WO2006013802A1

WO2006013802A1 - エナンチオマー豊富化化合物の製造方法

Info

Publication number: WO2006013802A1
Application number: PCT/JP2005/014007
Authority: WO
Inventors: Akira Iwasaki; Motohisa Washida; Junzou Hasegawa
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2005-08-01
Publication date: 2006-02-09
Also published as: EP1801228A4; JPWO2006013802A1; EP1801228A1; US20070292923A1

Abstract

　本発明は、以下の（１）および（２）を含むエナンチオマー豊富化化合物の製造方法に関する。（１）エナンチオマー混合物を、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と接触させ、一方のエナンチオマーを優先的に酸化し、他方のエナンチオマーを残存させ、ＮＡＤＨを生成させる。（２）（１）の酸化反応により生成したＮＡＤＨを、酸化的条件下で安定である水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼと接触させＮＡＤ＋へ変換する。　本発明によれば、脱水素酵素を用いるエナンチオマー混合物からエナンチオマー豊富化化合物の製造において、安定化剤を添加せずともＮＡＤ＋の再生が可能であり、効率的にエナンチオマー豊富化化合物を得ることができる。

Description

明細書

ェナンチォマー豊富化化合物の製造方法

技術分野

[0001] 本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (以下 NAD +と略す)を補酵素とする脱水素酵素による酸ィ匕反応において、ストレプトコッカス属由来水生成型 NAD Hォキシダーゼを用ヽる補酵素 NAD +の再生方法、並びに本 NAD +再生方法を利用したェナンチォマー混合物からの光学活性ィ匕合物の製造方法に関する。

関連出願の相互参照

[0002] 曰本国特許 2004— 230139号（2004年 8月 6曰出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。

背景技術

[0003] E. C. 1. 1や E. C. 1. 4に分類される酸化還元酵素（例えば脱水素酵素）には、 N AD+などの補酵素存在下、アルコールやアミノ酸をケトンゃケト酸へ酸ィ匕する反応を触媒するものがある。多くの場合、それら脱水素酵素による酸化反応は立体選択的であるため、アルコール類やアミノ酸類のェナンチォマー混合物にこれら酵素を作用させれば、一方のェナンチォマーのみ酸化され、残存するェナンチォマーが豊富化される。この反応は光学活性化合物の製造に有効な方法である。

[0004] し力しながら、上記酸ィ匕反応の際には酸ィ匕型補酵素 NAD +は NADHへ変換されるため、反応には化学量論量の NAD +が必要である。しかし、下の反応式 1に示すように、脱水素酵素による酸ィ匕反応によって生じた NADHを NAD +へ変換する反応 (NAD +再生系）を共役させる事により、 NAD +の化学量論量の使用を避け、その使用量を減らす事が可能である (反応式 1において、 *は不斉炭素を表し、この絶対配置は (R)でもよぐ（S)でもよい)。

[0005] [化 1] ぐ反応式 1 >

NAD+再生糸

[0006] 従来より、ラクトバチルス 'ブレビス（Lactobacillus brevis)由来の水生成型 NADH ォキシダーゼを補酵素再生系に利用した光学活性ィ匕合物の合成方法が報告されている（特許文献 1、非特許文献 1、 2)。ォキシダーゼは、酸素で NADHを酸ィ匕して、 NAD +と水を生成する反応を触媒する酵素であり、その反応には酸素の存在が必須である。水生成型 NADHォキシダーゼによる NADHからの NAD +生成反応は非可逆的である。また、反応産物としては NAD +以外に水が生成するのみであり、 NAD +再生系における本酵素の使用は好ま、と!/ヽる。

[0007] し力し、ラクトバチルス 'ブレビス由来の水生成型 NADHォキシダーゼは、酸化に対する感受性が強ぐその安定ィ匕には DTT (ジチオスレィトール)などの添加が必要である（非特許文献 1)。従って、本微生物由来の水生成型 NADHォキシダーゼを N AD +再生系に使用する場合にも、反応系に DTTなどの安定化剤を添加する必要がある。

[0008] ラクトバチルス ·ブレビス以外にラクトバチルス ·サンフランシスセンシス (Lactobacill us sanfranciscensis)由来の水生成型 NADHォキシダーゼを NAD +再生酵素に利用した光学活性ィ匕合物の合成方法が報告されているが、この場合も反応系に DTT を添加してヽる（非特許文献 3)。

特許文献 1 :特開 2003— 116585

非特許文献 1 : Enzyme and Microbial Technology 32, 205-211 (2003)

非特許文献 2 : Org. Lett. Vol. 5, No20, 3649-3650 (2003)

非特許文献 3 : Adv. Synth. Catal. 345, 707-712 (2003)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 従来のラクトバチルス ·ブレビス及びラクトバチルス ·サンフランシスセンシス由来の水生成型 NADHォキシダーゼを NAD +再生酵素として使用する場合、一般的には反応系に DTT添カロが必要となる。 DDT添カロが必要となる場合、（l) DDT添カ卩による余分なコストがかかる点、（2)反応に使用する基質、生成物によっては、添加した D TTと反応してしま、収率が低下する可能性がある点、（3)そのような DDTとの反応の結果、 DTT濃度が低下し、 NADHォキシダーゼの保護効果が減少してしまう点等の課題がある。これらの課題は、例えば工業的製法に適用する際には特に考慮する必要がある。

[0010] 本発明は、脱水素酵素による立体選択的酸ィ匕反応時の NAD +再生系に、活性、安定性などの点で優れ、特に反応時に DTTなどの酵素保護剤を必要としな、水生成型 NADHォキシダーゼを使用することによる、効率的な光学活性アルコール、アミノ酸などの有用物質を製造する方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明者らは、上記課題につき、ストレプトコッカス属微生物、さらに詳しく言えばストレプトコッカス .ミュータンス由来の NADHォキシダーゼ力安定化に DTTなどの保護剤の添加も必要とせず、 NAD +再生酵素として、非常に有利であることを見出し本発明を完成した。

(1)、本発明は、以下の（1)および (2)を含むェナンチォマー豊富化化合物の製造方法を対象とする。（1)ェナンチォマー混合物を、 NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と接触させ、一方のェナンチォマーを優先的に酸ィ匕し、他方のェナンチォマーを残存させ、 NADHを生成させる。（2) (1)の酸ィ匕反応により生成した NADHを、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼと接触させ NAD +へ変換する。

[0012] 本発明は、さらに以下の対象を含む。

(10) NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を補酵素とする立体選択的脱水素酵素によってェナンチォマー混合物のうちの一方の立体のェナンチォマーを優先的に酸ィ匕する反応において、

前記反応に伴って生ずる NADHを NAD+に再変換するために、酸素存在下であつても酵素保護剤なしで安定であることを特徴とする水生成型 NADHォキシダーゼを利用する方法。

(11) NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と組み合わせて使用し得る、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼ。

( 12) NAD +を補酵素とする脱水素反応に伴って生ずる NADHを NAD +に再変換する補酵素再生機能を有し、かつ、酵素保護剤なしで用いられることを特徴とする補酵素再生系用の水生成型 NADHォキシダーゼ。

(13) NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素の遺伝子と、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼの遺伝子とを含むベクター。

(14) NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素の遺伝子と、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼの遺伝子とを含むベクターによって形質転換された形質転換体微生物。

(15) NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼとを含む組成物。

発明の効果

[0013] ストレプトコッカス属微生物由来の水生成型 NADHォキシダーゼを NAD +再生系に用いることにより、還元剤などの酵素安定化剤を添加せずとも、 NAD +の再生反応が効率良く進む。従って、該 NAD +再生系を脱水素酵素による立体選択的酸ィ匕反応と共役させれば、ェナンチォマー混合物から効率的にェナンチォマー豊富化化合物を得る事が可能となる。

図面の簡単な説明 [0014] [図 1]実施形態としての組み換えベクター pNTNXの作成方法を示す図である。発明を実施するための最良の形態

[0015] 1.水生成型 NADHォキシダーゼ

本発明の NAD再生系に使用する「水生成型 NADHォキシダーゼ」は、酸化的条件下で安定である、すなわち，失活しないもの、または顕著な失活が抑制されるものを使用する。

[0016] 本明細書における「酸化的条件で安定である」とは、酸素存在下、例えば、特に脱気操作をしていない緩衝液中、又は酵素液を含んだ試験管を振盪するなどの酸素供給条件下において顕著な失活なぐ NADHを NAD +へと変換する反応を触媒する場合を含む概念である。また、酸素存在下において、酵素保護剤を利用しない場合であっても酵素保護剤を利用する場合と同様に安定である状態も、「酸化的条件で安定である」 t 、う概念に含まれる。

[0017] 本発明で使用する「酸ィ匕的条件で安定である水生成型 NADHォキシダーゼ」は、 DTTなどの酵素保護剤非存在下で、酸素存在下、約 20°C、約 3時間で約 70%以上、好ましくは約 80%以上、更に好ましくは約 90%以上の活性が保持される。

[0018] 本発明の「水生成型 NADHォキシダーゼ」の起源としては、例えばストレプトコッカス属微生物が挙げられ、好ましくはストレプトコッカス'ミュータンス、さらに好ましくはストレプトコッカス .ミュータンス NCIB11723を挙げることが出来る。ストレプトコッカス ·ミユータンス NCIB11723由来の水生成型 NADHォキシダーゼのアミノ酸配列、およびそれをコードする DNAの塩基配列は、既に報告されている（特許文献:特開平 8 — 196281)。

[0019] 配列番号 1、 2は、ストレプトコッカス'ミュータンス NCIB11723由来の水生成型 NA DHォキシダーゼのアミノ酸配列、およびそれをコードする DNAの塩基配列を示す。当該ストレプトコッカス属は、野生株であってもよぐまた変異株であってもよい。変異株は、定法に従い、 UV照射や、 N—メチル— Ν'-トロ— N— -トロソグァ二ジン (NT G)、メチルェタンスルホネート (EMS)等の変異剤による処理により取得することができる。変異株が本発明の NADHォキシダーゼを生産しうる限り、当該変異株は本発明に用いる NADHォキシダーゼの入手源として使用しうる。 [0020] 該ストレプトコッカス属微生物由来の水生成型 NADHォキシダーゼは、従来のラタトバチルス属由来の酵素とは異なり、安定ィ匕のために DTTなどの還元剤の添力卩を必要とせず、本発明の目的である NAD +再生系への使用に好ましいと言える。水生成型 NADHォキシダーゼは、ストレプトコッカス属細菌の培養液力酵素を調製して取得可能であり、その他、本酵素をコードする DNAをベクターに組込み、これを宿主内に導入して得られる形質転換体内で酵素遺伝子を発現させることによって容易かつ大量に取得可能である。

[0021] 本発明では、「水生成型 NADHォキシダーゼ」として、配列番号 1に示すアミノ酸配列からなる酵素タンパク質と実質的に同一の酵素タンパク質を使用できる。「実質的に同一」の酵素タンパク質とは、酵素タンパク質のアミノ酸配列において、 1、 2、 3、 4

、 5、 6、 7、 8、 9、 10またはそれ以上の置換、欠失および Zまたは挿入を導入し、そのとき該酵素タンパク質が同等の機能を有する場合、当該酵素タンパクは実質的に同一であるといえる。また、本発明で使用する酵素タンパク質は配列番号 1に示すァミノ酸配列と 60%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、そして最も好ましくは 99%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、配列番号 1に示すアミノ酸配列からなる酵素タンパク質と同等の機能を有する場合、当該酵素タンパク質は実質的に同一であると言える。

[0022] 上記アミノ酸配列の「同一性」とは、比較対象となる配列を最適な状態にァラインメントされた状態で比較することにより決定される。比較対象となる配列は、最適な状態にアラインメントされた場合に、付加または欠失を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性は、例えば相同検索プログラム FASTA(W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A. S. (1988) 85:2444- 2448)や BLAST (Altschul et. al., J. Mol. Biol. (1990) 215:403- 410)を用いて 2つのアミノ酸配列を比較した場合に、 Identityの値で算出することができる。 BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、 National Center for Biotechn ology Information(http：〃 www.ncbi.nih.gov/)を通じて公衆に利用可能である。

[0023] ここでいう同等の機能を有する酵素タンパク質は、それらをコードするヌクレオチド配列に相補的な配列を有するヌクレオチド鎖に、ストリンジヱント条件下でノ、イブリダィズするヌクレオチド配列を含む DNAによりコードされ得る。 [0024] 該ストリンジェント条件下のハイブリダィゼーシヨン条件の例は：好ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの Sodium phosphate、 ImMの EDTA中で約 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、および約 2XSSC、約 0. 1%の SDS中で 50°Cの洗浄；より望ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの Sodium pho sphate、約 ImMの EDTAで 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、および約 1XSSC、約 0 . 1%の SDSで約 50°Cの洗浄；より望ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS) 、約 0. 5Mの Sodium phosphate,約 ImMの EDTAで約 50°Cでハイブリダィゼーション、および約 0. 5XSSC、約 0. 1%の SDSで約 50°Cの洗浄；より好ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5Mの Sodium phosphate,約 ImMの EDTAで約 50°Cでハイブリダィゼーシヨン、および約 0. 1XSSC、約 0. 1%の SDSで約 50°C の洗浄；並びになおより好ましくは約 7%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、約 0. 5M の Sodium phosphate,約 ImMの EDTAで約 50°Cで、約 0. 1XSSC、約 0. 1%の3 DSで約 65°Cの洗浄である。もっとも、該条件は、ヌクレオチド鎖の長さ、該配列、および異なる環境パラメーターに依存して異なり得る。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダィズする。

[0025] 核酸のハイブリダィゼーシヨンの詳細なガイドは、例えば Tijssen(1993) Laboratory Tecnniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acia Probes part I chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay , Elsvier, New Yorkに見出される。

[0026] 2.ベクター

上記形質転転換体を得るために用いられるベクターとしては、適切な宿主内で本発明の酵素遺伝子を発現できるものであればいずれもが使用できる。このようなベタターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられる。また、他の宿主との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。このようなベクターは、作動可能に連結されたプロモーター（例えば lacUV5 プロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモーター、 tacプロモーター、 lppプロモータ一、 tufBプロモーター、 recAプロモーター、 pLプロモーター）等の制御因子を含み、本発明の DNAと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、 pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号パンフレット）等が好適に使用できる。

[0027] 本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばェンハンサー、 CCAATボックス、 TATAボックス、 SPI部位など）を有する塩基配列をいう。本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現するように、 DNAと、その発現を調節するプロモーター、ェンハンサ一等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動できる状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

[0028] 3.形質転換体

本発明の遺伝子を含む DNAを含有する組換えベクターを導入する宿主としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、大腸菌が特に好ましい。本発明の DNAは定法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば塩ィ匕カルシウム法により、本発明の DNAを導入できる。

[0029] 本明細書における形質転換体 (または組換え体）は、異種性核酸分子が導入された宿主生物を意味する。一般的に核酸分子は、宿主のゲノムに安定的に組み込まれるか、または、染色体外の分子と存在する。そのような染色体外の分子は、自己複製することができる。形質転換された細胞、組織または生物は、形質転換プロセスの最終産物のみならず、そのトランスジエニック後代もまた含まれる。

[0030] 4.反応

本発明の一つの実施形態では、脱水素酵素による立体選択的酸ィ匕によるェナンチォマー豊富化反応において、ストレプトコッカス属細菌由来水生成型 NADHォキシダーゼによる NAD +再生系を利用することを特徴としている。したがって、本発明は、立体選択的酸化反応に、ストレプトコッカス属由来の水生成型 NADHォキシダーゼによる NAD +再生系を共役させる点を一つの特徴とするものであり、製造するェナンチォマー豊富化化合物、更には反応に使用する脱水素酵素の種類によって、本発明はなんら限定されるものではない。

[0031] 5.基質

本発明により製造されるェナンチォマー豊富化化合物のための原料は、ェナンチォマー混合物を含む。本発明の「ェナンチォマー混合物」としては、不斉炭素を有し、その不斉炭素に、脱水素酵素で酸化され得る水酸基、アミノ基、ホルミル基等が結合した化合物が挙げられる。具体的には、ジオール誘導体などを含めたアルコール誘導体、ヒドロキシ酸誘導体、アミノ酸誘導体などが挙げられる。

[0032] 「誘導体」は、ある化合物に小部分の構造上の変化があってできる化合物である。

化合物中の水素原子あるいは特定の原子団カ他の原子あるいは原子団によって置換された化合物は、該化合物の誘導体であると理解される。

[0033] 6.脱水素酵素

上記アルコール誘導体、ヒドロキシ酸誘導体の製造には、 E. C. 1. 1. 1に分類される酵素群で、その反応がェナンチォマー選択的であり NAD+を補酵素として利用できるものであればいかなるものも使用し得る。上記アミノ酸誘導体の製造には E. C. 1. 4. 1に分類される酵素群で、その反応がェナンチォマー選択的であり NAD +を補酵素として利用できるものであればいかなるものも使用し得る。例を挙げると、以前我々が見出したセルロモナス 'スピーシーズ（Celluromonas sp.)株に由来する脱水素酵素（特願 2004— 182926)は、 NAD依存性の酵素であり、 1, 2—ブタンジォール及び 1 , 3 -ブタンジオールの (R)体に対し立体選択的酸化活性を有する。また、上記酵素は、 3—クロロー 1, 2—プロパンジオールの（S)体に対し立体選択的酸ィ匕活性を有する。

[0034] 従って、本発明の脱水素酵素として上記酵素を使用すれば、 1, 2—ブタンジォールまたは 1, 3—ブタンジオールのェナンチォマー混合物から（S)体のェナンチォマ一豊富化された上記ジオールを得る事ができる。また、（本発明の脱水素酵素として上記酵素を使用すれば、） 3—クロロー 1, 2—プロパンジオールのェナンチォマー混合物から (R)体のェナンチォマー豊富化された上記ジオールを得る事が出来る。

[0035] また、キャンディダ*マリス（Candida maris) IFO10003株に由来する脱水素酵素（国際公開第 WO01Z005996号パンフレット）は 1—フエ-ルエタノールの（R)体に対し立体選択的酸化反応を触媒する。

[0036] したがって、本発明の脱水素酵素として上記酵素を使用すれば、 1—フエニルエタノールのェナンチォマー混合物から（S)体のェナンチォマー豊富化化合物を得る事が出来る。また、 L体または D体特異的アミノ酸脱水素酵素を使用すれば、アミノ酸誘導体のェナンチォマー混合物力それぞれ D体、 L体のェナンチォマー豊富化されたアミノ酸誘導体を得ることが出来る。

[0037] 7.ェナンチォマー豊富化

本発明における「ェナンチォマー豊富化化合物」とは、目的の対掌体が、もう一方の対掌体との混合物において 50%モル量以上、好ましくは約 70%以上、更に好ましくは約 90%以上の割合で存在するものを意味する。

[0038] 本発明のェナンチォマー豊富化反応は、以下のように行うことができる。まず、適当な溶媒中に、ェナンチォマー混合物と、その一方のェナンチォマーに対し酸ィ匕活性を有する脱水素酵素と、水生成型 NADHォキシダーゼ及び NAD +とを添加し攪拌する事により行うことができる。

[0039] 本発明の水生成型 NADHォキシダーゼは、 NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と組み合わせて使用し得る。ここで、「組み合わせて使用」とは、水生成型 N ADHォキシダーゼおよび脱水素酵素の両酵素を反応液に同時に添加する場合のほか、両酵素が反応液中で共存する状態となる限り、両酵素を異なる時期に添加する場合も含まれる。

[0040] 反応条件は、用いる基質、酸ィ匕還元酵素などにより異なるが、通常、反応は約 5〜 80°C好ましくは約 10〜50°Cの温度で行われ、また pHは約 4〜10、好ましくは約 5〜 9で行う。基質であるェナンチォマー混合物は約 0. 1〜80% (WZV)、好ましくは約 1〜60%の仕込み濃度で添加できる。 NAD +は基質に対して約 0. 00001〜1モル %、好ましくは約 0. 00001〜0. 1% (WZV)の濃度で行う。また、 NADHォキシダーゼの反応には、酸素が必要であるため、反応液が空気または比較的純粋な酸素存在下で行われる事が好ましい。また、反応液への酸素の溶解を促進するため、反応は、振盪あるいは攪拌条件下で行われる事が好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応する事により、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより効率に進む場合もある。

[0041] 8.酵素

本発明に使用する酵素、例えば脱水素酵素、水生成型 NADHォキシダーゼは、単一にまたは部分的に精製された酵素であってもよいし、これら酵素を産生する生物 (例えば微生物）の培養物またはその培養物の処理物を使用することも可能である。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「処理物」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、酵素自体または菌体のまま公知の手段 (例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など)で固定化されて使用できる。

[0042] また、反応を行う際、脱水素酵素と水生成型 NADHォキシダーゼの両者を同一宿主細胞内に導入した形質転換体 (例えば形質転換体微生物）の培養物またはその培養物の処理物を用いれば、別々に両酵素を発現する微生物を培養する必要はないため、より低コストでェナンチォマー豊富化化合物が製造できる。

[0043] また、例えば、両酵素を同一細胞内に発現した形質転換微生物を用いれば、微生物細胞内の NAD +を使用し、反応が進行することも可能となり、従って、外部から別途 NAD +を添加する必要がない、または添加する NAD +の量を大幅に減らす事が可能となる。このような形質転換体は、使用する脱水素酵素をコードする DNA 及び水生成型 NADHォキシダーゼをコードする DNAを、同一のベクターに組込み、これを宿主に導入することにより製造できるし、また、これら 2種類の DNAを不和合性グループの異なる 2種のベクターにそれぞれ組込み、それらを同一の宿主に導入すること〖こよっても製造できる。

[0044] すなわち、使用する脱水素酵素をコードする DNAと NADHォキシダーゼをコードする DNAとを含有する組換えベクターを含む形質転換体や、使用する脱水素酵素をコードする DNAを含有する第 1の糸且換えベクターと、 NADHォキシダーゼをコードする DNAを含有する第 2の組換えベクターとを含む形質転換体を使用できる。

[0045] 本発明の NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と水生成型 NADHォキシダーゼとを含む「組成物」は、両酵素、および所望により担体を混合することにより製造する。そのような組成物はまた、他の作用性物質、および慣行の添加物、例えば安定剤、湿潤剤、乳化剤、香味剤、緩衝剤などを含みうる。本発明の組成物は、本発明の方法のために使用しうる。 [0046] 以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではな、。

実施例

[0047] (実施例 NADHォキシダーゼ遺伝子を含む組椽ぇベクターの作成及び組椽ぇのィ乍 5^

大腸菌におヽてストレプトコッカス ·ミュータンス由来の水生成型 NADHォキシダーゼを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作成した。まず NADH ォキシダーゼの構造遺伝子の開始部分に Ndel部位を付加し、かつ終止コドンの直後に新たな終止コドンと Pstl部位を付加した二本鎖 DNAを以下の方法により取得した。

[0048」 5 ― gaggatttgcatatgagtaaaatcgttattg— 3 、primer— 1：目 3歹 [J番号 3)及び 5 — atga aaacatgtgaattcccattgacatatc― 3， (primer― 2：酉己歹 U番号 4)記載の合成プライマーの組み合わせで、水生成型 NADHォキシダーゼ遺伝子を含有するプラスミド pSSW6 1 (Biosci. Biotech. Biochem., 60(1), 39-43, 1996)を铸型として PCRを行い二本鎖 D 丄を合成し 7こ。同様【こ、 5 ― gatatgtcaatgggaattcacatgttttcat― 3 (.primer— d : 配歹 U番号 5)及び 5， - tttctgcagttatcatttagcttttaatgct - 3，（primer— 4：配歹 U番号 6) の合成プライマーの組み合わせで、水生成型 NADHォキシダーゼ遺伝子を含有するプラスミド PSSW61 (Biosci. Biotech. Biochem., 60(1), 39-43, 1996)を铸型として P CRを行い、二本鎖 DNA2を合成した。

[0049] 更に前記 2種の合成プライマー（primer— 1、 primer— 4)を用い、上記で得た二本鎖 DNA1、 2の混合物を铸型に PCRを行い、二本鎖 DNAを得た。得られた DNA 断片を Ndel及び Pstl消化し、プラスミド pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号パンフレット）の lacプロモーターの下流の Ndel、 Pstl部位に挿入することにより、組換えプラスミド pNTNXを取得した。

[0050] 図 1は、 pNTNXの作製法及び構造を示す。本組換えベクター pNTMXを用いて大腸菌 HB101 (宝酒造株式会社製)を形質転換し、組換え大腸菌 HB101 (pNTN X)を得た。

[0051] 施例 2)組橼大腸菌による NADHォキシダーゼの発現実施例 1で得た組換え大腸菌 HB 101 (pNTNX)を 100 μ gZmlのアンピシリン及びグリセリン 0. 8% (wZv)を含む2 XYT培地（バクト·トリプトンl. 6% (wZv)、バタト 'イーストエキス 1. 0% (w/v) , NaClO. 5% (w/v) , 100 gZmlのアンピシリン、 pH7. 0)で培養し、集菌後、 lOOmMトリス塩酸緩衝液 (pH7)に懸濁し、超音波破砕法により破砕し無細胞抽出液を得た。本無細胞中の NADHォキシダーゼの比活性は 30UZmgタンパクであった。

[NADHォキシダーゼ活性の測定条件]

lOOmMジン酸緩衝液（pH7. 0)に NADHO. 17mM, EDTAO. 2mM、 FADO. 0 2mMを含む反応液 0. 95mlに酵素液 0. 05mlを添カ卩し、 30°Cでの波長 340nmの吸光度の減少を測定することにより行った。この反応条件において、 1分間に 1 /z mol の NADHを NAD +に酸ィ匕する酵素活性を lunitと定義した。

[0052] 3)無細朐柚液の調製

実施例 1で得た NADHォキシダーゼを発現する組換え大腸菌 HBlOl (pNTNX) を 500ml容坂口フラスコ中で滅菌した 80mlの実施例 2記載の培地に接種し、 30°C で 32時間振とう培養した。集菌後、 10mlの lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 0)に懸濁し、超音波破砕法により破砕後、遠心分離を行い、 NADHォキシダーゼを含む無細胞抽出液を得た。

[0053] また、キャンディダ.マリス（Candida maris)由来脱水素酵素を発現する E. coli HB lOl (pNTFP) (受託番号 FERM BP— 7116)およびセルロモナス 'スピーシーズ（ Celluromonas sp.)由来脱水素酵素を発現する E. coli HBlOl (pTSCS) (FERM BP- 10024)のそれぞれを、 500ml容坂口フラスコ中で滅菌した 60mlの半合成培地（グリセリン 1. 5% (w/v)、イーストエキス 0. 3% (w/v)、 Na HPO 0. 6% (w

2 4

Zv)、 KH HPO 0. 3% (w/v)、 NaClO. 2% (w/v)、 MGSO4- 7H2O0. 5% (

2 4

wv)、 100 gZmlのアンピシリン、 pH6. 0)に植菌し、 37°Cで 37時間培養した。集菌後、それぞれ 10mlの lOOmMリン酸緩衝液 (pH7. 0)に懸濁し、超音波破砕法により破砕後、遠心分離を行い、 2種の NAD依存性脱水素酵素を含む無細胞抽出液を得た。 HB101 (pTSCS)及び HB101 (pNTFP)力も調製した無細胞抽出液中は、それぞれ lOUZmgの 1, 2 ブタンジールに対する酸化活性、 5UZmgの 1 フエ-ルエタノールに対する酸ィ匕活性を有して、た。

[0054] [1, 2-ブタンジオールまたは 1 フエ-ルエタノール酸化活性の測定条件]

lOOmMリン酸緩衝液（pH7. 0)に 1 , 2 ブタンジオールまたは 1—フエニルェタノ一ノレ 20mM、 NAD+ O. 17mMを含む反応液 0. 95mlに酵素液 0. 05mlを添カロし、 30°Cでの波長 340nmの吸光度の増加を測定することにより行った。この反応条件において、 1分間に: molの NADHを NAD +に酸化する酵素活性を lunitと定義した。

[0055] なお、 E. coli HBIOI (pNTFP) (FERM— 7116) ίま 2000年 4月 11曰に、 E. co li HB101 (pTSCS) (FERM BP— 10024) ίま 2004年 5月 12曰に、それぞれ前記の受託番号にて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (ΙΡΟ D：〒 305-8566 茨城県つくば巿東 1 1 1 中央第 6)に寄託されている。

[0056] (実施例 4) 1. 2 ブタンジオールの光学分割

実施例 3で調整した HB101 (pTSCS)無細胞抽出液 (脱水素酵素） 70 μ HB10 Ι (ρΝΤΝΧ)無細胞抽出液 (NADHォキシダーゼ酵素） 28 /z l、 10mgラセミ体 1 , 2 ブタンジオール、 300mMリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 0)を含む反応液 lmlを試験管中で 20°Cで振盪し 23時間反応を行った。反応液 200 1を硫酸アンモ-ゥムで飽和させた後、酢酸ェチル 400 1〖こより 1 , 2 ブタンジオールを抽出した。本抽出液のうち 100 1から減圧下で溶媒を除去し、残渣にトリフルォロ酢酸無水物 200 1 をカロえて室温で 10分間静置する事によりトリフルォロアセチルイ匕したのち、減圧下で未反応のトリフルォロ酢酸無水物を除去した。さらに酢酸ェチル 500 1をカ卩えて、トリフルォロ化した 1 , 2—ブタンジオールを溶解し、キヤビラリーガスクロマトグラフィーにより光学純度を分析した。また、上記酵素反応液 100 1を硫酸アンモ-ゥムで飽和させた後、酢酸ェチル 1000 1により 1 , 2 ブタンジオールを抽出し、本抽出液中の 1 , 2—ブタンジオール含量ををガスクロマトグラフィーにより分析した。その結果、光学純度 97%の（S)体 1 , 2ブタンジオールが収率 49%で生成して!/、た。

[0057] [光学純度の分析条件]

カラム： Chiradex G— TA (20m X 0. 25mm) (ASTEC社製）

カラム温度： 60°C 注入温度： 150°C

検出温度： 150°C

キャリアーガス：ヘリウム（130kPa)

スプリット比： lOOZl

検出時間： 1, 2 ブタンジオール R体 5. 0分、 S体 5. 8分

[0058] [含量の分析条件]

カラム： HP— 5 30m X O. 32mml. D. (Agilent Technologies社製）

検出: FID

カラム初期温度： 50°C、カラム最終温度： 200°C、昇温速度： 6°CZ分

注入温度： 150°C

検出温度： 300°C

キャリアーガス：ヘリウム（70kPa)

スプリット比： lOOZl

[0059] (実施例 5) 1 フエニルエタノールの光学分割

実施例 3で調整した HB 101 (pNTFP)無細胞抽出液 (脱水素酵素） 19 1、 HB10 1 (pNTNX)無細胞抽出液 (NADHォキシダーゼ酵素） 28 μ 1、 10mgラセミ体 1 フェ-ルエタノール、 300mMリン酸カリウム緩衝液を含む反応液 lmlを 20°Cで振盪し 23時間反応を行った。反応液 100 1を硫酸アンモ-ゥムで飽和させた後、酢酸ェチル 700 1により 1—フエ-ルエタノールを抽出し、本抽出液中の 1 フエ-ルェタノールの光学純度及び含量を HPCLにより分析した (カラム:ダイセルィ匕学工業社製、 Chiralcell OD—H(0. 46 X 25cm)、カラム温度： 25°C、溶離液： n—へキサン Z2 プロパノール =9Zl、流速: 0. 5mlZ分、溶離時間：（R)体—12. 2分、（S)体 13. 3分)。その結果、光学純度 100%の（S)体 1 フニルエタノールが収率 4 8%で生成していた。

[0060] [光学純度、含量の分析条件]

カラム： Chiralcell OD— H 0. 46 X 25cm (ダイセルィ匕学工業社製）

溶離液： n—へキサン Z2—プロパノール =9Zl

流速： 0. 5mlZ分溶離時間：（R)体- 12. 2分、（S)体- 13. 3分）

[0061] (実施例 6) 1 フニルエタノールの光学分割（DTT添カロ、無添加）

実施例 3で調整した HB 101 (pNTFP)無細胞抽出液 (脱水素酵素） 10 1、 HB10 1 (pNTNX)無細胞抽出液（NADHォキシダーゼ） 5 1、 lOmgラセミ体 1 フエ-ルエタノール、 300mMリン酸カリウム緩衝液を含む反応液 lmlおよび本反応液に 5m MDTTを添加した反応液 lmlを 20°Cで振盪し 6時間反応を行った。その後、実施例 5と同様の方法で反応液中の 1ーフヱ-ルエタノールの含量、光学純度を測定した。その結果、 DTT無添カ卩および添カ卩した反応液中に、それぞれ光学純度 95%の 1 フエ-ルエタノールが収率 50%、光学純度 94%の 1 フ -ルエタノールが収率 51 %で生成していた。以上のように、反応液中に DTTを添カ卩しない場合も、 DTT添カロした場合と同程度の反応が進行しており、実質的に DTTの添加の必要性は無かつた。

[0062] 施例 7)酴泰存下での水牛成型 NADHォキシダーゼの安定件

実施例 3で調製した水生成型 NADHォキシダーゼを含む HB101 (pNTNX)無細胞抽出液 0. lmlを lOOmMリン酸緩衝液または 5mMの DTTを含む lOOmMリン酸緩衝液 0. 9mlに添加し、小型試験管中で静置または 300rpmでの振盪条件下 (酸素供給条件下）、 20°C、 3時間保存し、残存する NADHォキシダーゼ活性を測定した。その結果を表 1に示す。いずれの条件においても、 90%以上の活性が保持されていた。

[0063] [表 1] 残存活性 (％)

条件

静振還

100mMリン酸緩衝液 92 93

100mMリン酸緩衝液（+5mM DTT) 94 93

Claims

請求の範囲 [1] 以下の（1)および (2)を含むェナンチォマー豊富化化合物の製造方法：

(1)ェナンチォマー混合物を、 NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と接触させ、一方のェナンチォマーを優先的に酸化し、他方のェナンチォマーを残存させ、 NADHを生成させる。

(2) (1)の酸ィ匕反応により生成した NADHを、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼと接触させ NAD +へ変換する。

[2] 前記水生成型 NADHォキシダーゼ力ストレプトコッカス（Streptococcus)属微生物由来の酵素またはそれと実質的に同一の酵素である請求項 1記載の製造方法。

[3] 前記ストレプトコッカス属微生物力ストレプトコッカス ·ミュータンス (Streptococcus mu tans)である請求項 2記載の製造方法。

[4] 前記ストレプトコッカス'ミュータンスが、ストレプトコッカス'ミュータンス（Streptococcus mutans) NCIB11723またはその変異株である請求項 3記載の製造方法。

[5] 前記水生成型 NADHォキシダーゼ力配列番号 1に示すアミノ酸配列よりなるタンノク質またはそのタンパク質と実質的に同一のタンパク質を含む請求項 4記載の製造方法。

[6] 前記水生成型 NADHォキシダーゼの酵素源が、当該酵素を組換え発現した微生物の培養物又はその培養物の処理物である、請求項 1〜5のいずれかに記載の製造方法。

[7] 前記脱水素酵素の酵素源および水生成 NADHォキシダーゼの酵素源が、それら両方の酵素を同一宿主内で発現した組換え微生物の培養物又はその培養物の処理物である、請求項 1〜5のいずれかに記載の製造方法。

[8] 前記ェナンチォマー混合物が、 2級アルコールまたはその誘導体である請求項 1〜7 の！、ずれかに記載の製造方法。

[9] 前記ェナンチォマー混合物が、アミノ酸またはその誘導体である請求項 1〜7のいずれかに記載の製造方法。

[10] NAD+ (ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を補酵素とする立体選択的脱水素酵素によってェナンチォマー混合物のうちの一方の立体のェナンチォマーを優先的に酸化する反応において、当該反応に伴って生ずる NADHを NAD+に再変換するために、酸素存在下であっても酵素保護剤なしで安定であることを特徴とする水生成型 NADHォキシダーゼを利用する方法。

[11] NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と組み合わせて使用し得る、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼ。

[12] NAD +を補酵素とする脱水素反応に伴って生ずる NADHを NAD+に再変換する補酵素再生機能を有し、かつ、酵素保護剤なしで用いられることを特徴とする補酵素再生系用の水生成型 NADHォキシダーゼ。

[13] NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素の遺伝子と、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼの遺伝子とを含むベクター。

[14] NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素の遺伝子と、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼの遺伝子とを含むベクターによって形質転換された形質転換体微生物。

[15] NAD +を補酵素とする立体選択的脱水素酵素と、酸化的条件下で安定である水生成型 NADHォキシダーゼとを含む組成物。