WO2005078112A1 - Procedimiento de preparación de menadiona con un microorganismo recombinante - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
Definitions
- This invention relates to the field of industrial microbiology, and specifically to a new method of preparing a low molecular weight compound using microorganisms transformed with recombinant DNA.
- Menadione or 2-methyl-1,4-naphthalenedione is also known as synthetic vitamin K 3 0 or vitamin K 3 and has the attached chemical formula (I).
- Menadione plays an essential role in blood clotting, acting in the synthesis of prothrombin and blood clotting factors Vil, IX and X. It also acts in the conversion of hepatic glucose to glycogen. Apparently, it has an important role in the synthesis of human bones, which is why it is also used for the prevention of osteoporosis.
- the required daily intake of menadione ranges from 5 ⁇ g (children before 3 years of age) to 80 ⁇ g (adults), which is normally covered with a diet rich in vegetables.
- a deficiency in menadione mainly due to intestinal disturbances, can cause vascular and clotting problems. For these reasons, menadione is considered an active agent produced and used worldwide, in both animal and human therapy.
- menadione is synthesized mainly through an extremely contaminating oxidative procedure, which includes very dangerous and toxic chemical substances.
- This procedure involves the oxidation of 2-methylnaphthalene (11-4) with chromic acid or derivatives (C1-O 3 or Na 2 Cr 2 0, cf. ' US 2,402,226).
- Numerous procedures have been suggested for the manufacture of menadione trying to improve the current industrial synthesis.
- One of them is based on oxidation with hydrogen peroxide (cf. US 2,373,003), but it has not been feasible at an industrial level.
- Another procedure is based on the oxidation of 2-methylnaphthalene with sodium dichromate, sulfuric acid, acetic acid and pyridine (cf. US 3,751,437), which are also highly contaminating chemical compounds.
- the inventors have surprisingly found that the enzyme quinol oxidase exhibits high activity in the presence of 2-methi-1, 4-naphthalendiol or menadiol, resulting in the production of menadione.
- Quinol oxidase simply called “qox” in this description, functions as a terminal oxidase in the respiratory chain of some bacteria, reducing 0 2 to water. Terminal oxidases have different names depending on the characteristics of the enzyme and the microorganism.
- the inventors have found that the quinol oxidase of Bacillus subtilis. also known as quinol oxidase aa3-600 or cytochrome aa3 quinol oxidase, is particularly suitable in this invention.
- the inventors have exploited the potential of the qox enzyme to develop an alternative procedure for the preparation of menadione.
- Qox in its natural environment does not allow obtaining a high yield of menadione as is desirable at an industrial level:
- the inventors have used recombinant DNA technology to design an expression vector that comprises a quinol oxidase and the appropriate elements to overexpress the quinine! oxidase in the selected host bacteria.
- the engineered expression vector also facilitates the solubilization and purification of quinol oxidase.
- the process of the invention for the preparation of menadione involves the removal of acidic residues and toxic chemical compounds, making it an economical, safe and environmentally benign procedure.
- An additional advantage is that it is a selective process in which substantially no isomer of menadione is produced.
- the invention provides a recombinant DNA expression vector for the production of menadione in Escherichia coli.
- said vector comprising a nucleotide sequence encoding a quinol oxidase and nucleotide sequences that allow said vector to be selectable and autonomously replicable in Escherichia coli.
- Escherichia coli qox means Escherichia coli transformed with the recombinant expression vector comprising the nucleotide sequence of quinol oxidase.
- the recombinant DNA vector allows Escherichia coli to produce quinol oxidase and, when the conditions of the medium are adequate, to quinol oxidase catalyzes the production of menadione.
- the quinol oxidase gene introduced into the expression vector is the cytochrome aa3 quinol oxidase gene from Bacillus subtilis bacteria.
- Bacillus subtilis bacteria originate from the bacterial strain Bacillus subtilis DSMZ 402 and, more particularly, the nucleoid sequence encoding the cytochrome aa3 quino! Bacillus subtilis oxidase DSMZ 402 comprises SEQ ID NO: 5.
- the construction of the recombinant DNA expression vector is carried out with conventional recombinant DNA technologies, that is, procedures for joining DNA segments in a cell-free system.
- the term "vector” refers to a DNA molecule originating from a virus, a plasmid or a cell from a higher organism, in which another fragment of DNA of suitable size can be integrated (cloned) without losing the ability of the vector to self-replicate. . Some examples are yeast plasmids, cosmids, and artificial chromosomes. Vectors are often recombinant molecules that contain DNA sequences of various origins.
- expression vector means a vector that also contains the regulatory sequences necessary for transcription and translation of the cloned gene (s). Both circular and linearized DNA vectors are useful for this invention.
- the selected vector must be compatible with the selected Escherichia coli host cells.
- the nucleotide sequence that enables the vector to be autonomously selectable and replicable in Escherichia coli is the gene encoding the T7 promoter that allows the T7 RNA polymerase of the selected Escherichia coli strain to bind to the promoter.
- selectionable means that the vector remains stable in the offspring bacteria. Selection is achieved by stringent medium conditions in accordance with the introduction into the vector of an appropriate selection marker gene the expression of which allows identifying cells that have been successfully transformed with the vector.
- the selection marker gene is often an antibiotic resistance gene.
- Some preferred selection marker genes in this invention confer resistance to Kanamycin, Tetracycline, Carbenicillin and more preferably Ampicillin.
- the expression vector further comprises nucleotide sequences that allow increasing the solubility and / or improving the purification of the resulting quinol oxidase.
- nucleotide sequences that allow increasing the solubility and / or improving the purification of the resulting quinol oxidase.
- Nucleotide sequences encoding a polyhistidine tail at the C-terminal position of quinol oxidase, a thioredoxin tail at the N-terminal position of quinol oxidase, or glutathione S-transferase fusion proteins are useful.
- the invention also provides Escherichia coli bacteria transformed with the above described recombinant DNA expression vector, or its descendant bacteria.
- a person skilled in the art will appropriately choose the expression system consisting of an initial vector and a bacterial strain of Escherichia coli to maximize the production of menadione.
- Escherichia coli belongs to the BL21 bacterial strain.
- Some suitable expression vectors for Escherichia coli BL21 are, for example, pET vectors, trcHis vectors and pUB vectors (all from Invitrogen), and pGEX vectors and GST vectors (from Amersham).
- Also useful in this invention are the bacterial strain Escherichia coli DH5 alfa in combination with pUC vectors and Escherichia coli F 'in combination with PSL vectors, PEZZ vectors or M13 vectors (all from Amersham).
- the invention also provides a menadione preparation process comprising the steps of: (i) cultivating Escherichia coli bacteria in a suitable culture medium comprising one or more substrates of formula (II), where X and Y are radicals independently selected from H and OH, and (ii) recovering the menadione from the culture medium; said bacteria having the capacity to produce menadione because they comprise a recombinant DNA vector that encodes a quinol oxidase.
- the term "the ability to produce menadione” means that the bacterium accumulates menadione in the medium in an amount that can be collected.
- Possible substrates are 11-1, ll-2, II-3 and H-4.
- the substrate used is 2-methyl-1-naphthol (11-1).
- the bacterial cells are broken or whole. When cells are broken, quinol oxidase can be purified.
- the bacterial cells have been precultured in a culture medium comprising tryptone, yeast extract, sodium chloride and a. Antibiotic selected from the group consisting of Kanamycin, Tetracycline, Carbenicillin, and Ampicillin.
- the culture medium used to prepare the menadione comprises a linear saturated hydrocarbon of 10 to 18 carbon atoms, particularly hexadecane, at a concentration in the culture medium of 10% v / v.
- FIG. 1 shows a genetic map of the initial expression vector pET102 / D-TOPO ® before cloning.
- FIG. 2 shows a genetic map of the resulting recombinant expression vector.
- FIG. 1 shows a genetic map of the initial expression vector pET102 / D-TOPO ® of 6315 nucleotides.
- T7 promoter bases 209-225; primer hybridization T7 promoter region ("T7 promoter priming site"): bases 209-228; lac operator (lacO): bases 228-252; ribosome binding region (RBS): bases 282-288; open reading frame (ORF) of thioredoxin with histidine patch ("His-patch-thioredoxin”): bases 298-627; primer TrxFus forward hybridization region: bases 607-624; enterokinase recognition region (EK): bases 643-657; TOPO ® recognition region 1: bases 670-674; overhang sequence: bases 675-678; TOPO ® recognition region 2: bases 679-683; epitope V5: bases 700-741; polyhistidine region (6xHis): bases 751-768; primer T7 reverse hybridization region: bases 822-841; T
- FIG. 2 shows a genetic map of the resulting recombinant expression vector after cloning the qox nucleotide sequence.
- the elements of the vector are the same as in FIG. 1 but with the bases displaced.
- the qox insertion point is in the overhang sequence, bases 675-678.
- the cloned sequence read by sequencing corresponds to SEQ ID NO: 5 with 4177 bases (includes the bases up to the hybridization region of the "T7 reverse" primer), which is not exactly the entire nucleotide sequence cloned in the vector for inherent reasons to sequencing.
- Escherichia coli BL21 (pET102 Directional TOPO ® Expression K ⁇ t, Invitrogen) is a commercial strain that is used for the regulated expression of heterologous genes. It contains the gene for T7 RNA polymerase that makes the strain compatible with the use of pET vectors containing the T7 promoter for isopropyl- ⁇ -D-iogalactoside (1PTG) -induced recombinant protein overexpression.
- the pET102 / D-TOPO ® vector contains a pBR322ori for plasmid replication, the ampicillin resistance gene, the T7 promoter that allows binding of T7 RNA polymerase, the operator lac allowing inhibition of expression when IPTG is not present, a ribosome binding region for RNA translation, a thioredoxin patched with histidines to increase the solubility of the fusion protein and a polyhistidine tail ( ⁇ xHis ) to detect and purify the fusion protein.
- pBR322ori for plasmid replication
- the ampicillin resistance gene the ampicillin resistance gene
- the T7 promoter that allows binding of T7 RNA polymerase
- the operator lac allowing inhibition of expression when IPTG is not present
- a ribosome binding region for RNA translation a thioredoxin patched with histidines to increase the solubility of the fusion protein
- ⁇ xHis polyhistidine tail
- the commercial strain Escherichia coli BL21 was genetically modified by a transformation assay with the plasmid pET102 / D-TOPO ® containing the quinol oxidase (qox) gene of Bacillus subtilis DSMZ 402 (accession number of the deposit in the "Deutsche Sammlung von
- Qox also known as quinol oxidase aa3-600 or cytochrome aa3 quinol oxidase
- QoxA also known as quinol oxidase aa3-600 or cytochrome aa3 quinol oxidase
- qoxA the main oxidase in the exponential growth phase of Bacillus subtilis. It is made up of 4 subunits (qoxA, B, C and D) and the length of its DNA sequence is 3.9 Kb (GenBank, protein access numbers P34959 (qoxD), P34958 (qoxC), P34956 (qoxB) and P34957 (qoxA); gene accession number M86548).
- the qox gene was amplified by PCR using 2 units of the enzyme
- the primers were designed from the qox gene described in the GenBank, accession number M86548.
- the PCR reaction was performed with an initial denaturation step at 94 ° C for 3 min followed by 36 temperature cycles consisting of a denaturation step at 94 ° C for 1 min, a hybridization / extension step at 60 ° C for 1.5 min and one step at 68 ° C for 4 min. After the 36 cycles, the sample was subjected to 68 ° C for 10 min and finally to 4 ° C indefinitely.
- the PCR product was analyzed by agarose gel electrophoresis, and the DNA band was purified from the gel (SNAP TM UV-Free Gel Purification Kit, Invitrogen).
- Cloning in pET102 / D-TOPO ® vector and transformation of cells The DNA fragment was cloned into pET102 / D-TOPO ® vector and Escherichia coii BL21 bacteria were transformed with the vector by heat shock. The transformed cells were analyzed by DNA restriction with 10 units of the Hindlll enzyme. Positive gifts were sequenced using the 'TrxFus forward' 5 'TTCCTCGACGCTAACCTG 3' (SEQ ID NO: 3) and the 'T7 reverse' 5 'TAGTTATTGCTCAGGGGTGG.3 1 (SEQ ID NO: 4) sequencing primers. The 5 '->3' DNA sequence of the resulting fusion gene is SEQ ID NO: .5.
- SEQ ID NO: 5 does not exactly correspond to the entire nucleotide sequence cloned into the vector because SEQ ID NO: 5 is the. sequencing result. Inherent to sequencing, sequencing primers do not allow you to read the first and last 30-40 nucleotides of the entire cloned sequence.
- Test 1 Preparation of menadione with whole cells of Escherichia coli gox
- Preliminary growth of the microorganism Precultures of Escherichia coli qox were grown at pH 7 in soybean trypticase medium supplemented with ampicillin. One colony of the culture was transferred to a nutrient broth # 2 (Oxoid) containing Lab-lemco powder (10 g / l), peptone (10 g / l) and NaCl (5g / l), supplemented with 200 mg / l of ampicillin. Incubated at 37 ° C with vigorous shaking (200 rpm), adding 50-200 mg / L IPTG after three to four hours. The qox was overexpressed for eight hours, followed by harvesting the cells with a 20 min centrifugation step at 4500 rpm, and washing them in phosphate buffer.
- Menadione preparation Cells were passaged in 50 mM phosphate buffer supplemented with 25 mg / l 2-methyl-1-naphtho! using DMSO as solvent. Incubation was carried out at 37 ° C and shaking at 200 rpm for a reaction time of two, five and ten days. After these periods, the cells were collected and the menadione was extracted from the culture broth using dichloromethane. The product was concentrated and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results are shown in TABLE 1 (Test 1).
- Test 2 Preparation of menadione with whole cells of Escherichia coli qox and the addition of hexadecane
- Test 3 Preparation of menadione with guolinol oxidase completely or partially purified from Escherichia coli qox
- oxidase For a partial purification of the protein, cells were disrupted with the addition of 160 mg of lysozyme and one hour of incubation at 0 ° C followed by three freeze-thaw cycles (-80 ° C / 37 ° C) and a final step to reduce the viscosity by adding 1000 units of deoxyribonuclease L To achieve complete purification of the quinol oxidase, the above mixture was passed through an affinity chromatography column.
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Abstract
La invención proporciona un procedimiento alternativo para la preparación de menadiona, también conocida como vitamina K3, que evita los residuos ácidos y el uso de compuestos químicos tóxicos, por lo que es un procedimiento económico, seguro y medioambientalmente benigno. El procedimiento comprende cultivar bacterias Escherichia coli en un medio de cultivo adecuado que comprende uno o más sustratos, preferiblemente 2 metil-1-naftol, y recuperar la menadiona del medio de cultivo; teniendo dichas bacterias la capacidad de producir menadiona porque comprenden un vector de ADN recombinante que codifica una quinol oxidasa. El uso de microorganismos como biocatalizadores permite un procedimiento selectivo en el que sustancialmente no se produce ningún isómero de la menadiona.
Description
Procedimiento de preparación de menadiona con un microorganismo recombinante
Esta invención se relaciona con el campo de la microbiología industrial, y específicamente con un nuevo procedimiento de preparación de un compuesto de bajo peso molecular utilizando microorganismos transformados con ADN recombinante.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La menadiona o 2-metil-1 ,4-naftalenodiona se conoce también como vitamina K30 vitamina K3 sintética y tiene la fórmula química (I) adjunta. La menadiona juega un papel esencial en la coagulación de la sangre, actuando en la síntesis de ¡a protrombina y los factores de coagulación sanguínea Vil, IX y X. También actúa en la conversión de la glucosa hepática en glucógeno. Aparentemente, tiene un papel importante en la síntesis de los huesos humanos, razón por la que se utiliza también para la prevención de la osteoporosis. La ingesta diaria necesaria de menadiona va desde 5 μg (niños antes de ¡os 3 años de edad) a 80 μg (adultos), que normalmente queda cubierta con una dieta rica en vegetales. Una deficiencia en menadiona, principlamente debida a alteraciones intestinales, puede ocasionar problemas vasculares y de coagulación. Por estas razones, la menadiona se considera un agente activo producido y utilizado en todo el mundo, tanto en terapia animal como humana.
Indusírialmente la menadiona se sintetiza principalmente mediante un procedimiento oxidativo extremadamente contaminante, que incluye sustancias químicas muy peligrosas y tóxicas. Este procedimiento implica la oxidación de 2-metilnaftaleno (11-4) con ácido crómico o derivados (C1-O3 o Na2Cr20 , cfr.' US 2.402.226). Se han sugerido numerosos procedimientos
para la fabricación de menadiona intentando mejorar la actual síntesis industrial. Uno de ellos se basa en la oxidación con peróxido de hidrógeno (cfr. US 2.373.003), pero no ha resultado factible a nivel industrial. Otro procedimiento se basa en la oxidación de 2-metilnaftaieno con dicromato sódico, ácido sulfúrico, ácido acético y piridina (cfr. US 3.751.437), que también son compuestos químicos altamente contaminantes.
Uno de los principales problemas de las rutas sintéticas conocidas en la técnica es la producción concomitante de un regioisómero (III) que no tiene la actividad farmacológica de la menadiona. La presencia de este subproducto hace más difíciles y caros los pasos de purificación de la menadiona. Han habido otros intentos para mejorar los procedimientos contaminantes antes indicados, pero sus escalados a nivel industrial no han sido satisfactorios. Ejemplos de estos procedimientos alternativos conllevan la oxidación en un reactor multitubular con óxido de vanadio, pirosulfato potásico y sulfato potásico, o la oxidación con hidrógenosulfato potásico y una porfirina que contiene manganeso.
Para solucionar los problemas de contaminación de los procedimientos químicos de preparación, se ha descrito un procedimiento microbiológico que implica el uso de una bacteria del género Rhodococcus (cfr. JP 6022775)," aunque todavía no ha sido completamente industrializado. Por lo tanto, parece altamente deseable proporcionar procedimientos microbiológicos industriales antemativos para la preparación de menadiona, que sean tanto no contaminantes como regioselectivos.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han encontrado sorprendentemente que el enzima quinol oxidasa presenta una elevada actividad en presencia de 2-metii-1 ,4-naftalendiol o menadiol, resultando en la producción de menadioná. La quinol oxidasa, llamada simplemente "qox" en esta descripción, funciona como una oxidasa terminal en la cadena respiratoria de algunas bacterias, reduciendo 02 a agua. Las oxidasas terminales tienen nombres diferentes dependiendo de las características del enzima y del microorganismo. Los inventores han encontrado que la quinol oxidasa de Bacillus subtilis. también conocida como quinol oxidasa aa3-600 o citocromo aa3 quinol oxidasa, es particularmente adecuada en esta invención.
Los inventores han aprovechado el potencial del enzima qox para desarrollar un procedimiento alternativo para la preparación de menadiona. La qox en su ambiente natural no permite la obtención de un elevado rendimiento de menadiona como es deseable a nivel industrial: Para superar esta importante limitación, los inventores han utilizado la tecnología de ADN recombinante para diseñar un vector de expresión que comprende una quinol oxidasa y los elementos apropiados para sobreexpresar la quino! oxidasa en la bacteria huésped seleccionada. El vector de expresión diseñado también facilita la solubilización y la purificación de la quinol oxidasa. El procedimiento de la invención para la preparación de menadiona conlleva la eliminación de residuos ácidos y compuestos químicos tóxicos, por lo que es un procedimiento económico, seguro y medioambientalmente benigno. Una ventaja adicional es que se trata de un procedimiento selectivo en el que sustancialmente no se produce ningún isómero de la menadiona.
La invención proporciona un vector de expresión de ÁDN recombinante para la producción de menadiona en Escherichia coli. comprendiendo dicho vector una secuencia de nucleótidos que codifica una quinol oxidasa y secuencias de nucleótidos que permiten a dicho vector ser seleccionable y replicable autónomamente en Escherichia coli. En esta descripción "Escherichia coli qox" significa Escherichia coli transformada con el vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la quinol oxidasa. El vector de ADN recombinante permite a Escherichia coli producir quinol oxidasa y, cuando las condiciones del medio son adecuadas, ia quinol
óxidasa cataliza la obtención de menadiona. En una realización particular de la invención, el gen de la quinol oxidasa introducida en el vector de expresión es el gen de la citocromo aa3 quinol oxidasa de bacterias Bacillus subtilis. En particular, las bacterias de Bacillus subtilis provienen de la cepa bacteriana Bacillus subtilis DSMZ 402 y, más particularmente, la secuencia de nucleóíidos que codifica la citocromo aa3 quino! oxidasa de Bacillus subtilis DSMZ 402 comprende la SEQ ID NO: 5.
La construcción del vector de expresión de ADN recombinante se lleva a cabo con tecnologías convencionales de ADN recombinante, es decir, procedimientos para unir segmentos de ADN en un sistema libre de células. El término "vector" se refiere a una molécula de ADN originaria de un virus, un plásmido o una célula de un organismo superior, en el que puede integrarse (clonarse) otro fragmento de ADN de tamaño adecuado sin perder la capacidad del vector para autoreplicarse. Algunos ejemplos son los plásmidos, los cósmidos y los cromosomas artificiales de levadura. Los vectores son frecuentemente moléculas recombinantes que contienen secuencias de ADN de varios orígenes. El término "vector de expresión" significa un vector que además contiene las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y la traducción del gen o los genes clonados. Para esta invención son útiles tanto los vectores de ADN circular como linearizado.
Para permitir al vector de la invención ser seleccionable y replicable autónomamente en Escherichia coli, el vector seleccionado tiene que ser compatible con las células huésped de Escherichia coli seleccionadas. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que permite al vector ser seleccionable y replicable autónomamente en Escherichia coli es el gen que codifica el promotor T7 que permite a la ARN polimerasa T7 de la cepa seleccionada de Escherichia coli unirse al promotor. El término
"seleccionable" significa que el vector permanece estable en las bacterias descendientes. La selección se consigue mediante condiciones del medio estrictas de acuerdo con la introducción en el vector de un gen marcador de selección apropiado cuya expresión permite identificar las células que han sido transformadas satisfactoriamente con el vector. El gen marcador de selección es a menudo un gen de resistencia a un antibiótico. Algunos genes marcadores de selección preferidos en esta invención confieren resistencia a
la kanamicina, la tetraciclina, la carbenicilina y más preferiblemente a la ampicilina.
En otra realización particular de la invención, el vector de expresión comprende además secuencias de nucleótidos que permiten incrementar la solubilidad y/o mejorar la purificación de la quinol oxidasa resultante. Para . este fin. son útiles las secuencias de nucleótidos que codifican una cola de polihistidina en la posición C-terminal de la quinol oxidasa, una cola de tioredoxina en la posición N-terminal de la quinol oxidasa o las proteínas de fusión de la glutatión S-transferasa.
La invención también proporciona bacterias Escherichia coli transformadas con el vector de expresión de ADN recombinante antes descrito, o sus bacterias descendientes. Una persona experta en la materia escogerá apropiadamente el sistema de expresión constituido por un vector inicial y una cepa bacteriana de Escherichia coli para maximizar la producción de menadiona. En una realización particular, la Escherichia coli pertenece á la cepa bacteriana BL21. Algunos vectores de expresión adecuados para Escherichia coli BL21 son, por ejemplo, los vectores pET, los vectores trcHis y los vectores pUB (todos ellos de Invitrogen), y los vectores pGEX y los vectores GST (de Amersham). También son útiles en esta invención la cepa bacteriana Escherichia coli DH5 alfa en combinación con los vectores pUC y Escherichia coli F' en combinación con los vectores PSL, los vectores PEZZ o los vectores M13 (todos ellos de Amersham).
La invención también proporciona un procedimiento de preparación de menadiona que comprende los pasos de: (i) cultivar bacterias Escherichia coli en un medio de cultivo adecuado que comprende uno o más sustratos de fórmula (II), donde X e Y son radicales seleccionados independientemente entre H y OH, y (ii) recuperar la menadiona del medio de cultivo; teniendo dichas bacterias la capacidad de producir menadiona porque comprenden un vector de ADN recombinante que codifica una quinol oxidasa. En esta descripción, el término "la capacidad de producir menadiona" significa que la bacteria acumula menadiona en el medio en una cantidad que puede ser recogida. Los sustratos posibles son 11-1, ll-2, II-3 and H-4. En una realización preferida, el sustrato empleado es 2-metil-1-naftol (11-1 ).
Escherichia coli qox
En una realización particular de la invención, las células bacterianas están rotas o enteras. Cuando las células están rotas se puede purificar la quinol oxidasa. En una realización preferida, las células bacterianas han sido precultivadas en un medio de cultivo que comprende triptona, extracto de levadura, cloruro sódico y un. antibiótico seleccionado del grupo que consiste en kanamicina, tetraciclina, carbenicilina y ampicilina. En otras realizaciones de la invención, el medio de cultivo utilizado para preparar la menadiona comprende un hidrocarburo saturado lineal de 10 a 18 átomos de carbono, particularmente hexadecano, en una concentración en el medio de cultivo de 10% v/v.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones particulares, dibujos y lista de secuencias se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativas de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra un mapa genético del vector de expresión inicial pET102/D-TOPO® antes del clonaje.
La FIG. 2 muestra un mapa genético del vector de expresión recombinante resultante.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Descripción detallada de los dibujos
La FIG. 1 muestra un mapa genético del vector de expresión inicial pET102/D-TOPO® de 6315 nucleótidos. Promotor T7: bases 209-225; región del promotor T7 de hibridación de cebadores ("T7 promotor priming site"): bases 209-228; operador lac (lacO): bases 228-252; región de unión del ribosoma ("ribosome binding site", RBS): bases 282-288; marco abierto de lectura ("open reáding frame", ORF) de la tioredoxina con parche de histidinas ("His-patch-thioredoxin"): bases 298-627; región de hibridación del cebador "TrxFus forward": bases 607-624; región de reconocimiento de la enteroquinasa (EK): bases 643-657; región 1 de reconocimiento de la TOPO®: bases 670-674; secuencia que sobresale ("overhang"): bases 675-678; región 2 de reconocimiento de la TOPO®: bases 679-683; epítopo V5: bases 700-741 ; región de polihistidina (6xHis): bases 751-768; región de hibridación del cebador "T7 reverse": bases 822-841 ; región de terminación de la transcripción T7: bases 783-911 ; promotor bla: bases 1407-1505; ORF del gen de resistencia a la ampicilina (bla): bases 1506-2366; origen de pBR322: bases 2511-3184; ORF del gen RQP: bases 3552-3743 (hebra complementaria); ORF del gen lacl: bases 5055-6146 (hebra complementaria).
La FIG. 2 muestra un mapa genético del vector de expresión recombinante resultante después de clonar la secuencia de nucleótidos de la qox. Los elementos del vector son los mismos que en la FIG. 1 pero con las bases desplazadas. El punto de inserción de la qox está en la secuencia que sobresale ("overhang"), bases 675-678. La secuencia clonada leída por secuenciación corresponde a la SEQ ID NO: 5 con 4177 bases (incluye las bases hasta la región de hibridación del cebador "T7 reverse"), que no es exactamente toda la secuencia de nucléotidos clonada en el vector por razones inherentes a la secuenciación.
Cepa bacteriana v vector de expresión utilizados
La Escherichia coli BL21 (pET102 Directional TOPO® Expression K¡t, Invitrogen) es una cepa comercial que se utiliza para la expresión regulada de genes heterólogos. Contiene el gen para la ARN polimerasa T7 que hace la cepa compatible con el uso de los vectores pET que contienen el promotor T7 para la sobreexpresión de proteínas recombinantes inducida con isopropil-β-D-íiogalactósido (1PTG).
El vector pET102/D-TOPO® (pET102 Directional TOPO® Expression Kit, Invitrogen) contiene un pBR322ori para la replicación del plásmido, el gen de resistencia a la ampicilina, el promotor T7 que permite la unión de la ARN polimerasa T7, el operador lac que permite la inhibición de la expresión cuando el IPTG no está presente, una región de unión con el ribosoma para la traducción del ARN, una tioredoxina con parche de histidinas para aumentar la solubilidad de la proteína de fusión y una cola de polihistidina (δxHis) para detectar y purificar la proteína de fusión.
Construcción de la Escherichia coli qox
Se modificó genéticamente la cepa comercial Escherichia coli BL21 mediante un ensayo de transformación con el plásmido pET102/D-TOPO® que contenía el gen de la quinol oxidasa (qox) de Bacillus subtilis DSMZ 402 (número de acceso del depósito en el "Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH"; la cepa se compró directamente a la colección del DSMZ).
Obtención del gen qox: La qox, también conocida como quinol oxidasa aa3-600 o citocromo aa3 quinol oxidasa, es la principal oxidasa en la fase de crecimiento exponencial del Bacillus subtilis. Se compone de 4 subunidades (qoxA, B, C y D) y la longitud de su secuencia de ADN es de 3.9 Kb (GenBank, números de acceso de las proteínas P34959 (qoxD), P34958 (qoxC), P34956 (qoxB) y P34957 (qoxA); número de acceso del gen M86548).
Se amplificó el gen de la qox por PCR utilizando 2 unidades del enzima
Platinum Pfx (Invitrogen), 1 mM de Mg2S04 y 1x del tampón de amplificación, 200 μM de dNTPs y 0.3 μM de cada cebador. Los cebadores utilizados en la PCR fueron el "qox forward" 5" CACCGAGAAAAGATTTTGAGGAAGTATGCACTTC 3' (SEQ ID NO: 1 ; 79 °C de temperatura de fusión) y el "qox reverse"
5* GTATAATTCGTTATGGCCTGAATGCTCTG 3' (SEQ ID NO: 2; 75 °C de temperatura de fusión). Los cebadores se diseñaron a partir del gen de la qox descrito en el GenBank, número de acceso M86548. La reacción de la PCR se realizó con un paso inicial de desnaturalización a 94 °C durante 3 min seguido de 36 ciclos de temperatura que consistían en un paso de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, un paso de hibridación/extensión a 60 °C durante 1.5 min y un paso a 68 °C durante 4 mjn. Después de los 36 ciclos, se sometió la muestra a 68 °C durante 10 min y finalmente a 4 °C indefinidamente. El producto de la PCR se analizó por electroforesis en gel de agarosa, y se purificó la banda de ADN del gel (S.N.A.P.™ UV-Free Gel Purification Kit, Invitrogen).
Clonaie en el vector pET102/D-TOPO® v transformación de las células: Se clonó el fragmento de ADN en el vector pET102/D-TOPO® y se transformaron bacterias Escherichia coíi BL21 con el vector mediante choque térmico. Las células transformadas se analizaron por restricción de ADN con 10 unidades del enzima Hindlll. Los dones positivos se secuenciaron utilizando los cebadores de secuenciación "TrxFus forward" 5' TTCCTCGACGCTAACCTG 3' (SEQ ID NO: 3) y el "T7 reverse" 5' TAGTTATTGCTCAGGGGTGG.31 (SEQ ID NO: 4). La secuencia de ADN 5'->3' del gen de fusión resultante es la SEQ ID NO:.5. Esta secuencia SEQ ID NO: 5 no corresponde exactamente a toda la secuencia de nucleótidos
clonada en el vector porque la SEQ ID NO: 5 es el. resultado de la secuenciación. Inherentemente a la secuenciación, los cebadores de secuenciación no permiten leer los primeros y últimos 30-40 nucleótidos de la secuencia clonada completa.
Ensayo 1 : Preparación de menadiona con células enteras de Escherichia coli gox
Crecimiento preliminar del microorganismo: Precultivos de Escherichia coli qox se hicieron crecer a pH 7 en medio tripticasa soja suplementado con ampicilina. Una colonia del cultivo se pasó a un caldo de nutrientes n° 2 (Oxoid) que contenía polvo Lab-lemco (10 g/l), peptona (10 g/l) y NaCl (5g/l), suplementado con 200 mg/l de ampicilina. Se incubó a 37 °C con agitación vigorosa (200 rpm), añadiendo 50-200 mg/l de IPTG después de tres-cuatro , horas. La qox se sobreexpresó durante ocho horas, seguido de la recogida de las células con un paso de centrifugación de 20 min a 4500 rpm, y de lavarlas en tampón fosfato.
Preparación de menadiona: Se pasaron las células en 50 mM de íampón fosfato suplementado con 25 mg/l de 2-metil-1-nafto! utilizando DMSO como disolvente. La incubación se realizó a 37 °C y agitación a 200 rpm durante un tiempo de reacción de dos, cinco y diez días. Después de estos periodos, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró y se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Los resultados se muestran en la TABLA 1 (Ensayo 1).
Ensayo 2: Preparación de menadiona con células enteras de Escherichia coli qox y la adición de hexadecano
Crecimiento preliminar del microorganismo: Este paso se realizó como en el Ensayo 1.
Preparación de menadiona: Se pasaron las células en 50 mM de tampón fosfato suplementado con 25 mg/l de 2-meíil-1-ñaftol utilizando hexadecano como disolvente en una proporción del 10% (v/v). La incubación se realizó a 37 °C y agitación a 200 rpm durante un tiempo de reacción de dos, cinco y
diez días. Después de estos periodos, se recogió el hexadecano por decantación, se extrajo la menadiona con un sistema de extracción en fase sólida y se eluyó en metanol. La menadiona se concentró y se analizó por GC-MS. Se recogieron las células y se extrajo completamente la menadiona residual del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró y se analizó por GC-MS. Los resultados se muestran en la TABLA 1 (Ensayo 2) y la distribución en el hexadecano fue de >99%.
Ensayo 3: Preparación de menadiona con guiñol oxidasa completa o parcialmente purificada de Escherichia coli qox
Crecimiento preliminar del microorganismo: Este paso se realizó como en el Ensayo 1.
Rotura de las células y purificación de la quino! oxidasa: Para una purificación parcial de la proteína, se rompieron las células con la adición de 160 mg de lisozima y una hora de incubación a 0 °C seguido de tres ciclos de congelación-descongelación (-80 °C / 37 °C) y un paso final para reducir la viscosidad añadiendo 1000 unidades de desoxirribonucleasa L Para conseguir la purificación completa de la quinol oxidasa, se pasó la mezcla anterior por una columna de cromatografía de afinidad.
Preparación de menadiona: En dos ensayos diferentes, la mezcla de células rotas y las fracciones de quinol oxidasa purificada se pasaron a 50 mM de tampón fosfato suplementado con 25 mg/l de 2-metil-1 -naftol utilizando DMSO como disolvente. La incubación se realizó a 37 °C y agitación a 200 rpm durante un tiempo de reacción de dos, cinco y diez días. Después de estos periodos, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró y se analizó por GC-MS. Los resultados de los dos ensayos (con la mezcla de células rotas y con las fracciones de quinol oxidasa purificada) se muestran en la TABLA 1 (Ensayo 3).
Ensayo 4: Preparación de menadiona con guiñol oxidasa completa o parcialmente purificada de Escherichia coli qox v la addicíón de hexadecano
Crecimiento preliminar del microorganismo: Este paso se realizó como en el Ensayo 1.
Rotura de las células y purificación de la quinol oxidasa: Este paso se realizó como en el Ensayo 3.
Preparación de menadiona: En dos ensayos diferentes, la mezcla de células rotas y las fracciones de quinol oxidasa purificada se pasaron a 50 mM de tampón fosfato suplementado con 25 mg/l de 2-metil-1 -naftol utilizando hexadecano como disolvente en una proporción del 10% (v/v). La incubación se realizó a 37 °C y agitación a 200 rpm durante un tiempo de reacción de dos, cinco y diez días. Después de estos periodos, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró y se analizó por GC-MS. Los. resultados de los dos ensayos (con la mezcla de células rotas y con las fracciones de quinol oxidasa purificada) se muestran en la TABLA 1 (Ensayo 4).
Claims
1. Vector de expresión de ADN recombinante para la producción de menadiona en Escherichia coli, dicho vector comprendiendo una secuencia de nucleótidos que codifica una quinol oxidasa y secuencias de nucleótidos que permiten a dicho vector ser seleccionable y repiicable autónomamente en Escherichia coli.
2. Vector de expresión de ADN recombinante según la reivindicación 1 , que además comprende secuencias de nucleótidos que permiten incrementar la solubilidad y/o mejorar la purificación de la quinol oxidasa.
3. Vector de expresión de ADN recombinante según la reivindicación 2, donde una de las secuencias de nucleótidos codifica una cola de polihistidina en la posición C-terminal de la quinol oxidasa.
4. Vector de expresión de ADN recombinante según la reivindicación 2, donde una de las secuencias de nucleótidos codifica una cola de tioredoxina en la posición N-terminal de la quinol oxidasa.
5. Vector de expresión de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la secuencia de nucleótidos que permite al vector ser seleccionable y replicable autónomamente en Escherichia coli es el gen que codifica el promotor T7 que permite a la ARN polimerasa T7 de la cepa seleccionada de Escherichia coli unirse al promotor.
6. Vector de expresión de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la quinol oxidasa es la citocromo aa3 quinol oxidasa de bacterias Bacillus subtilis.
7. Vector de expresión de ADN recombinante según la reivindicación 6, donde las bacterias de Bacillus subtilis provienen de la cepa bacteriana Bacillus subtilis DSMZ 402.
8. Vector de expresión de ADN recombinante según la reivindicación 7, donde la secuencia de nucleótidos que codifica la citocromo aa3 quinol oxidasa de Bacílfus subtilís DSMZ 402 comprende ía SEQ ÍD NO: 5.
9. Bacterias Escherichia coli transformadas con el vector de expresión de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o sus bacterias descendientes.
- 5 10. Bacterias de la cepa Escherichia coli BL21 transformadas con el vector de expresión de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o sus bacterias descendientes. 0 11. Procedimiento de preparación de menadiona (I) que comprende los pasos de: (i) cultivar bacterias Escherichia coli en un medio de cultivo adecuado que comprende uno o más sustratos de fórmula (II), donde X e Y son radicales seleccionados independientemente entre H y OH, y (ii) recuperar la menadiona del medio de cultivo; dichas bacterias teniendo la 5 capacidad de producir menadiona porque comprenden un vector de ADN recombinante que codifica una quinol oxidasa.
12. Procedimiento de preparación de menadiona (l) que comprende Sos pasos de: (i) cultivar las bacterias Escherichia coli según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en un medio de cultivo adecuado que comprende uno o más sustratos dé fórmula (II), dónde X e Y son radicales seleccionados independientemente entre H y OH, y (ii) recuperar la menadiona de! medio de 0 cultivo.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde las células bacterianas están rotas; opcionalmeníe enriqueciendo el medio de cultivo en quino! oxidasa por separación de los restos celulares. 5
14. Procedimiento según la reivindicación 12, donde las células bacterianas están enteras.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, donde el medio de cultivo comprende 2-metil-1 -naftol.
16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12-15, donde las células bacterianas han sido precultivadas en un medio de cultivo que comprende triptona, extracto de levadura, cloruro sódico y un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en kanamicina, tetraciclina, carbenicilina y ampicilina.
17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12-16, donde el medio de cultivo comprende un hidrocarburo saturado lineal de 10 a 18 átomos de carbono.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, donde el hidrocarburo es hexadecano.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, donde la concentración de hexadecano en el medio de cultivo es de 10% v/v.
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|---|---|---|---|---|
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