CN112251478B - 一种酮还原酶及s-1-boc-3羟基哌啶的酶催化制备方法 - Google Patents

一种酮还原酶及s-1-boc-3羟基哌啶的酶催化制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种S‑1‑BOC‑3羟基哌啶的酶催化制备方法，所述酶催化制备方法以1‑BOC‑3哌啶酮为底物，在辅酶、辅酶循环体系和酮还原酶存在条件下反应，得到含S‑1‑BOC‑3羟基哌啶的反应液；所述的酮还原酶编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述酮还原酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。与其他S‑1‑BOC‑3羟基哌啶的制备方法相比，本发明提供的酮还原酶催化合成S‑1‑BOC‑3羟基哌啶的路线简单，不仅避免了化学合成法的繁琐步骤，而且还解决了现有酶催化技术中辅酶用量大、单位酶活低、底物1‑BOC‑3哌啶酮耐受浓度低的问题。底物浓度可提高到400g/L，辅酶用量0.1g/L，反应24小时转化率高达99.9％，光学纯度e.e％为99.9％，降低了S‑1‑BOC‑3羟基哌啶的生产成本，经济环保，具有很好的工业应用前景。

Description

一种酮还原酶及S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，特别涉及一种酮还原酶及S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法。
背景技术
S-1-BOC-3羟基哌啶是合成药物依鲁替尼非常重要的中间体，依鲁替尼(ibrutinib)是由Johnson公司和Pharmacyclics公司合作研发的靶向抗癌新药，用于治疗套细胞淋巴瘤，其药效从目前情况看是非常强力的。目前依鲁替尼的市场需求量增长强劲，从刚投放市场的5亿美元销售额增长到现在50亿美元以上的销售额，市场前景非常广阔。
目前合成S-1-BOC-3羟基哌啶主要采用化学拆分法或酶法合成：
公告号为CN105801518B“一种(S)-1-Boc-3-羟基哌啶的合成方法”专利，发明人以R-甘油醛缩丙酮为起始原料，通过witting反应，钯碳还原双键，催化加氢等步骤合成S-1-BOC-3羟基哌啶，该合成方法利用的是化学拆分法，虽然与常规拆分方法相比，改变了起始手性物料，降低了成本，但此方法步骤繁多，所用试剂较多，是一种非常不经济环保的方式。
近年来，国内外公司开发了用酮还原酶立体选择性还原1-BOC-3-哌啶酮至(S)-1-BOC-3-羟基哌啶的技术，公告号为CN105200089B“(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶制备方法及其装置”的专利，利用酮还原酶催化1-BOC-3哌啶酮生成S-1-BOC-3羟基哌啶，以异丙醇作为氢供体，该方法相较于传统的化学合成法更为绿色环保，并且在手性产品合成上具有优势，但是该方案中单次反应1-BOC-3哌啶酮浓度为125g/L，辅酶浓度较高，在面对较高的1-BOC-3哌啶酮及辅酶的原料价格下，难以实现工业化应用。
公告号为CN106520856B“(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的酶催化制备方法”的专利，利用酮还原酶催化技术，催化N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮进行还原反应得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，但反应过程中底物浓度最高可达250g/L，虽然可以工业化应用，但是由于单次反应底物浓度较低造成生产成本增加。
因此，虽然目前对利用酮还原酶催化合成S-1-BOC-3羟基哌啶的研究较多，但大都显示单次反应催化底物1-BOC-3哌啶酮的浓度较低，酶和辅酶用量较高，增加了成本，同时给后处理提纯步骤带来诸多不便，较难实现工业化生产。
发明内容
为了解决上述化学法或酶法合成S-1-BOC-3羟基哌啶中存在的至少一个技术问题，本发明提供一种S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法，所述酶催化制备方法以1-BOC-3哌啶酮为底物，在辅酶、辅酶循环体系和酮还原酶存在条件下反应，得到含S-1-BOC-3羟基哌啶的反应液；
所述的酮还原酶编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述酮还原酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述制备方法还包括提纯步骤，包括：向所述反应液中加入助滤剂，经过滤、浓缩、萃取、结晶、再过滤和干燥，获得S-1-BOC-3羟基哌啶。
进一步地，所述助滤剂为硅藻土。
进一步地，所述酮还原酶以菌体、菌体破壁后的液体酶、酶粉、固定化细胞或固定化酶粉中的一种或几种形式参与反应。
进一步地，所述的辅酶为NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，辅酶的用量为底物1-BOC-3哌啶酮用量的0.25～1wt‰。
进一步地，辅酶循环体系包括IPA辅酶循环体系、GDH和葡萄糖辅酶循环体系或FDH和甲酸盐辅酶循环体系。
进一步地，所述反应中还需要加入缓冲液，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐、Tris缓冲液或三乙醇胺缓冲液中的一种，反应pH范围为5.0～9.0，反应温度为20～60℃。
进一步地，1-BOC-3哌啶酮底物的浓度为400g/L；酮还原酶以菌体形式加入，菌体浓度为15g/L；辅酶为NAD，NAD的浓度为0.1g/L；辅酶循环体系为IPA辅酶循环体系，IPA体积为总反应体积的20％，反应pH为7.0，反应温度为40℃，反应时间为24小时。
本发明还涉及一种酮还原酶，所述酮还原酶编码基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO：1所示，所述酮还原酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述酮还原酶的制备方法包括以下步骤：将核苷酸序列如序列表SEQID NO：1的所述大肠杆菌菌株接种至含有氯霉素的培养基中进行活化培养，得到培养液；向所述培养液中添加诱导剂诱导酮还原酶表达，得到酮还原酶；
优选的，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
本发明具有如下所述的有益效果：
本发明提供的酮还原酶及S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法，只需一步即可合成得到目标产物，所用试剂少，无需化学法合成S-1-BOC-3羟基哌啶所用的手性拆分、催化加氢等繁琐步骤。同时，与目前研究较多的酶催化合成方法相比，本发明的酮还原酶对底物1-BOC-3哌啶酮耐受性好，单次反应1-BOC-3哌啶酮承载量高，辅酶用量少，最终获得的S-1-BOC-3羟基哌啶产品的手性纯度高，降低了成本，能够实现工业化生产。
附图说明
图1是本发明S-1-BOC-3羟基哌啶的合成路线示意图；
图2是本发明实施例2的底物转化率检测方法的GC图谱；
图3是本发明实施例3的产物光学纯度检测方法的HPLC图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1酮还原酶菌体及酶粉的制备
将核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1的所述大肠杆菌菌株接种于含有氯霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养20h。挑取单菌落接种于含有氯霉素抗性的50mL LB液体培养基，振荡培养20h，培养结束后移取菌液于250mL TB液体培养基，培养2.5后取菌液稀释检测OD值为0.7，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达，30℃振荡培养18h，8000rpm离心收集菌体。
制备的菌体用0.1mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.0)进行回溶菌体，均质破碎，离心收集酶液上清进行冷冻干燥，得到酮还原酶(酶粉)，其中，所述PBS缓冲液的加入量按照重量比是菌体∶PBS缓冲液＝1∶5的比例进行添加。
实施例2 1-Boc-3-哌啶酮转化率检测方法
GC分析方法：色谱柱DB-WAX 30m*0.25μm*0.25mm，检测器：FID，进样温度：230℃，检测器温度：300℃，流速为1.0mL/min，分流比：20∶1，进样体积：1uL，分析时间44min，1-BOC-3哌啶酮的保留时间为25.434min，S-1-BOC-3羟基哌啶的保留时间为22.572min。
实施例3 S-1-BOC-3-羟基哌啶光学纯度检测方法
HPLC分析方法：分析柱CHIRALPAKIG，流动相分别为0.1％甲酸水溶液和甲醇，流速为0.2mL/min，柱温25℃，检测波长为210nm，分析时间4min，S-1-BOC-3羟基哌啶的保留时间为26.619min，R-1-BOC-3羟基哌啶的保留时间为28.410min。
实施例4酮还原酶催化合成S-1-BOC-3羟基哌啶
称取3g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于160mL的0.1M，pH为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-Boc-3哌啶酮80g，40mL异丙醇、0.02g的NAD，在40℃下，搅拌反应24小时，取样用二氯甲烷淬灭反应，根据实施例2和3检测转化率和手性，1-Boc-3哌啶酮的转化率为99.9％，光学纯度e.e％为99.9％。
向上述反应24小时的反应液中加入硅藻土，搅拌1小时后减压过滤，收集到的液体旋蒸浓缩除去丙酮异丙醇等低沸点化合物，剩余液体经二氯甲烷萃取，低温结晶，过滤，干燥后获得68g固体，收率为85％，GC检测纯度大于99.5％，ee＞99.9％。
实施例5 GDH循环体系合成S-1-BOC-3羟基哌啶称取3g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于200mL的0.1M，pH为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-Boc-3哌啶酮20g，1g葡萄糖脱氢酶(GDH)，27g葡萄糖，0.02g的NAD，在40℃下，搅拌反应24小时，取样用二氯甲烷淬灭反应，根据实施例2和3检测转化率和手性，1-Boc-3-哌啶酮的转化率为99.9％，光学纯度e.e％为99.9％。
实施例6 FDH循环体系合成S-1-BOC-3羟基哌啶称取3g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于200mL的0.1M，pH为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-Boc-3哌啶酮20g，1g甲酸脱氢酶(FDH)，10g甲酸铵，0.02g的NAD，在40℃下，搅拌反应24小时，取样用二氯甲烷淬灭反应，根据实施例2和3检测转化率和手性，1-Boc-3-哌啶酮的转化率为99.9％，光学纯度e.e％为99.9％。
实施例7反应温度的优化
进行五组平行实验，各称取0.75g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，悬浮于40mL的0.1M，pH为7.0的磷酸缓冲液中，加入1-Boc-3哌啶酮20g，10mLIPA，0.005g的NAD，分别在20-60℃条件下搅拌反应24小时。
反应结束后，取样用二氯甲烷淬灭反应，按照实施例2的GC检测方法检测底物1-Boc-3哌啶酮的转化率，具体结果如表1表所示。
表1不同反应温度条件下的底物转化率
温度 24小时转化率
20℃ 85.2％
30℃ 97.8％
40℃ 99.9％
50℃ 87.4％
60℃ 62.1％
通过表1的检测结果可知，在40℃条件下反应时，所获得的转化率最高。
实施例8反应pH的优化
进行五组平行实验，各称取0.75g(湿重)实施例1制备获得的表达酮还原酶的大肠杆菌菌体，分别悬浮于40mL的0.1M，不同pH(5.0～9.0)的磷酸缓冲液中，每组加入1-Boc-3哌啶酮20g、10mL IPA、0.005g的NAD，在40℃条件下下搅拌反应24小时。
反应结束后，取样用二氯甲烷淬灭反应，按照实施例2的GC检测方法检测1-Boc-3哌啶酮转化率，具体结果如表2表所示。
表2不同pH条件下的的转化率
pH 24小时转化率
5.0 35.1％
6.0 71.4％
7.0 99.9％
8.0 99.9％
9.0 92.7％
通过表2的检测结果可知，pH为7.0～8.0的反应条件下，所获得的转化率最高。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
序列表
<110> 宁波酶赛生物工程有限公司
<120> 一种酮还原酶及S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 771
<212> DNA
<213> Sulfolobusacidocaldarius
<400> 1
atgtcgtatc aaagcctgaa aaataaagtc gtcatcgtca cgggtgccgg ttctggtatc 60
ggtcgtgcca ttgccaaaaa attcgccctg aacgactcaa ttgtggttgc tgtcgaactg 120
ctggaagatc gtctgaatca gatcgtgcaa gaactgcgcg gcatgggtaa agaagtcctg 180
ggcgtgaaag ccgatgttag caagaaaaaa gacgtggaag aatttgttcg tcgcaccttc 240
gaaacgtatt cgcgtattga tgtgctgtgc aacaatgccg gcatcatgga cggtgttacc 300
ccggtcgcag aagtgagcga tgaactgtgg gaacgtgttc tggcggtcaa cctgtattcc 360
gccttttaca gctctcgcgc agttattccg atcatgctga aacagggcaa aggtgtcatt 420
gtgaataccg caagcattgc tggtatccgc ggcggtttcg caggtgctcc gtataccgtt 480
gcgaaacatg gcctgattgg tctgacgcgt tctatcgcgg cccactacgg cgaccaaggt 540
attcgtgcag ttgcagtcct gccgggtacc gtgaaaacga acatcggcct gggtagttcc 600
aaaccgagcg aactgggtat gcgtaccctg acgaaactga tgtctctgtc atcgcgcctg 660
gctgaaccgg aagatattgc gaatgtgatc gtttttctgg cgtccgatga agcctcgttt 720
gtgaatggtg acgctgtcgt ggtggatggt ggtctgacgg tgctgtagta a 771
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> Sulfolobusacidocaldarius
<400> 2
Met Ser Tyr Gln Ser Leu Lys Asn Lys Val Val Ile Val Thr Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ile Gly Arg Ala Ile Ala Lys Lys Phe Ala Leu Asn Asp
20 25 30
Ser Ile Val Val Ala Val Glu Leu Leu Glu Asp Arg Leu Asn Gln Ile
35 40 45
Val Gln Glu Leu Arg Gly Met Gly Lys Glu Val Leu Gly Val Lys Ala
50 55 60
Asp Val Ser Lys Lys Lys Asp Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Thr Phe
65 70 75 80
Glu Thr Tyr Ser Arg Ile Asp Val Leu Cys Asn Asn Ala Gly Ile Met
85 90 95
Asp Gly Val Thr Pro Val Ala Glu Val Ser Asp Glu Leu Trp Glu Arg
100 105 110
Val Leu Ala Val Asn Leu Tyr Ser Ala Phe Tyr Ser Ser Arg Ala Val
115 120 125
Ile Pro Ile Met Leu Lys Gln Gly Lys Gly Val Ile Val Asn Thr Ala
130 135 140
Ser Ile Ala Gly Ile Arg Gly Gly Phe Ala Gly Ala Pro Tyr Thr Val
145 150 155 160
Ala Lys His Gly Leu Ile Gly Leu Thr Arg Ser Ile Ala Ala His Tyr
165 170 175
Gly Asp Gln Gly Ile Arg Ala Val Ala Val Leu Pro Gly Thr Val Lys
180 185 190
Thr Asn Ile Gly Leu Gly Ser Ser Lys Pro Ser Glu Leu Gly Met Arg
195 200 205
Thr Leu Thr Lys Leu Met Ser Leu Ser Ser Arg Leu Ala Glu Pro Glu
210 215 220
Asp Ile Ala Asn Val Ile Val Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ala Ser Phe
225 230 235 240
Val Asn Gly Asp Ala Val Val Val Asp Gly Gly Leu Thr Val Leu
245 250 255

Claims (8)

1.一种S-1-BOC-3羟基哌啶的酶催化制备方法，其特征在于，所述酶催化制备方法以1-BOC-3哌啶酮为底物，在辅酶、辅酶循环体系和酮还原酶存在条件下反应，得到含S-1-BOC-3羟基哌啶的反应液；
所述的酮还原酶编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述酮还原酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；所述1-BOC-3哌啶酮底物的浓度为400g/L；所述酮还原酶以菌体形式加入，所述菌体浓度为15g/L；所述反应pH为7.0～8.0。
2.根据权利要求1所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述酶催化制备方法还包括提纯步骤：向所述反应液中加入助滤剂，经过滤、浓缩、萃取、结晶、再过滤和干燥，获得S-1-BOC-3羟基哌啶。
3.根据权利要求2所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述助滤剂为硅藻土。
4.根据权利要求1所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述酮还原酶还可以以菌体破壁后的液体酶、酶粉、固定化细胞或固定化酶粉中的一种或几种形式参与反应。
5.根据权利要求1所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述的辅酶为NAD或NADP，辅酶的用量为底物1-BOC-3哌啶酮用量的0.25～1wt‰。
6.根据权利要求1所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述辅酶循环体系包括IPA辅酶循环体系、GDH和葡萄糖辅酶循环体系或FDH和甲酸盐辅酶循环体系。
7.根据权利要求1所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述反应中还需要加入缓冲液，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐、Tris缓冲液或三乙醇胺缓冲液中的一种或几种，反应温度为20～60℃。
8.根据权利要求1所述的酶催化制备方法，其特征在于，所述辅酶为NAD，NAD的浓度为0.1g/L；辅酶循环体系为IPA辅酶循环体系，IPA体积为总反应体积的20%，反应温度为40℃，反应时间为24小时。
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