JP2015065910A - 光学活性含窒素環状アルコール化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、光学純度の高い特定の光学活性含窒素環状アルコール化合物を効率良く製造できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明に係る光学活性含窒素環状アルコール化合物の製造方法は、３−ヒドロキシピペリジン化合物のエナンチオマー混合物を原料として用い、酵素を用いてこれに含まれるＲ体エナンチオマーを選択的に酸化することを特徴とする。【選択図】なし

Description

本発明は、光学純度の高い光学活性含窒素環状アルコール化合物を効率良く製造できる方法に関するものである。

光学活性含窒素環状アルコール化合物は、医薬品や農薬の出発原料や合成中間体として有用な化合物である。

例えば、光学活性（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物の製造方法としては、プロキラルな３−ピペリドン化合物を、酵素源を用いて（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジンへ不斉還元する方法（特許文献１，非特許文献１）、光学活性な酸性化合物を用いて造塩晶析により光学分割する方法（特許文献２〜４）、光学活性なグルタミン酸から誘導する方法（非特許文献２）などがある。しかしながら、３−ピペリドン化合物が高価である上に水中で不安定であるため、酵素不斉還元法は効率的・経済的な方法ではなかった。また、光学分割法は最大５０％の収率でしか得られず、光学活性なグルタミン酸から誘導する方法は多段階の反応が必要であり、非効率的であった。

これまで、酵素源を用いてラセミ体３−ヒドロキシピペリジン化合物を基質特異的に酸化した反応の報告例はない。また、酵素を用いて３−ピペリドン化合物を（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジンへ不斉還元した報告例もない。

中国特許出願公開第１０３１３１７３４号明細書 特公平７−１１３０１６号公報 特許第４６１３１５７号公報 特許第４０２５３５３号公報

Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，１１（６），１２４５−１２４８（２００９） Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５０（６），８９６−８９９（１９８５）

上述したように、光学活性含窒素環状アルコール化合物は合成中間体などとして有用であり、様々な製造方法が知られていたが、従来の製造方法は決して効率的なものではなかった。

そこで本発明は、光学純度の高い特定の光学活性含窒素環状アルコール化合物を効率良く製造できる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、出発原料化合物として３−ヒドロキシピペリジン化合物のエナンチオマー混合物を用い、酵素を用いてこれに含まれるＲ体エナンチオマーの水酸基を選択的に酸化することにより、特定の光学活性含窒素環状アルコール化合物を効率的に製造できることを見出して、本発明を完成するに至った。

本発明に係る下記式（Ｉ）で表される光学活性含窒素環状アルコール化合物の製造方法は、

［式中、Ｒはアミノ基の保護基を示す］

下記式（ＩＩ）で表されるエナンチオマー混合物に、

［式中、Ｒは上記と同義を示す］

Ｒ体のエナンチオマーに対する基質特異性を有する酸化酵素源を作用させて、Ｒ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化することにより下記式（ＩＩＩ）で表される３−ピペリドン化合物にする一方で、

［式中、Ｒは上記と同義を示す］

上記光学活性含窒素環状アルコール化合物（Ｉ）をそのまま維持する工程を含むことを特徴とする。

上記本発明方法においては、さらに、Ｓ体立体選択性を有する還元酵素源を作用させて上記３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）を立体選択的に還元することにより（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）にする工程を実施することが好ましい。かかる工程により、光学活性含窒素環状アルコール化合物（Ｉ）の製造効率をより一層高めることができる。

［式中、Ｒは上記と同義を示す］

本発明に係る製造方法においては、上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源と上記Ｓ体立体選択性還元酵素源の共存下、上記Ｒ体エナンチオマーの基質特異的酸化工程と上記３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の立体選択的還元工程を同時に行うことが好ましい。かかる態様により、製造効率がより一層高まる。

上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源としては、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌、ブレヴンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属細菌、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属細菌、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、オークロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌からなる群より選択される微生物に由来する酵素源が好ましい。また、上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源として、ＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺を補酵素とするものを用いるのも好ましい態様である。

上記Ｒ体エナンチオマーの基質特異的酸化工程においては、上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源により還元された還元型の上記補酵素をＮＡＤＨオキシダーゼによりＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺に酸化することが好ましい。かかる態様により、酵素反応の進行を促進することができる。

また、上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源としてＰＱＱを補酵素とするものを用いるのも好ましい態様である。

ＰＱＱを補酵素とする上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源としては、さらに、下記（ａ１）〜（ａ３）から選択される酵素源を挙げることができる。

（ａ１） 配列番号２のアミノ酸配列を有するＲ体基質特異性酸化酵素源；
（ａ２） 配列番号２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、上記エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有するＲ体基質特異性酸化酵素源；
（ａ３） 配列番号２のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、上記エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有するＲ体基質特異性酸化酵素源。

ＰＱＱを補酵素とするＲ体基質特異性酸化酵素源を用いる場合には、人工受容体を共存させることが好ましい。かかる態様により、酵素反応の進行を促進することができる。

上記Ｓ体立体選択性還元酵素源としては、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属細菌、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属細菌、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属細菌、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属細菌からなる群より選択される微生物に由来する酵素源を挙げることができる。また、上記Ｓ体立体選択性還元酵素源としてＮＡＤＰＨを補酵素とするものを用いるのも好ましい態様である。

上記３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の立体選択的還元工程においては、上記Ｓ体立体選択性還元酵素源により酸化された酸化型の上記補酵素をグルコース脱水素酵素によりＮＡＤＰＨに還元することが好ましい。かかる態様により、酵素反応の進行を促進することができる。

本発明に係る化合物のＲとしては、（Ｃ_1-6アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ_1-6ハロゲン化アルコキシ）カルボニル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）メチルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ_1-6アルカノイル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）カルボニル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）_1-3メチル基からなる群より選択される保護基を挙げることができる。

光学純度の高い含窒素環状アルコール化合物は合成中間体などとして有用であるが、従来の製造方法は、収率が低いなど効率の面で十分ではなかった。それに対して本発明方法によれば、光学純度の高い含窒素環状アルコール化合物を効率的に製造することができる。従って本発明は、特に有用な化合物である光学活性（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物を効率的に製造可能な技術として、産業上非常に優れている。

以下、本発明方法を実施の順番に従って詳述する。

（１） Ｒ体の基質特異的酸化工程
本工程では、エナンチオマー混合物（ＩＩ）にＲ体基質特異性を有する酸化酵素源を作用させて、下記反応式のとおり、Ｓ体のエナンチオマーはそのまま維持するのに対して、Ｒ体のエナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化することにより３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）にする。

上記式中、Ｒはアミノ基の保護基を示し、目的化合物である（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン（Ｉ）の利用条件などに応じて適切なものを選択すればよい。例えば、（Ｃ_1-6アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ_1-6ハロゲン化アルコキシ）カルボニル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）メチルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ_1-6アルカノイル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）カルボニル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）_1-3メチル基からなる群より選択されるものを挙げることができる。

（Ｃ_1-6アルコキシ）カルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基を挙げることができる。

（Ｃ_1-6ハロゲン化アルコキシ）カルボニル基としては、例えば、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、１，１−ジメチル−２−ハロエトキシカルボニル基、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエトキシカルボニル基、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基を挙げることができる。

本発明において、Ｃ_6-12アリールが有していてもよい置換基としては、Ｃ_1-6アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子、Ｃ_1-6アルキルスルフィニル基からなる群より選択される１以上を挙げることができる。また、置換基の数は適宜選択すればよいが、例えば、１以上、５以下とすることができ、１以上、３以下が好ましく、１とすることが特に好ましい。当該置換基数が２以上である場合、置換基は互いに同一であっても異なっていてもよい。

（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）メチルオキシカルボニル基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル基、４−メチルスルフィニルベンジルオキシカルボニル基を挙げることができる。

置換基を有していてもよいＣ_1-6アルカノイル基の置換基としては、Ｃ_1-6アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子からなる群より選択される１以上を挙げることができる。また、置換基の数は適宜選択すればよいが、例えば、１以上、５以下とすることができ、１以上、３以下が好ましく、１とすることが特に好ましい。置換基を有していてもよいＣ_1-6アルカノイル基としては、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、ｔ−ブチロイル基、メトキシアセチル基、フルオロアセチル基、ジフルオロアセチル基、トリフルオロアセチル基、クロロアセチル基、トリクロロアセチル基、３−メチル−３−ニトロブチロイル基を挙げることができる。

（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）カルボニル基としては、例えば、ベンゾイル基、ｏ−ニトロベンゾイル基を挙げることができる。

（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）_1-3メチル基において、置換基を有していてもよいＣ_6-12アリールの数が２または３である場合、当該Ｃ_6-12アリールは互いに同一であっても異なっていてもよい。また、メチル基には、さらにメチル基が置換していてもよいものとする。（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）_1-3メチル基としては、例えば、ベンジル基、α−メチルベンジル基。ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ベンズヒドリル基、トリチル基を挙げることができる。

本発明方法においては、出発原料化合物として、エナンチオマー混合物（ＩＩ）を用いる。本発明において「エナンチオマー混合物（ＩＩ）」とは、その光学純度が目的とする用途において要求される水準に満たない３−ヒドロキシピペリジン化合物のＲ体とＳ体との混合物を意味する。ラセミ体は言うまでもなく、例えば、９０％ｅ．ｅ．のＳ体が要求される場合には、高光学純度のＲ体も含め、Ｓ体が９０％ｅ．ｅ．に満たない３−ヒドロキシピペリジン化合物のＲＳ混合物は、全てエナンチオマー混合物（ＩＩ）の範疇に含まれるものとする。通常は、ラセミ体が安価で入手容易であることから、ラセミ体を用いる場合に、本発明の効果が最大限に発揮される。

本発明方法の出発原料化合物であるエナンチオマー混合物（ＩＩ）は、市販のものがあればそれを購入すればよいし、市販のものがない場合であっても、その構造は比較的シンプルであることから、当業者であれば容易に合成することができる。例えば、ラセミ体の３−ヒドロキシピペリジンまたはその塩は市販されているので、Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅら，「ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＪＯＨＮ ＷＩＬＥＹ＆ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．（１９９１）を参照し、当該市販製品のアミノ基を所望の保護基で保護することによりエナンチオマー混合物（ＩＩ）を合成すればよい。

本工程で使用するＲ体基質特異性酵素源としては、エナンチオマー混合物（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物を特異的に基質とし、その水酸基を酸化して３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）にする作用を有するものであれば特に制限されない。

本発明において「酵素源」は、目的とする酵素活性を有する限りにおいては、酵素活性を有するポリペプチドそのものだけでなく、当該ポリペプチドを生成する微生物そのもの、当該微生物がポリペプチドを体外に分泌する場合にはその培養液、または当該微生物の菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の酸化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含むものとする。

上記微生物の菌体処理物は特に限定されず、例えば、アセトンや五酸化二リンによる脱水処理またはデシケーターや扇風機を利用した乾燥によって得られる乾燥菌体、界面活性剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体または菌体を破砕した無細胞抽出標品などを挙げることができる。さらには、培養物より酸化反応を触媒するポリペプチドを精製し、これを使用してもよい。

酵素源は、単独で用いても、２種以上組み合わせて用いてもよい。また、上記微生物は周知の方法で固定化して用いてもよい。

３−ヒドロキシピペリジン化合物のエナンチオマー混合物（ＩＩ）のうちＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する能力を有する微生物は、例えば、以下に記載の方法によって得ることができる。

例えば、グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛七水和物６０ｍｇ、硫酸鉄七水和物９０ｍｇ、硫酸銅五水和物５ｍｇ、硫酸マンガン四水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍｌを試験管に入れて殺菌後、無菌的に微生物を接種し、３０℃で２〜３日間振とう培養する。

培養した微生物の菌体を遠心分離により集め、グルコース２〜１０％を含んだリン酸緩衝液１〜５ｍＬに懸濁し、あらかじめエナンチオマー混合物（ＩＩ）を２．５〜２５ｍｇ入れた試験管に加えて、３０℃で２〜３日間振とうする。この際、遠心分離により得た菌体をデシケーター中またはアセトンにより乾燥したものを用いることもできる。さらに、これら微生物もしくはその処理物とエナンチオマー混合物（ＩＩ）を反応させる際に、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤ⁺」という）および／または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、「ＮＡＤＰ⁺」という）および／または人工電子受容体を添加してもよい。また、ＮＡＤＨを添加する場合はＮＡＤＨオキシダーゼを添加してもよい。また、反応系に有機溶媒を共存させてもかまわない。変換反応の後、適当な有機溶媒で抽出を行い、残存した３−ヒドロキシピペリジン化合物の光学純度を測定することにより、（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物に対する基質特異性を判断することができる。また、（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物を基質特異的に酸化できる微生物を選択できた場合には、その培地などからＲ体基質特異性を有する酸化酵素を単離精製してもよい。

また、（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物の水酸基を基質特異的に酸化し、３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）を生成する能力を有する酵素源としては、ＮＡＤ⁺もしくはＮＡＤＰ⁺特異的なポリペプチド、および／またはＮＡＤ⁺もしくはＮＡＤＰ⁺非特異的なポリペプチドが使用できる。

本発明において、「酸化酵素源がＮＡＤ⁺（またはＮＡＤＰ⁺）に特異的である」とは、ＮＡＤ⁺（またはＮＡＤＰ⁺）を補酵素とした場合に、他方を補酵素とした場合よりも高い活性を示す、即ち特異性を示すことを意味する。特異性を示す補酵素を用いた際の活性と他方の補酵素を用いた際の活性の比率は、通常１００／５０以上、好ましくは１００／１０以上、さらに好ましくは１００／２以上である。

本発明において、「還元酵素源がＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＨ）に特異的である」とは、上記と同様の意味を表し、特異性を示す補酵素を用いた際の活性と他方の補酵素を用いた際の活性の比率も、上記と同様である。

ＮＡＤ⁺特異的もしくはＮＡＤＰ⁺特異的なＲ体基質特異性酸化酵素としては、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ １．１．１に分類される酸化還元酵素がある。

上記ＥＣ １．１．１に分類される酸化還元酵素としては、具体的には、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、オークロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等の微生物に由来するものが挙げられる。好ましくは、国際特許公報ＷＯ２００４/０２７０５５の配列表の配列番号１としてそのアミノ酸配列が開示されているデボシア・リボフラビナ（Ｄｅｖｏｓｉａ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ）属由来の酸化酵素（以下、「ＲＤＲ」という）、国際特許公報ＷＯ２００７/１１４２１７の配列表の配列番号２としてそのアミノ酸配列が開示されているブレブンディモナス・ディミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）属由来の酸化酵素（以下、「ＲＢＤ」という）、および後記の参考例２に示す国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のプロテインデーターベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｐｒｏｔｅｉｎ/）に登録されているレイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属由来の３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅと推定されるポリペプチド（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ. ＷＰ＿０１８１９１６８６．１、以下、「ＲＬＳ」という）が挙げられる。

これらポリペプチドをコードするＤＮＡは、微生物の染色体ＤＮＡからＰＣＲ法などにより増幅することが可能である。なお、本明細書において記述されているＰＣＲ法、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等の成書に記載されている方法により実施できる。

また、ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成してもよい。例えば、上記のレイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属由来の３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅと推定されるポリペプチド（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＷＰ＿０１８１９１６８６．１）をコードする塩基配列からなるＤＮＡもしくは配列表の配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡを化学合成し、ベクターに導入すればよい。

また、本発明に利用するＲ体基質特異性酸化酵素源（例えば、ＲＤＲ）は、エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有している限りにおいては、そのアミノ酸配列（例えば、国際特許公報ＷＯ２００４/０２７０５５の配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列）において１若しくは複数個（例えば、４０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。

さらに、本発明に利用する酸化酵素源（例えば、ＲＤＲ）は、エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有している限りにおいては、そのアミノ酸配列（例えば、国際特許公報ＷＯ２００４/０２７０５５の配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列）に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものであってもよい。「配列同一性」は、エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有している限り特に限定されない。即ち、８５％以上であれば特に限定されないが、９０％以上が好ましく、より一層好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上である。なお、アミノ酸配列の同一性は、当業者であれば配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。

上記微生物および後記微生物は、通常、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。

・独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）
・独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒３５１−０１９８ 埼玉県和光市広沢２−１）
・Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｍａｒｓｃｈｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）

ＮＡＤ⁺非特異的もしくはＮＡＤＰ⁺非特異的なＲ体基質特異性酸化酵素を産生する微生物としては、例えば、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属（実施例７〜１９参照）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属（実施例２０と実施例２１参照）の微生物を挙げることができる。

また、目的の酸化酵素活性を有する限り、本工程に利用するＲ体基質特異性酸化酵素源のアミノ酸配列に付加的なアミノ酸配列を結合してもよい。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのようなタグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、目的の酸化酵素活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。

本発明においては、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用すると、より効率的に（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）を製造することができる。

上記の形質転換体に用いるベクターとしては、適当な宿主生物内で本発明に利用する還元酵素をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。

このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）などが挙げられる。

なお、「制御因子」とは、機能的プロモーター、及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。

また、「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。なお、制御因子のタイプ及び種類が宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどについては、「微生物学基礎講座８遺伝子工学」共立出版（１９８７）などに詳細に記述されている。

各ポリペプチドを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入したポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)属、バシラス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)属、シュードモナス(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)属、セラチア(Ｓｅｒｒａｔｉａ)属、ブレビバクテリウム(Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、コリネバクテリイウム(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ)属、ストレプトコッカス(Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ)属、及びラクトバシラス(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ)属及びストレプトマイセス(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クライベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、トリコスポロン(Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ)属、ロドスポリジウム(Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、及びキャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ)属、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)属、セファロスポリウム(Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ)属、及びトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５,５９２−５９４（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））が特に好ましい。

本発明に利用する還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（以下、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）コンピテントセル（タカラバイオ株式会社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。

３−ヒドロキシピペリジン誘導体のエナンチオマー混合物のうち（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン誘導体の水酸基を選択的に酸化するポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターとしては、国際特許公報ＷＯ２００４/０２７０５５の実施例４に記載のｐＮＴＤＲが挙げられる。また、該酸化酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体の例としては、ベクターｐＮＴＤＲでＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換して得られる、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）が挙げられる。

また、本発明においては、目的とする還元活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を用いることにより、より効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。例えば、３−ヒドロキシピペリジン誘導体のエナンチオマー混合物のうち（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン誘導体の水酸基を選択的に酸化するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、酸化型補酵素を再生する能力を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、３−ヒドロキシピペリジン誘導体のエナンチオマー混合物のうち（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン誘導体の水酸基を選択的に酸化するポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、酸化型補酵素を再生する能力を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。

エナンチオマー混合物（ＩＩ）とＲ体基質特異性酸化酵素源を作用させる反応の条件は、適宜調整すればよい。例えば、水系溶媒にエナンチオマー混合物（ＩＩ）を加え、さらにＲ体基質特異性酸化酵素源をその形態などに応じて適量加えた上で、Ｒ体基質特異性酸化酵素源の至適温度前後で反応させればよい。エナンチオマー混合物（ＩＩ）は水溶性のものが多いが、完全に溶解しない場合にはメタノールやエタノールなどの水混和性有機溶媒を加えてもよい。但し、有機溶媒は酵素活性を貶める可能性があるので、その量はできるだけ少なくするか、或いは完全に溶解するまで水の量を多くすることが好ましい。また、反応液のｐＨをＲ体基質特異性酸化酵素源の至適ｐＨに合わせるため、水系溶媒を至適ｐＨに応じた緩衝液にすることもできる。反応時間は、エナンチオマー混合物（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物が十分に酸化されるまでとすればよく、具体的には、予備実験により決定したり、反応液中に（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物が測定されなくなるまでとすることができる。

より具体的には、通常、エナンチオマー混合物（ＩＩ）の濃度は０．１質量％以上、１００質量％以下程度、好ましくは１質量％以上、６０質量％以下であり、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）⁺はエナンチオマー混合物（ＩＩ）に対して０．０００１モル％以上、１００モル％以下程度、好ましくは０．０００１モル％以上、０．１モル％以下、反応温度は１０℃以上、６０℃以下程度、好ましくは２０℃以上、５０℃以下であり、反応のｐＨは４以上、９以下程度、好ましくは５以上、８以下であり、反応時間は１時間以上、１２０時間以下程度、好ましくは１時間以上、７２時間以下で行うことができる。

基質であるエナンチオマー混合物（ＩＩ）は一括、または連続的に添加して行うことができる。反応はバッチ方式または連続方式で行うことができる。また、酸化型補酵素の再生のための酵素を用いる場合は、反応を空気または比較的純粋な酸素存在下、好気条件にて行うことが好ましい。また、酸素の反応液への溶解を促進するため、反応は振盪あるいは攪拌条件下で行われることが好ましい。さらに大気圧以上の加圧下で反応することにより、反応液への酸素の溶解度が向上し、反応がより効率的に進む場合もある。

使用するＲ体基質特異性酸化酵素源がＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺を補酵素とするものである場合、即ちＲ体基質特異性酸化酵素源がＮＡＤ⁺特異的またはＮＡＤＰ⁺特異的である場合には、上記酸化反応によって還元された還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「ＮＡＤＨ」という）もしくは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、「ＮＡＤＰＨ」という）をそれぞれＮＡＤ⁺もしくはＮＡＤＰ⁺に変換する能力を有している酸化還元酵素を併用することが好ましい。

Ｒ体の基質特異的酸化に伴って還元された還元型補酵素を酸化型補酵素に再生するため、酸化還元酵素を併用してもよい。かかる酵素としては、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＰＨデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼが挙げられ、その中でも、ＮＡＤＨオキシダーゼは、補酵素再生反応ための基質として酸素が利用できること、その多くがＮＡＤＨに特異的であり、また触媒される反応が不可逆的であるなど点において好ましい。なお、ＮＡＤＨオキシダーゼには水を生成する水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼと、過酸化水素を生成する過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの２種が知られている。過酸化水素は酵素などに悪影響を与えることが知られており、過酸化水素生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いる場合は、反応系にカタラーゼを添加することにより過酸化水素を分解し、その悪影響を低減・除去することが好ましい。過酸化水素の生成自体を避けられることから、水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼを用いるのがより好ましい。

上記水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼの起源となる生物としては特に限定されず、微生物であってもよいし、高等生物であってもよいが、細菌、カビ、酵母などの微生物が好適であり、好ましくは細菌が挙げられる。例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｋ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、セルプリナ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、またはジアルディア（Ｇｉａｒｄｉａ）属に属する微生物が挙げられ、好ましくはストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物、さらに好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス、特に好ましくはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＮＣＩＢ１１７２３が挙げられる。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＮＣＩＢ１１７２３由来の水生成型ＮＡＤＨオキシダーゼは、そのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡの塩基配列はすでに報告されている(特開平８−１９６２８１号公報)。最も好ましくは、国際特許公報ＷＯ２０１１／０９００５４に記載の安定性の向上したＮＡＤＨオキシダーゼ変異体である。

ＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺を補酵素とするＲ体基質特異性酸化酵素源を用いる場合には、Ｒ体の基質特異的酸化に伴って還元された酸化型補酵素を再生するための上記酵素を反応液に共存させればよい。その添加量は、例えばＲ体基質特異性酸化酵素源の量などに応じて適宜調整することができる。また、その場合の反応条件は、Ｒ体基質特異性酸化酵素源と上記酵素の両方が活性を発揮できる範囲で適宜調整すればよい。

ＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺を補酵素としないＲ体基質特異性酸化酵素源、即ちＮＡＤ⁺非特異的またはＮＡＤＰ⁺非特異的なＲ体基質特異性酸化酵素源は、電子受容体としてＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺を利用しない酵素であり、国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ １．１．２、ＥＣ １．１．３、ＥＣ １．１．４、ＥＣ １．１．５、ＥＣ １．１．９８、ＥＣ １．１．９９のいずれかに分類される酸化還元酵素である。好ましくは、補酵素としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を利用する酵素である。さらに好ましくは、下記（ａ１）〜（ａ３）から選択される酵素源（以下、「ＡＤＨ−ＤＳ」という）である：
（ａ１） 配列番号２のアミノ酸配列を有するＲ体基質特異性酸化酵素源；
（ａ２） 配列番号２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、上記エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有するＲ体基質特異性酸化酵素源；
（ａ３） 配列番号２のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、上記エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有するＲ体基質特異性酸化酵素源。

なお、上記変異の数や配列同一性などの定義や好適値は、Ｒ体基質特異性酸化酵素ＲＤＲなどと同様である。

ＡＤＨ−ＤＳは電子受容体として人工電子受容体を利用できるため、反応中に人工電子受容体を添加することで、効率的に本発明の光学活性化合物を製造することができる。人工電子受容体としては、ＡＤＨ−ＤＳの酸化反応を促進する限り特に限定はされないが、好ましくはフェナジンメチルスルファート（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメチルスルファート、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸アンモニウム）（ＡＢＴＳ）、フェロセン、１，４−ナフトキノン、メナジオン、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ビタミンＫ３）、１，４−ベンゾキノン、２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンである。

ＡＤＨ−ＤＳと人工電子受容体を用いて３−ヒドロキシピペリジン化合物のエナンチオマー混合物（ＩＩ）のうち（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物の水酸基を基質特異的に酸化した場合、反応の進行に伴い、酸化型の人工電子受容体が還元されて還元型人工電子受容体となる。還元型人工電子受容体が酸素によって酸化される酸化型に再生される人工電子受容体（例えば、ＰＭＳ）は３−ヒドロキシピペリジン化合物に対する使用当量（例えば、０．０２当量）が少なくすみ、経済的である。

また、人工電子受容体再生用酵素を添加することで還元型人工電子受容体を酸化型に再生することもできる。また、人工電子受容体と人工電子受容体再生用酵素の添加によりＡＤＨ−ＤＳの反応性を向上させることもできるため好適である（実施例１５〜１７参照）。人工電子受容体再生用酵素を用いて、酸化型に変換できる還元型人工電子受容体としては特に限定されないが、好ましくは、フェロシアン化カリウム（フェリシアン化カリウムの還元体）、ヒドロキノン（ベンゾキノンの還元体）、還元型ＤＣＰＩＰがある。また、人工電子受容体再生用酵素としては、ラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼがある。これらの酵素の起源となる生物は特に限定されず、微生物であってもよいし、高等生物であってもよいが、細菌、カビ、酵母などの微生物が好適である。また、市販されている酵素を使用することもできる。好ましくは、ラッカーゼＭ１２０（天野エンザイム株式会社製）やｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）、ＢＯ ａｍａｎｏ ＩＩＩ（天野エンザイム株式会社製）である。

なお、Ｒ体基質特異性酸化酵素の遺伝子と、この酵素が依存する補酵素を還元型から酸化型に再生する能力を有する酵素（例えばＮＡＤＨオキシダーゼ）の遺伝子を同一宿主細胞内に導入した組換え微生物の培養物またはその処理物等を用いて、上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調製する必要がないため、より低コストで（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）を製造することができる。

上記反応により、３−ヒドロキシピペリジン化合物のエナンチオマー混合物（ＩＩ）のうち、Ｒ体エナンチオマー（（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物）の水酸基が基質特異的に酸化され、３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）と（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）が得られる。得られる（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）は、その光学純度が目的とする用途において要求される水準を満足する（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物を意味し、必ずしも光学純度が９９．９％ｅ．ｅ．以上である必要はない。例えば、医薬中間体では、目的とするエナンチオマーの光学純度が９０％ｅ．ｅ．以上、好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９８％ｅ．ｅ．以上が目安であるが、以降の工程における光学純度向上の可否などの要因によって、要求される水準が変動することは言うまでもない。

本発明における「Ｒ体のエナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する」とは、例えば、下記評価方法Ａで得られた（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）の光学純度が５０％ｅ．ｅ．以上であればよく、好ましくは９０％ｅ．ｅ．以上、より好ましくは９５％ｅ．ｅ．以上である。最も好ましくは９６、９７、９８、９９％ｅ．ｅ．以上である。また、下記評価方法Ｂの場合では、測定したＲ体に対する酸化活性とＳ体に対する酸化活性の比率は通常１００／５０以上、好ましくは１００／１０以上、さらに好ましくは１００／１以上である。

［（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物の水酸基を基質特異的に酸化する能力の評価方法Ａ］
０．２％ラセミ体１−ブトキシカルボニル−３―ヒドロキシピペリジン（以下、「ブトキシカルボニル」は「Ｂｏｃ」と略記する）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）に、酸化酵素源を加え、必要に応じて、適当な濃度のＮＡＤ⁺、ＮＡＤＨオキシダーゼ、人工電子受容体を加え、２０〜３０℃で反応させる。反応後、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出操作を行う。抽出液の溶媒を留去後、３，５−ジニトロ塩化ベンゾイルで残存した１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンを誘導体化し、例えば下記条件の高速液体クロマトグラフィーで分析することにより、残存した１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度を確認する。

［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，株式会社ダイセル製）
カラム温度：３０℃
検出波長：２４５ｎｍ
移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７／３
保持時間：（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの誘導体−１２．３分
（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの誘導体−１４．９分
なお、（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度は、下記式より求めることができる。

Ｓ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（Ｓ体のピーク面積）−（Ｒ体のピーク面積）｝÷｛（Ｓ体のピーク面積）＋（Ｒ体のピーク面積）｝×１００

［（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物の水酸基を基質特異的に酸化する能力の評価方法Ｂ］
（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンまたは（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン１０ｍｇ、ＮＡＤ⁺５ｍｇを含む０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）に酸化酵素源を加えて２０〜３０℃で反応させる。反応後、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出し、有機層を希釈して下記ガスクロマトグラフィーで分析することにより１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率を算出できる。

［ガスクロマトグラフィーの分析条件］
カラム：Ｒｔｘ−５ ａｍｉｎｅ キャピラリーカラム（３０ｍ，内径０．２５ｍｍ，Ｒｅｓｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２５０℃
カラム温度：１２５℃
検出器温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム 圧力１４０ＫＰａ
検出時間：１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン − ２６．７分
１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン − ２７．６分
なお、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は下記式より求めることができる。

変換率（％）＝（１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンのピーク面積）÷｛（１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンのピーク面積）＋（１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン）｝×１００

（２） ３−ピペリドン化合物の立体選択的還元工程
本工程では、上記工程（１）で生成した３−ヒドロキシピペリジン化合物にＳ体立体選択性を有する還元酵素源を作用させることにより、下記のとおり立体選択的に還元して、さらに（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物を得る。

［式中、Ｒは上記と同義を示す］

上記工程（１）の基質特異的酸化反応と本工程（２）の立体選択的還元反応は、別々に二段階で実施してもよい。しかし、Ｒ体基質特異性酸化酵素源とＳ体立体選択的還元酵素源の共存下で酸化反応と還元反応を同時に実施すれば、さらに効率的に（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）を製造することができる。

使用するＳ体立体選択的還元酵素源としては、３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の３位のカルボニル基を立体選択的に還元し、（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）を生成する能力を有するものであればいずれを用いてもよい。好ましくは国際生化学・分子生物学連合の酵素分類法によりＥＣ １．１．１に分類されるＮＡＤ⁺もしくはＮＡＤＰ⁺特異的な酵素である。さらに好ましくは、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、オガタエア（Ogataea）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属由来のものである。

本発明において、前記基質特異的酸化反応と立体選択的還元反応を同時に実施する場合（以下、「デラセミ化反応」という）、Ｒ体基質特異性酸化酵素源とＳ体立体選択的還元酵素源の補酵素依存性は異なる方がよい。即ち、Ｒ体基質特異性酸化酵素源がＮＡＤ⁺特異的である場合には、酸化型補酵素再生系の酵素はＮＡＤＨ特異的であり、還元型補酵素再生系の酵素はＮＡＤＰ⁺特異的であることが好ましく、同様に、Ｒ体基質特異性酸化酵素源がＮＡＤＰ⁺特異的である場合には、酸化型補酵素再生系の酵素はＮＡＤＰＨ特異的であり、還元型補酵素再生系の酵素はＮＡＤ⁺特異的であることが好ましい。特に好ましくは、酸化酵素源がＮＡＤ⁺特異的であり、還元酵素源がＮＡＤＰＨ特異的である。

還元型補酵素を再生する能力を有する酵素としては、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グルコース６−リン酸脱水素酵素が挙げられ、好ましくはグルコース脱水素酵素、より好ましくはＮＡＤＰ⁺特異的グルコース脱水素酵素が挙げられる。

上記グルコース脱水素酵素の起源となる生物としては特に限定されず、微生物であっても良いし、高等生物であってもよいが、細菌、カビ、酵母などの微生物が好適であり、好ましくは細菌が挙げられる。例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、好ましくはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が挙げられる。

上記ＮＡＤＰ⁺特異的グルコース脱水素酵素の起源となる生物としては特に限定されず、微生物であってもよいし、高等生物であってもよいが、細菌、カビ、酵母などの微生物が好適である。例えば、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（特開２００６−２６２７６７公報）、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４，６７２−６７８，（２００２））、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ８９，１５９−１６３，（１９８２））、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ぺディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属（国際特許公報ＷＯ２００９／０４１４１５）由来のグルコース脱水素酵素やクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属由来のグルコース−６−リン酸脱水素酵素が知られている（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２２８，１１３−１１９（１９８４））。

さらに好ましくは、乳酸菌由来の酵素であり、最も好ましくは国際特許公報ＷＯ２００９／４１４１５に記載のラクトバシラス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバシラス・ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ぺディオコッカス・パーブラス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ）由来のグルコース脱水素酵素である。

Ｓ体立体選択性還元酵素の遺伝子と、この酵素が依存する補酵素を酸化型から還元型に再生する能力を有する酵素（例えばグルコース脱水素酵素）の遺伝子を同一宿主細胞内に導入した組換え微生物の培養物またはその処理物等を用いて上記と同様の反応を行えば、別途に補酵素の再生に必要な酵素源を調製する必要がないため、より低コストで光学活性含窒素環状アルコールを製造することができる。

また、上記工程（１）の酸化反応系（Ｒ体エナンチオマーの酸化反応と酸化型補酵素再生系）、本工程（２）の還元反応系（３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の還元反応と還元型補酵素再生系）に関与する酵素をそれぞれ同一宿主細胞内で発現させれば、酸化反応系および／または還元反応系はそれぞれ宿主細胞膜で分離されることになり、その結果、酸化型補酵素再生系と還元型補酵素再生系の共役による不具合が起こらない、または起こりにくくなり、その結果、補酵素再生系に関与する酵素の補酵素に対する特異性が低い場合も、反応が良好に進行する場合がある。

さらに、上記工程（１）の酸化反応系（Ｒ体エナンチオマーの酸化反応と酸化型補酵素再生系）、本工程（２）の還元反応系（３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の還元反応と還元型補酵素再生系）に使用するすべての酵素遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換体の培養物またはその処理物等を用いて反応を行うことは、製造プロセスの効率化において好ましい。

酵素源として用いる微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなど、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用することができる。培養は好気的に行い、通常、培養時間は１〜５日間程度、培地のｐＨが３〜９、培養温度は１０〜５０℃で行うことができる。

Ｓ体立体選択性還元酵素源や３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の濃度などは適宜選択できるが、通常、３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の濃度は０．１質量％以上、１００質量％程度、好ましくは１１質量％以上、６０質量％以下であり、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）に対して０．０００１モル％以上、１００モル％以下程度、好ましくは０．０００１モル％以上、０．１モル％以下である。反応温度は１０℃以上、６０℃以下、好ましくは２０℃以上、５０℃以下であり、反応ｐＨは４以上、９以下程度、好ましくは５以上、８以下であり、反応時間は１時間以上、１２０時間以下程度、好ましくは１時間以上、７２時間以下で行うことができる。

その他、本工程（２）の詳細な実施条件は、酵素源を変更すること以外、上記工程（１）と同様にすることができる。

本工程（２）で生じた光学活性（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）は、常法により単離精製することができる。例えば、微生物等を用いた場合には必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下に除去し、そして再結晶化、またはクロマトグラフィー等の処理を行う事により、単離精製することができる。なお、得られた（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）の光学純度は、上記の［（Ｒ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物の水酸基を基質特異的に酸化する能力の評価方法Ａ］と同様の方法で測定することができる。

以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））。

参考例１：１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンおよび１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンの安定性評価
０．１Ｍ ２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍＬに、１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンまたは１−Ｂｏｃ−３−ピペリジンを各１０ｍｇを加え、攪拌しながら３０℃または５０℃で２５時間加熱した。２５時間後、酢酸エチルで抽出し、有機層を希釈して下記条件のガスクロマトグラフィーで分析し、各化合物の残存率を算出した。結果を表１に示す。１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンに比べて１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンは緩衝液中での安定性が高かった。即ち、不安定な１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンに比べると１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンは水溶液中で実施する酵素反応の基質に適している。

［ガスクロマトグラフィーの分析条件］
カラム：Ｒｔｘ−５ ａｍｉｎｅ キャピラリーカラム（３０ｍ，内径０．２５ｍｍ，Ｒｅｓｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２５０℃
カラム温度：１２５℃
検出器温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム，流量１４０ＫＰａ
検出時間：１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン − ２６．７分
１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン − ２７．６分

実施例１：デボシア・リボフラビナ由来酵素ＲＤＲを用いた１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの酸化反応
トリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ＝７）５ｍＬを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌した。これらの液体培地に、デボシア・リボフラビナ由来酵素ＲＤＲを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）（国際特許公報ＷＯ２００４/０２７０５５の実施例４参照）、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のＮＡＤＨオキシダーゼ変異体を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）（国際特許公報ＷＯ２０１１／０９００５４の実施例３参照）を無菌的にそれぞれ一白金耳接種して、３７℃で２４時間振とう培養した。

培養後、遠心分離により菌体を濃縮し、超音波ホモジナイザーによる菌体破砕を実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）の菌体破砕液０．１ｍＬ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）の濃縮菌体破砕液０．１ｍＬ、（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンまたは（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン１０ｍｇ、ＮＡＤ⁺ ５ｍｇ、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）０．８ｍＬを加えて、３０℃で２１時間反応させた。また、対照実験として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）を添加せずＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）のみでも同様に反応させた。

反応終了後、２倍量の酢酸エチルで抽出し、有機層を希釈して下記条件のガスクロマトグラフィーで分析した。１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率を算出した。

Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）を添加した反応では（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は４５．１％であった。一方、（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は０％であった。また、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）を添加しないＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）のみの反応では（Ｒ）体、（Ｓ）体いずれの１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンを基質とした場合も１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンの生成は確認できなかった。デボシア・リボフラビナ由来酵素ＲＤＲは（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンを選択的に酸化した。

［ガスクロマトグラフィーの分析条件］
カラム：Ｒｔｘ−５ ａｍｉｎｅ キャピラリーカラム（３０ｍ，内径０．２５ｍｍ，Ｒｅｓｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
検出器：水素炎イオン化検出器
注入部温度：２５０℃
カラム温度：１２５℃
検出器温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム，圧力１４０ＫＰａ
検出時間：１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン − ２６．７分
１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン − ２７．６分
なお、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は下記式より求めることができる。

変換率（％）＝（１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンのピーク面積）÷｛（１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンのピーク面積）＋（１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン）｝×１００

実施例２：ブレブンディモナス・ディミヌタ酵素ＲＢＤを用いた１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの酸化反応
実施例１のＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）の代わりにブレブンディモナス・ディミヌタ由来酵素ＲＢＤを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＢＤ）（国際特許公報ＷＯ２００７/１１４２１７の実施例８参照）を用いて、実施例１と同様に反応および分析を行った。その結果、（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は８５．８％であった。一方、（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は１．３％であった。（Ｒ）体からカルボニル化合物への反応変換率と（Ｓ）体からカルボニル化合物への反応変換率の比率は６７／１であった。ブレブンディモナス・ディミヌタ由来酵素ＲＢＤは（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンを選択的に酸化した。

参考例２：レイフソニア・スピーシーズ由来酵素ＲＬＳを生産する形質転換体の作製
国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のプロテインデーターベースに登録されているレイフソニア・スピーシーズ（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｐ．）１０９株由来の３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅと推定されるポリペプチド（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＷＰ＿０１８１９１６８６．１、以下、「ＲＬＳ」）をコードするＤＮＡの５‘末端にＮｄｅＩサイト、３’末端にＫｐｎＩサイトを付加した人工合成遺伝子（配列番号１，Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ Ｓ．Ａ．製）をプラスミドｐＵＣＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）のＮｄｅＩ−ＫｐｎＩの間に導入した。このプラスミドｐＮＴＬＳでＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、導入したＤＮＡがコードするＲＬＳを生産する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＬＳ）を作製した。

実施例３：レイフソニア・スピーシーズ由来酵素ＲＬＳを用いた１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの酸化反応
実施例１のＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）の代わりに参考例２で作製したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＬＳ）を用いて、実施例１と同様に反応および分析を行った。その結果、（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は１３．４％であった。一方、（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率は０％であった。レイフソニア・スピーシーズ由来酵素ＲＬＳは（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンを選択的に酸化した。

実施例４：ブレブンディモナス・ディミヌタ由来酵素ＲＢＤを用いたデラセミ化反応による（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
実施例１と同様の方法で、ブレブンディモナス・ディミヌタ由来酵素ＲＢＤを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＢＤ）（国際特許公報ＷＯ２００７/１１４２１７の実施例８参照）、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のＮＡＤＨオキシダーゼ変異体を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）（国際特許公報ＷＯ２０１１／０９００５４の実施例３参照）、ロドトルーラ・グルチニス由来の還元酵素ＲＲＧを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）（国際特許公報ＷＯ２００３/０９３４７７の実施例７参照）、ラクトバシラス・ペントサス由来のグルコース脱水素酵素ＧＬＰ２を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）（国際特許公報ＷＯ２００９／０４１４１５の実施例５参照）の４種類の組換え大腸菌の濃縮菌体破砕液を調製した。４種類の組換え大腸菌の濃縮菌体破砕液 各０．１ｍＬずつに、ラセミ体１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン１００μｇ、ＮＡＤ⁺ ５ｍｇ、ＮＡＤＰ⁺ ０．５ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）０．６ｍＬを加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応終了後、実施例１と同様にして１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンへの変換率を算出した。また、抽出液の溶媒を留去後、３，５−ジニトロ塩化ベンゾイルで、残存した１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンを誘導体化し、下記条件の高速液体クロマトグラフィーで分析することにより、残存した１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度を算出した。

その結果、得られた（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度は９５．４％ｅ．ｅ．であった。また、１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンの生成は認められず、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの収率は９７％であった。前記４種類の酵素を生産する組換え大腸菌を用いたデラセミ化反応により（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンが製造できた。

［高速液体クロマトグラフィーによる分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈ（２５０ｍｍ，内径４．６μｍ，株式会社ダイセル製）
カラム温度：３０℃
検出波長：２４５ｎｍ
移動相：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７／３
保持時間：（Ｒ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの誘導体−１２．３分
（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの誘導体−１４．９分
なお、（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度は下記式より求めることができる。

（Ｓ）体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝｛（（Ｓ）体のピーク面積）−（（Ｒ）体のピーク面積）｝÷｛（（Ｓ）体のピーク面積）＋（（Ｒ）体のピーク面積）｝×１００

参考例３：サッカロマイセス・セレビジエ由来酵素ＹＰＲ１を生産する形質転換体の作製
国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のプロテインデーターベースに登録されているサッカロマイセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）株由来のＡｌｄｏ/ｋｅｔｏ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＮＰ＿０１０６５６．１，ＹＰＲ１）を生産する形質転換体を作製した。サッカロマイセス・セレビジエ Ｓ２８８Ｃ（ＡＴＣＣ２６１０８）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー１：５’−GGAGTCCATATGCCTGCTACGTTAAAGAAT−３’（配列表の配列番号３）と、プライマー２：５’−TATATACTGCAGTCATCATTGGAAAATTGG−３’（配列表の配列番号４）を用いて、サッカロマイセス・セレビジエ由来のＹＰＲ１をコードするＤＮＡの開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＰｓｔＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを増幅し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）のＮｄｅＩ−ＰｓｔＩ間に導入した。このプラスミドｐＮＴＹＰＲ１でＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、ＹＰＲ１を生産する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＹＰＲ１）を作製した。

実施例５：ブレブンディモナス・ディミヌタ由来酵素ＲＢＤを用いたデラセミ化反応による（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
実施例４のロドトルーラ・グルチニス由来の還元酵素ＲＲＧを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）の代わりに参考例３のＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＹＰＲ１）を用いて、実施例４と同様にデラセミ化反応を実施した。

その結果、得られた（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度は９５．５％ｅ．ｅ．であった。１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンの生成は認められず、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの収率は９３％であった。

実施例６：デボシア・リボフラビナ由来酵素ＲＤＲを用いたデラセミ化反応による（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
実施例１と同様の方法で、デボシア・リボフラビナ由来酵素ＲＤＲを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＤＲ）（国際特許公報ＷＯ２００４/０２７０５５の実施例４参照）、ストレプトコッカス・ミュータンス由来のＮＡＤＨオキシダーゼ変異体を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）（国際特許公報ＷＯ２０１１／０９００５４の実施例３参照）、ロドトルーラ・グルチニス由来の還元酵素ＲＲＧを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）（国際特許公報ＷＯ２００３/０９３４７７の実施例７参照）、ラクトバシラス・ペントサス由来のグルコース脱水素酵素ＧＬＰ２を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）（国際特許公報ＷＯ２００９／０４１４１５の実施例５参照）の４種類の組換え大腸菌の濃縮菌体破砕液を調製した。４種類の組換え大腸菌の濃縮菌体破砕液 各０．１ｍＬずつに、ラセミ体１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジン１００μｇ、ＮＡＤ⁺ ５ｍｇ、ＮＡＤＰ⁺ ０．５ｍｇ、グルコース１０ｍｇ、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）０．６ｍＬを加えて、２０℃で９６時間反応させた。反応終了後、実施例４と同様にして１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン及び１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンを分析した。

その結果、得られた（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度は７５．０％ｅ．ｅ．であった。１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンの生成は認められず、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの収率は１００％であった。前記４種類の酵素を生産する組換え大腸菌を用いたデラセミ化反応により（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンが製造できた。

実施例７：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳの精製
以下の方法に従って、発明者らが自然界より単離した土壌単離菌デボシア・スピーシーズＫＮＫ７−４６７株より、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンのエナンチオマー混合物のうち（Ｒ）体を選択的に酸化するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。また、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンに対する酸化活性は、後述の「１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンに対する酸化活性の評価方法」に記載の方法で実施した。

［１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンに対する酸化活性の評価方法］
２５ｍＭ ラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン、０．５ｍＭ ＰＭＳ、５μＭ ＰＱＱ・２Ｎａ、５ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．１Ｍ ２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）に酸化酵素源を加え、３０℃で１時間反応した。反応終了後、実施例１と同様にして分析し、下記式よりポリペプチドの酸化活性を数値化した。酸化活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンを生成する酵素量とした。

１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンに対する還元活性（Ｕ）＝（１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンのエリア面積）÷［（１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンのエリア面積）＋（１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンのエリア面積）］×（反応に用いた１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン量（μｍｏｌ））÷反応時間（分）。

［微生物の培養］
５Ｌ容ミニジャーファーメンターに、肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（株式会社ＡＤＥＫＡ製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）３０００ｍＬを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたデボシア・スピーシーズＫＮＫ７−４６７株の培養液を３０ｍＬ接種し、３０℃、０．３ｖｖｍ、４５０ｒｐｍで攪拌しながら５４時間培養を行った。

［無細胞抽出液の調製］
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、同緩衝液に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０（日本エマソン株式会社製）を用いて超音波破砕した後、遠心分離（４０００×ｇ，５分）にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。

［硫安分画］
上記で得た無細胞抽出液に、終濃度２０％になるように硫酸アンモニウムを添加し１時間攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。この上清に終濃度４０％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１時間攪拌後、遠心分離により沈殿を取得した。さらに、終濃度６０％になるように硫酸アンモニウムを添加し１時間攪拌後、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）に溶解した。

［Ｐｈｅｎｙｌ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍカラムクロマトグラフィー］
硫安分画の活性画分を、１Ｍ 硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）で希釈し、予め同緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍカラムクロマトグラフィー（東ソー株式会社製）カラム（１１０ｍＬ）に供し、同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。

［ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー］
疎水クロマトグラフィーの活性画分を、１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（１５０ｍＬ）に供し、同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．５Ｍまで）により活性画分を溶出させ、電気泳動的に単一なポリペプチドの精製標品を得た。本酵素は１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンのエナンチオマー混合物のうち（Ｒ）体を選択的に酸化する活性を有していた。

実施例８：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳの基質特異性評価
５０ｍＭ 基質（表１参照）、１ｍＭ ＰＭＳ、５μＭ ＰＱＱ・２Ｎａ、５ｍＭ 塩化カルシウム、０．１ｍＭ ＤＣＰＩＰを含む０．１Ｍ ２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）に実施例７で得た精製酵素を加え、３０℃で１０分間反応した。その間、６００ｎｍの吸光度の変化から還元されたＤＣＰＩＰ量を定量し、酵素活性を算出した。酸化活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＤＣＰＩＰを還元する酵素量とした。各基質に対する酸化活性を表２に示す。なお、活性は１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンに対する活性を１００％としたときの相対活性（％）で示した。ＡＤＨ−ＤＳは１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンだけでなく、３−ヒドロキシピペリジンや１−ベンジル−３−ヒドロキシピペリジンに対する酸化活性もあった。

実施例９：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳをコードするＤＮＡの取得
［精製酵素の内部アミノ酸配列の決定］
実施例７で得られた精製デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）または、スタフィロコッカス由来のＶ８プロテアーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＰＰＳＱ−３３Ａ型プロテインシーケンサー（株式会社島津製作所製）により決定した。その結果、以下、３つのペプチド断片のアミノ酸配列が決定できた。これらの３つのペプチドはシュードグルコノバクター由来のＰＱＱ依存型アルコール脱水素酵素ＡＤＨ−ＰＳ（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２，５２４−５３１．（２００１））のアミノ酸配列と高い配列同一性を示した。以下、本精製酵素をＡＤＨ−ＤＳと呼ぶ。

ペプチド断片１：ENFQPVTADDLAGKNPAN（１００％）（配列表の配列番号５）
ペプチド断片２：NPANWPILRGNYQGWGYSP（１００％）（配列表の配列番号６）
ペプチド断片３：WTTRLPGSVSGYTTSYSI（８８％）（配列表の配列番号７）
なお、上記括弧内はＡＤＨ−ＰＳのアミノ酸配列との配列同一性を示している。

［ＡＤＨ−ＤＳをコードするＤＮＡの増幅］
公知酵素ＡＤＨ−ＰＳをコードするＤＮＡ及びその周辺領域の配列を元に、下記５種類のＰＣＲプライマーを設計した。フォワードプライマーとして、プライマー３（ＡＤＨ−ＰＳ遺伝子の開始コドンの約２００ｂｐ上流付近１）：５’−GAATTCCGGCACTTTTCGATGTCCAGCCTG−３’（配列表の配列番号８）、プライマー４（ＡＤＨ−ＰＳ遺伝子の開始コドンの約１００ｂｐ上流付近２）：５’−CTGCGGACGTGGCTGGAATTACCAATGTTC−３’（配列表の配列番号９）、プライマー５（ＡＤＨ−ＰＳ遺伝子の開始コドン付近）：５’−GGAGTCCATATGAGATTTGAGTATTTGCGG−３’（配列表の配列番号１０）、リバースプライマーとして、プライマー６（ＡＤＨ−ＰＳ遺伝子の終止コドンの約７０ｂｐ下流付近）：５’−GAGCGCCGCAAGGGCTTTGATGTTCATGGG−３’（配列表の配列番号１１）、プライマー７（ＡＤＨ−ＰＳ遺伝子の終止コドン付近）：５’−TATATAGAATTCTTACTTCTTCTCGGGAAG−３’（配列表の配列番号１２）を作製した。各フォワードプライマー、リバースプライマーのいずれの組み合わせでも、デボシア・スピーシーズＫＮＫ７−４６７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ断片の増幅が確認できた。このＤＮＡ断片を、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社製）を用いてダイレクトシーケンスを行い、その塩基配列を解析した。その結果判明したＡＤＨ−ＤＳおよびその周辺領域の塩基配列を配列表の配列番号１３に示す。また、判明した塩基配列から予測されるＡＤＨ−ＤＳのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。アミノ酸配列を決定した精製酵素のペプチド断片（配列表の配列番号５〜７）はすべて配列番号２に含まれることから、本ポリペプチドが精製酵素と同一であると判断した。

実施例１０：組換えベクターｐＮＴＡＤＨ−ＤＳの構築
デボシア・スピーシーズＫＮＫ７−４６７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、プライマー５：５’−GGAGTCCATATGAGATTTGAGTATTTGCGG−３’（配列表の配列番号１０）と、プライマー８：５’−TATATAGAATTCTTACTTCGTCTCGGGAAG−３’（配列表の配列番号１４）を用いて、デボシア・スピーシーズ由来の酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳをコードするＤＮＡの開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを増幅し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）に導入した。

実施例１１：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産する組換え大腸菌の作製
実施例１０で作製したプラスミドｐＮＴＡＤＨ−ＤＳでＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、ＡＤＨ−ＤＳを生産する形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）を作製した。

実施例１２：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産する組換え大腸菌の１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの酸化活性の測定
実施例１と同様の方法でデボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）および対照としてＡＤＨ−ＤＳを生産しないＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３に記載のｐＵＣＮＴでＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換した形質転換体）を培養した。培養後、遠心分離により菌体を濃縮し、超音波ホモジナイザーにより菌体を破砕し、これを菌体破砕液とした。実施例７と同様にして１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンに対する酸化活性を測定した。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）の培養液は３１４０Ｕ／ｍＬの酸化活性を示した。一方、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）の培養液には酸化活性を確認できなかった。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）がＡＤＨ−ＤＳを生産していることを確認できた。

実施例１３：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの製造
実施例１２と同様の方法でデボシア・スピーシーズ由来酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）の菌体破砕液を調製した。５０ｍＭ ラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン、１ｍＭ ＰＭＳ、５μＭ ＰＱＱ・２Ｎａ、５ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．１Ｍ ２−モルホリノエタンスルホン酸・一水和物（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）に上記菌体破砕液を加え、３０℃で１時間反応した。反応終了後、実施例４と同様にして分析し、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンへの変換率および残存する１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度を算出した。その結果、１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンへの変換率は４９．４％、残存する１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンは（Ｓ）体であり、その光学純度は９７．６％ｅ．ｅ．であった。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）を用いて、（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンを製造できた。

実施例１４：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産する組換え大腸菌の人工電子受容体に対する特異性の評価
実施例１２と同様の方法でデボシア・スピーシーズ由来酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）の菌体破砕液を調製した。表２に示す人工電子受容体（各５ｍＭ）、５０ｍＭ ラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン、５μＭ ＰＱＱ・２Ｎａ、５ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に上記菌体破砕液を加え、３０℃で１時間反応した。反応終了後、実施例１と同様にして分析し、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンへの変換率を算出した。結果を表３に示す。ＡＤＨ−ＤＳは各種人工電子受容体存在下で反応が進行した。

実施例１５：フェリシアン化カリウムとデボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを用いた酸化反応における人工電子受容体再生用酵素の反応促進効果の評価
実施例１２と同様の方法でデボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）の菌体破砕液を調製した。表４に示す各０．１％の市販の人工電子受容体再生用酵素（対照として酸化酵素未添加の反応も実施した）、５０ｍＭ ラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン、２５ｍＭ フェリシアン化カリウム、５μＭ ＰＱＱ・２Ｎａ、５ｍＭ 塩化カルシウムを含む０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に上記菌体破砕液を加え、３０℃で１時間反応した。反応終了後、実施例４と同様にして分析し、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンへの変換率を算出した。結果を表４に示す。人工電子受容体再生用酵素の添加により、酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳによる１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの酸化反応が促進された。

実施例１６：１，４−ベンゾキノンとデボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを用いた酸化反応における人工電子受容体再生用酵素の反応促進効果の評価
実施例１５の２５ｍＭフェリシアン化カリウムの代わりに５ｍＭ １，４−ベンゾキノンを用いて同様の反応を実施した。結果を表５に示す。市販の人工電子受容体再生用酵素の添加により、酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳによる１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの酸化反応が促進された。

実施例１７：ＤＣＰＩＰとデボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを用いた酸化反応における人工電子受容体再生用酵素の反応促進効果の評価
実施例１５の２５ｍＭフェリシアン化カリウムの代わりに２５ｍＭ ＤＣＰＩＰを用いて同様の反応を実施した。結果を表６に示す。市販の人工電子受容体再生用酵素の添加により、酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳによる１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの酸化反応が促進された。

実施例１８：フェリシアン化カリウムとデボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを用いた酸化反応による（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
実施例１２と同様の方法でデボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）の菌体破砕液を調製した。ＭＥＳ緩衝液（終濃度０．１Ｍ，ｐＨ６．５）で希釈した菌体破砕液２０ｍＬにフェリシアン化カリウム １．６４ｇ、ラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン ２．００ｇ、ラッカーゼＭ１２０ ０．１０ｇ、５ｍＭ ＰＱＱ・２Ｎａ溶液 ０．０２ｇ、塩化カルシウム １１ｍｇ、トルエン２ｍＬを添加し、３０℃で攪拌した。反応中は３０％ ＮａＯＨ水溶液にてｐＨ６．５を維持した。反応２時間でフェリシアン化カリウム １．６４ｇを追加した。反応２８時間後、実施例４と同様にして分析し、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンへの変換率および残存する１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度を算出した。さらに、反応液からトルエン抽出により、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンおよび１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンを抽出し、溶媒を留去した。濃縮物中の１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンおよび１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンの含量を実施例１の分析条件と同様の方法で定量し、回収率を算出した。その結果、反応終了時の変換率５１％、残存する（Ｓ）１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度９８．９％ｅ．ｅ．、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンおよび１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンの回収率の合計値は８６％であった。

実施例１９：デボシア・スピーシーズ由来酸化酵素ＡＤＨ−ＤＳとロドトルーラ・グルチニス由来の還元酵素ＲＲＧを用いた（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
実施例１２と同様の方法でデボシア・スピーシーズ由来酵素ＡＤＨ−ＤＳを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）、ロドトルーラ・グルチニス由来の還元酵素ＲＲＧを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）（国際特許公報ＷＯ２００３/０９３４７７の実施例７参照）およびラクトバシラス・ペントサス由来のグルコース脱水素酵素ＧＬＰ２を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）（国際特許公報ＷＯ２００９／０４１４１５の実施例５参照）の菌体破砕液を調製した。ＭＥＳ緩衝液（終濃度０．１Ｍ，ｐＨ６．５）で希釈したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＡＤＨ−ＤＳ）の菌体破砕液２０ｍＬにフェリシアン化カリウム ０．２０ｇ、ラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン ０．２０ｇ、５ｍＭ ＰＱＱ・２Ｎａ溶液 ０．０２ｇ、塩化カルシウム １１ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。反応中は３０％ ＮａＯＨ水溶液にてｐＨ６．５を維持した。反応２時間でフェリシアン化カリウム ０．２０ｇを追加した。反応４時間目、実施例４と同様にして分析したところ、変換率５４％、（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度は９７．５％ｅ．ｅであった。この反応液にＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＲＧ）およびＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＧＬＰ２）の菌体破砕液各１ｍＬ、グルコース０．１８ｇ、ＮＡＤＰ⁺２ｍｇを加え、３０℃で４時間攪拌した。反応中は３０％ ＮａＯＨ水溶液にてｐＨ６．５を維持した。その結果、反応終了時の１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの収率は９８％、（Ｓ）１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度９５．７％ｅ．ｅ．となった。さらに、反応液からトルエン抽出により、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンおよび１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンを抽出し、溶媒を留去した。得られた濃縮物中の１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンを定量したところ、収率８４％であった。ラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンを酵素的酸化反応、還元反応を経て（Ｓ）体へ変換できた。

実施例２０：酢酸菌を用いた酸化反応による（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、グリセロール１０ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍＬを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。これらの液体培地に表７に示す酢酸菌を無菌的にそれぞれ一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を濃縮し、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７）に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液１ｍＬにラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン２ｍｇを加え、３０℃で２４時間反応した。反応後、実施例４と同様に分析し、変換率と残存する１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度を算出した。結果を表７に示す。いずれの菌株の反応液も（Ｒ）体に比べ（Ｓ）体が多く残存しており、（Ｒ）体選択的な酸化反応が進行していた。

実施例２１：酢酸菌を用いた酸化反応による（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
グルコノバクター・タイランディカスＮＢＲＣ３２５４株を実施例２０と同様にして培養し、菌体懸濁液を調製した。この懸濁液を超音波破砕し、これを菌体破砕液とした。この菌体破砕液１ｍＬにラセミ体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン１０ｍｇを加え、後述の（１）〜（３）の添加物を加え、３０℃で１８時間反応した。反応後、実施例４と同様に分析し、変換率と残存する１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度を算出した。添加物：（１）添加物なし、（２）ＮＡＤ⁺ ０．５ｍｇおよび実施例１と同様に調製したＮＡＤＨオキシダーゼ変異体を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＮＸ−Ｌ０４２Ｍ）の濃縮菌体破砕液０．１ｍＬ、（３）５ｍＭ ＰＱＱ水溶液 １μＬ、塩化カルシウム０．５ｍｇ。その結果、変換率はそれぞれ（１）１５％、（２）１２％、（３）２３％であった。また、（３）の光学純度は（Ｓ）体２８．４％ｅ．ｅ．であった。本結果から、グルコノバクター・タイランディカスＮＢＲＣ３２５４株が有する（Ｒ）体選択的な１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン酸化酵素はＮＡＤ依存型ではなく、ＰＱＱ依存型酵素と考えられた。

実施例２２：微生物を用いた酸化反応による（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍＬを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地に表８のＮｏ.１〜５に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、３０℃で７２時間振とう培養した。また、肉エキス１ｇ、グルコース１０ｇ、酵母エキス１ｇ、ＮＺアミン２ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍＬを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地に表８のＮｏ.４に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、２８℃で７２時間振とう培養した。また、グルコース４０ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸水素二アンモニウム６．５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８ｇ、硫酸亜鉛七水和物６０ｍｇ、硫酸鉄七水和物９０ｍｇ、硫酸銅五水和物５ｍｇ、硫酸マンガン四水和物１０ｍｇ、塩化ナトリウム１００ｍｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）５ｍＬを大型試験管に分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地に表８のＮｏ.６〜７に示す微生物を無菌的に一白金耳接種して、２８℃で７２時間振とう培養した。培養後、遠心分離により菌体を濃縮し、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７）に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液１ｍＬに（Ｒ）体または（Ｓ）体１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジン各２ｍｇを加え、３０℃で２４時間反応した。反応後、実施例４と同様に分析し、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンから１−Ｂｏｃ−３―ピペリジノンへの変換率を算出した。結果を表８に示す。表８に示した微生物はいずれも（Ｓ）体に比べ（Ｒ）体の変換率が高く、（Ｒ）体を選択的に酸化した。

実施例２３：還元酵素を用いた（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンの製造
実施例１と同様の方法で、セルロモナス・スピーシーズ由来酵素ＲＣＧを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＴＳＣＳ）（国際特許公報国際特許公報ＷＯ２００５/１２３９２１の実施例５参照）、オガタエア・ミニュータ由来酵素ＲＯＭ４を生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４）（国際特許公報ＷＯ２００６／０１３８０１の実施例６参照）、パエニバシラス・アルベイ由来酵素ＲＢＡを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＢＡ）（国際特許公報ＷＯ２００７/０９９７６４の実施例４参照）、キャンディダ・マルトーサ由来酵素ＲＭＡを生産するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）（国際特許公報ＷＯ２００８／０６６０１８の実施例８参照）の４種類の組換え大腸菌の濃縮菌体破砕液を調製した。各濃縮菌体破砕液０．１ｍＬ、１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン１０ｍｇ、ＮＡＤ⁺ ０.５ｍｇ、ＮＡＤＰ⁺ ０．５ｍｇ、グルコース２０ｍｇ、グルコース脱水素酵素ＧＬＵＣＤＨ“Ａｍａｎｏ”２（天野エンザイム株式会社製）１ｍｇ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）０．９ｍＬを加えて、３０℃で２４時間反応させた。反応終了後、実施例１と同様にして分析し、１−Ｂｏｃ−３−ピペリジノンから１−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピペリジンへの変換率を算出した。また、実施例４と同様にして、１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンの光学純度を算出した。結果を表９に示す。いずれの酵素も（Ｓ）−１−Ｂｏｃ−３―ヒドロキシピペリジンを生成した。これらの酵素は本発明の本工程（２）の還元反応系（３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の還元反応）に利用できる。

Claims (13)

1. 下記式（Ｉ）で表される光学活性含窒素環状アルコール化合物を製造するための方法であって、
   
   ［式中、Ｒはアミノ基の保護基を示す］
   下記式（ＩＩ）で表されるエナンチオマー混合物に、
   
   ［式中、Ｒは上記と同義を示す］
   Ｒ体のエナンチオマーに対する基質特異性を有する酸化酵素源を作用させて、Ｒ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化することにより下記式（ＩＩＩ）で表される３−ピペリドン化合物にする一方で、
   
   ［式中、Ｒは上記と同義を示す］
   上記光学活性含窒素環状アルコール化合物（Ｉ）をそのまま維持する工程を含むことを特徴とする製造方法。
2. さらに、Ｓ体立体選択性を有する還元酵素源を作用させて上記３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）を立体選択的に還元することにより（Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジン化合物（Ｉ）にする工程を含む請求項１に記載の製造方法。
   
   ［式中、Ｒは上記と同義を示す］
3. 上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源と上記Ｓ体立体選択性還元酵素源の共存下、上記Ｒ体エナンチオマーの基質特異的酸化工程と上記３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の立体選択的還元工程を同時に行う請求項１または２に記載の製造方法。
4. 上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源として、デボシア（Ｄｅｖｏｓｉａ）属細菌、ブレヴンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属細菌、レイフソニア（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ）属細菌、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、オークロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌からなる群より選択される微生物に由来する酵素源を用いる請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
5. 上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源がＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺を補酵素とするものである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
6. 上記Ｒ体エナンチオマーの基質特異的酸化工程において、上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源により還元された還元型の上記補酵素をＮＡＤＨオキシダーゼによりＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺に酸化する請求項５に記載の製造方法。
7. 上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源がＰＱＱを補酵素とするものである請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
8. 上記Ｒ体基質特異性酸化酵素源が、下記（ａ１）〜（ａ３）から選択される酵素源である請求項７に記載の製造方法。
   （ａ１） 配列番号２のアミノ酸配列を有するＲ体基質特異性酸化酵素源；
   （ａ２） 配列番号２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、上記エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有するＲ体基質特異性酸化酵素源；
   （ａ３） 配列番号２のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、上記エナンチオマー混合物（ＩＩ）中のＲ体エナンチオマーの水酸基を基質特異的に酸化する活性を有するＲ体基質特異性酸化酵素源。
9. 人工受容体を共存させる請求項７または８に記載の製造方法。
10. 上記Ｓ体立体選択性還元酵素源として、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属細菌、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属細菌、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属細菌、オガタエア（Ｏｇａｔａｅａ）属細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属細菌からなる群より選択される微生物に由来する酵素源を用いる請求項２〜９のいずれかに記載の製造方法。
11. 上記Ｓ体立体選択性還元酵素源がＮＡＤＰＨを補酵素とするものである請求項２〜１０のいずれかに記載の製造方法。
12. 上記３−ピペリドン化合物（ＩＩＩ）の立体選択的還元工程において、上記Ｓ体立体選択性還元酵素源により酸化された酸化型の上記補酵素をグルコース脱水素酵素によりＮＡＤＰＨに還元する請求項１１に記載の製造方法。
13. Ｒが、（Ｃ_1-6アルコキシ）カルボニル基、（Ｃ_1-6ハロゲン化アルコキシ）カルボニル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）メチルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいＣ_1-6アルカノイル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）カルボニル基、（置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール）_1-3メチル基からなる群より選択される保護基である請求項１〜１２のいずれかに記載の製造方法。