JPH0622775A - 微生物によるメナジオンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】微生物を用いて、２−メチルナフタレンから高
収率、高選択率でメナジオンを製造する方法。 【構成】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属ｓ
ｐ．Ｍ１９２が、２−メチルナフタレンを２−メチル−
１−ナフトールに変換し、さらにメナジオンへと高収
率、高選択率で変換する。さらにこの菌株の２−メチル
−１−ナフトール生産能を高める培養方法、炭素源、反
応補助炭素源、メチル基酸化阻害物質を用いることによ
って２−メチル−１−ナフトールを効率良く生産して、
これをメナジオンに変換させるメナジオンの製造方法を
提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物によるメナジオ
ンの製造方法に関する。メナジオンはビタミンＫ₃ 作用
を有し血液の凝固を促進する脂溶性ビタミンで抗出血性
作用を有する事から重要な生理活性物質である。

【０００２】

【従来の技術】メナジオンの製造法としては有機化学的
合成法が知られているが、原料の入手が困難な上、コス
ト高であり、さらに過酸化水素を酸化剤としてクロム酸
触媒法により行われるため、公害源として指摘されてい
る。

【０００３】一方、微生物による化学品の生産はコスト
高で、生産性が低いとされて来たが、近年、エイ．ヨシ
カワ、エス．ヨシダおよびアイ．テラオ著、バイオ・イ
ンダストリー（ BIO INDUSTRY)、７巻、106 頁(1990)
で、ベンゼンをフェノールへ、フェノールをハイドロキ
ノンへと酸化するモノオキシゲナーゼの存在が報告さ
れ、工業化の可能性も検討されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
背景のもと、石油留分やコールタール留分に含まれ、メ
ナジオンに構造が似ている安価な２−メチルナフタレン
から微生物変換によってメナジオンが生産供給出来れば
産業上の利点は極めて高いと考えられ、このため新規な
バイオプロセスによるメナジオンの製造方法を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる目的
にかなう微生物を検索した結果、ロドコッカス（Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属し、２−メチルナフタレンを
２−メチル−１−ナフトールに変換し、さらにメナジオ
ンへと変換する菌株を見いだした。さらにこの菌株の２
−メチル−１−ナフトール生産能を高める培養方法、炭
素源、反応補助炭素源、メチル基酸化阻害物質を新規に
発見することによって２−メチル−１−ナフトールを効
率良く生産して、これをメナジオンに変換させるメナジ
オンの製造方法を完成するにいたった。

【０００６】本発明は、２−メチル−ナフタレンを、微
生物Rhodococcus sp.(ロドコッカス・エスピー）Ｍ１９
２を用いて変換せしめ、メナジオンを生産するメナジオ
ンの製造方法を提供する。

【０００７】また、微生物Rhodococcus sp.(ロドコッカ
ス・エスピー) Ｍ１９２を用いて、２−メチルナフタレ
ンを２−メチル−１−ナフトールに変換する方法を提供
する。

【０００８】さらに、前記微生物Rhodococcus sp.(ロド
コッカス・エスピー) Ｍ１９２が、休止菌体反応を行う
２−メチルナフタレンを２−メチル−１−ナフトールに
変換する方法を提供する。

【０００９】また、メナジオンの製造方法は、前記微生
物Rhodococcus sp.(ロドコッカス・エスピー) Ｍ１９２
が、メチルエチルケトン、１−プロパノール、２−プロ
パノール、２−ブタノール、エタノールの中から選択さ
れた少なくとも１種の物質を炭素源として培養された菌
体であるのが好ましく、前記２−メチルナフタレンを変
換する際に、１−プロパノール、メチルエチルケトン、
エタノール、２−プロパノール、２−ブタノールの中か
ら選択された少なくとも１種の物質を反応補助炭素源と
して使用するのがよい。

【００１０】また、前記２−メチルナフタレンを変換す
る際に、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウ
ム塩３水和物またはエチルキサントゲン酸カリウムを添
加して行うのが好ましい。

【００１１】さらに、得られた２−メチル−１−ナフト
ールを酸化させるメナジオンの製造方法を提供する。

【００１２】また、Rhodococcus sp.(ロドコッカス・エ
スピー）Ｍ１９２である微生物を提供する。

【００１３】本発明で使用される菌株は表１の培地Ａと
培地Ｂを用いて自然界より新たに分離した菌株である。
本発明者は、茨城県の土壌から目的とする微生物を分離
した。

【００１４】本発明の方法は、以下の記載に限定される
ものではないが、以下に好適な１例を説明する。

【００１５】本発明の方法は、まず土壌より分離した菌
株を液体培地５ｍｌで試験管中２８℃で培養し、生育度
（ＯＤ₆₁₀ ）＝約１．０まで増殖させた後、培養液を褐
色細管（φ１０×１０．５ｍｍ）に移し、休止菌体反応
を行った。培養液を約１５００×ｇで１５分間遠心して
集菌し、菌体を０．０２％ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏを含む
２５ｍＭりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗
浄した後、同緩衝液１ｍｌに懸濁し、１００ｍＭの２−
メチルナフタレンおよびメチルエチルケトンを含む混液
または１００ｍＭの２−メチルナフタレンおよびエタノ
ールを含む混液を１０μｌ入れ、２−メチルナフタレン
の濃度を１ｍＭとした。これを攪拌後、２８℃で２４時
間振動して反応させた後、１−ブタノールを１ｍｌ添加
して反応を停止させ、これを十分に攪拌して抽出した。
この抽出液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，
シマズ ＬＣ−１０Ａ）で分析した。また、各物質の定
量はあらかじめ濃度の分かっている標準サンプルをＨＰ
ＬＣで測定して使用した。

【００１６】さらに、大量の菌体を使用する休止菌体反
応には以下の培養を行った。土壌より分離した菌株を液
体培地５ｍｌで試験管中２８℃で２４時間振盪培養し
て、これを前培養とした後、次に５００ｍｌ容振盪フラ
スコに同じ培地１００ｍｌを入れ、前培養液を１ｍｌ植
菌して２８℃で３日間振盪培養した。この培養菌体を以
下の休止菌体反応に使用した。

【００１７】休止菌体反応は、生存しているが増殖しな
い状態にした菌体を利用して、外界から得られた物質を
利用して目的とする新たな化合物を得る反応で、本発明
では、微生物ロドコッカス・エスピー１９２の休止菌体
を用いて、２−メチルナフタレンを２−メチル−１−ナ
フトールに変換する。

【００１８】まず培養液を４℃、８０００×ｇで１５分
間遠心して集菌し、菌体を緩衝液で２回洗浄し、リン酸
カリウム緩衝液でＯＤ₆₁₀ ＝１０になるように懸濁し
た。この懸濁液１００ｍｌを５００ｍｌ容褐色振盪フラ
スコに注ぎ、１００ｍＭの２−メチルナフタレン／メチ
ルエチルケトン混液または１００ｍＭの２−メチルナフ
タレン／エタノール混液を１ｍｌ入れ、２−メチルナフ
タレン濃度を１ｍＭとした。これを攪拌後、休止菌体反
応を行った。一定時間反応させた後、１−ブタノール２
０ｍｌを添加して１５分間振盪し、反応の停止と生成物
の抽出を行った。抽出液は、ＨＰＬＣで分析した。

【００１９】以上の工程で得られた菌株を、その分類学
的特徴から〔バージェイズ・マニュアル・オブ・システ
マテック・バクテリオロジー ２巻、１４７２頁（Berg
ey'sManual of Systematic Bacteriology volume 2 ）
第１版、１９８６年〕によりロドコッカス・エスピー
（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｍ１９２と命名し
た。

【００２０】さらには、本菌は下記のような特徴を有し
ている。 形態 コリネフォーム種 大きさ ２〜３μｍ×１０〜１５μｍ（直径 ０．５〜１．２μｍ） グラム染色 ＋ 胞子の形成 − 運動性 − カタラーゼ ＋ コロニー形態 サーモンピンク／オレンジ オキシターゼ − （４８時間） 不透明 定形 グルコースの醗酵性 − 円形 つやのある 表面なめらか 凸面 直径 約０．５ｍｍ 生育温度 ３７℃ ＋ ４５℃ −

【００２１】本菌株は、通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所に、平成４年３月１７日付け、Rhodococcu
s sp. Ｍ１９２という識別のための表示で寄託されてお
り、その寄託番号は微工研菌寄第１２８８２号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２８８２）である。本発明の微生物を培養す
るに当たって用いられる栄養培地は炭素源、窒素源およ
び無機塩からなる細菌の培地に用いられる通常の培地が
用いられる。

【００２２】上記炭素源としては、グルコース、フラク
トース、シュークロース、ラクトース、マンニトール、
ソルビトール、澱粉加水分解物等の糖類、コハク酸、フ
マル酸、クエン酸等の有機酸、エタノール、１−プロパ
ノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタ
ノール、グリセロール、グリセロール−ペプトン、１，
４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、メチル
エチルケトン、メチル−ｎ−ブチルケトン、メチル−ｎ
−プロピルケトン等が使用でき、この中でもメチルエチ
ルケトン、１−プロパノール、２−プロパノール、２−
ブタノール、エタノールはメナジオンの前駆物質である
２−メチル−１−ナフトールの生産量の増大に有効であ
る。さらに、エタノールを用いた場合、休止菌体反応に
おける酸化部位を特異的に選択し、２−メチル−１−ナ
フトールひいてはメナジオンの収率を上げるのに有効で
ある。微生物を培養する際の炭素源の濃度は、培地中
０．２〜１０．０重量％であり、好ましくは０．５〜
１．５重量％が良い。

【００２３】上記窒素源としては硫酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス、麦芽エキス等が用いられ、無機塩類とし
ては、リン酸塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄
塩、その他必要に応じてカルシウム、亜鉛、マンガン、
コバルト、銅、モリブデン、ホウ素、ヨードなどの微量
金属塩が用いられる。さらに、アミノ酸、核酸、チアミ
ン、リボフラビン、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキシ
ン、パントテン酸、ビオチン、葉酸等のビタミン、酵母
エキス、麦芽エキス等成育促進物質も使用される。微生
物の培養はｐＨ５〜８．５、培養温度２０〜４０℃で１
〜５日間好気的に振盪または通気攪拌培養することによ
って行われる。

【００２４】休止菌体反応は、微生物の培養後、遠心分
離等により培養物を集菌し、リン酸カリウム緩衝液で数
回洗浄した後、休止菌体反応溶液に移してから２−メチ
ルナフタレンを添加することにより行われる。休止菌体
反応溶液は、リン酸カリウム緩衝液等の緩衝液を用いて
行うが酵素阻害物質と反応補助炭素源を添加してもよ
い。

【００２５】さらに該微生物の休止菌体による変換反応
に当たって、メチルエチルケトン、エタノール、１−プ
ロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−
ブタノール、アセトン、酢酸エチル、メチル−ｎ−プロ
ピルケトン、メチル−ｎ−ブチルケトン、２−メチル−
２−ブタノン等を反応補助炭素源として加えることによ
り、２−メチル−１−ナフトールの生成量は飛躍的に増
加する上、同時に生成する２−ナフトエ酸の副生を抑え
ることを見出した。中でも、１−プロパノール、メチル
エチルケトン、エタノール、２−プロパノール、２−ブ
タノールの効果は大きい。上記反応補助炭素源は、反応
溶液中の濃度で０．５〜１．５重量％で加えるのが好ま
しい。

【００２６】また、２−メチルナフタレンからのメナジ
オン生産の重要な前駆物質である２−メチル−１−ナフ
トールを生成するためには、ナフタレン環の酸化は抑制
せずにメチル基の酸化だけを特異的に抑制する酵素阻害
物質を反応系に添加することは有効であり、Ｎ，Ｎ−ジ
エチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩３水和物、エチ
ルキサントゲン酸カリウム、ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、ｐ−クロロ安息香酸水銀、酢酸フェニル水銀、
２−メルカプトベンゾチアゾール、塩基性酢酸アルミニ
ウム、セレン化ナトリウムにその効果を見出した。中で
も、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩
３水和物（Sodium N,N-diethyldithiocarbamate trihyd
rate) 、エチル化キサントゲン酸カリウムの効果が大き
く、反応補助炭素源の減少にともなって副生する副生成
物の生成を顕著に抑制し、２−メチル−１−ナフトール
の生成を増大させた。この阻害物質は、休止菌体反応溶
液中の濃度で０．００１〜０．００００１ｍｏｌ／ｌで
あるのが好ましい。

【００２７】休止菌体反応時の微生物の濃度は、休止菌
体反応溶液中、６１０ｎｍの吸光度で、５以上であるの
が好ましい。添加する２−メチルナフタレンは、反応補
助炭素源との混合物の形態で添加してもよく、好ましい
添加量は、休止菌体反応溶液中の２−メチルナフタレン
の濃度が０．５〜１００ｍＭとするのがよい。１００ｍ
Ｍ超では、反応の阻害が認められる。また、２−メチル
−１−ナフトールを製造する休止菌体反応は、ｐＨ６．
０〜９．０、反応温度２０〜４０℃の通気攪拌下で、６
〜８０時間行われるのかよい。

【００２８】休止菌体反応溶液に１０〜５０v/v ％の反
応停止剤１−ブタノールを加えて反応を停止させること
ができる。また、２−メチル−１−ナフトールの分析
は、休止菌体反応後、十分に攪拌して目的物を有機溶媒
を用いて抽出し、この抽出液を高速液体クロマトグラフ
ィーで標準物質との面積比から求めた。

【００２９】さらに、本発明の炭素源、反応補助炭素源
および停止剤は、同一の物質を使用してもよく、その場
合は使用量をそれぞれの目的に合わせ上記の使用好適濃
度に適宜調整する。

【００３０】次に、休止菌体反応停止後、２−メチル−
１−ナフトールからメナジオンへの変換を行う。メナジ
オンへの変換の工程は、エタノールまたは１−ブタノー
ル等の低級アルコールの存在下で、２０〜４０℃、常圧
で、数時間静置することで、自然酸化させ、メナジオン
に変換することが可能であるが、常法によりサルコミン
触媒を用いてメナジオンに変換することも可能である。

【００３１】２−メチル−１−ナフトールおよびメナジ
オンの反応液からの単離は、常法により抽出した抽出液
を濃縮した後、エーテルで再抽出し、シリカゲル薄層ク
ロマトグラフィーを行いクロマトグラム上の２−メチル
−１−ナフトールあるいはメナジオンをアセトンで抽出
し結晶化した。

【００３２】

【実施例】本発明の２−メチル−１−ナフトールおよび
メナジオンの同定はＴＬＣ、元素分析値、融点、ＵＶお
よびＩＲスペクトル、ＮＭＲスペクトル等の結果から２
−メチル−１−ナフトール、メナジオンであることを確
認した。また、定量法としては高速液体クロマトグラフ
ィー法を使用した。以下、実施例および比較例を用い
て、本発明を具体的に説明する。使用した培地の組成
は、下記の表１および表２の通りである。

【００３３】 表１ 培地の組成 培地Ａ メチルエチルケトン ０．５％ ＮＨ₄ Ｃｌ ０．２％ （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ０．１％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．２％ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１％ ＮａＣｌ ０．１％ ＭｇＣｌ₂ ０．０２％ 微量金属溶液^* ０．２％ ビタミン混合液^** ０．１％ 水道水を加えて１００％とする ────────────────────────────── （ｐＨ ７．０） 培地Ｂ 炭素源^*** ０．６％ ＮＨ₄ ＮＯ₃ ０．３％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．２％ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．２％ ＮａＣｌ ０．１％ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０２％ 微量金属溶液^* ０．２％ ビタミン混合物^** ０．１％ 水道水を加えて１００％とする ────────────────────────────── （ｐＨ ７．０） 注：^* 微量金属溶液 ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ １００ｍｇ ＺｎＣｌ₂ １００ｍｇ ＦｅＣｌ₂ ・ｎＨ₂ Ｏ １００ｍｇ ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ １０ｍｇ ＣｏＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ １０ｍｇ ＣｕＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ １０ｍｇ ＮａＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ １０ｍｇ Ｎａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇ ・１０Ｈ₂ Ｏ １０ｍｇ ＫＩ １０ｍｇ 水道水 ２５０ｍｌ^** ビタミン混合物 チアミン・ＨＣｌ １０ｍｇ リボフラビン ２０ｍｇ ｐ−アミノ安息香酸 １０ｍｇ ピリドキシン・ＨＣｌ ２０ｍｇ ピリドキサール・ＨＣｌ ２．０ｍ
ｇ パントテン酸カルシウム ２０ｍｇ ニコチン酸 １０ｍｇ ビオチン １．０ｍ
ｇ 葉酸 １．０ｍ
ｇ 水道水 １００ｍｌ^*** 炭素源：２，３−ブタンジオール、１，４−ブタン
ジオール、またはｃｉｓ−２−ブテン−１，４−ジオー
ル

【００３４】 表２ 培地の組成 培地Ｃ グルコース １．０％ ポリペプトン １．５％ 酵母エキス ０．１％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．３％ ＮａＣｌ ０．２％ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０２％ 水道水を加えて１００％とする ────────────────────────────── （ｐＨ ７．０） 培地Ｄ 炭素源 １．０％ ＮａＮＯ₃ １．０％ ＮＨ₄ Ｃｌ ０．２％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．７％ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．３％ ＮａＣｌ ０．２％ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．２％ 微量金属溶液^* ０．２％ ビタミン混合物 ０．２％ 水道水を加えて１００％とする ────────────────────────────── （ｐＨ ７．０） 注：^* 微量金属溶液 ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ ４００ｍｇ ＦｅＣｌ₂ ・ｎＨ₂ Ｏ ３５０ｍｇ ＺｎＣｌ₂ ２００ｍｇ ＣａＣｌ₂ １００ｍｇ ＣｏＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ２０ｍｇ ＣｕＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ ２０ｍｇ ＮａＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ １０ｍｇ ＮａＢ₄ Ｏ₇ ・１０Ｈ₂ Ｏ １０ｍｇ 水道水 １００ｍｌ ビタミン混合物の組成は表１に示す。

【００３５】（実施例１）表１の培地Ａからメチルエチ
ルケトンを除いた培地１００ｍｌを各々５ｍｌづつ試験
管に分注し、１２０℃、１．２ｋｇ／ｃｍ² 、３０分間
加熱減菌して冷却した後、各々にメチルエチルケトン２
５ｍｇを無菌的に添加した。これにRhodococcus sp.
（ロドコッカス・エスピー）Ｍ１９２を一白金耳植菌し
て２８℃で１日間振盪培養して前培養とした。これを表
２の培地Ｄから炭素源を除いた培地を５００ｍｌ容振盪
フラスコに１００ｍｌ入れて、１２０℃、１．２ｋｇ／
ｃｍ² 、３０分間加熱減菌して冷却した後、メチルエチ
ルケトン１ｇを無菌的に添加した後、培地に前培養液を
１ｍｌ植菌して２８℃で３日間振盪して本培養を行っ
た。

【００３６】得られた培養液を４℃、８，０００×ｇで
遠心分離して集菌し、リン酸カリウム緩衝液で２回洗浄
した。この菌体を同様の緩衝液１００ｍｌにＯＤ₆₁₀ ＝
１０となるように懸濁して褐色細管に入れ、Ｎ，Ｎ−ジ
エチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩３水和物 １０
^-3Ｍ，および１００ｍＭの２−メチルナフタレン／エタ
ノールを加えて２−メチルナフタレンの濃度が１ｍＭ、
反応補助炭素源としてエタノール濃度が１％となるよう
にして、２８℃で４８時間振盪して反応させた。

【００３７】生成物の分析は液体クロマトグラフィーで
行ない、１２時間で５３．２μＭ、２４時間で６２．７
μＭ、４８時間で６３．１μＭの２−メチル−１−ナフ
トールを生成した。

【００３８】得られた反応液に１−ブタノールを２０ｍ
ｌ添加して反応を停止させ、３０分間攪拌して抽出し
た。抽出残渣にさらに２０ｍｌの１−ブタノールを加え
て同様に抽出し、得られた抽出液を合わせて、減圧下で
５ｍｌまで濃縮した。この濃縮液に水５ｍｌを加えエー
テル２０ｍｌに転溶し、エーテル層を分別後減圧下で除
去して１６．１ｍｇの粗生成物を得た。これを少量のア
セトンに溶解して、シリカゲル薄層クロマトグラフィー
を行いクロマトグラム上の２−メチル−１−ナフトール
をアセトンで抽出し８．３ｍｇの結晶を得た。

【００３９】エタノールに溶解後再結晶を行って得られ
た精製標品の融点は６４．５℃、元素分析はＣ：８３．
５％，Ｈ：６．４％，Ｏ：１０．１％（理論値；Ｃ：８
３．５２％，Ｈ：６．３７％，Ｏ：１０．１１％）であ
り、そのＩＲスペクトル、ＮＭＲスペクトルはオーセン
チックな２−メチル−１−ナフトールのものとよく一致
した。

【００４０】この２−メチル−１−ナフトールはエタノ
ールに溶解してガラス容器中で自然酸化により、容易に
メナジオンに変換するが、常法によりサルコミン（Salc
omine)触媒により変換して８．２ｍｇのメナジオンを得
た。

【００４１】この結晶の融点は１０６．０℃、元素分析
はＣ：７６．７％，Ｈ：４．７％，Ｏ：１８．６％（理
論値；Ｃ：７６．７３％，Ｈ：４．６８％，Ｏ：１８．
５８％）であり、そのＩＲスペクトル、ＮＭＲスペクト
ルはオーセンチックなメナジオンのものとよく一致し
た。

【００４２】（実施例２）実施例１に示した反応条件の
中で、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム
塩３水和物を無添加として、反応補助炭素源としてメチ
ルエチルケトンを使用して、反応液量を４００ｍｌとし
た他は実施例１と全く同じ方法で反応を行い、２４時間
で１１．９ｍｇの２−メチル−１−ナフトールを得た。
また、２−ナフトエ酸の副生は全く認められなかった。
これを実施例１と同様に処理して１１．６ｍｇのメナジ
オンを取得した。

【００４３】（実施例３）実施例２に示した反応条件の
中で、反応補助炭素源を１−プロパノールとした以外は
実施例２と全く同じ条件、方法で反応を行い、２４時間
で１３．９ｍｇの２−メチル−１−ナフトールを得た。
２−ナフトエ酸の副生は全く認められなかった。同様に
このものを酸化してメナジオン１３．４ｍｇを得た。

【００４４】（実施例４）実施例１に示した休止菌体反
応液（緩衝液）の菌体濃度をＯＤ₆₁₀ ＝２０．０として
Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩３水
和物１０^-3Ｍに変え、エチルキサントゲン酸カリウムを
添加、反応補助炭素源として１−プロパノール１％、反
応液量を４００ｍｌとした他は、実施例１と全く同じ方
法で行った。４８時間反応終了後の２−メチル−１−ナ
フトールの生成量は１４．０ｍｇで、２−ナフトエ酸の
副生は完全に抑えられ全く認められなかった。同様にこ
のものを酸化してメナジオン１３．６ｍｇを得た。

【００４５】（実施例５）表２の培地Ｄから炭素源を除
いた培地を３０Ｌ容ジャーファーメンターに２０Ｌ仕込
み、１２０℃、１．２ｋｇ／ｃｍ² 、３０分間スチーム
減菌した。冷却後、メチルエチルケトン２００ｇを無菌
的に添加し、次いで実施例１の培養と同様に２８℃、１
８０rpm で３日間振盪培養したフラスコ培養母菌４００
ｍｌを接種して、２８℃、攪拌３００rpm 、通気４L/mi
n で３日間培養を行った。培養終了後、５℃、８，００
０×ｇで１０分間遠心分離して集菌し、リン酸カリウム
緩衝液で２回洗浄した。この菌体を同様の緩衝液２ｌで
ＯＤ₆₁₀ ＝２０となるように懸濁して褐色反応容器に入
れ、エチルキサントゲン酸カリウム０．２Ｍおよび２−
メチルナフタレン２０ｇを４０ｇの１−プロパノールに
溶解して添加した。２８℃、４８時間振盪して反応させ
て、以下、得られた反応液に１−ブタノールを４００ｍ
ｌ添加して反応を停止させ、３０分間攪拌して抽出し
た。抽出残渣にさらに２００ｍｌの１−ブタノールを加
えて同様に抽出し、得られた抽出液を合わせて、減圧下
で７５ｍｌまで濃縮した。この濃縮液に水２００ｍｌを
加えエーテル２００ｍｌに転溶し、エーテル層を分別後
減圧下でエーテルを除去して粗生成物２３ｇを得た。こ
れを常法により、ゲルクロマト分離して、精製して２．
６ｇの２−メチル−１−ナフトールを得た。さらにこれ
を変換してメナジオン２．５ｇの結晶を得た。

【００４６】（実施例６）実施例１に示した反応条件の
中で、炭素源としてメチルエチルケトンの代わりに同量
のエタノールを加え、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミ
ン酸ナトリウム塩３水和物の代わりに、エチルキサント
ゲン酸カリウム１０^-3Ｍを添加した他は実施例１と全く
同じ方法で、菌体培養、集菌、変換反応を行い、各々４
２．０μＭ、５８．８μＭ、６５．０μＭの２−メチル
−１−ナフトールが生成された。

【００４７】メチルエチルケトンで培養した菌体（実施
例１）では、全酸化物の４１％が２−メチル−１−ナフ
トールであったのに対して、エタノールで培養した菌株
は、全酸化物の７５％が２−メチル−１−ナフトール
で、その内の１０％はメナジオンに変換されていた。

【００４８】（実施例７）実施例２と全く同じ反応条件
で４８時間まで反応を行ったところ、２−メチル−１−
ナフトールは０．１ｍｇに減少し、７６．２ｍｇの２−
ナフトエ酸が生成した。

【００４９】（実施例８）実施例３と全く同じ反応条件
で４８時間まで反応を行ったところ、２−メチル−１−
ナフトールは９．４ｍｇに減少し、４．５ｍｇの２−ナ
フトエ酸が認められた。

【００５０】（実施例９）実施例７に阻害剤として、
Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩３水
和物１０^-3Ｍを加えて４８時間まで反応を行い１２．９
ｍｇの２−メチル−１−ナフトールを得た。また、２−
ナフトエ酸の副生は全く認められなかった。

【００５１】（実施例１０）実施例８にエチルキサント
ゲン酸カリウム１０^-3Ｍを加えて７２時間まで反応を行
い、１２．１ｍｇの２−メチル−１−ナフトールを得
た。また、２−ナフトエ酸の副生は全く認められなかっ
た。

【００５２】（比較例１）表２の培地Ｄの液体培地に炭
素源としてグルコースを加えたものを５００ｍｌ容振盪
フラスコに１００ｍｌ入れ、実施例１と同じ前培養液を
１ｍｌ植菌して２８℃で３日間振盪培養して本培養を行
った。以下、実施例１と同じ条件で菌体を集菌、処理し
て２−メチルナフタレン１ｍＭ添加で変換を行い１２時
間、２４時間、４８時間で各々０．４μＭ、０．３μ
Ｍ、０．３μＭの２−メチル−１−ナフトールと、８１
８．３μＭ、８４０．０μＭ、８４６．４μＭの２−ナ
フトエ酸が生成された。

【００５３】（比較例２）Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカル
バミン酸ナトリウム塩３水和物を添加しない以外は実施
例１と全く同じ条件で菌体培養、集菌、変換反応を行
い、１２時間、２４時間、４８時間で各々３１．６μ
Ｍ、３３．９μＭ、３３．６μＭの２−メチル−１−ナ
フトールと１７６．７μＭ、１８２．０μＭ、１７４．
４μＭの２−ナフトエ酸が生成された。

【００５４】

【発明の効果】本発明の微生物を用いると、２−メチル
ナフタレンから高収率にメナジオンを製造し得る。特
に、２−メチルナフタレンから２−メチル−１−ナフト
−ルへの変換が特異的に行われ高収率のメナジオンを製
造し得る。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】２−メチル−ナフタレンを、微生物Rhodoc
   occus sp.(ロドコッカス・エスピー) Ｍ１９２を用いて
   変換せしめ、メナジオンを生産することを特徴とするメ
   ナジオンの製造方法。
2. 【請求項２】微生物Rhodococcus sp.(ロドコッカス・エ
   スピー) Ｍ１９２を用いて、２−メチルナフタレンを２
   −メチル−１−ナフトールに変換する方法。
3. 【請求項３】前記微生物Rhodococcus sp.(ロドコッカス
   ・エスピー) Ｍ１９２が、メチルエチルケトン、１−プ
   ロパノール、２−プロパノール、２−ブタノール、エタ
   ノールの中から選択された少なくとも１種の物質を炭素
   源として培養された菌体である請求項１または２に記載
   の方法。
4. 【請求項４】前記２−メチルナフタレンを変換する際
   に、１−プロパノール、メチルエチルケトン、エタノー
   ル、２−プロパノール、２−ブタノールの中から選択さ
   れた少なくとも１種の物質を反応補助炭素源として使用
   する請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 【請求項５】前記２−メチルナフタレンを変換する際
   に、Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム塩
   ３水和物またはエチルキサントゲン酸カリウムを添加し
   て行う請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】請求項２で得られた２−メチル−１−ナフ
   トールを酸化させることを特徴とするメナジオンの製造
   方法。
7. 【請求項７】前記微生物Rhodococcus sp.(ロドコッカス
   ・エスピー) Ｍ１９２が、休止菌体反応を行う請求項２
   〜６のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】Rhodococcus sp.(ロドコッカス・エスピ
   ー）Ｍ１９２であることを特徴とする微生物。