CN104099383A - (s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法 - Google Patents

(s)-n-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法 Download PDF

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吴会
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张启鹏
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Abstract

本发明公开了一种(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法，所述方法包括如下步骤：将固定化全细胞、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮、辅因子、缓冲液和异丙醇按一定比例混合，在pH＝5～8、温度为20～45℃下反应，经后处理得到产物。与现有技术相比，本发明所采用的方法具有成本低、操作方便和催化剂可回收利用的优点，具有良好的工业应用价值。

Description

(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法
技术领域
本发明属于制药工业生物技术领域，具体涉及一种(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法。
背景技术
(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是一个在医药领域具有重要应用价值的化合物，被广泛应用于镇痛、抗精神病和抗肿瘤等药物的合成。目前文献报道的制备方法主要有化学拆分法和生物转化法。
化学拆分法是将外消旋3-羟基哌啶在手性有机酸的作用下成盐析出得到(S)-3-羟基哌啶的盐，然后游离、上保护基得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶。该方法存在拆分收率低、操作繁琐及成本高昂的缺点。
2009年，文献Organic Letters Vol.11,No.6,1245-1248报道了一种生物转化合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。该方法利用磨碎的野生胡萝卜根为生物催化剂，将N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮还原得到(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶，该方法存在生物催化剂大量获得困难及产物光学纯度不高等问题，反应效率太低、生产成本过高，难以产业化应用。
CN103571908A中公开了一种生物酶催化制备(R)或(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。该方法所用的生物酶为冻干粉，存在价格高和后处理繁琐等问题。
此外，我们在申请号为201410309627.5的专利申请中报道了一种固定化全细胞组合物催化合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法。该方法将酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例混合并经固定化处理后用于生物转换，反应中会产生与产物等当量的葡萄糖酸，为了维持反应体系的pH，需要加入等当量的碱中和，这就大大影响反应的工艺经济性和原子经济性。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法。
具体工艺路线如下所示：
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：将经固定化处理的酮还原酶全细胞、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮、辅因子、缓冲液和异丙醇混合，在pH＝5～8、温度为20～45℃下反应1～48h；反应混合液中固定化全细胞湿重浓度为5～100g/L，N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮的浓度10～250g/L，辅因子浓度为0.001～1g/L；缓冲液的浓度为1mmol/L～1mol/L；固定化全细胞能将异丙醇转换为丙酮；反应结束后过滤回收固定化全细胞；滤液用有机溶剂萃取、浓缩和结晶得到纯度大于99％、光学纯度大于99％的目标产物。
进一步说，所述辅因子为选自NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
进一步说，所述酮还原酶全细胞由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。
进一步说，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为磷酸盐缓冲液。
进一步说，所述固定化全细胞制备方法为：将酮还原酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型。
进一步说，所述酮还原酶全细胞与所述固定剂的重量比为1:1～1:2。
进一步说，所述固定剂为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙中的一种或它们地组合。
进一步说，所述酮还原酶全细胞选自市场上可以购得的KRED101～KRED250全细胞(尚科生物医药(上海)有限公司)，优选KRED198全细胞。
进一步说，所述固定化全细胞经过滤后可以回收套用，套用次数为1～10次。
与现有技术相比，本发明生产成本较低，固定化全细胞容易与反应液分离，操作方便，催化剂可回收利用，反应的工艺经济性和原子经济性得以提高，产物收率及光学纯度高，具有良好的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
一、固定化全细胞的制备
室温下，将0.6kg聚乙烯醇加入3.5L水中，升温至90～95℃，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25～30℃；向上述溶液中加入0.3kg KRED198全细胞(尚科生物医药(上海)有限公司)，混匀后搅拌1h；用蠕动泵和塑料排枪吸取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30℃干燥1.0-1.5h；移入0.1M Na2SO4溶液稳定2h，滤干并用清水洗涤两次，得到1.6kg固定化全细胞。
二、(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向20L带夹套的玻璃反应釜中加入15L事先配好的pH＝7的100mmol/L的磷酸盐缓冲液、1kg固定化全细胞和0.001kg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入2kg N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝5.8，30℃搅拌6h，HPLC显示转化率大于98％；过滤，滤液用甲苯萃取，减压浓缩甲苯得到1.88kg淡黄色液体；粗品加入10kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，过滤、真空烘干得产品1.75kg，纯度99.8％，光学纯度99.5％，收率88％。
实施例2
一、固定化全细胞的制备
室温下，将0.3kg聚乙二醇溶解在3.5L水中，后向溶液中加入0.2kg聚乙烯醇，升温至90～95℃，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25～30℃；向上述溶液中加入0.3kgKRED198全细胞(尚科生物医药(上海)有限公司)，混匀后搅拌1小时；用蠕动泵和塑料排枪吸取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30℃干燥1.0-1.5h；移入0.1M Na2SO4溶液稳定2h，滤干并用清水洗涤两次，得到1.45kg固定化全细胞。
二、(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的合成
向20L带夹套的玻璃反应釜中加入15L事先配好的pH＝7的100mmol/L的三乙醇胺缓冲液、1.2kg固定化细胞和0.001kg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入2kg N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝8.0，42℃搅拌10h，HPLC显示转化率大于98％；过滤除去固定化细胞，待下一批套用；滤液用甲苯(3kg×3)萃取，合并有机层，减压浓缩甲苯得到1.92kg淡黄色液体；加入10kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，真空干燥得产品1.80kg，纯度99.8％，光学纯度99.5％，收率91％。
实施例3
用回收固定化细胞合成(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶
向20L带夹套的玻璃反应釜中加入15L事先配好的pH＝7的100mmol/L的三乙醇胺缓冲液、1.2kg实施例2中回收的固定化细胞和0.001kg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，搅拌均匀后，加入2kg N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和3L异丙醇，反应过程中用10％氢氧化钠水溶液控制反应液为pH＝8.0，42℃搅拌10小时，HPLC显示转化率大于98％；过滤，滤液用甲苯(3kg×3)萃取，合并有机层，减压浓缩甲苯得到1.80kg淡黄色液体；加入10kg正己烷，在0～5℃搅拌析出白色固体，真空干燥得产品1.67kg，纯度99.6％，光学纯度99.4％，收率84％。

Claims (10)

1.一种(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的生物制备方法，其特征在于：将固定化全细胞、N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮、辅因子、缓冲液和异丙醇按一定比例混合反应得到产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定化全细胞为酮还原酶全细胞经固定化处理后得到；所述固定化全细胞能将所述异丙醇转换为丙酮。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酮还原酶全细胞由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定化全细胞浓度为5～100g/L、所述N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮浓度为10～250g/L、所述辅因子浓度为0.001～1g/L和所述缓冲液的浓度为1mmol/L～1mol/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在pH＝5～8、温度为20～45℃下进行。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述辅因子为选自NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定化全细胞的制备方法为：将所述酮还原酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述酮还原酶全细胞与所述固定剂的重量比为1：1～1：2。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述固定剂为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙的一种或它们的组合。
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