global Bioenergies | Composition de maquillage à base d’isododécane biosourcé et son procédé de préparation |
CN117384868A (zh) * | 2022-06-29 | 2024-01-12 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 制备手性醇类化合物的工程化酮还原酶及方法 |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4424275A (en) | 1979-09-17 | 1984-01-03 | Sidney Levy | Continuous process for producing N-butanol employing anaerobic fermentation |
US4568643A (en) | 1981-08-03 | 1986-02-04 | Sidney Levy | Continuous process for producing n-butanol employing anaerobic fermentation |
FR2523153A1 (fr) | 1982-03-08 | 1983-09-16 | Inst Francais Du Petrole | Obtention de mutants de clostridium acetobutylicum a haute productivite de butanol et d'acetone, mutants obtenus et utilisation de ces mutants pour la production conjointe de butanol et d'acetone |
US4520104A (en) | 1982-11-18 | 1985-05-28 | Cpc International Inc. | Production of butanol by a continuous fermentation process |
JPS61209594A (ja) | 1985-03-14 | 1986-09-17 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | アルコ−ルの製造方法 |
JPS6317695A (ja) | 1986-07-09 | 1988-01-25 | Idemitsu Kosan Co Ltd | アルコ−ル類の製造法 |
JPS63102687A (ja) | 1986-10-20 | 1988-05-07 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | ブタノ−ルの製造方法 |
AT388174B (de) | 1987-03-10 | 1989-05-10 | Vogelbusch Gmbh | Verfahren zur vergaerung von kohlenhydrathaeltigen medien mit hilfe von bakterien |
JPS63254986A (ja) | 1987-04-10 | 1988-10-21 | Res Assoc Petroleum Alternat Dev<Rapad> | アルコ−ルの製造法 |
JPH084515B2 (ja) | 1987-11-09 | 1996-01-24 | 出光興産株式会社 | 有機化合物の製造方法 |
US5000000A (en) | 1988-08-31 | 1991-03-19 | University Of Florida | Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes |
US5192673A (en) | 1990-04-30 | 1993-03-09 | Michigan Biotechnology Institute | Mutant strain of C. acetobutylicum and process for making butanol |
US5210032A (en) | 1992-01-21 | 1993-05-11 | Trustees Of The Boston University | Degeneration-resistant solventogenic clostridia |
EP0973929A4 (en) | 1997-05-14 | 2003-02-05 | Univ Illinois | PROCESS FOR THE PREPARATION OF BUTANOL USING A MUTANT STRAIN OF CLOSTRIDIUM BEIJERINCKII |
EP1149918A1 (de) | 2000-04-27 | 2001-10-31 | Creavis Gesellschaft für Technologie und Innovation mbH | Verfahren zur Oxidation von Kohlenwasserstoffen unter Verwendung von Mikroorganismen |
US7223575B2 (en) | 2000-05-01 | 2007-05-29 | Midwest Research Institute | Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof |
US6960465B1 (en) | 2001-06-27 | 2005-11-01 | Northwestern University | Increased cell resistance to toxic organic substances |
WO2007130745A1 (en) | 2006-03-15 | 2007-11-15 | Regents Of The University Of Colorado | Enhanced alcohol tolerant microorganism and methods of use thereof |
US8962298B2 (en) * | 2006-05-02 | 2015-02-24 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Recombinant host cell comprising a diol dehydratase |
US7659104B2 (en) * | 2006-05-05 | 2010-02-09 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Solvent tolerant microorganisms and methods of isolation |
-
2007
- 2007-06-12 US US11/761,497 patent/US7541173B2/en active Active - Reinstated
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