KR101114918B1 - 재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 - Google Patents

재조합 미생물을 이용한 광학활성（ｓ）-3-하이드록시부탄산 및（ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 미생물을 이용한 광학활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 합성 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법 및 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제, 아실 CoA 하이드로라아제 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 미생물의 해당과정에 의해 생성된 아세틸 CoA를 비싼 금속 촉매나 기질을 사용하지 않고, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작하여, 공정이 간단하며, 광학순도가 높은 (S)-3-하이드록시부탄산 를 생산할 수 있으며, 리파아제를 이용하여 본 발명에 따른 방법으로 생산된 (S)-3-하이드록시부탄산으로부터 간단하게 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 락톤(lactone)을 생산할 수 있다.
(S)-3-하이드록시부탄산, (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르, β-케토티올라아제, 3-하이드록시이소부틸 CoA 하이드로라아제, (S)-3-하이드록시부틸 CoA 디하이드로게나아제

Description

재조합 미생물을 이용한 광학활성 （Ｓ）-3-하이드록시부탄산 및 （Ｓ）-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법{Preparing Method for (S)-3-hydroxybutyric Acid and (S)-3-hydroxybutyrate Ester Using Recombinant Microorganism}
본 발명은 재조합 미생물을 이용한 광학활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 합성 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법 및 β-케토티올라아제, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제, 아실 CoA 하이드로라아제 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물을 이용한 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.
(S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르는 플라스 틱 재료, 방향제, 의약품, 농약 등 활용범위가 매우 넓은 chiral intermediate로 그 효용성이 매우 크다 (Speciality Chemicals Magazine, April:39, 2004). 예를 들면, 에틸 (S)-3-하이드록시부티레이트를 환원하여 다양한 항생제와 페로몬(Pheromone) 등을 만드는 중간체 물질인 (S)-1,3-부탄다이올(Butanediol)을 합성할 수 있으며(T. Ferreira et al ., Tetrahedron, 46:6311, 1990), 제초제인 (S)-설카톨(Sulcatol)의 전구체로도 이용되며(K. mori et al., Tetrahedron, 37:1341, 1981), b-lactam 계열의 항생제인 카바페넴(Carbapeneme)의 전구체로도 이용되고 (T. Chiba et al., Chemistry letters, 16:2187, 1987), 유사 비타민(vitamin-like nutrient)인 L-카르니틴의 전구체로도 이용된다 (B. -N. Zhou et al., Journal of American Chemical society, 105:5925, 1983).
기존의 에스테르의 제조방법으로는 프로키랄 전구체(prochiral precursor)인 3-케토에스테르(3-ketoester)를 이용하여 촉매 diphosphine-ruthenium로 asymmetric reductive hydrogenation하는 방법이 있으나 (R. Noyori et al., Journal of the American Chemical Society, 109:5856, 1987), 사용하는 금속 촉매가 매우 비싸고 순수한 기질이 필요하며, hydrogenation반응은 매우 고압의 반응기를 필요로 한다는 단점이 있다. 또한, 효모를 Whole-cell 촉매로 사용하여 b-케토에스테르를 biocatalytic reduction하여 수율 58%, 광학순도 94%ee의 에틸 (S)-3- 하이드록시부티레이트를 생산하는 방법은, 미생물 내에 존재하는 다양한 옥시도리덕타아제(oxidoreductase)에 의해 광학 활성이 낮아지는 단점이 있다 (Tetrahedron Letters, 34:3949, 1993).
미생물의 대사경로를 조작하여 포도당으로부터 생합성된 광학활성 (R)-3-하이드록시알칸산을 생산하는 보고는 알려져 있다 (Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65:363, 1999; Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69:1295, 2003; Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213:59, 2002). (R)-3-하이드록시알칸산을 생산하는 경로는 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫째, 생분해성 고분자인 폴리하이드록시알칸산의 자가분해를 이용한 것 (Lee et al., Biotechnol Bioeng, 65:363, 1999; Lee and Lee., Appl Environ Microbiol, 69:1295, 2003), 둘째, 생분해성 고분자의 자가분해가 아닌 포도당으로부터 우선 (R)-3-하이드록시알카노일 CoA를 생산하고 생산된 (R)-3-하이드록시알카노일 CoA로부터 CoA를 제거한 후 (R)-3-하이드록시알칸산을 생산하는 것이다 (Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213:59, 2002). 두 번째 방법의 경우, 포도당으로부터 β-케토티올라아제(PhaA)와, (R)-3-하이드록시부티릴 CoA 리덕테이즈(PhaB)를 이용하여 우선 (R)-3-하이드록시부티릴 CoA를 생산하며, 생산된 (R)-3-하이드록시부티릴 CoA로부터 CoA를 제거하는 것은 포스포트랜스부틸라아제(ptb)와 부티릴 카이네이즈 (BuK)를 이용한다 (Gao et al., FEMS Microbiol Lett, 213:59, 2002).
광학 활성 (S)-3-하이드록시부티레이트를 생산하는 화학적 경로(chemical route), 생촉매 경로(biocatalytic route)들이 알려져 있지만, 미생물의 대사 경로를 조작하여 포도당(glucose)으로부터 생합성된 광학 활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르를 생산하는 보고는 아직까지 없었다.
이에, 본 발명자들은 광학활성 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르를 생합성하기 위하여 예의 노력한 결과, 미생물의 해당과정에 의해 생성된 아세틸 CoA를 비싼 금속 촉매나 기질을 사용하지 않고, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작하여, 공정이 간단하며, 광학순도가 높은 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르가 생합성되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제 및 리파아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 제조용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 제조용 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자 및 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터와 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자가 크로모좀에 삽입되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 포스포트랜스부틸라아제를 코딩하는 유전자(ptb) 및 부티레이트카이네이즈를 코딩하는 유전자(Buk)로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물의 배양액 또는 균주추출액을 아세틸-CoA, 아세토아세틸 CoA 및 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 구성된 군에서 선택되는 기질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 에스테르 제조용 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 ((S)-3-하이드록시부탄산 에스테르의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 미생물의 해당과정에 의해 생성된 아세틸 CoA를 비싼 금속 촉매나 기질을 사용하지 않고, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작하여, 공정이 간단하며, 광학순도가 높은 (S)-3-하이드록시부탄산 및 (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르의 생합성 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조되는 (S)-3-하이드록시부탄산은 화학식 1에 나타난 바와 같이, (R) -3-하이드록시부탄산과는 다른 키랄도를 가지는 광학활성 화합물이다.
Figure 112007057855517-pat00001
본 발명에 따른 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물은 도 1에 나타낸 생합성 경로를 거쳐 (S)-3-하이드록시부탄산을 생산한다.
먼저, 포도당으로부터 해당과정을 통해 아세틸 CoA가 생성되면, β-케토티올라아제에 의해 아세토아세틸 CoA로 전환되고, 상기 아세토아세틸 CoA는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제에 의해, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 전환되며, 최종적으로, 아실 CoA 하이드로라아제에 의하여 (S)-3-하이드록시부탄산으로 전환되게된다.
본 발명에 따른, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부 티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 미생물은 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 도 1의 (S)-3-하이드록시부탄산 생합성경로를 거쳐 생산된 (S)-3-하이드록시부탄산이 리파아제에 의해 에스테르화 되면서, (S)-3-하이드록시부티레이트 에스테르를 생성하게된다.
또, 다른 (S)-3-하이드록시부탄산의 생합성 경로로, 포도당으로부터 해당과정을 통해 아세틸 CoA가 생성되면, β-케토티올라아제에 의해 아세토아세틸 CoA로 전환되고, 상기 아세토아세틸 CoA는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제에 의해, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 전환되며, 상기 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA는 포스포트랜스부틸레이즈(Ptb) 또는 포스포트랜스아세틸레이즈(Pta)에 의하여, (S)-3-하이드록시부티릴 포스페이트로 전환되고, 상기 S)-3-하이드록시부티릴 포스페이트는 부틸레이트 카이네이즈(Buk) 또는 프로피오네이트 카이네이즈(Puk)에 의하여 최종적으로 (S)-3-하이드록시부탄산으로 전환되게 된다 (도 3).
본 발명에 따른 β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 포스포트랜스부틸라아제를 코딩하는 유전자(ptb) 및 부티레이트카이네이즈를 코딩하는 유전자(Buk)로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물은 상기 도 3에 나타낸 경로를 통하여 (S)-3-하이드록시부탄산을 생산하게 된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: β- 케토티올라아제 및 (S)-3- 하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터( pTacReA - HBD )의 제작
먼저 Ralstonia eutropha H16균주(ATCC 17699)를 LB 액체배지 3ml에 18시간 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 세포를 수득하고, 10ml Tris 버퍼를 이용하여 세척한 후, Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega사, USA)을 이용하여 균주의 염색체를 분리하였다.
상기 분리된 염색체를 다음으로 ReAf-EcoRI 프라이머(서열번호 5) 및 ReAb1259 프라이머(서열번호 6)를 사용하여 상기 분리된 염색체를 주형으로 하여 Ralstonia eutropha균주의 β-ketothiolase 유전자(서열번호 1)를 증폭하였다. PCR반응 혼합물 100μl는 dNTP 250μM, primer각각 20pmol, 1.5mM MgCl2, 10buffer 10μl, DNA 주형 100ng, pfu polymeras 5 units을 첨가하였으며 95℃에서 5분 동안 초기 변성 과정을 거친 다음 95℃에서 1분 동안 변성, 50℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 중합과정을 25회 반복하였다.
ReAf-EcoRI :5'-ggaattc ATGACTGACGTTGTCATCGTATCC-3'(서열번호 5)
ReAb1259: 5'-gtc cac tcc ttg att ggc ttc g-3'(서열번호 6)
또 동일한 조건으로 Cahbdf 프라이머 (서열번호 7), Cahbdb-XbaI 프라이머 (서열번호 8)를 이용하여 Clostridium acetobutylicum 균주(ATCC 824)의 (S)-3-hydroxybutyrate dehydrogenase 유전자(서열번호 2)를 증폭하였다.
Cahbdf: 5'- GAA GCC AAT CAA GGA GTG GAC ATGAAAAAGGTATGTGTTATAGG-3' (서열번호 7)
Cahbdb-XbaI: 5'- gc tctaga tta ttt tga ata atc gta gaa acc -3' (서열번호 8)
증폭된 유전자를 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 이들 두 유전자를 PCR 반응을 이용하여 퓨전시켰다. 먼저, 각각 1pmol 농도로 두 유전자를 혼합하여 PCR을 위한 주형으로 이용하였으며, 다른 조건은 상기와 모두 동일하고 중합과정을 2.5분으로 하여 증폭을 수행하였다. 증폭된 유전자는 1% 아가로오즈 젤에서 정제하고 EcoRI, XbaI 제한효소로 DNA 단편을 절단하고 동일한 제한효소로 절단한 pTac99A 벡터(Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003)에 라이게이션 하여 pTacReA-HBD를 제작하였다 (도 4).
실시예 2: (S)-3- 하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터( pET21aBCH , pET28bBCH 및 pK28BCH )의 제작
먼저 Bacillus cereus(ATCC 14579)균주를 LB액체배지에서 18시간 배양 후 실시예 1과 동일한 방법으로 염색체를 분리하였다. 분리한 염색체를 주형으로 하고 ACH_NdeI 프라이머(서열번호 9) 및 ACH_BamHI 프라이머(서열번호 10)를 이용하여 역시 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR을 이용하여 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase(BCH) 유전자(서열번호 4)를 증폭하였다.
ACH_NdeI 5'- CGC CAT ATG ACT GAA CAA GTT TTA TTT -3'(서열번호 9)
ACH_BamHI 5'- ATA GGA TCC TTA TGC ATT AAG TAA GTT AAA G -3'(서열번호 10)
증폭한 유전자를 실시예 2와 동일한 조건으로 정체하고 제한효소 NdeI, BamHI을 이용하여 절단 후, 동일한 제한효소로 절단한 pET21a(Novagen, USA), peET28B(Novagen, USA) 및 pK28에 각각 라이게이션하여 pET21aBCH, pET28bBCH 및 pK28BCH를 제작하였다 (도 5).
상기 pK21 벡터는 PET21a 벡터를 제한효소 BglII 및 XbaI 제한효소로 절단한 후 EZ::TN<KAN2> 트랜스포존(Epicenter, USA; Cat#: MOD 1503)의 프로모터 의심부위를 KAN2 P-bgl I I 프라이머(서열번호 11) 및 KAN2-P-XbaI 프라이머(서열번호 12)를 이용하여 PCR로 증폭한 후, 동일한 제한효소로 절단 후 라이게이션하여 자체 제작하였다. 증폭한 DNA 서열은 서열번호 13에 나타내었다.
KAN2 P-bgl I I: TATA AGA TCT CAA CCA TCA TCG ATG AAT TGT (서열번호 11)
KAN2-P-XbaI: TAT TCT AGA AAC ACC CCT TGT ATT ACT GTT(서열번호 12)
EZ::TN<KAN2> 트랜스포존: 5'-TACACATCTCAACCATCATCGATGAATTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTT-3'(서열번호 13)
실시예 3: (S)-3- 하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터( pET21aHBD 및 pK21HBD )의 제작
먼저 실시예 1에서 분리한 Clostridium acetobutylicum(ATCC 824) 염색체를 주형으로 hbd_NdeI 프라이머(서열번호 14) 및 hbd_BamHI 프라이머(서열번호 15)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 (S)-3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase 유전자(서열번호 2)를 증폭하였다.
hbd_NdeI: 5'- ATA CAT ATG AAA AAG GTA TGT GTT ATA GGT GCA GGT-3'서열번호 14)
hbd_BamHI 5'- ATA GGA TTC TTA TTT TGA ATA ATC GTA GAA ACC TTT-3'서열번호 15)
증폭된 유전자는 NdeI 및 BamHI 제한효소로 절단 후 동일한 제한효소로 절단한 pET21a 벡터와 pK21 벡터와 라이게이션하여 pET21aHBD 및 pK21HBD를 제작하였다 (도 6).
실시예 4: (S)-3- 하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 (HBD ) 유전자의 활성확 인
실시예 3에서 제작한 pET21aHBD를 electroporation을 이용해 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환하고 LB ampicillin 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 콜로니를 ampicillin 100μg/ml을 함유하는 LB 액체배지 3ml에 접종하고 진탕 배양기(제이오텍, 한국)에서 200rpm, 37℃, OD600 값이 0.5가 될 때가지 배양한 다음, IPTG를 최종농도 1mM이 되게 첨가하여 단백질 발현을 유도시킨 후, 밤새 배양하였다. 그 후 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한 후 초음파 처리하여 세포를 파쇄한 다음, 원심분리 하여 cell free extract를 확보하였다. 이렇게 확보한 cell free extract를 효소 활성 확인 시료로 이용하였다.
시료의 (S)-3-hydroxybytyryl CoA dehydrogenase 활성은 1mM acetoacetyl CoA, 3mM NADH 및 5mg/ml cell free extract 20μl가 함유된 반응 액을 5분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 생성된 (S)-3-hydroxybutyryl CoA를 HPLC(shimadzu, Japan)를 이용하여 확인하였다.
HPLC 조건은 이동상으로 물과 아세토니트릴을 97:3 비율로 5분 흘리다가 아세토니트릴 비율을 15% 까지 25분 동안 증가시키면서 분석하였다. 용매의 유속은 1ml/min이었고 C18 Capcel PAK 칼럼(Shisheido, Japan)을 이용하였으며, 생성되는 (S)-3-hydroxybutyryl CoA 는 210nm에서 검출하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 활성형 (S)-3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
(S)-3-hydroxybutyryl CoA dehydrogenase 효소의 활성
HBD Control
전환율 75% 0%
실시예 5: (S)-3- 하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제 ( BCH ) 유전자의 활성확인
실시예 2에서 제작한 pET21aBCH를 실시예 4와 동일한 방법으로 대장균에 형질전환시킨 후 배양하여, cell free extract를 확보하고, 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 활성 확인에 이용하였다.
3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 활성은 1mM (S)-3-hydroxybutyryl CoA 및 5mg/ml cell free extract 20μl가 함유된 반응액을 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후, 생성된 3-하이드록시부탄산을 HPLC(shimadzu, Japan)를 이용하여 확인하였다. HPLC는 실시예 4와 동일한 조건에서 수행하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 활성형 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
3-Hydroxyisobutyryl CoA hydrolase(BCH) 의 활성 확인
BCH Control
전환율 73.5% 28%
실시예 6: β- ketothiolase , HBD 및 BCH 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 미생물의 cell extract 를 이용한 (S)-3- 하이드록시부탄산의 제조
실시예 1 내지 실시예 3에서 제작한 pTacReA-HBD, pET21aBCH 및 pK28BCH를 electroporation을 이용해 동시에 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시키고 실시예 4와 동일한 방법으로 cell free extract를 수득하여, 효소 활성 확인에 이용하였다.
(S)-3-하이드록시부탄산의 생성은 1mM acetyl CoA, 3mM NADH, 및 5mg/ml cell free extract 20μl가 함유된 반응액을 30분 동안 37℃ 에서 반응시킨 용액을 HPLC(shimadzu, Japan)를 이용하여 확인하였다.
분석은 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하여 가수분해 되어 생성된 CoA를 검출하여 측정하였다.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, pTacReA-HBD, pET21aBCH 및 pK28BCH로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 활성형 β-ketothiolase, 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase 및 (S)-3-hydroxybytyryl CoA dehydrogenase 를 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
재조합 대장균의 cell extract를 이용한 (S)-3-Hydroxybutyric acid 의 생산
재조합 대장균 Control
전환율 7.84% 0.01%
실시예 7: β- ketothiolase , HBD , BCH 유전자를 함유하는 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 및 이를 이용한 (S)-3- 하이드록시부탄산의 제조( In - vivo )
실시예 1 및 실시예 2에서 제작한 pTacReA-HBD 및 pET28bBCH를 electroporation을 이용해 대장균 BL21(DE3)에 동시에 형질전환시키고, ampicillin 100μg/ml 과 kanamycin 50μg/ml을 함유하는 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 콜로니 2개를 100μg/ml을 함유하는 LB액체 배지 3ml이 포함된 15ml 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37℃에서, 200rpm으로 밤새 진탕배양하여 종균을 배양하였다. 이렇게 배양된 종균을 다시 50ml 2% glucose및 ampicillin 100μg/ml를 포함하는 LB 액체배지에 접종하고 37℃에서, 200rpm으로 진탕배양하여, OD600이 0.5가 되었을 때, IPTG를 최종농도 1mM이 되게 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후, 밤새 배양하였다.
그 후, 배양액을 원심분리한 후, 상등액을 수득하고, HPLC 분석을 통해 생성된 3-하이드록시부탄산을 정량분석하였다. HPLC 조건은 이동상으로 0.01N 황산을 함유한 물을 이용하였으며 유속은 0.6ml/min이었다. 칼럼은 Aminex87H(Bio-rad,USA)을 이용하였으며, 생성되는 3-하이드록시부탄산은 RI(Reflactive Index) detector를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
(S)-3-하이드록시부탄산의 정량
(S)-3-HB (g/L)
After induction		 Acetate (g/L)
final		 Glucose consumed(g/L)
DCW 0h 5h 24hr
시료1 0.74g/L 0 0.190 0.348 2.12 8.36
시료2 1.6g/L 0 0.193 0.370 2.01 9.10
또한 보다 정확한 정성분석 및 정량분석을 위하여, 생성된 3-하이드록시부탄산을 함유한 배양액을 동결건조한 후, 생성물을 메틸화시키고, methyl (S)-3-hydroxybutyrate의 GC-MSD(질량분석) 및 키랄도(Chirality) 분석을 수행하였다. 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였으며, 분석 조건은 표 4에 나타내었다. 질량분석도 수행하였으며, 그 결과에서도 생성된 산물이 3-하이드록시부탄산임을 확인할 수 있었으며, 상기 결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다. 키랄도 분석결과, 광학순도 99.9%ee 이상의 (S)-3-하이드록시부탄산이 생산되었음을 확인하였고, Enantiomeric excess(ee)값은 아래의 수식 (1)로부터 결정하였다.
ee S =( C S - C R )/( C S + C R ) x 100 (1)
GC MSD 및 GC 키랄도 분석조건
GC-MSD 정성분석 Oven temperature : 50℃/5min - 10℃/min - 320℃/10min
Injector temperature : 320℃
Detector temperature : 320℃
Injector Split ratio : 20/1
GC-FID 정량분석(chriality) Injector 160oC, 3mL/min He, 20:1 s/s ratio
Oven 80℃/15min
Detector make up flow : 30mL/min
Air flow : 300mL/min
H2 flow : 30mL/min
Temperature : 160 ℃
Column G-TA (30m x 0.25mm)
실시예 8: pET21aBCH - ReA - HBD , pET21aBCH - ReA - ReHBD 벡터의 제작
실시예 1과 동일한 방법으로 R. eutropha 유래의 HBD(ReHBD) 유전자(서열번호 3)를 ReHBD-RBS-UP 프라이머 및 ReHBD-DN-XhoI 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
ReHBD-RBS-UP: 5'-GAAGCCAATCAAGGAGTGGACATGAGCATCAGGACAGTGGG-3' (서열번호 16)
ReHBD-DN-XhoI:　5'-ATACTCGAGTTACTTGCTATAGACGTACACGC CGCGGCC-3' (서열번호 17)
실시예 1과 동일한 조건으로 ReAf-EcoRI 프라이머(서열번호 5)와 ReHBD-DN-XhoI 프라이머(서열번호 17)를 이용하여 ReA 유전자와 ReHBD유전자를 fusion 하여 ReAReHBD 유전자를 완성하였다. 또 실시예 1에서 제작한 pTacReA-HBD 벡터를 주형으로 상기 ReAf-EcoRI 프라이머와 상기 ReHBD-DN-XhoI 프라이머를 이용하여 ReA-HBD유전자를 증폭하였다. 상기 fusion하여 증폭된 두 유전자를 EcoRI 과 XhoI 제한효소 처리하고 실시예 2에서 제작한 pET21aBCH 또한 동일한 제한효소로 절단한 후 정제하여 라이게이션하여 pET21aBCH-ReA-HBD 및 pET21aBCH-ReA-ReHBD를 완성하였다.
HBD-DN-XhoI: 5'-ATACTCGAGTTATTTTGAATAATCGTAGAAACCTTTTCCTG-3'(서열번호 18)
실시예 9 : pET21aBCH - ReA - HBD , pET21aBCH - ReA - ReHBD 벡터로 형질전환된 대장균을 이용한 (S)-3- 하이드록시부탄산의 제조
실시예 8에서 제작한 pET21aBCH-ReA-HBD 및 pET21a-BCH-ReA-ReHBD를 electroporation을 이용해 대장균 Codon Plus(DE3)에 각각 형질전환시키고, LB/ ampicillin 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 콜로니 2개를 LB/ampicillin 배지 3ml이 포함된 15ml 일회용 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37℃에서, 200rpm으로 진탕배양하여 밤샘 배양하였다. 배양된 종균을 다시 100ml 2% glucose를 포함하는 MR 액체배지에 접종하고 37℃에서, 200rpm으로 10시간 진탕 배양하여 1.5L 발효조에 접종하여 배양을 시작하였다. 배양 시작후 OD가 120이 되었을 때 IPTG를 최종농도 1mM이 되게 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후 2 시간 마다 생성되는 (S)-3-Hydroxybutyric acid를 실시예 7과 동일한 방법으로 분석하였으며, 그 결과, 약 10g/L의 (S)-3-HB가 생성되었다 (도 10 및 표 6).
pET21aBCH-ReA-HBD, pET21aBCH-ReA-ReHBD 벡타로 형질전환된 대장균을 이용한 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조
반응시간(h) HBD (g/L) ReHBD (g/L)
배양 발현유도 DCW Glu S3HB AA DCW Glu S3HB AA
0.0 　 -0.7 20.1 　 0.2 -0.3 21.1 　 0.2
8.0 　 4.5 17.0 　 0.0 3.6 18.9 　 0.0
10.0 　 6.0 10.5 　 0.1 5.1 14.1 　 0.1
12.0 　 16.7 5.6 　 0.2 12.8 11.9 　 0.2
15.0 　 31.2 9.1 　 0.3 34.7 7.9 　 0.3
16.0 0.0 44.2 5.0 　 0.2 46.2 5.7 　 0.3
18.0 2.0 51.1 6.2 0.8 0.6 53.5 7.3 1.2 0.6
20.0 4.0 59.7 2.5 2.4 0.8 62.2 5.6 2.8 0.7
22.0 6.0 64.8 5.3 4.0 0.8 64.7 2.0 4.1 0.7
24.0 8.0 66.3 5.0 5.6 1.0 62.3 7.3 4.2 2.0
26.0 10.0 68.5 3.6 6.7 1.4 68.3 7.8 6.2 2.4
28.0 12.0 67.5 7.0 7.5 1.2 66.9 4.0 8.0 2.2
30.0 14.0 71.3 5.6 8.1 1.2 65.4 3.3 9.5 1.9
32.0 16.0 71.6 3.6 8.9 1.5 68.1 2.8 10.6 1.4
34.0 18.0 72.5 3.6 9.3 2.0 64.7 4.3 10.6 1.3
36.0 20.0 68.4 2.7 9.7 2.7 70.6 4.8 10.3 1.1
38.0 22.0 68.2 2.3 10.3 3.4 65.8 4.6 10.4 1.4
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
도 1은 (S)-3-HB 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 (S)-3-HB esters를 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 (S)-3-HB 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 4는 pTacReA-hbd 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 pET21aBCH 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 pK28BCH, pET28bBCH 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 7은 pET21aHBD, pK21HBD 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따라 생산된 ((S)-3-HB를 메틸화시켜 분석한 GC-MSD분석 결과이다.
도 9는 본 발명에 따라 생산된 (S)-3-HB를 메틸화시켜 키랄도(Chriality)를 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 유가식 배양을 통한 (S)-3-HB 를 생산할 때의 시간 profile을 결과를 나타낸 것이다.
<110> LG Chem, LTD <120> Preparing Method for (S)-3-hydroxybutyric acid and (S)-3-hydroxybutyrate ester Using Recombinant Microorganism <130> P06-B248 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1182 <212> DNA <213> Ralstonia eutropha <400> 1 atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg 60 ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120 gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180 tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240 gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300 gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360 gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420 gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480 gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540 ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600 ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga 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agactggccg cggcgtgtac 1080 gtctatagca agtaa 1095 <210> 4 <211> 1056 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 4 atgactgaac aagttttatt ttctgttagt gaaaatggcg ttgcgacaat tactttaaac 60 cgtccaaaag cacttaattc tttatcttat gacatgttac aacctatcgg acaaaaactt 120 aaagagtggg aacacgatga gcgtattgca cttatcgtgt taaaaggagc tggcacaaaa 180 ggtttttgtg caggtggcga cattaaaact ctttatgaag cgcgttccaa tgaagtggca 240 ttgcaacatg cagaacgttt ttttgaagaa gagtatgaaa ttgatacata tatttatcaa 300 tatacaaaac cgattattgc ttgtttagat ggaattgtaa tgggcggtgg tgtcggtctt 360 acaaatggtg cgaagtatcg cattgtaact gagcgtacga aatgggcaat gccagagatg 420 aatatcggct tcttcccaga cgtcggagct gcatatttct taaataaagc gcctggatat 480 acaggacgat tcgttgcttt aacagcatct attttaaaag cttctgacgt attatttatt 540 aatgctgcag attactttat gacatctgat tcattaccag agtttcttac tgaacttgaa 600 agtgtaaatt ggcataaaga agatgatgta catactaatt taaaagaagt tattcgtaca 660 tttgcaactg ctccaaactt agaaagcgag ctcgctcctt cattagaagt aatcaattca 720 cattttgctt tcgatacaat tgaagaaatc atccattcat tggagaaaga tgaaagttcc 780 tttgctctaa aaacgaaaga aatactgtta tcaaaatccc ctatttcact aaaagtaaca 840 ttaaaacagt ttattgatgg acaagataaa tccgttgaag aatgtttcgc tacggacctt 900 atacttgcta aaaacttcat gagacatgaa gatttcttcg aaggagtacg ctccgttgtc 960 gttgataaag atcaaaatcc gaattataaa tataaacagt taagtgacgt ttcagaagaa 1020 gatgtgaatc gtttctttaa cttacttaat gcataa 1056 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggaattcatg actgacgttg tcatcgtatc c 31 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtccactcct tgattggctt cg 22 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaagccaatc aaggagtgga catgaaaaag gtatgtgtta tagg 44 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctctagatt attttgaata atcgtagaaa cc 32 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgccatatga ctgaacaagt tttattt 27 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ataggatcct tatgcattaa gtaagttaaa g 31 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tataagatct caaccatcat cgatgaattg t 31 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tattctagaa acaccccttg tattactgtt 30 <210> 13 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EZ::TN<KAN2> <400> 13 tacacatctc aaccatcatc gatgaattgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca 60 agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag 120 gggtgtt 127 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 atacatatga aaaaggtatg tgttataggt gcaggt 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ataggattct tattttgaat aatcgtagaa accttt 36 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaagccaatc aaggagtgga catgagcatc aggacagtgg g 41 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atactcgagt tacttgctat agacgtacac gccgcggcc 39 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 atactcgagt tattttgaat aatcgtagaa accttttcct g 41

Claims (23)

  1. β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것를 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  9. 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  10. 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  12. 제11항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  13. 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자 및 (S)-3-하이드록 시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터와 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  15. 제14항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  16. 제6항에 있어서, β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 및 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자가 크로모좀에 삽입되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 아실 CoA 하이드로라아제는 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제인 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  18. 제17항에 있어서, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 하이드로라아제는 서열번호 4의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산 제조용 재조합 미생물.
  19. 삭제
  20. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
  21. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 재조합 미생물의 배양액 또는 균주추출액을 아세틸-CoA, 아세토아세틸 CoA 및 (S)-3-하이드록시부티릴 CoA로 구성된 군에서 선택되는 기질과 반응시키는 것을 특징으로 하는 (S)-3-하이드록시부탄산의 제조방법.
  22. β-케토티올라아제를 코딩하는 유전자, (S)-3-하이드록시부티릴 CoA 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자, 아실 CoA 하이드로라아제를 코딩하는 유전자 및 리파아제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 (S)-3-하이드록시부탄산 에스테르 제조용 재조합 미생물.
  23. 제22항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 ((S)-3-하이드록시부탄산 에스테르의 제조방법.
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