JP2579588B2 - 新規微生物及び該微生物を用いた２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法 - Google Patents
新規微生物及び該微生物を用いた２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はスフィンゴモナス属に属
する新規微生物及び該微生物の休止菌体又は菌体由来の
酵素を用いて２，６−ジメチルナフタレンを酸化し、
２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する方法に関す
る。
する新規微生物及び該微生物の休止菌体又は菌体由来の
酵素を用いて２，６−ジメチルナフタレンを酸化し、
２，６−ナフタレンジカルボン酸を製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】２，６−ナフタレンジカルボン酸あるい
は、そのエステル誘導体は高機能性樹脂原料、液晶原
料、ポリアミド系医薬品原料、染料顔料用として有用な
化合物であり、現在数種の化学合成法により生産されて
いる。特にポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）樹脂と
しての用途は、８０〜９０％とも言われており、現在の
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂に比べ、耐
熱温度で約３５℃、破断強度も約２５％高い他、二次転
移点、結晶化速度、軟化点、溶融粘度等に対し、優れた
性能を有するものとして大量生産化が期待されている。
しかしながら、２，６−ジメチルナフタレンを原料とし
た化学合成法は、高温反応であるため官能基の転移が起
こり易く、純度の高い２，６−ナフタレンジカルボン酸
が得られにくい上、高温高圧条件を必要とし、大量のエ
ネルギーを消費することや環境汚染等の問題点もあっ
た。
は、そのエステル誘導体は高機能性樹脂原料、液晶原
料、ポリアミド系医薬品原料、染料顔料用として有用な
化合物であり、現在数種の化学合成法により生産されて
いる。特にポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）樹脂と
しての用途は、８０〜９０％とも言われており、現在の
ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）樹脂に比べ、耐
熱温度で約３５℃、破断強度も約２５％高い他、二次転
移点、結晶化速度、軟化点、溶融粘度等に対し、優れた
性能を有するものとして大量生産化が期待されている。
しかしながら、２，６−ジメチルナフタレンを原料とし
た化学合成法は、高温反応であるため官能基の転移が起
こり易く、純度の高い２，６−ナフタレンジカルボン酸
が得られにくい上、高温高圧条件を必要とし、大量のエ
ネルギーを消費することや環境汚染等の問題点もあっ
た。
【０００３】これらの問題点を解決する方法として、近
年、微生物を用いた微生物酸化法の研究が進められてい
る。微生物を触媒とする酸化法は、常温常圧で反応させ
ることができる上、官能基の転移が起こらないため副産
物の生成がほとんど無いという優れた特徴を有してい
る。しかし、これまでの報告では、フラボバクテリウ
ム属等の微生物を用いて、２，６−ジメチルナフタレン
を酸化しても、一方のメチル基しか酸化されず、２，６
−ナフタレンジカルボン酸は検出されなかった（Ｅ．
Ａ．ＢＡＲＮＳＬＥＹ ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮ
ＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
５４，４２８〜４３３，１９８８）。
年、微生物を用いた微生物酸化法の研究が進められてい
る。微生物を触媒とする酸化法は、常温常圧で反応させ
ることができる上、官能基の転移が起こらないため副産
物の生成がほとんど無いという優れた特徴を有してい
る。しかし、これまでの報告では、フラボバクテリウ
ム属等の微生物を用いて、２，６−ジメチルナフタレン
を酸化しても、一方のメチル基しか酸化されず、２，６
−ナフタレンジカルボン酸は検出されなかった（Ｅ．
Ａ．ＢＡＲＮＳＬＥＹ ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮ
ＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ
５４，４２８〜４３３，１９８８）。
【０００４】又、ノカルディア属細菌により、糖質と
の共酸化による２，６−ナフタレンジカルボン酸の確認
の報告（Ｇ．Ｋ．ＳＫＲＹＡＢＩＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｄ
ＯＫＬ．ＡＫＡＤ．ＮＡＵＫ．ＵＳＳＲ ２０２，９７
３〜９７４，１９７２）があるが、収量が低く定性的な
研究にとどまっているというものであった。
の共酸化による２，６−ナフタレンジカルボン酸の確認
の報告（Ｇ．Ｋ．ＳＫＲＹＡＢＩＮ，ｅｔ ａｌ．，Ｄ
ＯＫＬ．ＡＫＡＤ．ＮＡＵＫ．ＵＳＳＲ ２０２，９７
３〜９７４，１９７２）があるが、収量が低く定性的な
研究にとどまっているというものであった。
【０００５】更に最近では、シュードモナス属細菌を
用いて発酵法による２，６−ナフタレンジカルボン酸の
製造法（特開平３−８００９１号公報）や、アルキル
ナフタレン化合物のアルキル基に対して酸化力を有する
微生物を利用した、ナフタレンカルボン酸の製造法（特
開平５−１５３６５号公報）が提案されている。
用いて発酵法による２，６−ナフタレンジカルボン酸の
製造法（特開平３−８００９１号公報）や、アルキル
ナフタレン化合物のアルキル基に対して酸化力を有する
微生物を利用した、ナフタレンカルボン酸の製造法（特
開平５−１５３６５号公報）が提案されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、前記、の
方法は省エネルギー、環境保全型の生産法としては、好
ましいものであるが、生産を行なう培養条件は水系であ
り、しかも変換基質としての２，６−ジメチルナフタレ
ンは水に不溶性で、いわゆる固−液反応系であるため変
換基質の供給量に限界が生じ、かつ供給量の制御も困難
で効率的な連続的大量生産化の点において、まだ問題を
内包している。
方法は省エネルギー、環境保全型の生産法としては、好
ましいものであるが、生産を行なう培養条件は水系であ
り、しかも変換基質としての２，６−ジメチルナフタレ
ンは水に不溶性で、いわゆる固−液反応系であるため変
換基質の供給量に限界が生じ、かつ供給量の制御も困難
で効率的な連続的大量生産化の点において、まだ問題を
内包している。
【０００７】そこで、２，６−ジメチルナフタレンの両
メチル基末端酸化能を有し、かつ有機溶媒系において
も、生育もしくは反応可能であり、かつ酸化反応が阻害
されることのない微生物を見出し、このような微生物へ
２，６−ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒を供給
することができれば、液−液反応系により連続的に２，
６−ナフタレンジカルボン酸への大量変換も可能とな
り、石油産業及び石油化学産業にとって有用性も大きい
ことから、この様な反応系で使用し得る菌と製造法の確
立が望まれていた。
メチル基末端酸化能を有し、かつ有機溶媒系において
も、生育もしくは反応可能であり、かつ酸化反応が阻害
されることのない微生物を見出し、このような微生物へ
２，６−ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒を供給
することができれば、液−液反応系により連続的に２，
６−ナフタレンジカルボン酸への大量変換も可能とな
り、石油産業及び石油化学産業にとって有用性も大きい
ことから、この様な反応系で使用し得る菌と製造法の確
立が望まれていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】かかる状況において、本
発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討を重ね、有
効な菌株のスクリーニング法の開発とそれによる効率的
な微生物の探索を実施した結果、有機溶媒に溶解した
２，６−ジメチルナフタレンの両側のメチル基を効率良
く酸化可能な新規微生物を見出し、液−液反応系による
製造法を初めて可能にし本発明をなすに至った。
発明者らは前記課題を解決すべく、鋭意検討を重ね、有
効な菌株のスクリーニング法の開発とそれによる効率的
な微生物の探索を実施した結果、有機溶媒に溶解した
２，６−ジメチルナフタレンの両側のメチル基を効率良
く酸化可能な新規微生物を見出し、液−液反応系による
製造法を初めて可能にし本発明をなすに至った。
【０００９】すなわち本発明は、スフィンゴモナス属に
属し、有機溶媒に溶解した２，６−ジメチルナフタレン
からの２，６−ナフタレンジカルボン酸生成菌を、２，
６−ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒と培地から
なる液−液系、つまりは有機溶媒系で、培養し変換する
ことを特徴とする２，６−ナフタレンジカルボン酸の製
造方法、及び２，６−ナフタレンジカルボン酸生成菌の
固定化菌体もしくは菌体由来の酵素を有機溶媒に溶解し
た２，６−ジメチルナフタレンと、有機溶媒系で接触さ
せて変換することを特徴とする２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸の製造法を提供するものである。
属し、有機溶媒に溶解した２，６−ジメチルナフタレン
からの２，６−ナフタレンジカルボン酸生成菌を、２，
６−ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒と培地から
なる液−液系、つまりは有機溶媒系で、培養し変換する
ことを特徴とする２，６−ナフタレンジカルボン酸の製
造方法、及び２，６−ナフタレンジカルボン酸生成菌の
固定化菌体もしくは菌体由来の酵素を有機溶媒に溶解し
た２，６−ジメチルナフタレンと、有機溶媒系で接触さ
せて変換することを特徴とする２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸の製造法を提供するものである。
【００１０】本発明の新規微生物は、炭素源として２，
６−ジメチルナフタレンのみを添加した培地にて生育
し、かつ２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産する能
力の有無をもって、あるいは有機溶媒に２，６−ジメチ
ルナフタレンのみを溶解したものと、培地からなる有機
溶媒系培養により生育し、かつ２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸生産能の有無をもってスクリーニングすること
により分離することができる。
６−ジメチルナフタレンのみを添加した培地にて生育
し、かつ２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産する能
力の有無をもって、あるいは有機溶媒に２，６−ジメチ
ルナフタレンのみを溶解したものと、培地からなる有機
溶媒系培養により生育し、かつ２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸生産能の有無をもってスクリーニングすること
により分離することができる。
【００１１】発明者らが全国各地から集めた土壌につい
て、微生物の増殖に必要な成分のうち、炭素源を含まな
い培地（以下、培地という）を試験管等に分注し、これ
を滅菌したのち土壌を添加し、さらに２，６−ジメチル
ナフタレンあるいは２，６−ジメチルナフタレンを溶解
した有機溶媒、例えばデカリンを加え、試験管振とう機
等により培養を行う。この培養液を、別の試験管等に予
め分注しておいた同様の培地に白金耳等を用いて植え継
ぎした後、２，６−ジメチルナフタレンを添加し、試験
管振とう機等によりさらに培養する。培養後の培養液
を、上記培地もしくは滅菌水等で希釈し、炭素源を含ま
ない寒天培地等に塗布した後、２，６−ジメチルナフタ
レンを供給してさらに培養する。培養によって得られた
コロニーを単離し、それぞれの菌株について２，６−ナ
フタレンジカルボン酸の生産能力を確認することによ
り、２，６−ナフタレンジカルボン酸生成菌を選抜する
ことができる。
て、微生物の増殖に必要な成分のうち、炭素源を含まな
い培地（以下、培地という）を試験管等に分注し、これ
を滅菌したのち土壌を添加し、さらに２，６−ジメチル
ナフタレンあるいは２，６−ジメチルナフタレンを溶解
した有機溶媒、例えばデカリンを加え、試験管振とう機
等により培養を行う。この培養液を、別の試験管等に予
め分注しておいた同様の培地に白金耳等を用いて植え継
ぎした後、２，６−ジメチルナフタレンを添加し、試験
管振とう機等によりさらに培養する。培養後の培養液
を、上記培地もしくは滅菌水等で希釈し、炭素源を含ま
ない寒天培地等に塗布した後、２，６−ジメチルナフタ
レンを供給してさらに培養する。培養によって得られた
コロニーを単離し、それぞれの菌株について２，６−ナ
フタレンジカルボン酸の生産能力を確認することによ
り、２，６−ナフタレンジカルボン酸生成菌を選抜する
ことができる。
【００１２】これらの菌を培養する培地として、炭素源
以外は一般的な培地成分を使用することができる。すな
わち、窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、燐
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、尿素等を、無機塩類としては、例えばカリウム、
ナトリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシ
ウム等の各塩類等を使用できる。又、前記培養条件は、
一般に微生物が死滅しない培養条件であれば良く、例え
ばｐＨ約５〜９、温度約２０〜４０℃で好気的に行われ
る。
以外は一般的な培地成分を使用することができる。すな
わち、窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、燐
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリ
ウム、尿素等を、無機塩類としては、例えばカリウム、
ナトリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カルシ
ウム等の各塩類等を使用できる。又、前記培養条件は、
一般に微生物が死滅しない培養条件であれば良く、例え
ばｐＨ約５〜９、温度約２０〜４０℃で好気的に行われ
る。
【００１３】得られた菌株の２，６−ナフタレンジカル
ボン酸の生産能力の確認は、それぞれの菌株を炭素源と
して２，６−ジメチルナフタレンを添加した培地中で、
上記と同様の条件で培養した培養液を遠心分離等で分離
した後、上清を適当な分析手法、例えば高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー
（ＧＣ）、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、赤外線吸
収スペクトル（ＩＲ）、紫外線吸収スペクトル（ＵＶ）
等を用いて分析すれば良い。得られた微生物は、腸内細
菌以外の非醗酵菌同定用ＡＰＩ２０ＮＥ（ビオメリュー
社）を用いて試験した結果、以下の表１に示す菌学的性
質を有するものであった。
ボン酸の生産能力の確認は、それぞれの菌株を炭素源と
して２，６−ジメチルナフタレンを添加した培地中で、
上記と同様の条件で培養した培養液を遠心分離等で分離
した後、上清を適当な分析手法、例えば高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー
（ＧＣ）、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、赤外線吸
収スペクトル（ＩＲ）、紫外線吸収スペクトル（ＵＶ）
等を用いて分析すれば良い。得られた微生物は、腸内細
菌以外の非醗酵菌同定用ＡＰＩ２０ＮＥ（ビオメリュー
社）を用いて試験した結果、以下の表１に示す菌学的性
質を有するものであった。
【００１４】
【表１】
【００１５】表１で示された菌学的性質を、ＢＥＲＧＥ
Ｙ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ
ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．１，Ｐ１９８（１
９８４）、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡ
Ｌ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ
ＯＧＹ，ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．３，Ｐ３２０〜３２１
（１９９０）、ＡＰＩ２０ＮＥプロファイルインデック
スにて分類すると、スフィンゴモナス パウチモビリス
に属するものと認められた。
Ｙ’Ｓ ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ
ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｌ．１，Ｐ１９８（１
９８４）、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＪＯＵＲＮＡ
Ｌ ＯＦ ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ
ＯＧＹ，ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．３，Ｐ３２０〜３２１
（１９９０）、ＡＰＩ２０ＮＥプロファイルインデック
スにて分類すると、スフィンゴモナス パウチモビリス
に属するものと認められた。
【００１６】本菌は２，６−ジメチルナフタレンを単一
炭素源として、有機溶媒系でも生育可能であり、かつ培
地中に２，６−ナフタレンジカルボン酸を蓄積する。こ
のような特性を有した２，６−ナフタレンジカルボン酸
生産菌は、未だ報告されていない。
炭素源として、有機溶媒系でも生育可能であり、かつ培
地中に２，６−ナフタレンジカルボン酸を蓄積する。こ
のような特性を有した２，６−ナフタレンジカルボン酸
生産菌は、未だ報告されていない。
【００１７】以上の菌学的性質より本発明者らは、本菌
はスフィンゴモナス パウチモビリスに属する新菌株で
あると判定し、本菌をスフィンゴモナス パウチモビリ
スＡ−７（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏ
ｂｉｌｉｓ Ａ−７）株と命名し、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した〔ＦＥＲＭ Ｐ−１３６３
２〕。
はスフィンゴモナス パウチモビリスに属する新菌株で
あると判定し、本菌をスフィンゴモナス パウチモビリ
スＡ−７（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏ
ｂｉｌｉｓ Ａ−７）株と命名し、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した〔ＦＥＲＭ Ｐ−１３６３
２〕。
【００１８】本発明の微生物は、スフィンゴモナス パ
ウチモビリスに属する、２，６−位のメチル基の酸化能
を有する微生物の他に、当該微生物に例えばＸ線・紫外
線照射、エチルメタンスルホン酸などの変異剤による処
理等の、公知の変異処理を施した、いわゆる変異株の使
用や、遺伝子操作等による育種株の使用も包含するもの
である。
ウチモビリスに属する、２，６−位のメチル基の酸化能
を有する微生物の他に、当該微生物に例えばＸ線・紫外
線照射、エチルメタンスルホン酸などの変異剤による処
理等の、公知の変異処理を施した、いわゆる変異株の使
用や、遺伝子操作等による育種株の使用も包含するもの
である。
【００１９】次に、本発明による２，６−ナフタレンジ
カルボン酸の製造方法を、スフィンゴモナス パウチモ
ビリス Ａ−７株（以下、本菌という）を用いた場合を
一例に説明する。
カルボン酸の製造方法を、スフィンゴモナス パウチモ
ビリス Ａ−７株（以下、本菌という）を用いた場合を
一例に説明する。
【００２０】本菌を培養する場合の培地成分としては、
炭素源及び変換基質として２，６−ジメチルナフタレン
を含有すること以外は、本菌の生育が良好であれば他の
培地成分は特に制限されない。すなわち、生育基質とし
て、窒素源では、例えばアンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナ
トリウム、尿素等を、無機塩類としては、例えばカリウ
ム、ナトリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カ
ルシウム、コバルト等の各塩類等が使用できる。又、炭
素源としては、２，６−ジメチルナフタレン以外に、サ
リチル酸、２−メチルナフタレン、アントラセン、グル
コース、フラクトース、デンプン等を補助基質として添
加することも可能である。
炭素源及び変換基質として２，６−ジメチルナフタレン
を含有すること以外は、本菌の生育が良好であれば他の
培地成分は特に制限されない。すなわち、生育基質とし
て、窒素源では、例えばアンモニア、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナ
トリウム、尿素等を、無機塩類としては、例えばカリウ
ム、ナトリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カ
ルシウム、コバルト等の各塩類等が使用できる。又、炭
素源としては、２，６−ジメチルナフタレン以外に、サ
リチル酸、２−メチルナフタレン、アントラセン、グル
コース、フラクトース、デンプン等を補助基質として添
加することも可能である。
【００２１】有機溶媒系培養で用いる２，６−ジメチル
ナフタレンを溶解する溶媒としては、例えば、ヘプタ
ン、ｎ−オクタン、イソオクタン、シクロオクタン、ノ
ナン、デカン、ドデカン、テトラリン、デカリン、ヘキ
シルエーテル、等が使用できるが、数日間の培養で揮発
減少せず、又、雑菌の繁殖を抑制する意味から微生物毒
性が強すぎず、また弱すぎないもので、かつ、２，６−
ジメチルナフタレンを溶解し資化されないものであれ
ば、上記以外の溶媒も使用することができる。そして、
これらの内のいづれか１種、又は２種以上を任意に混合
し使用しても良い。
ナフタレンを溶解する溶媒としては、例えば、ヘプタ
ン、ｎ−オクタン、イソオクタン、シクロオクタン、ノ
ナン、デカン、ドデカン、テトラリン、デカリン、ヘキ
シルエーテル、等が使用できるが、数日間の培養で揮発
減少せず、又、雑菌の繁殖を抑制する意味から微生物毒
性が強すぎず、また弱すぎないもので、かつ、２，６−
ジメチルナフタレンを溶解し資化されないものであれ
ば、上記以外の溶媒も使用することができる。そして、
これらの内のいづれか１種、又は２種以上を任意に混合
し使用しても良い。
【００２２】本発明のように、溶媒に２，６−ジメチル
ナフタレンを溶解して供給する方法は、従来の水系培地
に直接２，６−ジメチルナフタレンを供給する、固−液
反応方法に比べ、変換基質の分散性を極めて良好にする
ため菌体との接触が容易になり、溶媒中の変換基質は均
一状態にし易いことから、その供給量を容易に制御する
ことができ、培地のみならず溶媒中の変換基質を効率良
く連続的に、又は間欠的に、自在に供給できるので、連
続式反応が可能となり、２，６−ナフタレンジカルボン
酸の生産効率をより高めることができる。又、本菌では
従来法のように２，６−ジメチルナフタレンを溶剤に溶
解せずに、直接供給しても２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸を製造することができるが、当然その生産効率は劣
るものとなる。
ナフタレンを溶解して供給する方法は、従来の水系培地
に直接２，６−ジメチルナフタレンを供給する、固−液
反応方法に比べ、変換基質の分散性を極めて良好にする
ため菌体との接触が容易になり、溶媒中の変換基質は均
一状態にし易いことから、その供給量を容易に制御する
ことができ、培地のみならず溶媒中の変換基質を効率良
く連続的に、又は間欠的に、自在に供給できるので、連
続式反応が可能となり、２，６−ナフタレンジカルボン
酸の生産効率をより高めることができる。又、本菌では
従来法のように２，６−ジメチルナフタレンを溶剤に溶
解せずに、直接供給しても２，６−ナフタレンジカルボ
ン酸を製造することができるが、当然その生産効率は劣
るものとなる。
【００２３】培養条件は、本菌が死滅せず増殖可能であ
れば良く、例えば培養温度は約１５〜３７℃、より好ま
しくは約２５〜３５℃、培地のｐＨは約４．２〜８．
９、より好ましくは６．０〜８．０の範囲で、約１〜３
０日間好気的に培養又は反応させるのが好ましい。
れば良く、例えば培養温度は約１５〜３７℃、より好ま
しくは約２５〜３５℃、培地のｐＨは約４．２〜８．
９、より好ましくは６．０〜８．０の範囲で、約１〜３
０日間好気的に培養又は反応させるのが好ましい。
【００２４】２，６−ジメチルナフタレンを単一炭素源
もしくは変換基質として、本菌を培養し、目的とする
２，６−ナフタレンジカルボン酸を効率よく生産するた
めには、２，６−ジメチルナフタレンを、少なくとも本
菌が生育するのに必要な量以上を添加することが必要で
ある。本菌は、２，６−ジメチルナフタレンによって阻
害を大きく受け難いため、これを多量に添加することが
可能であるが、生成する２，６−ナフタレンジカルボン
酸の量が増加してくると培地のｐＨが低下するので、水
酸化ナトリウム、アンモニア水、水酸化カリウム等のア
ルカリ溶液を供給したり、緩衝能を有する成分を供給す
るか、あるいは予め培地に用いる等してｐＨを適性な範
囲に調整すれば、より効率良い生産ができる。更に上記
の条件で菌体を予め培養増殖して集菌後、これを以下に
述べる方法に供しても良い。
もしくは変換基質として、本菌を培養し、目的とする
２，６−ナフタレンジカルボン酸を効率よく生産するた
めには、２，６−ジメチルナフタレンを、少なくとも本
菌が生育するのに必要な量以上を添加することが必要で
ある。本菌は、２，６−ジメチルナフタレンによって阻
害を大きく受け難いため、これを多量に添加することが
可能であるが、生成する２，６−ナフタレンジカルボン
酸の量が増加してくると培地のｐＨが低下するので、水
酸化ナトリウム、アンモニア水、水酸化カリウム等のア
ルカリ溶液を供給したり、緩衝能を有する成分を供給す
るか、あるいは予め培地に用いる等してｐＨを適性な範
囲に調整すれば、より効率良い生産ができる。更に上記
の条件で菌体を予め培養増殖して集菌後、これを以下に
述べる方法に供しても良い。
【００２５】本菌を用いて、２，６−ジメチルナフタレ
ンから２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産する工程
はバッチ式でも良く、バイオリアクター等を用いても可
能である。また、本菌の菌体、その処理物または酵素
を、例えばアルギン酸カルシウム、ポリアクリルアミド
法、ポリウレタン樹脂法、光架橋性樹脂法等を用いて通
常の固定化法に従って固定化することもできる。得られ
た菌体培養物は、そのまま酵素源として使用することが
できるが、遠心分離等の操作により固液分離して得た微
生物菌体を用いることが好ましい。さらに微生物菌体を
燐酸緩衝液等の溶液で洗浄し、該溶液に懸濁して使用す
ることもできる。又、菌体由来の酵素は、常法により精
製することができ、これらの休止菌体、菌体処理物ある
いは酵素を用いて生産する場合は、前記培養条件下で行
なうことができる。培養液又は反応液中の２，６−ナフ
タレンジカルボン酸は常法に従い精製すれば良い。すな
わち、培養液又は反応液をろ過、遠心分離等により処理
した後、得られた溶液に塩酸や硫酸等の酸溶液を加えて
酸性化することにより、２，６−ナフタレンジカルボン
酸を回収することができる。また、溶剤抽出等の方法に
より回収することも可能であり、クロマトグラフィー等
公知の精製方法を適宜併用することができる。
ンから２，６−ナフタレンジカルボン酸を生産する工程
はバッチ式でも良く、バイオリアクター等を用いても可
能である。また、本菌の菌体、その処理物または酵素
を、例えばアルギン酸カルシウム、ポリアクリルアミド
法、ポリウレタン樹脂法、光架橋性樹脂法等を用いて通
常の固定化法に従って固定化することもできる。得られ
た菌体培養物は、そのまま酵素源として使用することが
できるが、遠心分離等の操作により固液分離して得た微
生物菌体を用いることが好ましい。さらに微生物菌体を
燐酸緩衝液等の溶液で洗浄し、該溶液に懸濁して使用す
ることもできる。又、菌体由来の酵素は、常法により精
製することができ、これらの休止菌体、菌体処理物ある
いは酵素を用いて生産する場合は、前記培養条件下で行
なうことができる。培養液又は反応液中の２，６−ナフ
タレンジカルボン酸は常法に従い精製すれば良い。すな
わち、培養液又は反応液をろ過、遠心分離等により処理
した後、得られた溶液に塩酸や硫酸等の酸溶液を加えて
酸性化することにより、２，６−ナフタレンジカルボン
酸を回収することができる。また、溶剤抽出等の方法に
より回収することも可能であり、クロマトグラフィー等
公知の精製方法を適宜併用することができる。
【００２６】本発明の製造方法は、有機溶媒に溶解した
２，６−ジメチルナフタレンの両側のメチル基を効率良
く酸化可能な微生物を、見出したことで初めて可能とな
ったものである。
２，６−ジメチルナフタレンの両側のメチル基を効率良
く酸化可能な微生物を、見出したことで初めて可能とな
ったものである。
【００２７】
【実施例】以下、実施例及び比較例を挙げ、本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
らに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものではない。
【００２８】
【実施例１】２，６−ジメチルナフタレンから２，６−
ナフタレンジカルボン酸を生産する菌を分離するため
に、脱イオン水で溶解した表２に示す成分の培地を用い
てスクリーニングを行った。この培地のｐＨは７となっ
た。
ナフタレンジカルボン酸を生産する菌を分離するため
に、脱イオン水で溶解した表２に示す成分の培地を用い
てスクリーニングを行った。この培地のｐＨは７となっ
た。
【００２９】
【表２】
【００３０】この培地を、５００ｍｌのバッフル付き三
角フラスコに１００ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間滅菌
した。室温にて冷却した後、各地にて採集した土壌を薬
さじ１〜２杯分添加し、別途滅菌した２，６−ジメチル
ナフタレンを１００ｍｇ添加し、３０℃、２７０ｒｐｍ
で振とう培養した。別の同様培地に０．１ｍｌ植えつぎ
した後、再度３０℃、２７０ｒｐｍで振とう培養し、一
週間後培養液の一部を滅菌した生理的食塩水にて希釈
し、前もって調整しておいた表２に示した成分の培地
に、寒天を１５ｇ／ｌとなる様に加えた平板培地に塗布
し、さらに２，６−ジメチルナフタレンを溶かしたジエ
チルエーテル溶液を噴霧して平板培地上に供給し、３０
℃で一週間培養した。
角フラスコに１００ｍｌ入れ、１２１℃で２０分間滅菌
した。室温にて冷却した後、各地にて採集した土壌を薬
さじ１〜２杯分添加し、別途滅菌した２，６−ジメチル
ナフタレンを１００ｍｇ添加し、３０℃、２７０ｒｐｍ
で振とう培養した。別の同様培地に０．１ｍｌ植えつぎ
した後、再度３０℃、２７０ｒｐｍで振とう培養し、一
週間後培養液の一部を滅菌した生理的食塩水にて希釈
し、前もって調整しておいた表２に示した成分の培地
に、寒天を１５ｇ／ｌとなる様に加えた平板培地に塗布
し、さらに２，６−ジメチルナフタレンを溶かしたジエ
チルエーテル溶液を噴霧して平板培地上に供給し、３０
℃で一週間培養した。
【００３１】平板培地上に形成された、２，６−ジメチ
ルナフタレンが資化されたことを示す、透明帯を有した
コロニーを単離し、これらすべての微生物を、以下に記
す方法で２，６−ナフタレンジカルボン酸生産菌株を選
択した。すなわち、上記と同様の培地４ｍｌと、２，６
−ジメチルナフタレンを１ｗｔ％に溶解したデカリン４
ｍｌを、内径２１ｍｍの試験管に分注し、１２０℃で２
０分間滅菌し室温にて冷却した後、単離した微生物を白
金耳を用いて１白金耳植え付けた。試験管振とう機によ
り３０℃、３００ｐｍで数日間往復振とう培養した。培
養後、この培養液の水性部分の上清を、強アルカリで処
理した後、中性で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて分析し、２，６−ナフタレンジカルボン酸生産
菌を複数選択し、その中から表１に示した菌学的性質を
有するスフィンゴモナス パウチモビリス Ａ−７株を
取得した。
ルナフタレンが資化されたことを示す、透明帯を有した
コロニーを単離し、これらすべての微生物を、以下に記
す方法で２，６−ナフタレンジカルボン酸生産菌株を選
択した。すなわち、上記と同様の培地４ｍｌと、２，６
−ジメチルナフタレンを１ｗｔ％に溶解したデカリン４
ｍｌを、内径２１ｍｍの試験管に分注し、１２０℃で２
０分間滅菌し室温にて冷却した後、単離した微生物を白
金耳を用いて１白金耳植え付けた。試験管振とう機によ
り３０℃、３００ｐｍで数日間往復振とう培養した。培
養後、この培養液の水性部分の上清を、強アルカリで処
理した後、中性で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて分析し、２，６−ナフタレンジカルボン酸生産
菌を複数選択し、その中から表１に示した菌学的性質を
有するスフィンゴモナス パウチモビリス Ａ−７株を
取得した。
【００３２】
【実施例２】５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに
実施例１と同様の培地を５０ｍｌと、２，６−ジメチル
ナフタレンを１ｗｔ％に溶解したデカリン５０ｍｌを入
れ、１２１℃で２０分間滅菌した。室温にて冷却後、実
施例１で得た菌株、スフィンゴモナス パウチモビリス
Ａ−７株を１白金耳植菌し、３０℃、３００ｒｐｍで
４日間振とう培養した。培養後、培養液の水性部分の上
清を実施例１と同様の方法で分析し、２，６−ナフタレ
ンジカルボン酸の生産量を測定した。結果を表３に示
す。
実施例１と同様の培地を５０ｍｌと、２，６−ジメチル
ナフタレンを１ｗｔ％に溶解したデカリン５０ｍｌを入
れ、１２１℃で２０分間滅菌した。室温にて冷却後、実
施例１で得た菌株、スフィンゴモナス パウチモビリス
Ａ−７株を１白金耳植菌し、３０℃、３００ｒｐｍで
４日間振とう培養した。培養後、培養液の水性部分の上
清を実施例１と同様の方法で分析し、２，６−ナフタレ
ンジカルボン酸の生産量を測定した。結果を表３に示
す。
【００３３】
【比較例１】実施例２における、２，６−ジメチルナフ
タレンの供給方法を、溶媒に溶解せずに直接培地に添加
する従来の固−液反応系に変えて、実施例１と同様の培
地を５０ｍｌ用い、以下実施例２と同様な条件で４日間
培養、分析し、２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産
量を測定した。２，６−ジメチルナフタレンは５００ｍ
ｇ添加した。結果を表３に示す。表３の結果から本発明
の有機溶媒系による方法がより優れていることが判る。
タレンの供給方法を、溶媒に溶解せずに直接培地に添加
する従来の固−液反応系に変えて、実施例１と同様の培
地を５０ｍｌ用い、以下実施例２と同様な条件で４日間
培養、分析し、２，６−ナフタレンジカルボン酸の生産
量を測定した。２，６−ジメチルナフタレンは５００ｍ
ｇ添加した。結果を表３に示す。表３の結果から本発明
の有機溶媒系による方法がより優れていることが判る。
【００３４】
【表３】
【００３５】
【実施例３】２，６−ジメチルナフタレンを溶解する溶
媒を、ヘプタン、シクロオクタン、イソオクタン、オク
タン、ヘキシルエーテル、ノナン、デカンの各種溶媒に
変えて、これらに２，６−ジメチルナフタレンを１ｗｔ
％溶解し、そして、これら溶媒を、表２に示した成分の
培地が４ｍｌ入った内径２１ｍｍの試験管に、４ｍｌ分
注し１２１℃で２０分間滅菌した。室温にて冷却後、ス
フィンゴモナス パウチモビリス Ａ−７株を１白金耳
植え付け、試験管振とう機により３０℃、３００ｒｐｍ
で数日間往復振とう培養した。培養後、この培養液の水
性部分の上清を、強アルカリで処理した後、中性で高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。そ
の結果、本発明の菌株は、種々の有機溶媒を用いても生
育可能で、しかも２，６−ジメチルナフタレンに対し十
分な変換能を有することが判った。
媒を、ヘプタン、シクロオクタン、イソオクタン、オク
タン、ヘキシルエーテル、ノナン、デカンの各種溶媒に
変えて、これらに２，６−ジメチルナフタレンを１ｗｔ
％溶解し、そして、これら溶媒を、表２に示した成分の
培地が４ｍｌ入った内径２１ｍｍの試験管に、４ｍｌ分
注し１２１℃で２０分間滅菌した。室温にて冷却後、ス
フィンゴモナス パウチモビリス Ａ−７株を１白金耳
植え付け、試験管振とう機により３０℃、３００ｒｐｍ
で数日間往復振とう培養した。培養後、この培養液の水
性部分の上清を、強アルカリで処理した後、中性で高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分析した。そ
の結果、本発明の菌株は、種々の有機溶媒を用いても生
育可能で、しかも２，６−ジメチルナフタレンに対し十
分な変換能を有することが判った。
【００３６】
【実施例４】内径２１ｍｍの試験管に２，６−ジメチル
ナフタレンを４０ｍｇと、表２に示した培地にデカリン
濃度が１０〜９０％にあるようにしたものとを加え、全
量を１０ｍｌとし、１２１℃で２０分間滅菌した。室温
にて冷却後、スフィンゴモナス パウチモビリス Ａ−
７株を１白金耳植え付け、試験管振とう機により３０
℃、３００ｒｐｍで数日間往復振とう培養した。培養
後、この培養液の水性部分の上清を、強アルカリで処理
した後、中性で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて分析し、図１に示した結果を得た。本発明の菌
株は、各種濃度のデカリンを用いても生育可能で、しか
も２，６−ジメチルナフタレンに対し十分な変換能を有
することが判った。
ナフタレンを４０ｍｇと、表２に示した培地にデカリン
濃度が１０〜９０％にあるようにしたものとを加え、全
量を１０ｍｌとし、１２１℃で２０分間滅菌した。室温
にて冷却後、スフィンゴモナス パウチモビリス Ａ−
７株を１白金耳植え付け、試験管振とう機により３０
℃、３００ｒｐｍで数日間往復振とう培養した。培養
後、この培養液の水性部分の上清を、強アルカリで処理
した後、中性で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）にて分析し、図１に示した結果を得た。本発明の菌
株は、各種濃度のデカリンを用いても生育可能で、しか
も２，６−ジメチルナフタレンに対し十分な変換能を有
することが判った。
【００３７】
【実施例５】２本の５００ｍｌのバッフル付き三角フラ
スコに、Ｌ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エ
キス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ・５ｇ／ｌ）をそれぞれ１００
ｍｌ入れ、２，６−ジメチルナフタレンを１００ｍｇ添
加して１２１℃、２０分間滅菌した。室温で冷却後、ス
フィンゴモナス・パウチモビリス Ａ−７株を、白金耳
を用いて１白金耳ずつ植菌し、３０℃で５日間振とう培
養した。培養後の培養液を遠心分離して集菌後、培地の
緩衝能を高めてｐＨの低下を抑制するため、表２に示し
た培地成分の内、ＫＨ2ＰＯ4を（ＮＨ4）2ＨＰＯ4に変
えて、２０ｇ／ｌを添加、ＮＨ4ＮＯ3を無添加に変更し
た培地（ｐＨ７）で洗浄し、同培地４ｍｌに菌体を懸濁
させ、これを滅菌済みの内径２１ｍｍの試験管に移し、
更に１ｗｔ％にジメチルナフタレンを溶解したデカリン
４ｍｌを加え、３０℃で３日間振とうして反応させた。
反応生成液をＨＰＬＣで分析したところ２，６−ナフタ
レンジカルボン酸の収量は３１０ｍｇ／ｌであった。
スコに、Ｌ培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エ
キス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ・５ｇ／ｌ）をそれぞれ１００
ｍｌ入れ、２，６−ジメチルナフタレンを１００ｍｇ添
加して１２１℃、２０分間滅菌した。室温で冷却後、ス
フィンゴモナス・パウチモビリス Ａ−７株を、白金耳
を用いて１白金耳ずつ植菌し、３０℃で５日間振とう培
養した。培養後の培養液を遠心分離して集菌後、培地の
緩衝能を高めてｐＨの低下を抑制するため、表２に示し
た培地成分の内、ＫＨ2ＰＯ4を（ＮＨ4）2ＨＰＯ4に変
えて、２０ｇ／ｌを添加、ＮＨ4ＮＯ3を無添加に変更し
た培地（ｐＨ７）で洗浄し、同培地４ｍｌに菌体を懸濁
させ、これを滅菌済みの内径２１ｍｍの試験管に移し、
更に１ｗｔ％にジメチルナフタレンを溶解したデカリン
４ｍｌを加え、３０℃で３日間振とうして反応させた。
反応生成液をＨＰＬＣで分析したところ２，６−ナフタ
レンジカルボン酸の収量は３１０ｍｇ／ｌであった。
【００３８】
【発明の効果】本発明によれば、２，６−ジメチルナフ
タレンを単一炭素源もしくは変換基質として溶解した有
機溶媒と、炭素源を含まない培地との有機溶媒系におい
て、生育可能で、かつ２，６−ナフタレンジカルボン酸
を生産することができる生産菌、もしくはその休止菌
体、その処理物又は菌体由来の酵素を用い、２，６−ジ
メチルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸
を効率よく生産することができる。
タレンを単一炭素源もしくは変換基質として溶解した有
機溶媒と、炭素源を含まない培地との有機溶媒系におい
て、生育可能で、かつ２，６−ナフタレンジカルボン酸
を生産することができる生産菌、もしくはその休止菌
体、その処理物又は菌体由来の酵素を用い、２，６−ジ
メチルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸
を効率よく生産することができる。
【図１】実施例４においてデカリン濃度１０〜９０％と
あるようにして２，６−ナフタレンジカルボン酸の生成
の影響をみた図である。
あるようにして２，６−ナフタレンジカルボン酸の生成
の影響をみた図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 上 村 直 久 埼玉県川口市並木１−13−32 エバーグ リーン川口609号 (72)発明者 酒 井 豊 神奈川県横浜市緑区藤が丘２−36−66 グリーンヒル藤が丘ＣＩＩ−114 (72)発明者 飛 田 雅 文 神奈川県横浜市戸塚区戸塚町2021−１ ホーユウパレス戸塚711 (72)発明者 牧 野 知 之 香川県善通寺市文京町２−５−10 農林 水産省 生野宿舎２−１ 審査官 高堀 栄二 (56)参考文献 特開 平３−80091（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−15365（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−103659（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−184669（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−194368（ＪＰ，Ａ) 米国特許3361546（ＵＳ，Ａ) 米国特許5030568（ＵＳ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】 スフィンゴモナス属に属する２，６−ナ
フタレンジカルボン酸生成菌、スフィンゴモナス パウ
チモビリス。 - 【請求項２】 スフィンゴモナス属に属し、２，６−ジ
メチルナフタレンから２，６−ナフタレンジカルボン酸
を生成することのできる２，６−ナフタレンジカルボン
酸生成菌、スフィンゴモナス パウチモビリス。 - 【請求項３】 スフィンゴモナス属に属し、有機溶媒系
において２，６−ジメチルナフタレンの両メチル基末端
酸化能を有する２，６−ナフタレンジカルボン酸生成
菌、スフィンゴモナス パウチモビリス。 - 【請求項４】 請求項１〜３に記載の生成菌がスフィン
ゴモナス パウチモビリス Ａ−７である２，６−ナフ
タレンジカルボン酸生成菌。 - 【請求項５】 スフィンゴモナス属に属する２，６−ナ
フタレンジカルボン酸生成菌を、２，６−ジメチルナフ
タレンを溶解した有機溶媒と、培地からなる有機溶媒系
培地において培養し、２，６−ナフタレンジカルボン酸
を生成させることを特徴とする２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸あるいはその塩の製造法。 - 【請求項６】 スフィンゴモナス属に属する２，６−ナ
フタレンジカルボン酸生成菌を、２，６−ジメチルナフ
タレンを含むかもしくは含まない培地あるいは２，６−
ジメチルナフタレンを溶解した有機溶媒と、培地からな
る有機溶媒系培地で培養し、集菌後、その菌体もしくは
休止菌体、又はその処理物もしくは菌体由来の酵素を用
いて、有機溶媒系において反応させて２，６−ナフタレ
ンジカルボン酸を生成せしめるか、もしくは２，６−ジ
メチルナフタレンを２，６−ナフタレンジカルボン酸に
変換せしめることを特徴とする２，６−ナフタレンジカ
ルボン酸あるいはその塩の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24972093A JP2579588B2 (ja) | 1993-09-13 | 1993-09-13 | 新規微生物及び該微生物を用いた２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24972093A JP2579588B2 (ja) | 1993-09-13 | 1993-09-13 | 新規微生物及び該微生物を用いた２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0779768A JPH0779768A (ja) | 1995-03-28 |
| JP2579588B2 true JP2579588B2 (ja) | 1997-02-05 |
Family
ID=17197200
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24972093A Expired - Lifetime JP2579588B2 (ja) | 1993-09-13 | 1993-09-13 | 新規微生物及び該微生物を用いた２，６−ナフタレンジカルボン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2579588B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100770516B1 (ko) * | 2004-12-30 | 2007-10-25 | 주식회사 효성 | 벤즈알데히드 디하이드로게나제를 발현하는 형질전환체의제조방법 및 이를 이용한 2,6-나프탈렌 디카르복실산의정제방법 |
-
1993
- 1993-09-13 JP JP24972093A patent/JP2579588B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0779768A (ja) | 1995-03-28 |
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