CN102471786A - 有机酸类的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为具有以下的工序A~C、由葡萄糖制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的方法。(A)通过将由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物,在能够使5-酮-D-葡萄糖酸形成水溶性盐的碱的存在下,用含有葡萄糖的培养液培养,得到含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的工序A;(B)通过将工序A中得到的含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的pH调整并维持在7~12的范围内,得到5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐转换为L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的反应液的工序B;(C)由工序B中得到的反应液,提取L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的工序C。
Description
技术领域
本发明涉及由葡萄糖制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的方法。
背景技术
L-酒石酸或其盐,在食品领域中用作酸味剂、pH调整剂,在工业领域中用作化妆品、染色、洗剂、镀层,在药品领域中用作药品原料等,为在产业界广泛利用的有用的物质。此外,由葡萄糖制备L-酒石酸时,与L-酒石酸同时生产的乙醇酸为用作金属洗涤剂、镀层添加剂、化妆品添加物、硬质类生物分解性聚合物的原料等的有用的物质。
作为L-酒石酸的制备方法,已知各种方法,但是现在由葡萄酒酿造的残渣以及来源于石油的中间体马来酸酐来制备。此外,乙醇酸通过石油化学上的方法制备。另一方面,使用葡萄糖作为起始原料,经过5-酮葡萄糖酸,制备酒石酸和乙醇酸的方法尚为研究阶段,过去进行了各种研究。作为由葡萄糖转换为5-酮-D-葡萄糖酸的方法,报道了使用属于葡糖杆菌属(Gluconobacter)或醋酸杆菌属(Acetobacter)的醋酸菌,由葡萄糖经过葡萄糖酸发酵生成5-酮-D-葡萄糖酸的方法。在5-酮-D-葡萄糖酸的实际的发酵生成中,已知利用碳酸钙作为中和剂或使用氢氧化钙进行pH控制,将5-酮-D-葡萄糖酸以水难溶性的5-酮-D-葡萄糖酸的钙盐的方式析出,将该5-酮-D-葡萄糖酸的钙盐由发酵液回收的方法。
此外已知,属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的很多醋酸菌,由葡萄糖经过葡萄糖酸生成5-酮-D-葡萄糖酸的同时,也由上述葡萄糖酸同时生成2-酮-D-葡萄糖酸。该2-酮-D-葡萄糖酸不能形成L-酒石酸、乙醇酸,因此导致5-酮-D-葡萄糖酸的收获量降低。因此,通过诱导2-酮-D-葡萄糖酸非生产菌株,实现5-酮-D-葡萄糖酸的收率的升高(参照专利文献1)。但是,很多醋酸菌,不仅具有由葡萄糖经过葡萄糖酸生成5-酮葡萄糖酸的酶,而且在细胞质内具有由5-酮-D-葡萄糖酸转换为葡萄糖酸的5-酮-D-葡萄糖酸还原酶。已知所还原的葡萄糖酸由于戊糖·磷酸途径以及恩特纳·杜多罗夫途径等代谢途径而消耗,成为L-酒石酸和乙醇酸的原料的5-酮-D-葡萄糖酸的生成量降低(参照非专利文献1)。
另一方面,存在关于由5-酮-D-葡萄糖酸制备酒石酸的报告。Isbell等人报告了使用水难溶性的5-酮-D-葡萄糖酸钙盐作为起始原料,使其首先与碳酸钠接触转换为水溶性的5-酮-D-葡萄糖酸钠盐,然后在1摩尔氢氧化钠溶液中进行反应,以约10%的收获量得到酒石酸(参照非专利文献2)。该制备方法中,由于产生副产物水难溶性的碳酸钙,在将5-酮-D-葡萄糖酸转换为酒石酸之前,有必要预先从反应液除去碳酸钙。此外,所除去的碳酸钙有必要作为废弃物进行处理,因此导致本制备方法的成本高。此外,根据本制备方法,存在酒石酸的收获量低,约为10%,以及除了酒石酸之外产生大量副产物不需要的有机酸,因此有必要将它们分离等问题,不能用于工业上的酒石酸的制备中。
作为进一步改善酒石酸的收获量的方法,报道了使5-酮-D-葡萄糖酸在碱条件下,在含有碳酸离子或磷酸离子的缓冲液中与贵金属催化剂氧化性地接触,由此以高收获量生产酒石酸的制备方法。进一步报道了在这种条件下,若使用钒酸作为催化剂则以进一步高的收获量生产酒石酸(参照专利文献2)。但是,在这些制备方法中存在使用碳酸等昂贵的缓冲剂作为制备材料以及由于使用对于人表现出毒性的钒酸作为催化剂而必需高昂的纯化成本等缺点。
进一步随后报道了,在碱条件下,使5-酮-D-葡萄糖酸与铂等稀有金属碳催化剂在水溶液、碳酸、磷酸、焦磷酸或硫酸缓冲液中接触,由此以61%收获量生产酒石酸的制备方法(参照专利文献3)。但是,该制备方法中,由于使用碳酸缓冲液作为溶液,导致酒石酸生产中的成本高。
如以上所述,基于以往的知识,考虑由葡萄糖制备酒石酸的方法时,该制备方法由以下工序组成:由葡萄糖通过微生物发酵生成5-酮-D-葡萄糖酸的钙盐,分离5-酮-D-葡萄糖酸钙盐的工序,将所得到的水难溶性的5-酮-D-葡萄糖酸钙盐转换为水溶性的盐的工序,进而将水溶性的5-酮-D-葡萄糖酸盐化学上转换为酒石酸的工序。但是,该制备方法中存在工序多、此外操作花费工夫的缺点,因此必需高昂的制备成本。所以至今认为在工业上不能实现由上述工序组成的酒石酸的制备方法。
作为弥补上述缺点的方法,报道了在最初的工序的利用醋酸菌由葡萄糖转换为5-酮-D-葡萄糖酸的培养基中,添加接下来的反应工序(将5-酮-D-葡萄糖酸盐转换为酒石酸的工序)所必需的钒酸催化剂的酒石酸的制备方法(参照专利文献4)。但是根据专利文献4,该制备方法中,由1000g的葡萄糖仅得到43g(取得收率5.2重量%)的少量的酒石酸。如此,该制备方法的收获量由于非常低,该制备方法不能用于工业上的酒石酸的制备中。
另一方面,对于通过化学反应,由5-酮-D-葡萄糖酸制备乙醇酸的方法,至今仅已知一个报告(参照专利文献5)。根据专利文献5,在反应液中除了乙醇酸之外还产生大量副产物低分子的有机酸,由796g/L的5-酮-D-葡萄糖酸仅生产11.6g/L的少量的乙醇酸。如此,由于该制备方法的收获量非常低,该制备方法不能用于工业上的乙醇酸的制备中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:丹麦专利第102004010786号公报
专利文献2:美国专利第5763656号公报
专利文献3:德国专利第2388368号公报
专利文献4:美国专利第3585109号公报
专利文献5:美国专利第5731467号公报
非专利文献
非专利文献1:O.Adachi,ビタミン,76,65-77,2003
非专利文献2:H.Isbell and N.Hold,The Journal of Research of theBureau of Standards,35,433-438,1945
发明内容
如背景技术所述,由葡萄糖制备L-酒石酸、乙醇酸的以往的方法,在操作的效率性、成本方面不充分,事实上难以用于工业上的制备中。本发明的目的在于,提供能够由葡萄糖有效且低成本地制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的、能够用于工业上的制备中的实用性高的方法。
本发明人以实现能够由葡萄糖有效且低成本地制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的、能够用于工业上的制备中的实用性高的方法作为课题而进行精心研究结果发现,通过采用以下的工序A~C,可以解决该课题,从而完成本发明。
(A)通过将由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物,在能够使5-酮-D-葡萄糖酸形成水溶性盐的碱的存在下,用含有葡萄糖的培养液培养,得到含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的工序A;
(B)通过将工序A中得到的含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的pH调整并维持在7~12的范围内,得到5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐转换为L-酒石酸或其盐和/或乙醇酸或其盐的反应液的工序B;
(C)由工序B中得到的反应液,提取L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的工序C。
即,本发明涉及(1)具有以下的工序A~C,由葡萄糖制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的方法,(A)通过将由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物,在能够使5-酮-D-葡萄糖酸形成水溶性盐的碱的存在下,用含有葡萄糖的培养液培养,得到含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的工序A;(B)通过将工序A中得到的含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的pH调整并维持在7~12的范围内,得到5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐转换为L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的反应液的工序B;(C)由工序B中得到的反应液,提取L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的工序C;(2)上述(1)中记载的方法,其特征在于,使用在上述工序B中的培养液中进一步含有过渡金属催化剂的培养液;(3)上述(2)中记载的方法,其特征在于,过渡金属催化剂为选自由钯、铑、钌、铂、锰、铜、钴、镍、锌、钒和铁组成的组中的1种或2种以上的过渡金属催化剂;(4)上述(2)或(3)中记载的方法,其特征在于,过渡金属催化剂的浓度为0.00002~2%;(5)上述(2)~(4)中任意一项记载的方法,其特征在于,过渡金属催化剂的浓度为0.0001~1%;(6)上述(1)~(5)中任意一项记载的方法,其特征在于,由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物为属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物;(7)上述(6)中记载的方法,其特征在于,属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物为选自由氧化葡糖杆菌NBRC 3172及氧化葡糖杆菌NBRC 3255、巴氏葡糖杆菌NBRC 3225、微白葡糖杆菌NBRC 3250、氧化葡糖杆菌亚氧化亚种NBRC 3254、グルコノバクタ一·インダストリアスNBRC 3260、蜡状葡糖杆菌NBRC 3267、グルコノバクタ一·ジオキシアセトニカス(Gluconobacter dioxyacetonicus)NBRC 3273、グルコノバクタ一·モノオキシグルコニカスNBRC 3276、グルコノバクタ一·グルコニカスNBRC 3285、グルコノバクタ一·ロゼウス(Gluconobacter roseus)NBRC 3990、グルコノバクタ一·フラトイリNBRC 3265、醋酸杆菌NBRC3259以及它们的变异菌株的由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的菌株组成的组中的任意1种或2种以上的微生物;(8)上述(7)中记载的方法,其特征在于,属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物进一步为2-酮-D-葡萄糖酸低生产性和/或5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的菌株(9)上述(1)~(8)中任意一项记载的方法,其特征在于,将上述工序B中的培养液的pH调整并维持在8~11的范围内;(10)上述(1)~(9)中任意一项记载的方法,其特征在于,将上述工序B中的培养液pH调整并维持在9~10的范围内;(11)上述(1)~(10)中任意一项记载的方法,其特征在于,上述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将培养液的温度调整并维持在0℃~70℃的范围内;(12)上述(1)~(11)中任意一项记载的方法,其特征在于,上述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将培养液的温度调整并维持在20℃~60℃的范围内;(13)上述(1)~(12)中任意一项记载的方法,其特征在于,上述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将空气供给量与培养液的比率调整并维持在0.2~5的范围内;(14)上述(1)~(13)中任意一项记载的方法,其特征在于,上述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将空气供给量与培养液的比率调整并维持在0.5~3的范围内;(15)上述(1)~(14)中任意一项记载的方法,其特征在于,工序C中提取的L-酒石酸的盐为L-酒石酸的一钾盐;(16)上述(1)~(15)中任意一项记载的方法,其特征在于,工序C中提取的乙醇酸或其盐,为乙醇酸的游离酸或其盐。
根据本发明,可以由葡萄糖非常有效且低成本地制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐。因此,本发明的制备方法,可以用于工业上的制备中,实用性极高。
附图说明
图1为表示本发明的制备方法的一例子的概况的图。
图2为表示醋酸菌的代谢途径的图。
具体实施方式
作为本发明的“由葡萄糖制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的方法”(以下仅表示为“本发明的制备方法”),只要具有通过将由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物,在能够使5-酮-D-葡萄糖酸形成水溶性盐的碱的存在下,用含有葡萄糖的培养液培养,得到含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的工序A;通过将工序A中得到的含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的pH调整并维持在7~12的范围内,得到5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐转换为L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的反应液的工序B;以及由工序B中得到的反应液,提取L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的工序C,则不特别限定。通过具有这一系列工序A~C,可以由葡萄糖非常有效且低成本地制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐(以下将“L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐”仅表示为“L-酒石酸等”。)。特别是虽然得到含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液(上述工序A),但是不由该培养液分离纯化5-酮-D-葡萄糖酸,而直接如上述B所述,通过转换为L-酒石酸等,L-酒石酸等的制备效率显著提高,此外,随之制备L-酒石酸等所需的成本显著降低。而且,本发明的制备方法的一例子的概况如图1所示。
此外,作为上述工序A中的“由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物”(以下表示为“本发明中的微生物”)指的是具有通过将该微生物在适于该微生物的生长的条件下,用含有葡萄糖的培养液培养,由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的能力(以下仅表示为“5-酮-D-葡萄糖酸生产能力”)的微生物。作为上述本发明中的微生物,可以优选举出属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的很多醋酸菌,其中,作为由独立行政法人制品评价技术基盘机构(独立行政法人製品評価技術基盤機構,NBRC)等公共菌菌株保存机关保存的属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的菌菌株,可以更优选举出氧化葡糖杆菌NBRC 3172及氧化葡糖杆菌NBRC 3255、巴氏葡糖杆菌NBRC 3225、微白葡糖杆菌NBRC 3250、氧化葡糖杆菌亚氧化亚种NBRC 3254、グルコノバクタ一·インダストリアスNBRC 3260、蜡状葡糖杆菌NBRC 3267、グルコノバクタ一·ジオキシアセトニカスNBRC 3273、グルコノバクタ一·モノオキシグルコニカスNBRC 3276、グルコノバクタ一·グルコニカス(Gluconobacter gluconicus)NBRC 3285、グルコノバクタ一·ロゼウスNBRC 3990、グルコノバクタ一·フラトイリNBRC 3265、醋酸杆菌NBRC3259等,由于5-酮-D-葡萄糖酸生产能力优异,可以进一步优选举出氧化葡糖杆菌NBRC 3172菌株。此外,本发明中的微生物中,只要具有5-酮-D-葡萄糖酸生产能力,则也可以使用新的由自然界分离的属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的菌株。
此外,作为本发明中的微生物中特别优选的微生物,可以举出除了具有5-酮-D-葡萄糖酸生产能力之外,进一步具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性或5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的微生物(优选为属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物),作为更优选的微生物,可以举出除了具有5-酮-D-葡萄糖酸生产能力之外,进一步具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性及5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的微生物(优选为属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物)。这是因为,醋酸菌等本发明的微生物,由于由葡萄糖经过葡萄糖酸,不仅生产5-酮-D-葡萄糖酸,还生产作为不必要的副产物的2-酮-D-葡萄糖酸(参照图2),因此若具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性,则在5-酮-D-葡萄糖酸的收率提高方面优选。此外,醋酸菌等本发明的微生物由于为了生长所生成的5-酮-D-葡萄糖酸的一部分而消耗,若进一步具有5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性,则在5-酮-D-葡萄糖酸的收率提高方面优选。
本说明书中的“具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性的微生物”指的是2-酮-D-葡萄糖酸的生产性低(来自特定量的葡萄糖的2-酮-D-葡萄糖酸的生成量少或相对于由特定量的葡萄糖生产的5-酮-D-葡萄糖酸量的2-酮-D-葡萄糖酸量的比率低)的微生物,例如该微生物为醋酸菌时,指的是与氧化葡糖杆菌NBRC 3172菌株相比,2-酮-D-葡萄糖酸的生产性低的醋酸菌。从进一步提高5-酮-D-葡萄糖酸的收率的观点考虑,在2-酮-D-葡萄糖酸低生产性中,优选为2-酮-D-葡萄糖酸非生产性。
此外,本说明书中的“具有5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的微生物”指的是5-酮-D-葡萄糖酸的消耗少的微生物,例如该微生物为醋酸菌时,指的是与氧化葡糖杆菌NBRC 3172菌株相比,5-酮-D-葡萄糖酸的消耗少的醋酸菌。从进一步提高5-酮-D-葡萄糖酸的收率的观点考虑,在5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性中,优选为5-酮-D-葡萄糖酸非消耗性。
作为由本发明中的微生物(由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物)制备上述具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性的微生物、具有5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的微生物的方法,不特别限定,可以优选举出对于本发明中的微生物,利用N-甲基-N-硝基-N’-亚硝基胍(以下简单表示为“NTG”)等化学变异剂实施变异处理,筛选具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性的微生物、具有5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的微生物的方法,作为更具体的方法,可以更优选举出后述的实施例1中记载的筛选方法。某种微生物是否具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性,例如可以通过下述方法等确认,该方法中,将该微生物的培养液的上清点样到Silica gel TLC(Merck公司制)上,用正丁醇-乙酸-水(3∶2∶1)展开,接着风干后喷雾碱性四唑蓝(和光纯药工业社制)试剂后,100℃下加热显色,目视判定2-酮-D-葡萄糖酸与5-酮-D-葡萄糖酸的生成比,是否具有5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性,可以通过下述方法等确认,该方法中,将该微生物的培养液的上清取到孔板上,加入对于5-酮-D-葡萄糖酸特异性地显色为粉红色的1-甲基-1-苯基肼溶液(和光纯药工业社制、终浓度=2%(w/v)),95℃下加热60分钟进行显色反应(M.Schramm,Anal.Chem.,28,963-965,1956),目视调查5-酮-D-葡萄糖酸的消耗。
作为上述具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性的微生物的具体例子,可以优选举出氧化葡糖杆菌TABT-200菌株。该TABT-200菌株,为本发明人通过对NBRC 3172菌株进行NTG处理,筛选2-酮-D-葡萄糖酸低生产性的菌株而制备的菌株(参照后述的实施例1)。而且,该TABT-200菌株为几乎不生产2-酮-D-葡萄糖酸的2-酮-D-葡萄糖酸非生产性菌株。此外,作为具有2-酮-D-葡萄糖酸低生产性及5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性两者的微生物,可以特别优选举出氧化葡糖杆菌TADK-267菌株。该TADK-267菌株,为本发明人通过对TABT-200菌株进行NTG处理,筛选5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的菌株而制备的菌株(参照后述的实施例1)。而且,该TADK-267菌株为2-酮-D-葡萄糖酸非生产性菌株,此外,也为不消耗5-酮-D-葡萄糖酸的5-酮-D-葡萄糖酸非消耗性菌株。
上述工序A中的“能够使5-酮-D-葡萄糖酸形成水溶性盐的碱”,只要是在溶液中与5-酮-D-葡萄糖酸接触时,生成5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的碱,则不特别限定,可以优选举出例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨等。此外,作为上述工序A中使用的碱的量,只要本发明中的微生物可以生长则不特别限定,可以使用为了将培养中的培养液的pH优选维持在3~9的范围内、更优选4~7的范围内、进一步优选5~6的范围内所必需的量。
作为上述工序A中的“含有葡萄糖的培养液”,只要为含有葡萄糖且上述工序A中的微生物可以生长的培养液,则不特别限定,可以举出含有该微生物可以同化的碳源、可以消化的氮源、无机金属盐类以及生长所必需的维生素类或消泡剂的培养液。而且,钙对于该微生物的生长来说不是必须的,但是对于由葡萄糖生成5-酮葡萄糖酸的反应来说是必须的成分,因此在尽可能不生成5-酮葡萄糖酸钙盐的范围内,有必要将微量的钙添加到上述含有葡萄糖的培养液中。作为所添加的钙的浓度的上限,优选为培养液中的葡萄糖浓度(w/w(%))的20分之1以下的浓度(w/w(%)),更优选为40分之1以下的浓度(w/w(%)),此外,作为下限,优选为培养液中的葡萄糖浓度(w/w(%))的500分之1以上的浓度(w/w(%)),更优选为200分之1以上的浓度(w/w(%))。进一步地,作为工序A中的培养之前的前培养中的培养液的碳源,可以使用葡萄糖、果糖、甘露醇、山梨醇、山梨糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖或甘油等,而作为工序A中的培养液的碳源,优选使用葡萄糖,使其浓度为1%~20%、优选为5%~16%。此外,工序A中的培养液中,除了葡萄糖之外,辅助性地将果糖、甘露醇、山梨醇、山梨糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖或甘油等具体地说以0.1%~2.0%的范围添加到培养基中,从进一步提高5-酮-D-葡萄糖酸的收率的观点考虑优选。
此外,前培养及工序A中的培养液,作为氮源,都可以分别单独或以混合物的方式使用例如蛋白胨、大豆粉、玉米浆干粉、玉米浆、肉萃取物、酵母萃取物、氨基酸类等有机氮源或硫酸铵、硝酸铵、尿素等无机氮源,但是在工业上玉米浆干粉、玉米浆等由于廉价而优选。作为无机金属盐,例如优选使用钙、镁、锌、锰、钴和铁等的硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐或磷酸盐。此外,根据需要将少量的动物油、植物油、矿物油等用于培养液中从进一步提高5-酮-D-葡萄糖酸的收率的观点考虑优选。而且,作为微生物为醋酸菌时的工序A中优选的培养液,更具体地说,可以特别优选举出含有6%葡萄糖、0.09%氯化铵、0.06%磷酸二氢钾、0.18%玉米浆干粉(シグマ社制)、0.1%酵母萃取物(デイフコ·ラボラトリ一社制)、0.015%硫酸镁7水盐、0.0029%硫酸锰5水盐、0.12%氯化钙2水盐和0.1%アクトコ一ル(武田化学工业社制)的MB培养基。
此外,作为上述工序A中的培养的条件,只要是该工序中的微生物可以生长且该微生物可以生成5-酮-D-葡萄糖酸的条件则不特别限定,但是工序A中,由于生成大量的葡萄糖酸、5-酮-D-葡萄糖酸等强酸性有机酸而培养液的pH显著变化,优选将酸溶液和碱溶液连续地加入到培养液中的同时维持适于5-酮-D-葡萄糖酸的生产的pH。作为上述pH,可以优选举出在3~9的范围内,可以更优选举出在4~7的范围内,可以进一步优选举出在5~6的范围内。作为上述酸溶液,可以优选举出盐酸、硫酸、硝酸等酸水溶液,作为上述碱水溶液,可以优选举出氢氧化钠、氢氧化钾、氨等碱水溶液。此外,作为培养的温度条件,可以优选举出10℃~40℃的范围内的温度,可以更优选举出25℃~35℃的范围内的温度。进一步地,作为培养的氧条件,优选为通气搅拌培养等需氧的条件,更具体地说,可以优选举出每1分钟空气供给量与培养液量的比率在0.2~2.0的范围内,可以更优选可以举出在0.5~1.5的范围内。为了维持这些优选的培养条件,可以优选使用能够连续地进行控制的搅拌式发酵槽。若将本发明中的微生物在优选的培养条件下进行工序A中的培养,则通常1天~7天、优选1天~4天结束工序A的培养,可以以70%~95%的摩尔收率生成5-酮-D-葡萄糖酸。
若进行工序A中的培养,则在培养液中生产5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐。
作为上述工序B中,将工序A中得到的含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的pH调整并维持在7~12的范围内的方法,不特别限定,可以优选举出在进行工序A中的培养的培养槽(优选为可以连续地进行控制的搅拌式发酵槽)中,将盐酸、硫酸、硝酸等酸水溶液,氢氧化钠、氢氧化钾、氨等碱水溶液添加到工序A中得到的培养液中的方法。此外,作为在上述工序B中调整并维持的pH,从得到向L-酒石酸等的优异的转换效率的观点考虑,优选在8~11的范围内,进一步优选在9~10的范围内。此外,调整并维持pH时,从提高L-酒石酸等的收率的观点考虑,优选对温度也进行调整并维持,作为上述温度,可以优选举出在0℃~70℃的范围内,可以更优选举出在20℃~60℃的范围内。进一步地,维持pH时,优选将培养液通气搅拌,作为其空气供给量,可以优选举出每1分钟空气供给量与培养液量的比率在0.2~5的范围内,可以更优选举出在0.5~3的范围内。若在优选的条件下进行工序B中的反应则通常1天~14天、优选1天~10天结束反应,相对于葡萄糖可以以10~30%(优选20~30%)的摩尔比率分别得到L-酒石酸及乙醇酸。
此外,工序B中调整或维持pH时,在培养液(反应液)中添加选自由钯、铑、钌、铂、锰、铜、钴、镍、锌、钒和铁组成的组中的1种或2种以上(优选2种以上)的过渡金属催化剂,从得到向L-酒石酸等的更优异的转换效率的观点考虑特别优选。作为从上述组中选择2种过渡金属元素来使用时的特别优选的组合,可以举出钯与钒的组合,其中,可以更优选举出钯碳与钒酸盐的组合。作为过渡金属催化剂的添加剂,相对于培养液(反应液),优选在0.00002%(w/v)~2%(w/v)的范围内,更优选在0.0001%(w/v)~1%(w/v)的范围内。若使用适量的过渡金属催化剂则工序B中的向L-酒石酸等的反应速度加快,因此,通常1天~7天、优选1天~4天结束反应(维持pH),相对于葡萄糖可以以40~70%(优选50~70%、更优选60~70%)的摩尔比率分别得到L-酒石酸及乙醇酸。
此外,上述过渡金属催化剂,可以为盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、乙酸盐等水溶性金属盐,若使用氧化钯、铑氧化物、钌氧化物、铂氧化物、锰氧化物、铜氧化物、钴氧化物、镍氧化物、锌氧化物、钒氧化物、铁氧化物等过渡金属氧化物,钯碳、铑碳、钌碳、铂碳、镍碳、钯氧化铝、铑氧化铝、钌氧化铝、铂氧化铝等的1种或2种以上的过渡金属催化剂吸附在水不溶性载体(碳、氧化铝等)中而成的化合物等水不溶性金属化合物,则由于通过将反应结束后的反应液离心分离,可以容易地回收过渡金属催化剂,通过将回收物进一步重复使用,可以非常有效且低成本地制备L-酒石酸等而优选。作为使上述过渡金属催化剂吸附在水不溶性载体上的量,优选以0.1重量%~30重量%的含量使过渡金属催化剂吸附在水不溶性载体上,更优选以1重量%~15重量%的含量进行吸附。
工序B中,若将工序A中得到的含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的pH调整并维持在7~12的范围内则可以得到5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐转换为L-酒石酸或其盐和/或乙醇酸或其盐的反应液。而且,反应液中可以残留5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐。
作为上述工序C中由工序B中得到的反应液,提取L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的方法,不特别限定,例如提取L-酒石酸或其盐时,通过使用利用酒石酸一钾对于水为难溶性质的方法等公知的纯化方法,可以容易地将L-酒石酸等分离纯化。例如由工序B中得到的反应液,通过离心分离除去不溶性成分(工序A中使用的微生物的菌体残渣、工序B中使用过渡金属催化剂吸附在水不溶性载体上而成的化合物时该化合物),向其离心上清中添加盐酸等无机酸降低pH(优选降低到3.5~4.0的范围内),可以以一钾盐(酒石酸一钾)的形式沉淀L-酒石酸。将含有该沉淀物的溶液离心分离,可以得到沉淀物。将该沉淀物再次悬浮在少量的水中,添加氢氧化钾溶液(例如5M氢氧化钾溶液)的同时进行溶解后,可以再次进行离心分离以除去微量的微粉末催化剂。向所得到的离心上清中添加盐酸等无机酸再次降低pH,在低温(例如5℃)的条件下放置一晚则可以进行酒石酸一钾的重结晶化。将所得到的酒石酸一钾的结晶通过离心分离收集,真空减压下,干燥一晚则可以得到高纯度的酒石酸一钾。
此外,作为提取乙醇酸或其盐的方法,例如可以使用利用阴离子交换树脂的离子交换法或电透析等公知的纯化方法。例如将工序B中得到的反应液或由该反应液提取L-酒石酸后的反应液的pH用氢氧化钠等碱溶液调整到7.0以上,使调制后的该溶液通过强碱性阴离子交换树脂(例如甲酸型)色谱柱,除去钠离子等阳离子后,可以将含有乙醇酸、甲酸的非吸附馏分用氨水(例如2M氨水)中和。然后,对于该溶液在35℃下进行减压浓缩,除去甲酸铵,进一步在真空减压下,干燥一晚,则可以得到高纯度的乙醇酸铵。
而且,各工序中的生产物是否为目的产物(工序A的5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐、工序B的L-酒石酸等、工序C的L-酒石酸等),是否为工序A中的中间产物(乙醇酸)等,可以使用Herrmann等人报告的高效液相色谱(以下简称为“HPLC”)法(Herrmann,U.,Merfort,M.,Jeude,M.,Bringer-Meyer,S.,and Sahm,H.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,64,86-90,2004),但是优选通过将该方法改良而成的方法来定量。作为该优选的方法,具体地说可以举出以下的方法。
本方法中,可以使用DE-613色谱柱(シヨウデツクス社制),流通高氯酸溶液作为流动相溶剂,用UV=210nm的紫外线检测器检测,用记录仪记录。定量乙醇酸、5-酮-D-葡萄糖酸及酒石酸时,使用1根DE-613色谱柱,以每1分钟0.5mL的流速流通10mM高氯酸溶液进行HPLC分析,则乙醇酸、5-酮-D-葡萄糖酸及酒石酸分别表现出6.28分钟、7.35分钟、9.00分钟的保留时间。定量乙醇酸时,将2根DE-613色谱柱串联连接,以每1分钟0.7mL的流速流通20mM高氯酸溶液进行HPLC分析,则乙醇酸表现出11.7分钟的保留时间。反应液中的乙醇酸、5-酮-D-葡萄糖酸、酒石酸及乙醇酸的浓度,可以通过将各物质的峰面积与已知浓度的各物质的峰面积进行比较,算出各自的浓度,进行定量。此外,葡萄糖可以使用グルコ一ステストワコ一(和光纯药工业社制)进行定量。酒石酸的绝对构型及纯度检测,可以通过使用对于D-酒石酸及内消旋酒石酸不表现出活性、而仅对于L-酒石酸表现出活性的D-苹果酸脱氢酶的L-酒石酸的酶学上的检测方法(T.Tsukatani,K.Matsumoto,Biosci.Biotechnol.Biochem.,63,1730-1735,1999)来进行。
而且,工序C中的L-酒石酸的盐的种类由于取决于工序A、工序B中使用的碱的种类等,不特别限定,例如工序A、工序B中使用氢氧化钾作为碱时,在工序C中,得到L-酒石酸的一钾盐。此外,作为工序C中的L-酒石酸的盐,可以举出L-酒石酸二钾盐、L-酒石酸钠盐、L-酒石酸钠钾盐、L-酒石酸铵盐。此外,工序C中的乙醇酸的盐的种类也由于取决于工序A、工序B中使用的碱的种类,工序C中使用的酸的种类等,不特别限定,例如工序C中使用盐酸时,得到乙醇酸的游离酸。此外,作为工序C中的乙醇酸的盐,可以举出乙醇酸钾盐、乙醇酸钠盐、乙醇酸铵盐。以下通过实施例对本发明进行具体说明,但是本发明不被以下实施例所限定。
实施例1
[2-酮-D-葡萄糖酸非生产菌及5-酮-D-葡萄糖酸非消耗变异菌株的取得]
为了制备来源于氧化葡糖杆菌NBRC 3172菌株的2-酮-D-葡萄糖酸非生产菌株,对于NBRC 3172菌株进行NTG变异处理,尝试进行2-酮-D-葡萄糖酸非生产菌的筛选。具体地说,用以下的方法进行。
将MA琼脂培养基[2.5%甘露醇、0.5%酵母萃取物(デイフコ·ラボラトリ一社制)、0.2%蛋白胨(デイフコ·ラボラトリ一社制)、1.5%琼脂(无pH调整)]中生长的氧化葡糖杆菌NBRC 3172菌株,以1铂圈接种到加入有在121℃下用20分钟高压釜杀菌的30mL的MA培养基的300mL容量三角烧瓶中后,30℃下以每1分钟220转振荡培养19小时,由该培养液通过离心分离无菌性地取得细胞。将所得到的细胞用0.85%灭菌生理盐水洗涤1次后,悬浮在灭菌生理盐水中。向灭菌的试验管中依次分注Tris盐酸缓冲液(pH=8.0、终浓度=50mM)和洗涤细胞悬浮液后,加入2000μg/mL浓度的NTG溶液形成5mL以使终浓度分别为0、50、100、200、300μg/mL。将这些试验管以30℃、每分钟250转往复振荡30分钟,由此进行变异处理。将试验管中的反应液用灭菌生理盐水洗涤2次后,再悬浮。将该悬浮液阶段性地稀释至107倍,将各稀释液涂布在MA琼脂培养基上,用30℃的恒温机培养3~5天。由生长的菌落随机地将2600个菌落选出到相同的琼脂培养基中,使用30℃下培养1~2天的菌体进行筛选。在分注了含有100μL的2%葡萄糖酸钠(和光纯药工业社制)的50mM磷酸钾缓冲液(pH=6.0)的96孔板中悬浮1铂圈的菌体,室温下振荡1天进行休止菌体反应。将该反应上清1μL点样到Silica gel TLC(Merck公司制)上,用正丁醇-乙酸-水(3∶2∶1)展开,接着风干后喷雾碱性四唑蓝(和光纯药工业社制)试剂后,100℃下加热显色,目视判定2-酮-D-葡萄糖酸与5-酮-D-葡萄糖酸的生成比。
结果,亲本菌株的氧化葡糖杆菌NBRC 3172菌株以大致1∶1的比率生成2-酮-D-葡萄糖酸与5-酮-D-葡萄糖酸,与此相对地,得到7株主要仅生成5-酮-D-葡萄糖酸、几乎不生成2-酮-D-葡萄糖酸的菌株(2-酮-D-葡萄糖酸非生产性菌株)。
进一步地,对于所得到的7株的2-酮-D-葡萄糖酸非生产菌株中的1株的氧化葡糖杆菌TABT-200菌株,通过与上述相同的方法进行NTG变异处理,尝试5-酮-D-葡萄糖酸非消耗变异菌株的筛选。将NTG处理后得到的1600个菌落选出到琼脂培养基中,使用30℃下生长的菌体。在分注了含有75μL的0.3%的5-酮-D-葡萄糖酸的100mM磷酸钾缓冲液(pH=6.0)的96孔板中悬浮1铂圈的菌体,同样地进行菌体反应。反应后,将上清15μL取到平底的96孔板中,加入对于5-酮-D-葡萄糖酸特异性地显色为粉红色的1-甲基-1-苯基肼溶液(和光纯药工业社制、终浓度=2%(w/v)),95℃下加热60分钟进行显色反应(M.Schramm,Anal.Chem.,28,963-965,1956),目视调查5-酮-D-葡萄糖酸的消耗。结果得到3株除了具有2-酮-D-葡萄糖酸非生产性之外、而且完全不消耗5-酮-D-葡萄糖酸的变异菌株。这些变异菌株由于为2-酮-D-葡萄糖酸非生产性且为5-酮-D-葡萄糖酸非消耗性,因此认为由葡萄糖的5-酮-D-葡萄糖酸生产性提高。所得到的3株中的1株的氧化葡糖杆菌TADK-267菌株用于以后的实验中。
实施例2
[(由葡萄糖制备酒石酸及乙醇酸(添加过渡金属催化剂))]
将上述实施例1中得到的氧化葡糖杆菌TADK-267菌株接种到加入有在121℃下加热杀菌20分钟的5mL的MB培养基[2.5%甘露醇、0.5酵母萃取物(デイフコ·ラボラトリ一社制)、0.3%蛋白胨(デイフコ·ラボラトリ一社制)]的试验管3根中,28℃下以250转往复振荡培养17小时。将这3根试验管中的培养液合并作为种培养液。本培养如下进行,在1L的发酵槽(エイブル株式会社制)中,加入含有6%葡萄糖、0.09%氯化铵、0.06%磷酸二氢钾、0.18%玉米浆干粉(シグマ社制)、0.1%酵母萃取物(デイフコ·ラボラトリ一社制)、0.015%硫酸镁7水盐、0.0029%硫酸锰5水盐、0.12%氯化钙2水盐和0.1%アクトコ一ル(武田化学工业社制)的培养基500mL,同样地加热杀菌后,接种上述种培养液10mL开始本培养。用6M氢氧化钾溶液将pH调整为5.5以上的同时,以30℃、1vvm、800转进行通气搅拌培养,将培养液用1M盐酸溶液稀释51倍后,进行离心上清的HPLC分析经时性地定量产物。在培养开始后第50小时,培养液中的葡萄糖完全消耗,在培养液中残留2.2g/L的葡萄糖酸,但是生成70.5g/L的5-酮-D-葡萄糖酸。向该培养液中添加6M氢氧化钾溶液将培养液的pH升高到9.6后,直接添加该氢氧化钾溶液将培养液的pH维持在9.6以上的同时,继续通气搅拌直至第144小时后,生成12.1g/L的酒石酸和6.0g/L的葡萄糖酸。若考虑到由于蒸发及添加氢氧化钾溶液所导致的液量变化,以及由于中途中取样所导致的液量减少份来进行计算,则由葡萄糖的酒石酸的摩尔收率为23.0%,由葡萄糖的乙醇酸的摩尔收率为22.5%。
实施例3
[由葡萄糖制备酒石酸和乙醇酸(添加钯碳)]
与上述实施例2同样地将氧化葡糖杆菌TADK-267使用发酵槽培养50小时后,葡萄糖完全消耗,残留2.8g/L的葡萄糖酸,但是在溶液中生成67.4g/L的5-酮-D-葡萄糖酸。向该培养液中添加6M氢氧化钾溶液将培养液的pH升高到9.6后,添加10g的钯活性碳(10%、和光纯药工业社制),之后添加氢氧化钾溶液将pH维持在9.6以上的同时,继续通气搅拌直至第144小时后,得到含有31.9g/L的酒石酸和15.9g/L的乙醇酸的反应液。若考虑到由于蒸发及添加氢氧化钾溶液所导致的液量变化,以及由于中途中取样所导致的液量减少份来进行计算,则由葡萄糖的酒石酸的摩尔收率为61%,由葡萄糖的乙醇酸的摩尔收率为60%。
实施例4
[酒石酸和乙醇酸的提取]
将上述实施例3中得到的反应液总量与发酵槽的洗液一起以5000转进行离心处理,分离菌体残渣、钯碳等不溶性馏分后,用约100mL的水洗涤一次,合并离心上清,由635mL的溶液进行纯化。通过HPLC分析确认,在所得到的溶液中含有13.1g的酒石酸和5.9g的乙醇酸。向上述所得到的该溶液中缓慢加入浓盐酸将pH降低至3.7后,生成沉淀,因此5℃下放置一晚后进行离心处理,分离为沉淀和上清。沉淀中含有酒石酸,上清中含有乙醇酸。
沉淀含有微细的钯碳、稍微灰色,但是通过HPLC分析确认,酒石酸的峰面积值占总面积值的94%。将该沉淀悬浮在水中,缓慢地加入氢氧化钾溶液进行溶解后,用1M盐酸缓慢地将pH降低至3.7进行重结晶,以白色粉末的形式得到酒石酸一钾14.1g。然后对于所提取的酒石酸,通过以下所述的酶学上的方法进行检测。作为标准物质,分别正确地称量L-酒石酸(シグマ·アルドリツチ社制)、D-酒石酸(シグマ·アルドリツチ社制)和内消旋酒石酸(シグマ·アルドリツチ社制),制备0、2.5、5、7.5mM溶液。向安装在样品侧的微量吸收池中加入20mM氯化锰、2mM二硫苏糖醇(和光纯药工业社制)、15mM氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+、オリエンタル酵母社制)、5单位的D-苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.83、メガザイム社制)、60mM甘氨酰甘氨酸缓冲液(用氢氧化钾将pH调整为9.0)以及上述制备的含有各浓度的L-酒石酸、D-酒石酸或内消旋酒石酸的混合液(总量150μL),此外向安装在对照侧的微量吸收池中加入150μL的水,使用UV2200分光光度计(岛津制作所社制)在340mm的波长下测定50分钟的吸光度的增加。结果,对于L-酒石酸,7.5mM的浓度下表现出3.75的吸光度的增加,将0、2.5、5、7.5mM溶液的各吸光度的增加作为纵轴,将L-酒石酸的浓度作为横轴进行绘图后可知,对于所有的L-酒石酸标准溶液,绘制在通过原点的直线上。与此相对地,对于D-酒石酸,所有浓度下完全未发现吸光度的增加,此外对于高浓度的内消旋酒石酸,发现吸光度稍微增加,但是若与L-酒石酸的吸光度的增加相比则为可以无视的程度的增加。因此,所提取的酒石酸认为为酒石酸一钾,正确地称量制备5mM的溶液,通过与上述相同的方法测定吸光度的增加。结果,吸光度的增加表现为2.45,由L-酒石酸的标准曲线判明,所得到的酒石酸为纯度99.7%的L-酒石酸。
将离心分离得到的含有乙醇酸的上清约630mL用5M氢氧化钠将pH调整为7.0后,通过1000mL的アンバ一ライトCG400阴离子交换树脂(甲酸型、ロ一ム·アンド·ハ一ス社制)的色谱柱。该色谱柱用1000mL的20mM甲酸钠溶液洗涤后,流通200mM甲酸钠溶液,将该洗脱液每10mL分馏。对分馏的馏分进行HPLC分析,收集具有表现出与乙醇酸标准液相同的保留时间的峰的馏分序号54~205的洗脱馏分。为了由该洗脱液除去钠离子等阳离子,通过2000mL的ダウエツクス50W×8阳离子交换树脂(OH-型)的色谱柱后,进一步用500mL的去离子水洗涤。将该非吸附馏分和洗液一起收集,用2mM氨溶液将pH调整为7.0后,将该中和溶液在35℃下减压浓缩除去甲酸铵。进一步在真空减压下干燥一晚,得到4.7g的乙醇酸铵的白色粉末。将该粉末的一部分溶解在水中,使LCMS-2010A液相色谱质量分析仪(岛津制作所社制)与デイスカバリ一HS F5、25cm×4.6mm色谱柱(スペルコ社制)连接,在含有0.1%甲酸的乙腈/0.1%甲酸水溶液的溶剂系统中,将含有0.1%甲酸的乙腈从0%直线性地增加至50%,以每1分钟0.3mL的流速流通28分钟,进行210nm的波长下的液相色谱、所检出的峰的紫外线吸收光谱及阴离子质谱、质量色谱测定。结果,在提取的物质中,用液相色谱在10.2分钟检出峰,该峰与标准品的乙醇酸的保留时间,紫外线吸收光谱,以m/z=75.05、121.05为特征的阴离子质谱,及它们的阴离子的质量色谱一致。结果鉴定所提取的物质为乙醇酸。
实施例5
[钯碳的再利用]
在含有1%的5-酮-D-葡萄糖酸钾盐的5mL的0.45M碳酸钠缓冲液(pH9.55)中添加40mg的钯碳,振荡9天。结果生成4g/L的L-酒石酸和1g/L的乙醇酸,残留0.7g/L的5-酮-D-葡萄糖酸。将该3.5mL的反应液离心而回收钯碳,加入0.5M的相同碳酸钠缓冲液3.15mL和0.10%的5-酮-D-葡萄糖酸钾35mL,振荡7天后,生成5g/L的L-酒石酸和1.2g/L的乙醇酸,残留2.1g/L的5-酮-D-葡萄糖酸。
实施例6
[pH对由5-酮-D-葡萄糖酸生成L-酒石酸和乙醇酸的影响]
在含有1%的5-酮-D-葡萄糖酸的pH 6、7、8或9的450mM的磷酸钾缓冲液或pH 9、10、11或11.5的碳酸钠缓冲液中,添加或不添加钯碳(10%)的条件下,对酒石酸和乙醇酸的生成进行研究。反应在带硅氧烷塞的10mL容量试验管中以1.5mL的液量进行,28℃下以250rpm往复振荡2天后测定pH,定量生成的酒石酸和乙醇酸。结果如以下的表1所示,由于难以维持反应中的pH,认为在酒石酸及乙醇酸的生成中pH为8~11是合适的。特别是在pH为9~10时,发现显著的生产。此外可知,在任意一种pH下,若添加钯碳,则酒石酸及乙醇酸的生产性显著提高。
[表1]
磷酸缓冲液
碳酸钠缓冲液
单位(g/L)
实施例7
[温度对由5-酮-D-葡萄糖酸生成L-酒石酸和乙醇酸的影响]
在含有1%的5-酮-D-葡萄糖酸的450mM碳酸钠缓冲液(pH 9.55)中,添加或不添加钯碳(10%)的条件下,对30℃、40℃、50℃、60℃下的酒石酸和乙醇酸的生成进行研究。反应在带硅氧烷塞的30mL烧瓶中以3mL的液量,在各温度下以80转往复振荡2天来进行,对得到的反应液分析的结果如以下的表2所示,从30℃到60℃,特别是从30℃到40℃,发现酒石酸及乙醇酸的良好的生产。此外可知,在任意一种温度下,若添加钯碳,则酒石酸及乙醇酸的生产性显著提高。
[表2]
单位(g/L)
实施例8
[由5-酮-D-葡萄糖酸生成L-酒石酸及乙醇酸中可使用的催化剂的研究]
在含有1%的5-酮-D-葡萄糖酸的450mM碳酸钠缓冲液(pH 9.55)中加入后述的表3记载的催化剂,对酒石酸及乙醇酸的生成进行研究。反应在带硅氧烷塞的30mL烧瓶中以5mL的液量,在24℃下往复振荡2天来进行。对所得到的反应液分析的结果如以下的表3所示。所研究的任意一种催化剂对于酒石酸及乙醇酸的生产性的提高都是有效的,但是特别是钯、铑和锰优异。
[表3]
所添加的金属催化剂 | 酒石酸 | 乙醇酸 |
10g/L钯碳(10%) | 1.14 | 0.57 |
20g/L钯氧化铝(5%) | 0.93 | 0.49 |
1.75g/L氯化钯 | 0.74 | 0.39 |
10g/L铑碳(5%) | 1.04 | 0.50 |
2g/L二氧化锰 | 0.91 | 0.44 |
0.5g/L硫酸铁 | 0.68 | 0.34 |
无 | 0.52 | 0.25 |
单位(g/L)
[在由5-酮-D-葡萄糖酸生成L-酒石酸及乙醇酸中表现出催化剂效果的过渡金属的研究]
在含有10%的5-酮-D-葡萄糖酸的500mM碳酸钾缓冲液(pH 10.0)中分别加入后述的表4记载的过渡金属催化剂,对酒石酸及乙醇酸的生成进行研究。反应在带聚氨酯塞的含有2mL的反应液的大试验管(直径21mm、长度200mm)中28℃下以250转/分钟往复振荡来进行。第19小时添加3M碳酸钾溶液0.5mL,将反应液的pH维持在9.5左右。对从反应开始第3天的反应液分析的结果如以下的表4所示。所研究的任意一种催化剂对于酒石酸及乙醇酸的生产性的提高都是有效的。所使用的催化剂中,硫酸铜(II)5水合物、钒酸铵特别优异。
[表4]
所添加的金属催化剂 | 酒石酸 | 乙醇酸 |
0.4g/L硫酸铜(II)5水合物 | 35.6 | 14.6 |
0.4g/L硝酸钴(II)6水合物 | 10.5 | 4.24 |
0.4g/L钒酸(V)铵 | 19.1 | 7.66 |
0.4g/L硫酸镍(II)6水合物 | 9.05 | 3.68 |
0.4g/L硫酸锌7水合物 | 8.91 | 3.60 |
无 | 5.81 | 2.34 |
单位(g/L)
[利用铜或钒催化剂的由5-酮-D-葡萄糖酸生成L-酒石酸及乙醇酸中的这些催化剂的最优浓度的研究]
在含有10%的5-酮-D-葡萄糖酸的500mM碳酸钾缓冲液(pH 10.0)中加入后述的表5记载的浓度的硫酸铜(II)6水合物或钒酸铵,对酒石酸及乙醇酸的生成进行研究。以无过渡金属盐作为对照区,反应在带聚氨酯塞的含有5mL的反应液的100ml烧瓶中28℃下以每分钟250转旋转振荡来进行。从反应开始第19小时添加3M碳酸钾溶液0.5mL,将反应液的pH维持在9.5左右。对所得到的反应液分析的结果如以下的表5所示。在0.075g/L浓度的硫酸铜(II)6水合物下或0.2g/L浓度的钒酸铵下,酒石酸、乙醇酸的生成量达到最大,任意一种催化剂在更高的浓度下,酒石酸、乙醇酸的生成量大致相同。
[表5]
1):振荡4天、2)振荡3天 单位(g/L)
[在由5-酮-D-葡萄糖酸生成L-酒石酸及乙醇酸中通过并用钯碳和钒酸实现的催化剂效果的研究]
在含有10%的5-酮-D-葡萄糖酸的500mM碳酸钾缓冲液(pH 10.0)中加入后述的表6记载的浓度的10%钯碳和钒酸铵,对酒石酸及乙醇酸的生成进行研究。以单独的钯碳或单独的各浓度的钒酸铵作为对照区。反应在带聚氨酯塞的含有5mL的反应液的100ml烧瓶中28℃下以每分钟250转旋转振荡来进行。从反应开始第19小时添加3M碳酸钾溶液0.5mL,将反应液的pH维持在9.5左右。分析第3天的反应液的结果如以下的表6所示。使用0.2g/L的10%钯碳和0.2、0.4或0.8g/L的钒酸铵作为混合催化剂的反应液,与单独使用0.2g/L的10%钯碳或单独使用0.2、0.4或0.8g/L的钒酸铵的反应液相比,L-酒石酸、乙醇酸的生成量显著增加,它们的生产性显著提高。
[表6]
所添加的催化剂的浓度(g/L) | 酒石酸 | 乙醇酸 |
10g/L钯碳+0.2g/L钒酸铵 | 45.0 | 20.8 |
10g/L钯碳+0.4g/L钒酸铵 | 49.4 | 22.7 |
10g/L钯碳+0.8g/L钒酸铵 | 50.4 | 23.3 |
10g/L钯碳 | 35.5 | 16.5 |
0.2g/L钒酸铵 | 30.3 | 14.1 |
0.4g/L钒酸铵 | 29.9 | 14.0 |
0.8g/L钒酸铵 | 30.3 | 13.9 |
单位(g/L)
[比较例1]
[由葡萄糖制备酒石酸及乙醇酸的方法(由5-酮-D-葡萄糖酸在1M氢氧化钾存在下反应]
向与实施例2同样地使用氧化葡糖杆菌TADK-267得到的含有67.3g/L的5-酮-D-葡萄糖酸的培养液约430mL中,以约30mL的水溶液的形式加入24g的氢氧化钾,使溶液的氢氧化钾终浓度为1M。此时的pH为13.7。然后继续通气搅拌后,第55小时生成3.1g/L的酒石酸及1.5g/L的乙醇酸,残留微量的5-酮-D-葡萄糖酸。此外,反应直至第144小时,但是酒石酸为3.6g/L、乙醇酸为1.7g/L,若考虑到由于蒸发及由于中途中取样所导致的减少份来进行计算,则由葡萄糖的酒石酸的摩尔收率为6.6%,由葡萄糖的乙醇酸的摩尔收率为6.2%。即,pH为12以上时,酒石酸及乙醇酸的收率显著低。
工业实用性
根据本发明,可以由葡萄糖非常有效且低成本地制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐。因此,本发明的制备方法,可以用于工业上的制备中,实用性极高。因此,在使用L-酒石酸、乙醇酸等的产业领域例如食品领域、工业领域、药品领域中特别有用。
Claims (16)
1.一种具有以下的工序A~C、由葡萄糖制备L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的方法,
(A)通过将由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物,在能够使5-酮-D-葡萄糖酸形成水溶性盐的碱的存在下,用含有葡萄糖的培养液培养,得到含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的工序A;
(B)通过将工序A中得到的含有5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐的培养液的pH调整并维持在7~12的范围内,得到5-酮-D-葡萄糖酸的水溶性盐转换为L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的反应液的工序B;
(C)由工序B中得到的反应液,提取L-酒石酸或其盐、和/或乙醇酸或其盐的工序C。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,使用在所述工序B中的培养液中进一步含有过渡金属催化剂的培养液。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,过渡金属催化剂为选自由钯、铑、钌、铂、锰、铜、钴、镍、锌、钒和铁组成的组中的1种或2种以上的过渡金属催化剂。
4.如权利要求2或3所述的方法,其特征在于,过渡金属催化剂的浓度为0.00002~2%。
5.如权利要求2~4中任意一项所述的方法,其特征在于,过渡金属催化剂的浓度为0.0001~1%。
6.如权利要求1~5中任意一项所述的方法,其特征在于,由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的微生物为属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物为选自由氧化葡糖杆菌NBRC 3172及氧化葡糖杆菌NBRC3255、巴氏葡糖杆菌NBRC 3225、微白葡糖杆菌NBRC 3250、氧化葡糖杆菌亚氧化亚种NBRC 3254、グルコノバクタ一·インダストリアスNBRC 3260、蜡状葡糖杆菌NBRC 3267、グルコノバクタ一·ジオキシアセトニカスNBRC 3273、グルコノバクタ一·モノオキシグルコニカスNBRC 3276、グルコノバクタ一·グルコニカスNBRC 3285、グルコノバクタ一·ロゼウスNBRC 3990、グルコノバクタ一·フラトイリNBRC 3265、醋酸杆菌NBRC 3259以及它们的变异菌株的由葡萄糖生产5-酮-D-葡萄糖酸的菌株组成的组中的任意1种或2种以上的微生物。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,属于葡糖杆菌属或醋酸杆菌属的微生物进一步为2-酮-D-葡萄糖酸低生产性和/或5-酮-D-葡萄糖酸低消耗性的菌株。
9.如权利要求1~8中任意一项所述的方法,其特征在于,将所述工序B中的培养液的pH调整并维持在8~11的范围内。
10.如权利要求1~9中任意一项所述的方法,其特征在于,将所述工序B中的培养液pH调整并维持在9~10的范围内。
11.如权利要求1~10中任意一项所述的方法,其特征在于,所述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将培养液的温度调整并维持在0℃~70℃的范围内。
12.如权利要求1~11中任意一项所述的方法,其特征在于,所述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将培养液的温度调整并维持在20℃~60℃的范围内。
13.如权利要求1~12中任意一项所述的方法,其特征在于,所述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将空气供给量与培养液的比率调整并维持在0.2~5的范围内。
14.如权利要求1~13中任意一项所述的方法,其特征在于,所述工序B中,调整并维持培养液的pH时,进一步将空气供给量与培养液的比率调整并维持在0.5~3的范围内。
15.如权利要求1~14中任意一项所述的方法,其特征在于,工序C中提取的L-酒石酸的盐为L-酒石酸的一钾盐。
16.如权利要求1~15中任意一项所述的方法,其特征在于,工序C中提取的乙醇酸或其盐,为乙醇酸的游离酸或其盐。
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