ES2470618T3 - Obtención de acetona por fermentación a partir de materias primas renovables mediante una nueva ruta metabólica - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de acetona partiendo de la acetil-Coenzima A, que comprende las etapas de: A. una reacción enzimática de acetil-CoA para dar acetoacetil-CoA catalizada por una β-cetotiolasa B. una reacción enzimática de acetoacetil-CoA para dar acetoacetato y CoA catalizada por una acetoacetato- CoA hidrolasa, una acil-CoA-tioesterasa, una acil-CoA sintetasa o una acil-CoA-tiocinasa C. una descarboxilación de acetoacetato para dar acetona y CO2, catalizada por una acetoacetato descarboxilasa caracterizado por que en la etapa B de procedimiento, la coenzima A no es transferida a una molécula aceptora, y la reacción enzimática en la etapa B de procedimiento es catalizada por un polipéptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, 3 ó 5.

Description

Obtenci�n de acetona por fermentación a partir de materias primas renovables mediante una nueva ruta metabólica

Sector del invento Son objeto del invento una nueva ruta de biosíntesis enzim�tica para la producción de acetona, la cual, al contrario que los procedimientos de fermentación habituales, est� desacoplada de la formación de etanol y butanol, as� como las enzimas y los ácidos nucleicos que se utilizan en estos casos.

Estado de la técnica

Proceso ABE en Clostridium

El clásico proceso de fermentación ABE, es decir, la producción microbiana de acetona, butanol y etanol, fue el segundo proceso biotecnol�gico más grande a escala mundial durante un prolongado período de tiempo, directamente después de la fermentación de etanol con levaduras. La fermentación ABE comercial se inici� en 1916 en Inglaterra, en donde, entre otros, Chaim Weizmann descubrió la capacidad de Clostridium acetobutylicum para la formación de los disolventes acetona, butanol y etanol. El proceso fue utilizado hasta finales de los años 50 en el mundo occidental, y en Sur�frica incluso todavía hasta 1981.

Dos motivos principales son responsables de que este proceso fuese desechado: por una parte, la síntesis química de acetona y butanol se hizo cada vez más barata, y, por otra parte, el precio de los substratos de la fermentación aument� grandemente. Especialmente el precio de las melazas aument� grandemente debido a su utilización como aditivo para piensos de animales bovinos.

Los costes crecientes de los productos precursores petroquímicos, as� como también las nuevas posibilidades tecnológicas dentro del sector de la ingeniería de la ruta metabólica (en inglés "pathway engineering) de los microorganismos han abierto por fin nuevas opciones para el desarrollo de cepas de alto rendimiento y de procesos comerciales de fermentación para la producción de disolventes tales como la acetona.

La clásica fermentación ABE se basa en los organismos Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii. Ambos son gram positivos y se reproducen en condiciones estrictamente anaerobias. Estos organismos pueden convertir químicamente a mono-, di-y polisac�ridos, siendo las melazas y los almidones los substratos utilizados predominantemente en la fermentación.

El proceso de fermentación con C. acetobutylicum se subdivide en dos fases. En la primera fase, la formación de biomasa va acompañada por la formación de acetato, butirato y de trazas de etanol ("fase acidog�nica"). En la segunda fase, la denominada "fase solventog�nica", los ácidos son aprovechados entonces para formar los productos de fermentación acetona, butanol y etanol (ABE). Los productos acetona, butanol y etanol se forman en el

C. acetobutylicum del tipo silvestre en la relación de aproximadamente 3 : 6 : 1. Esta relación de productos puede variar en gran manera según sean las condiciones de cultivo escogidas (p.ej. el pH o la aportación de sustancias nutrientes) o los substratos empleados.

Las enzimas de la biosíntesis de los disolventes acetona, butanol y etanol est�n ampliamente purificadas y caracterizadas bioqu�micamente (compárese la Figura 1; Duerre, P., y Bahl, H. 1996. Microbial production of acetone/butanol/isopropanol (Producción microbiana de acetona/butanol/isopropanol). En: Biotechnology, tomo 6, 2a edición M. Roehr (compilador de edición), VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, Alemania. p. 229-268. Duerre,

P. 1998. New insights and novel developments in clostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation (Nuevos conocimientos y recientes desarrollos en la fermentación clostridiana de acetona/butanol/isopropanol). Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639-648.). También se encuentra presente la secuencia gen�mica de C. acetobutylicum (Noelling, J., Breton, G., Omelchenko, M. V. y otros 16 autores (2001). Genome sequence and comparative analysis of the solvent producing bacterium Clostridium acetobutylicum (Secuencia gen�mica y análisis comparativo de la bacteria productora de disolventes Clostridium acetobutylicum. J Bacteriol 183, 4823-4838.).

En los últimos años se desarroll� una serie de herramientas genéticas, que hacen posible un deliberado tratamiento ingenieril de la ruta metabólica. Hasta ahora, est�n a disposición tres replicones diferentes, que se conservan de una manera estable (pIM13, pCBU2 y pAM�1; Lee y colaboradores (1992). Vector construction, transformation, and gene amplification in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Construcción de vectores, transformación y amplificación g�nica en Clostridium acetobutylicum ATCC 824). Ann. N. Y. Acad. Sci. 665: 39-51; Minton y colaboradores 1993). Clostridial cloning vectors (Vectores de clonaci�n clostridiana). En: The clostridia and biotechnology (Las clostridias y su biotecnolog�a) (D. R. Woods; compilador de edición). Butterworth-Heinemann. Stoneham, EE.UU. P. 119-150) y dos marcadores de resistencia a antibióticos frente a eritromicina y tiamfenicol (Green y Bennett (1998). Genetic manipulation of acid and solvent formation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824. (Manipulación genética de la formación de ácidos y disolventes en Clostridium acetobutylicum ATCC 824). Biotechnol. Bioeng. 58: 215-21.).

Por el contrario, ciertos métodos tales como la desactivación por inserción o las supresiones (deleciones) de genes todavía no son realizables de una manera rutinaria, y también la inhibición de la expresión g�nica basada en una orientación antisentido varía en cuanto a la efectividad en este conjunto de organismos y nunca es completa (Desai y Papoutsakis (1999). Antisense RNA strategies for metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum (Estrategias con ARN antisentido para la ingeniería metabólica de Clostridium acetobutylicum). Appl. Environ. Microbiol. 65:93645; Tummala y colaboradores (2003). Antisense RNA downregulation of coenzyme A transferase combined with alcohol-aldehyde dehydrogenase overexpression leads to predominantly alcohologenic Clostridium acetobutylicum fermentations (Una regulaci�n en sentido descendente con un ARN antisentido de la coenzima A transferasa, combinada con una sobreexpresi�n de la alcohol-aldeh�do deshidrogenasa, conduce a unas fermentaciones predominantemente alcoholog�nicas de Clostridium acetobutylicum). J. Bacteriol. 185:3644-53). Una serie de publicaciones describe la ingeniería de la ruta metabólica de biosíntesis tanto "solventog�nica" como también "acidog�nica". La desactivación de los genes buk (de la butirato cinasa) o pta (de la fosfotransacetilasa) condujo a unas disminuciones drásticas de las concentraciones de butirato o respectivamente de acetato (Green y colaboradores (1996); Genetic manipulation of acid formation pathways by gene inactivation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Manipulación genética de la rutas metabólicas de formación de ácidos mediante desactivación de genes en Clostridium acetobutylicum ATCC 824). Microbiology. 142:2079-86; Harris y colaboradores (2000). Characterization of recombinant strains of the Clostridium acetobutylicum butyrate kinase inactivation mutant: need for new phenomenological models for solventogenesis and butanol inhibition? (Caracterización de cepas recombinantes del mutante con desactivación de la butirato cinasa de Clostridium acetobutylicum: �Existe una necesidad de nuevos modelos fenomenol�gicos para la solventog�nesis y la inhibición de butanol Biotechnol. Bioeng. 67:1-11). A pesar de ello, por estos mutantes se formaban butirato y acetato, puesto que las enzimas acetato cinasa y fosfotransbutirilasa sustituían a las enzimas desactivadas butirato cinasa y fosfotransacetilasa. Ambas cepas formaban altas concentraciones de ácido l�ctico, el cual no se enriquece por el C. acetobutylicum del tipo silvestre, posiblemente como una reacción al enriquecimiento del piruvato. La desactivación de la aldeh�do/alcohol-deshidrogenasa adhE/aad conducía a un drástico hundimiento de la formación de butanol y a un simultáneo aumento de las concentraciones de butirato. Sin embargo, las concentraciones de butirato y butanol que son usuales en el tipo silvestre se ajustan de nuevo cuando el gen adhE/aad es expresado sobre un pl�smido en este mutante. De modo interesante, ni en el mutante de AdhE/aad ni en la cepa con la complementaci�n con adhE/aad se pudo detectar una formación de acetona. Este fenómeno se basa en unos efectos polares, que repercuten sobre dos genes localizados corriente abajo (“downstream”) del adhE/aad. Estos dos genes codifican las dos subunidades de la coenzima A transferasa, que es esencial para la biosíntesis de acetona (Green, E.M, y Bennett, G.N. 1996. Inactivation of an aldehyde/ alcohol dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (Desactivación de un gen de la aldeh�do/ alcohol deshidrogenasa de Clostridium acetobutylicum ATCC 824).Appl. Biochem. Biotechnol. 57/58: 213-221). éste es el primer ejemplo descrito de que mediante un tratamiento ingenieril de una ruta metabólica en C. acetobutylicum se pueden desacoplar una de otra las formaciones de acetona y butirato.

En otras publicaciones se confirm� esta observación. En estos estudios se investigaron unas cepas microbianas, que han perdido la capacidad de formar acetona y butanol, puesto que a ellas les falta el megapl�smido de 192 kb pSOL1. En este pl�smido est�n localizados la mayoría de los genes para la formación de acetona y butanol, y también algunos genes para la síntesis de etanol (Cornillot, E., Nair, R., Papoutsakis, E.T., y Soucaille, P. 1997. The genes for butanol and acetone formation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 reside on a large plasmid whose loss leads to degeneration of the strain (Los genes para la formación de butanol y acetona en Clostridium acetobutylicum ATCC 824 residen en un gran pl�smido, cuya pérdida da lugar a la degeneración de la cepa). J.Bacteriol. 179: 5442-5447). Estas cepas degeneradas forman sólo la mitad de la cantidad de etanol que forman las cepas de tipo silvestre en comparación. Estas cepas, partiendo de C. acetobutylicum ATCC 824, fueron designadas como M5 (resultante mediante una mutag�nesis química) y DG1 (obtenida mediante una cultivaci�n múltiple del tipo silvestre). éstas servían como receptoras de pl�smidos, que llevaban las secuencias codificadoras de proteínas de las subunidades A y B de la coenzima A transferasa (ctfA y ctfB), as� como el gen de la acetoacetato descarboxilasa (adc), o de la butiraldeh�do/butanol deshidrogenasa (adhE/aad). Las cepas resultantes producían o bien sólo acetona o sólo butanol (Mermelstein y colaboradores (1993). Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 for increased solvent production by enhancement of acetone formation enzyme activities using a synthetic operon (Ingeniería metabólica de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 para conseguir una producción aumentada de disolventes mediante un aumento de las actividades enzim�ticas para la formación de acetona utilizando un oper�n sintético). Biotech. Bioeng. 42:1053-1060.; Nair, R.V., y Papoutsakis, E. T. 1994. Expression of plasmidencoded aad in Clostridium acetobutylicum M5 restores vigorous butanol production (La expresión del aad codificado en un pl�smido en Clostridium acetobutylicum M5 regenera la producción vigorosa de butanol J. Bacteriol. 176: 5843-5846; Cornillot, E., Nair, R., Papoutsakis, E.T., y Soucaille, P. 1997. The genes for butanol and acetone formation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 reside on a large plasmid whose loss leads to degeneration of the strain (Los genes para la formación de butanol y acetona en Clostridium acetobutylicum ATCC 824 residen en un pl�smido grande, cuya pérdida da lugar a la degeneración de la cepa). J. Bacteriol. 179: 5442-5447). Los títulos medidos para el respectivo disolvente estaban situados fundamentalmente por debajo de las concentraciones de acetona y butanol en el tipo silvestre, pudiéndose acumular acetato y butirato hasta llegar a una concentración total de 240 mM. La formación de etanol se podía restablecer de nuevo hasta el nivel del tipo silvestre con unos pl�smidos, que llevaban el gen adhE/aad.

En la Figura 2 se representa la ruta metabólica clásica, caracterizada en Clostridium para la síntesis de acetona. Esta ruta metabólica parte de la acetil-CoA, que es un metabolito central primordial, que se forma en todos los

microorganismos, independientemente de cual sea la fuente de C que sea metabolizada o de cuales sean las rutas metabólicas que se hayan establecido. Las enzimas, que se requieren son: la β-cetotiolasa, las dos subunidades de la acetil-CoA/butiril-CoA transferasa, y la acetoacetato descarboxilasa.

Se pudo mostrar que la expresión heter�loga de estas enzimas de C. acetobutylicum en Escherichia coli, que catalizan la formación de acetona partiendo de la acetil-CoA (con la acetoacetato descarboxilasa, la acetil- CoA/butiril-CoA transferasa y la tiolasa) conduce en este organismo a una formación de acetona de aproximadamente 150 mM, pero resultaron también de una manera desventajosa altas cantidades de acetato (50 mM) (Bermejo L. L., N. E. Welker, E. T. Papoutsakis. 1998. Expression of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Genes in Escherichia coli for Acetone Production and Acetate Detoxification (Expresión de genes de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 en Escherichia coli para la producción de acetona y la desintoxicación con respecto del acetato). Appl. Env. Microbiol. 64:1079-1085). Otra ventaja consiste, en este caso, en que la acetona era producida solamente en condiciones aerobias, puesto que los equivalentes de redox, que resultan durante la metabolizaci�n de glucosa para dar acetil-CoA, no pueden ser reoxidados por E. coli en condiciones anaerobias. En este procedimiento, por medio de la enzima que cataliza la reacción, la CoA separada del acetoacetilo era transferida de nuevo a una molécula aceptora.

Enzimas que disocian acil-CoA Unas enzimas, que pueden hidrolizar a la acil-CoA, pueden ser p.ej. acil-CoA tioesterasas o acil-CoA tiocinasa. La diferencia principal entre la hidrólisis de acil-CoA por una acil-CoA tioesterasa o una acil-CoA sintetasa / acil-Coa tiocinasa es la formación de ATP o respectivamente de GTP en el caso de las cinasas, puesto que la hidrólisis de la acetoacetil-CoA posee un más alto valor de ΔG0' de -44kJ en comparación con el de la hidrólisis del ATP (-31,8 kJ).

Acetoacetil-Co hidrolasa (EC 3.1.2.11) Esta enzima cataliza la hidrólisis de acetoacetil-CoA para dar acetoacetato y la coenzima A, sin que en este caso la molécula CoA sea transferida simultáneamente a una molécula aceptora tal como p.ej. un ácido carbox�lico.

Acil-CoA tioesterasas (EC 3.1.2.18) La proteína YbgC de Haemophilus influenzae es una acil-CoA tioesterasa (EC 3.1.2.18) específica para moléculas de cadena corta, que acepta a butiril-CoA y β-hidroxibutirato-CoA como substratos. Los valores de Km son de 24 mM o respectivamente 20 mM para estos substratos (Zhuang y colaboradores, (2002). The YbgC protein encoded by the ybgC gene of the tol-pal gene cluster of Haemophilus influenzae catalyzes acyl-coenzyme A thioester hydrolysis (La proteína YbgC codificada por el gen ybgC del racimo de genes tol-pal de Haemophilus influenzae cataliza la hidrólisis del tio�ster de la acil-coenzima A) . FEBS Lett. 516:161-3.).

Tambi�n en Bacillus subtilis se ha descrito una tioesterasa II (TEIIsrf) con la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 1 y una correspondiente secuencia de ADNc SEQ ID No. 2, que se presenta asociada con las p�ptido sintetasas no ribosomales para la formación del antibiótico pept�dico surfactina (Schwarzer D., H. D. Mootz, U. Linne, M. A. Marahiel. 2002. Regeneration of misprimed nonribosomal peptide synthetases by type II thioesterases (Regeneración de p�ptido sintetasas no ribosomales mal cebadas por tioesterasas del tipo II. PNAS 99:1408314088).

Acil-CoA sintetasas / acil-CoA tiocinasas (mediando formación de AMP; EC 6.2.1.2, y mediando formación de GDP; EC 6.2.1.10)) La función fisiológica de estas dos enzimas mencionadas reside en la síntesis de acil-CoA, pero también se conocen unos ejemplos, en los que estas enzimas catalizan la reacción hidrol�tica inversa mediando formación de ATP, tal como p.ej. la succinil-CoA tiocinasa en el ciclo de los ácidos tricarbox�licos. Hasta ahora, para las clases de enzimas más arriba mencionadas no se detect�, ni in vitro ni in vivo, que ellas sean capaces de hidrolizar a la acetoacetil-CoA mediando formación de acetoacetato y la coenzima A libre.

La degradación de polihidroxialcanos por una acil-Coa sintetasa mediando formación de AMP ha sido descrita para AcsA2 procedente de Sinorhizobium meliloti (Aneja y colaboradores (2002). Identification of an acetoacetyl coenzyme A synthetase-dependent pathway for utilization of L-(+)-3-hydroxybutyrate in Sinorhizobium meliloti (Identificación de una ruta metabólica dependiente de la acetoacetil coenzima A sintetasa para la utilización de L-(+)3-hidroxibutirato en Sinorhizobium meliloti. J. Bacteriol. 184:1571-7.).

En el caso de otra enzima purificada procedente de Pseudomonas aeruginosa se podía detectar una acil-CoA sintetasa / acil-CoA tiocinasa (mediando formación de AMP; EC. 6.2.1.2) específica para moléculas de cadena corta. Esta enzima acepta tanto a la butiril-CoA y a la β-hidroxibutiril-CoA as� como también al 2-cetobutirato como substrato, con unos muy bajos valores de Km de en cada caso 10, 25 y 25 μM (Shimizu y colaboradores (1981). Butyryl-CoA synthetase of Pseudomonas aeruginosa-purification and characterization (Purificación y caracterización de la butiril-CoA sintetasa de Pseudomonas aeruginosa). Biochem. Biophys. Res. Commun. 103:1231-7.).

Una misión del presente invento fue, por lo tanto, poner a disposición una nueva ruta metabólica simplificada para la síntesis de acetona partiendo de acetil-CoA.

Descripci�n del invento El invento aquí descrito trata de la producción mejorada de acetona con ayuda de unas técnicas enzim�ticas recombinantes: Partiendo de acetil-CoA, y pasando por acetoacetil-CoA, se genera acetoacetato, el cual es transformado a continuación en acetona y CO2. Por lo tanto son objeto del presente invento un procedimiento para la producción de acetona tal como se describe en la reivindicación 1, as� como unas secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 13.

El procedimiento conforme al invento tiene la ventaja de que la butirato-acetoacetato-CoA transferasa, que en los sistemas habituales transforma a la acetoacetil-CoA en acetoacetato, y que se compone de dos subunidades, es reemplazada por una enzima, que puede ejercer su actividad en forma de un mon�mero.

De esta manera, el procedimiento conforme al invento tiene la ventaja adicional de que los rendimientos de acetona en un sistema establecido son más altos que con la conocida butirato-acetoacetato-CoA transferasa. Otra ventaja consiste en que la relación del acetato a la acetona durante el proceso de producción es desplazada en favor de la acetona.

Todav�a otra ventaja del procedimiento conforme al invento consiste en el hecho de que la síntesis de acetona est� desacoplada de la de butanol y etanol, y por consiguiente, en el caso de la utilización de unos organismos productores microbianos, éstos no se intoxican por los productos secundarios alcohólicos resultantes. Esto da lugar a unas concentraciones más altas del producto en el medio y por consiguiente a unos mejorados rendimientos de espacio-tiempo.

Otra ventaja de la producción de acetona desacoplada de la de butanol y etanol consiste en un protocolo simplificado de fermentación, as� como en un aislamiento y un tratamiento más sencillos del producto, puesto que éste ya no tiene que ser separado de los productos secundarios alcohólicos. Esto conduce también a un consumo de energía más pequeño, comparado con el de la separación del producto en el caso de la fermentación ABE clásica. Por lo demás, en el procedimiento conforme al invento es ventajoso el hecho de que él se puede llevar a cabo en diferentes microorganismos, que han sido especialmente bien caracterizados, que se pueden cultivar de manera sobresaliente de una manera tanto aerobia como también anaerobia, y para los que se conocen las más diversas posibilidades de manipulación genética y por consiguiente otras posibilidades de mejoramiento. En resumidas cuentas, la producción efectiva de acetona por fermentación a partir de unas materias primas renovables constituye una contribución adicional a una producción, respetuosa para el medio ambiente y protectora de los recursos, de un producto químico industrial.

El procedimiento conforme al invento para la producción de acetona y la utilización de unos polip�ptidos as� como de unos ácidos nucleicos indicados para la realización del procedimiento conforme al invento se describen a continuación a modo de ejemplo, sin que el invento deba de estar restringido a esta forma ejemplificativa de realización. Por el concepto de "polip�ptidos" se entienden los que tienen una longitud de cadena arbitraria. Por consiguiente, por este concepto se entienden también proteínas y enzimas de cualquier tipo y en particular unas acetoacetato-CoA hidrolasas, acil-CoA tioesterasas, acil-CoA sintetasas o acil-CoA tiocinasas. Por el concepto de "una reacción que se efectúa espontáneamente" se ha de entender una reacción química exerg�nica.

Por el concepto de hibridar "en condiciones rigurosas" se han de entender unas condiciones de ensayo, como se emplean por ejemplo en la técnica de borrón de transferencia Northern, la utilización de una solución de lavado caliente a una temperatura de 50 -70 �C, de manera preferida de 60 -65 �C, por ejemplo un tampón 0,1x SSC con 0,1 % de SDS (20x SSC: NaCl 3 M, citrato de Na 0,3 M, pH 7,0) para la eluci�n de unas sondas de ADNc o de unos oligonucle�tidos hibridadas/os inespec�ficamente. En este caso, permanecen fijados unos a otros solamente unos ácidos nucleicos, que son complementarios en alto grado. El ajuste de unas condiciones rigurosas es conocido por un experto en la especialidad y ha sido descrito en la cita de Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

El presente invento contiene un procedimiento para la producción de acetona partiendo de la acetil-coenzima A, que abarca las siguientes etapas: A. una reacción enzim�tica de acetil-CoA para dar acetoacetil-CoA, B. una reacción enzim�tica de acetoacetil-CoA para dar acetoacetato y CoA y C. una descarboxilaci�n de acetoacetato para dar acetona y CO2, y que est� caracterizado por que en la etapa B de procedimiento la coenzima A no es transferida a una molécula aceptora.

En el procedimiento conforme al invento, en la etapa A de procedimiento se emplea una β-cetotiolasa para la reacción enzim�tica de acetil-CoA para dar acetoacetil-CoA. De manera preferida, se emplea una β-cetotiolasa procedente de Clostridium spec., por lo tanto, un microorganismo del género Clostridium, de manera especialmente preferida procedente de Clostridium acetobutylicum o Clostridium beijerinckii. De manera preferida, la reacción enzim�tica en la etapa de procedimiento A es catalizada por un polip�ptido con una actividad de cetotiolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90% de manera preferida en por lo menos un 95%, y de manera más preferida en un 96, 97, 98, 99 o 100 % a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 16.

En el procedimiento conforme al invento, en la etapa C de procedimiento se emplea una acetoacetato descarboxilasa para la conversión química de acetoacetil-CoA en acetona y CO2. De manera preferida, se emplea una acetoacetato descarboxilasa procedente de Clostridium spec., por lo tanto un microorganismo del género Clostridium, de manera especialmente preferida procedente de Clostridium acetobutylicum o Clostridium beijerinckii. De manera preferida, la reacción enzim�tica en la etapa C de procedimiento es catalizada por un polip�ptido con una actividad de acetoacetato descarboxilasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 % y de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 18. Otra forma de realización del procedimiento conforme al invento est� caracterizada por que la reacción en la etapa C de procedimiento se efectúa espontáneamente.

El procedimiento conforme al invento para la producción de acetona se distingue por el hecho de que en la etapa B de procedimiento, la coenzima A no es transferida a una molécula aceptora. Esto se consigue mediante el recurso de que se emplean unas enzimas con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa, que tienen una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 1, 3 o 5. Sorprendentemente, unas enzimas, a las que no se había atribuido hasta ahora esta actividad, tales como p.ej. las escogidas entre el conjunto formado por las acil-CoA tioesterasas, unas acil-CoA sintetasas o acil-CoA tiocinasas, pueden resolver asimismo el problema planteado por esta misión. Por lo tanto, en el procedimiento conforme al invento, la reacción enzim�tica en la etapa B de procedimiento es catalizada por una acetoacetato-CoA hidrolasa, una acil-CoA tioesterasa, una acil-CoA sintetasa o una acil-CoA tiocinasa.

En una forma preferida de realización del procedimiento conforme al invento, la reacción enzim�tica en la etapa B de procedimiento puede ser catalizada por un polip�ptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 % y de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 1. En otra forma preferida de realización del procedimiento conforme al invento, la reacción enzim�tica en la etapa B de procedimiento puede ser catalizada por un polip�ptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 % y de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 3. En una forma especialmente preferida de realización del procedimiento conforme al invento, la reacción enzim�tica en la etapa B de procedimiento puede ser catalizada por un polip�ptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 % y de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 5.

De manera preferida el procedimiento se lleva a cabo por medio de microorganismos. Los microorganismos utilizados para el procedimiento pueden poseer de por s� la capacidad de sintetizar acetona, o pueden ser capacitados para formar acetona tan sólo mediante la ingeniería genética de la ruta metabólica. Esto se puede conseguir mediante un aumento de la concentración celular o de la actividad de unas enzimas, que catalizan una síntesis de acetona independiente de la de acetato, partiendo de acetil-CoA.

De manera preferida, el procedimiento conforme al invento se lleva a cabo en unos microorganismos modificados por tecnología genética. Tales microorganismos pueden proceder p.ej. de un género escogido entre el conjunto formado por Clostridium, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula y Saccharomyces. Unas especies de estos géneros, dadas a modo de ejemplo, son Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae. En el procedimiento conforme al invento se prefiere un organismo, escogido entre el conjunto formado por Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Clostridium spec., Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Yarrowia lipolytica, Saccharomyces spec., Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, y se prefiere especialmente la cepa "E. coli pUC19ayt", compárense los Ejemplos 5 y 6.

Unos microorganismos recombinantes pueden ser producidos mediante los procedimientos recombinantes de tecnología genética, que son conocidos por un experto en la especialidad. Por lo general, los vectores que llevan los genes ajenos son introducidos en las células mediante unas técnicas convencionales de transformación o transfecci�n. Unos métodos adecuados se pueden encontrar en la obra de Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonaci�n molecular: Un manual de laboratorio). 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). En el caso de los microorganismos utilizados se puede tratar de unas cepas, que habían sido producidas mediante mutag�nesis y selección, mediante unas técnicas de ADN recombinante o mediante una combinación de ambos métodos. Para la mutag�nesis se pueden utilizar unos clásicos procedimientos de mutag�nesis in vivo mediando utilización de unas sustancias mut�genas tales como, por ejemplo, la N-metil-N'-nitroN-nitrosoguanidina o luz ultravioleta. Además, para la mutag�nesis se pueden utilizar unos métodos in vitro tales como, por ejemplo, un tratamiento con hidroxilamina (Miller; J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Un breve curso de genética bacteriana. Un manual de laboratorio para Escherichia coli y bacterias relacionadas con ella), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) o unos oligonucle�tidos mut�genos (T. A. Brown: Gentechnologie f�r Einsteiger (Tecnología genética para principiantes), editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como se ha descrito en el manual de Newton y Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994).

Otras instrucciones para la producción de mutaciones se pueden deducir a partir del estado de la técnica y de unos conocidos manuales de genética y biología molecular tales como p.ej. el libro de texto de Knippers ("Molekulare Genetik" (Genética molecular), 6a edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemania, 1995), el de Winnacker ("Gene und Klone" (Genes y clones), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1990) o el de von Hagemann ("Allgemeine Genetik", (Genética general) Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

En el caso de la utilización de unos métodos in vitro, el gen descrito en el estado de la técnica, partiendo de un ADN total aislado de una cepa de tipo silvestre, se amplifica con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, eventualmente se clona en unos vectores plasm�dicos adecuados, y el ADN se somete a continuación a unos procedimientos de mutag�nesis. Unas instrucciones para la amplificación de secuencias de ADN con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, acr�nimo de "Polymerase Chain Reaction”)) las puede encontrar un experto en la especialidad, entre otros, en el manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (Síntesis de oligonucle�tidos: Una aproximación práctica) (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) y en la obra de Newton y Graham: PCR (editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994). De igual manera, se pueden utilizar también unos métodos de mutag�nesis in vitro tal como se describen, por ejemplo, en el conocido manual de Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU., 1989). Unos correspondientes métodos est�n disponibles comercialmente también en forma de unos denominados "estuches" tales como, por ejemplo, el "QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit" (estuche de mutag�nesis dirigida a un sitio QuikChange) de la entidad Stratagene (La Jolla, EE.UU.) descrito por Papworth y colaboradores (Strategies 9(3), 3-4 (1996)).

Asimismo, son objeto del invento unos pl�smidos, que contienen los polinucle�tidos empleados conforme al invento y que se replican eventualmente en las bacterias. Asimismo se divulgan los microorganismos recombinantes, que habían sido transformados con los mencionados vectores. En este caso, los polinucle�tidos pueden estar bajo el efecto de un único promotor o de varios promotores. El concepto de "refuerzo" describe en este contexto el aumento de la actividad intracelular o de la concentración de una o varias enzimas o proteínas en un microorganismo, que son codificadas por el correspondiente ADN, mediante el recurso de que, por ejemplo, se aumenta el número de copias del gen o respectivamente de los genes, del ORF o respectivamente de los ORF en por lo menos una (1) copia, un promotor fuerte est� unido funcionalmente con el gen o se utiliza un gen o un alelo o un ORF, que codifica una correspondiente enzima o respectivamente proteína con una alta actividad, y eventualmente se combinan estas medidas. En E. coli, como promotores fuertes se mencionan ejemplificativamente lac, tac y trp. Por el concepto de "marco abierto de lectura" (ORF, acr�nimo de "open reading frame") se designa a un segmento de una secuencia de nucleótidos, que codifica o puede codificar una proteína o respectivamente un polip�ptido o un ácido ribonucleico, a la (al) que no se le puede asignar ninguna función de acuerdo con el estado de la técnica. Después de la asignación de una función al correspondiente segmento de la secuencia de nucleótidos, se habla por lo general de un gen. Por el concepto de "alelos" se entienden por lo general unas formas alternativas de un determinado gen. Las formas se distinguen por ciertas diferencias en la secuencia de nucleótidos.

Por el concepto de "producto g�nico" se designa, por lo general, a la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos, es decir por un ORF, un gen o un alelo, o al ácido ribonucleico codificado. Mediante las medidas de refuerzo, en particular de sobreexpresi�n, se aumenta la actividad o la concentración de la correspondiente proteína por lo general en por lo menos un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % o 500 %, como máximo hasta un 1.000 % o 2.000 %, referido a la proteína de tipo silvestre o respectivamente a la actividad o a la concentración de la proteína en el microorganismo o en la cepa parental no recombinante para la correspondiente enzima o proteína. Por el concepto de un microorganismo o cepa parental (en inglés "parent strain") no recombinante se entiende un microorganismo, en el que se lleva a cabo el refuerzo o la sobreexpresi�n. Los genes o las construcciones artificiales de genes pueden presentarse o bien en unos pl�smidos en diferentes números de copias o pueden ser integrados/as y amplificados/as. Alternativamente, se puede conseguir por lo demás una sobreexpresi�n de los correspondientes genes mediante una modificación de la composición de los medios y de la conducción del cultivo.

Es objeto del invento un procedimiento, en el que unos microorganismos modificados genéticamente expresan unos ácidos nucleicos, que codifican unas enzimas tales como las más arriba descritas, que pueden llevar a cabo las etapas A hasta C de procedimiento.

El procedimiento conforme al invento est� caracterizado por que el microorganismo contiene por lo menos

un ácido nucleico a, que codifica proteicamente por lo menos un polip�ptido

con una actividad de cetotiolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un

90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 % y de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %,

99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 16, un ácido nucleico b, que codifica proteicamente por lo menos un polip�ptido que es una acetoacetato-CoA hidrolasa, una acil-CoA tioesterasa, una acil-CoA sintetasa o una acil-CoA tiocinasa,

o con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 %, de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 1,

o con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 %, de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 3,

o con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 %, de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 5,

y un ácido nucleico c, que codifica proteicamente por lo menos un polip�ptido con una actividad de acetoacetato descarboxilasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 %, de manera preferida en por lo menos un 95 %, de manera más preferida en un 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %, a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 18,

siendo utilizados los ácidos nucleicos a, b y c con la finalidad de asegurar la expresión del polip�ptido en el microorganismo.

En este caso, se emplea de manera preferida un ácido nucleico, que se escoge entre: aa una secuencia de ADN descrita por la secuencia 17 o por su cadena complementaria, bb unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de

ADN descritas dentro de aa cc unas secuencias de ADN, que sin la degeneración del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN definidas en aa y bb.

Como un ácido nucleico c se emplea de manera preferida uno que se escoge entre dd una secuencia de ADN descrita por la secuencia 19 o por su cadena complentaria, ee unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de

ADN descritas dentro de dd, ff unas secuencias de ADN, que sin la degeneración del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN definidas en dd y ee.

Como un ácido nucleico b se emplea uno que se escoge entre: gg una secuencia de ADN descrita por la secuencia 2 o por su cadena complementaria, hh unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de

ADN descritas dentro de gg ii unas secuencias de ADN, que sin la degeneración del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN definidas en gg y hh.

o de manera preferida entre: jj una secuencia de ADN descrita por la secuencia 4 o por su cadena complementaria, kk unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de

ADN descritas dentro de jj ll unas secuencias de ADN, que sin la degeneración del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN definidas en jj y kk,

o de manera especialmente preferida entre: mm una secuencia de ADN descrita por la secuencia 6 o por su cadena complementaria, nn unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de

ADN descritas dentro de mm, oo unas secuencias de ADN, que sin la degeneración del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN definidas en mm y nn.

En unas formas preferidas de realización del procedimiento conforme al invento, los ácidos nucleicos a, b y c est�n situados en una cadena de nucleótidos, que hace posible una expresión de la totalidad de los tres productos g�nicos.

De manera especialmente preferida, los ácidos nucleicos a, b y c est�n situados en una cadena de nucleótidos y

�sta se escoge entre el conjunto formado por: el pl�smido pSKatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 7, el pl�smido pKSatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 8, el pl�smido pUC19att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 9, el pl�smido pUC18att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 10, y el pl�smido pUC19ayt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 11.

Por consiguiente, son objeto del invento también los ácidos nucleicos el pl�smido pSKatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 7, el pl�smido pKSatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 8, el pl�smido pUC19att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 9, el pl�smido pUC18att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 10, y el pl�smido pUC19ayt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 11.

En los Ejemplos expuestos en lo sucesivo se describe el presente invento ilustrativamente, sin que el invento, cuya amplitud de uso se establece a partir de la descripción global y de las reivindicaciones, deba de ser restringido a las formas de realización mencionadas en los Ejemplos.

Figura 1: Biosíntesis de acetona, butanol y etanol Figura 2: Biosíntesis de acetona Figura 3: Expresión de la TEIIsrf en E. coli M15 Figura 4: Purificación de la TEIIsrf a partir de E. coli Figura 5: Diagramas de Lineweaver-Burk para la determinación de los valores de Km de TEIIsrf para los substratos

acetil-CoA y acetoacetil-CoA Figura 6: Expresión de AACS en E. coli BL21 (DE3) Figura 7: Purificación de AACS a partir de E. coli Figura 8: Expresión y purificación de YbgC Figura 9: Representación esquemática de la clonaci�n sucesiva de los genes adc, teIIsrf y thlA en el pl�smido pSK. Figura 10: Producción de las construcciones artificiales pUC19 Figura 11: Formación de acetona y acetato en cultivos de 5 ml de diferentes vectores de expresión en E. coli HB101 Figura 12: Formación de acetona y acetato en cultivos de 100 ml de E. coli HB101 con pUC19ayt (YbgC) y

pUC19act (testigo CtfA/B)

Ejemplos

Ejemplo 1: Tioesterasa II (TEIIsrf) procedente de Bacillus subtilis

Esta enzima est� asociada con las p�ptido sintetasas no ribosomales para la formación de surfactina (antibióticos del tipo de p�ptidos) en B. subtilis ATCC 21332. Schwarzer y colaboradores pudieron clonar el correspondiente gen (pTEIIsrf) en el pl�smido pQE60, que proporciona la fusión de la proteína diana con una marca His situada junto al extremo terminal de C, y purificar la proteína (de 28 kDa) (Schwarzer D., H. D. Mootz, U. Linne, M. A. Marahiel. 2002. Regeneration of misprimed nonribosomal peptide synthetases by type II thioesterases (Regeneración de p�ptido sintetasas no ribosomales mal cebadas por tioesterasas del tipo II). PNAS 99:14083-14088). En unas subsiguientes investigaciones se detect� para esta proteína una actividad hidrol�tica con acetil-CoA y propionil-CoA como substratos.

El pl�smido pTEIIsrf con la SEQ ID No. 13 fue producido tal como se ha descrito en la cita bibliográfica de Schwarzer D, Mootz HD, Linne U, Marahiel MA. Regeneration of misprimed nonribosomal peptide synthetases by type II thioesterases. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Oct 29; 99(22):14083-8. La expresión de la proteína se efectuaba en E. coli M15 en un medio LBAmp a 30 �C y 150 rpm (revoluciones por minuto), y era inducida en el caso de una densidad óptica (DO600nm) de 0,6 -0,8 con IPTG 1 mM. Después de otras 2 horas se cosechaba el cultivo. Unas muestras tomadas durante el crecimiento confirmaban la expresión exitosa de la proteína. La Fig. 3 muestra un gel de SDS-poliacrilamida al 12 % después de una tinción según Coomassie, sobre el que se habían aplicado 15 μl de extracto en bruto por cada banda; 1: antes de la inducción, 2: 1 h después de la inducción, 3: 2 h después de la inducción. La prevista medición de la actividad mediante un ensayo con DTNB [5,5'-ditiobis(ácido 2-nitro-benzoico)], con el que se determinan los grupos SH libres, requería la purificación de la proteína. Esto se efectuaba de un modo apoyado por una FPLC a través de la marca His fusionada de TEIIsrf mediante una cromatograf�a por afinidad con un quelato de metal en Ni2+-NTA-agarosa y unos gradientes crecientes de imidazol. Para esto, primeramente las células se cosechaban (a 5.000 x g, 15 min, 4 �C), se suspendían en 3 ml/g de peso en fresco de un tampón de disgregaci�n celular (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,8) y eventualmente se almacenaban a -20 �C. Mediante un tratamiento con ultrasonidos (en un Sonicator Bandelin Sonopuls, de Bandelin Berlin) se disgregaban las células y el extracto en bruto se obtenía mediante una centrifugaci�n (a 30.000 x g, 30 min, 4 �C). La purificación se efectuaba en una instalación de FPLC (de Pharmacia Biotech GmbH). Sobre la columna de Ni2+-NTA-agarosa (de Qiagen Superflow, volumen del lecho 5 ml) previamente preparada y equilibrada de un modo correspondiente según los datos del fabricante (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 30 mM, pH 7) se aplicaron 3,5 ml del extracto en bruto. A continuación, la columna se lavaba con 50 ml de un tampón de equilibraci�n. La eluci�n se efectuaba con un gradiente lineal de imidazol a lo largo de 50 ml (30 -300 mM de imidazol en HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7). La Fig. 4 muestra en la zona superior el perfil de eluci�n de la FPLC en presencia de Ni2+-NTA-agarosa (de Qiagen Superflow, volumen del lecho 5 ml) en el caso de un programa con: un lavado con 0-50 ml, una eluci�n con 50-100 ml con imidazol 30-300 mM (gradiente lineal) y unos tamaños de las fracciones de en cada caso 1 ml; en la zona inferior se representa un gel de SDS-PAGE al 12 % teñido según Coomassie, sobre el que se aplican las fracciones de eluci�n 23-31, en cada caso 1 μg de proteína/pista.

Las fracciones obtenidas se reunieron y emplearon para la determinación de la actividad. Como substratos servían acetoacetil-CoA y como comparación acetil-CoA. En el ensayo con DTNB, el grupo sulfhidrilo situado en un extremo de la CoA, que se había puesto en libertad mediante la reacción enzim�tica para dar acetoacetato o respectivamente acetato, reacciona con DTNB para dar un producto coloreado, que puede ser determinado por medios fotom�tricos a 412 nm.

Se determinaron los siguientes valores de Km: Para la acetil-CoA éste fue de 2 . 10-4 moles . l-1 (0,2 mM) y para la acetoacetil-CoA éste fue de 7,7 . 10-4 moles . l-1 (0,77 mM). Por consiguiente, la TEIIsrf tiene una afinidad más alta para el substrato acetil-CoA. La Fig. 5 muestra el diagrama de Lineweaver-Burk para la determinación de los valores de Km de TEIIsrf para los substratos acetil-CoA y acetoacetil-CoA.

Ejemplo 2: Acetoacetil-CoA sintetasa (AACS) procedente de Sinorhizobium meliloti La acetoacetil-CoA sintetasa (AACS) con la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 3 y la correspondiente secuencia de ADNc SEQ ID No. 4 procedente de S. meliloti cataliza la reacción de acetoacetato con la coenzima A mediando consumo de ATP para dar acetoacetil-CoA y AMP. No obstante, dentro del marco del presente invento fue interesante la retrorreacci�n.

El correspondiente gen acsA2 fue clonado en el vector de expresión pET30 Xa/LIC tal como se ha divulgado en la cita de Aneja, P., R. Dziak, G.-Q. Cai, T. C. Charles. 2002. Identification of an Acetoacetyl Coenzyme A Synthetase-Dependent Pathway for Utilization of L-(+)-3-Hydroxybutyrate in Sinorhizobium meliloti (Identificación de una ruta metabólica dependiente de la acetoacetil-CoA sintetasa para la utilización de L-(+)-3-hidroxibutirato). J. Bacteriol. 184:1571-1577. El pl�smido "pRD112" as� obtenido proporciona la fusión junto al terminal de N de la proteína diana con una marcación His, que por su parte hace posible la purificación mediante cromatograf�a por afinidad en presencia de Ni2+-NTA-agarosa.

La expresión de la proteína se efectuaba en células E. coli BL21 (DE3) a 37 �C y 180 rpm. Con una densidad óptica (DO600nm) de 0,5-0,6 se inducía el cultivo con IPTG 1 mM y a continuación se incubaba durante otras 3 h. La expresión exitosa de la proteína (aproximadamente 72 kDa) la presentaron unas muestras, que se habían tomado durante el crecimiento.

La Fig. 6 muestra un gel de SDS-PAGE al 7,5 % después de una tinción según Coomassie; se aplicaron en cada caso 15 μl de un extracto en bruto/pista (disgregaci�n celular rápida). 1: antes de la inducción, 2: 1 h después de la inducción, 3: 2 h después de la inducción La purificación se efectuaba de una manera análoga a la de la TEIIsrf mediante una cromatograf�a por afinidad con un quelato de metal en presencia de Ni2+-NTA-agarosa y de un gradiente de imidazol de 20-250 mM (Fig. 7A). En este caso aparecieron dos picos (1 y 2), cuyas fracciones se habían comprobado en cuanto a su contenido de proteínas. Un subsiguiente análisis en unos geles de SDS-PA al 7,5 % mostraba, en particular en el caso del primer pico, la aparición de una banda adicional a aproximadamente 55 kDa. Puesto que esta banda era manifiestamente más débil en el segundo pico o respectivamente no aparecía en absoluto, las correspondientes fracciones de este pico se reunían y empleaban para la determinación de la actividad. Como substratos servían, de nuevo, la acetoacetil-CoA y como comparación la acetil-CoA en el ensayo de DTNB. La determinación de los valores de Km

. 10-4 . l-1

proporcion� para la acetil-CoA como substrato un valor de 7 mol (0,7 mM). Por el contrario, para la acetoacetil-CoA, los valores medidos no eran suficientes para la determinación de un valor de Km. Puesto que sin

min-1 . -1

embargo, la actividad específica de la enzima con acetoacetil-CoA era solamente de 0,0038 μmol . mg, se prescindió de una utilización ulterior de la AACS procedente de S. meliloti y respectivamente de una clonaci�n del correspondiente gen en combinación con los genes de clostridias.

La Fig. 7 muestra la purificación de AACS procedente de E. coli, en la zona superior se representa el perfil de eluci�n FPLC en presencia de Ni2+-NTA-agarosa (de Qiagen Superflow, volumen del lecho 5 ml) con el programa: lavado 0-100 ml, eluci�n 100-150 ml con imidazol 20-250 mM (gradiente lineal) y un tamaño de las fracciones de en cada caso 1 ml; la zona inferior muestra un gel de SDS-PAGE al 7,5 % después de una tinción con plata, fracciones escogidas de eluci�n de los picos 1 y 2, en cada caso 1 μg de proteína/banda. RE: extracto en bruto, DL: material que ha pasado.

Ejemplo 3: Acil-CoA tioesterasa YbgC procedente de Haemophilus influenzae

La proteína YbgC con la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 5 y la correspondiente secuencia de ADNc SEQ ID No. 6 procedente de H. influenzae tiene algunas similaridades con una proteína correspondiente procedente de E. coli, en donde ésta, como una proteína citoplasmática, pertenece al denominado sistema Tol-Pal. ésta est� ampliamente propagada en bacterias gram negativas. Ella es importante para el mantenimiento de la integridad de las paredes celulares y posiblemente tiene una función en el caso del transporte de sustancias a través del periplasma. Por el contrario, la función de YbgC en H. influenzae y unas eventuales relaciones con unas funciones del sistema Tol-Pal no han sido publicadas hasta ahora. La publicación de Zhuang y colaboradores (2002) describe, sin embargo, unas investigaciones acerca de la función catalítica de esta proteína y el análisis de una actividad de tioesterasa. En este caso, se pudo mostrar la hidrólisis de ciertos ésteres de acil-CoA alif�ticos de cadenas cortas, tales como p.ej. propionil-CoA y butiril-CoA (valores de Km 11-24 mM) mediante la YbgC (Zhuang Z., F. Song, B. M.

Martin, D. Dunaway-Mariano. 2002. The YbgC protein encoded by the ybgC gene of the tol-pal gene cluster of Haemophilus infuenzae catalyzes acyl-coenzyme A thioester hydrolysis (La proteína YbgC, codificada por el gen ybgC del racimo de genes tol-pal de Haemophilus infuenzae cataliza la hidrólisis de la función tio�ster de la acilcoenzima A). FEBS Lett. 516:161-163). Una detección in vitro de una actividad con acetil-CoA y acetoacetil-CoA dentro del marco de este proyecto presuponía de nuevo la purificación de la proteína. Partiendo del ADN gen�mico, el gen se incorporaba por clonaci�n dentro de otro sistema de expresión, el IMPACTTM (sistema de purificación mediado por una inte�na con una marcación de fijación por afinidad a quitina) (en inglés "Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding-Tag) de la entidad Firma NEB (Francfort a. M.). Su ventaja reside en que este método hace posible una sencilla purificación de una proteína recombinante en su forma natural, es decir sin ninguna marcación.

La clonaci�n de ybgc en el vector pTYB1 (NEB Francfort a. M.) hacía posible la expresión y la subsiguiente purificación de la acil-CoA tioesterasa YbgC a partir de E. coli.

El gen ybgc se amplificó mediante una PCR de un ADN gen�mico con los cebadores ybgcTYB1Ndefw (ATA TAC ATA TGT TGG ATA ATG GCT TTT C) e ybgcTYB1Xhorev (TCC GAA CTC GAG TTT TAA GTG ATG). En este caso, los cebadores proporcionaban la incorporación de un sitio de corte con NdeI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con XhoI junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la Taq-Mastermix (de Qiagen, Hilden) según los datos del fabricante en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

94 �C

2 min 1

94 �C

30 s 30

55 �C

1 min 30

72 �C

1 min 30

72 �C

10 min 1

Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 430 pb (pares de bases). éste fue subclonado primeramente en el vector pJET (de Fermentas, St. Leon-Rot) de acuerdo con los datos del fabricante (pJet_ybgcTYB, 410 pb). A continuación, el fragmento de ybgc se recort� de nuevo desde este pl�smido con las endonucleasas de restricción NdeI y XhoI y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit, de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). El vector pTYB1 (de 7.477 pb) se cort� asimismo con NdeI y XhoI (de 7.439 pb) y a continuación se ligó con el fragmento de ybgc cortado y eluido en un gel mediando utilización del Rapid Ligation Kit (estuche de ligación rápida) según los datos del fabricante (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot). En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células

E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido de LB-ampicilina y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con NdeI/XhoI) y se secuenciaron (Agowa GmbH, Berlin). El pl�smido resultante fue designado como pTYBybgc (SEQ ID No. 15) y se emple� para la transformación ulterior en el seno de E. coli BL21 DE3.

La expresión se efectu� en E. coli BL21 (DE3) en un medio LBAmp hasta la inducción en el caso de una DO600nm de ~ 0,5 con IPTG 0,5 mM a 37 �C, después de esto se continu� incubando el cultivo durante 6 h a 20 �C y 150 rpm. La proteína de fusión (de aproximadamente 70 kDa) expresada heter�logamente, se fija a la quitina. Mediante una adición de DTT se da lugar a una modificación de la conformación y se induce el recorte de la proteína diana (de aproximadamente 15 kDa), la cual puede ser eluida a continuación. La Figura 8 muestra unos geles de SDS-PAGE. En la zona superior se representa una SDS-PAGE para el análisis de la expresión de YbgC. Se trata de un gel de SDS-PA en un gradiente de 10-20 % después de una tinción según Coomassie. Se aplicaron en cada caso 15 μl de un extracto en bruto/pista (disgregaci�n rápida de las células). 1: antes de la inducción, 2, 3: 6 h después de la inducción. En la parte inferior se representa la evolución de la purificación de YbgC en unas columnas con quitina en un gel de SDS-PA en un gradiente de 10-20 % después de una tinción con plata. Se aplicaron en cada caso 2 μg de proteína/pista; -RE: extracto en bruto, DL: material que ha pasado, W: fracciones de lavado, materiales eluidos: fracciones de eluci�n, que contienen proteínas (tamaño de las fracciones: en cada caso 1 ml). A pesar de que en las fracciones de eluci�n, junto a la deseada proteína de 15 kDa, aparecieron todavía unas bandas de la proteína de fusión y del dominio de inte�na separado, éstas se aprovecharon para la determinación de la actividad in vitro en el ensayo con DTNB. Las mediciones para la determinación del valor de Km oscilaban ciertamente (datos no mostrados), sin embargo, para la acetil-CoA se pudieron determinar un valor de Km de

. 10-4 . l-1

5,3 mol (0,53 mM), o respectivamente, para la acetoacetil-CoA como substrato, un valor de Km de 1,4 . 10-4 mol . l-1 (0,14 mM). De esta manera se pudo determinar en la comparación directa una afinidad incluso aumentada de la enzima para el substrato en comparación con la acetoacetil-CoA. Estos resultados argumentaron en favor de incluir a la YbgC en los ensayos ulteriores para la clonaci�n.

Ejemplo 4: Estrategia de clonaci�n para la construcción de los vectores de expresión

Para la producción de acetona en E. coli se llev� a cabo la clonaci�n de los genes de unas adecuadas acil-CoA tioesterasa o acil-CoA sintetasa / acil-CoA tiocinasa en común con los genes thlA (un producto g�nico con la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 16 y con la correspondiente secuencia de ADNc SEQ ID No. 17, la tiolasa A) y adc (un producto g�nico con la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 18 y la correspondiente secuencia de ADNc SEQ ID No. 19, la acetoacetato descarboxilasa) procedente de C. acetobutylicum. Para esto, se escogieron primeramente los pl�smidos pSK y pKS. Se trata de unos vectores de clonaci�n, que se diferencian esencialmente en lo que respecta a la orientación del sitio de clonaci�n múltiple (MCS, acr�nimo del inglés "Multi Cloning Site"). El MCS est� situado en cada caso dentro de una secuencia presente del gen lacZ' , que codifica el fragmento del

5 extremo del terminal de N de la β-galactosidasa y permite un escrutinio en blanco y azul de los pl�smidos recombinantes. Para los ensayos en el marco del proyecto, la expresión de los genes clonados estaba en predominancia bajo el control del promotor inducible de lac. Para esta finalidad estaba previsto el vector pSK. Por lo demás, se produjo una variante mediante la integración en el pl�smido pKS, en cuyo caso los genes debían ser expresados bajo el control del promotor constitutivo de la tiolasa procedente de C. acetobutylicum. La clonaci�n de los respectivos genes en los vectores se efectu� secuencialmente. Para esto, se desarrollaron primeramente unos oligonucle�tidos para la amplificación de los genes mediando introducción de unos correspondientes sitios de corte y se llevaron a cabo las reacciones en cadena de la polimerasa. Todos los fragmentos fueron amplificados y se clonaron en los vectores tal como se representa. El modo de proceder estratégico y los sitios de corte por restricción utilizados se han ilustrado esquemáticamente en el caso del pSK en la

15 Figura 9. Se procedió de manera análoga con el pl�smido pKS.

A continuación se divulgan en detalle las etapas de clonaci�n:

Clonaci�n de los genes adc, teII, thlA en el pl�smido pKS: El objetivo fue clonar los genes adc (de la acetoacetato descarboxilasa procedente de Clostridium acetobutylicum), teIIsrf (de la tioesterasa II procedente de Bacillus subtilis) y thlA (de la tiolasa procedente de C. acetobutylicum) en común en un vector y expresarlos a continuación en E. coli. El gen de la acetoacetato descarboxilasa adc se amplificó mediante una PCR del pl�smido pDrive_adc (SEQ ID No. 20) con los cebadores AdcXhofwneu (CAT GCT CGA GAC GCG TTA CGT ATC) y AdcAparevneu (GAT GGG GCC

25 CTG AAT TCT ATT ACT TAA G). En este caso, los cebadores proporcionaron la introducción de un sitio de corte con XhoI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con ApaI junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la polimerasa GoTaq (de Promega GmbH, Mannheim) según los datos del fabricante mediando adición de MgCl2 4 mM y en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

95 �C

2 min 1

95 �C

30 s 30

60 �C

30 s 30

72 �C

1 min 30

72 �C

5 min 1

Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 800 pb. éste se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, según los datos del fabricante) y a continuación, se cort� al igual que el pl�smido pKS, con las endonucleasas de restricción XhoI y ApaI (788 pb) y el vector se desfosforil� adicionalmente (con la Antarctic phosphatase (fosfatasa antártica), de New England Biolabs

35 GmbH, Francfort a. M., según los datos del fabricante). A esto le siguió la ligación del vector tratado de esta manera y del fragmento con la ligasa de T4 (de New England Biolabs GmbH, Francfort a. M.) según los datos del fabricante. En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células E. coli XL1 B competentes en presencia de CaCl2. Para cada tanda se transfirieron 100 μl de células E. coli XL1 B competentes en presencia de CaCl2 a unos recipientes de reacción enfriados previamente, con una capacidad de 1,5 ml, y se añadieron en cada caso 10 μl de la tanda de ligación, se mezcl� con precaución y las tandas se incubaron sobre hielo durante 30 min. A continuación se efectu� un choque térmico durante 90 s a 42 �C y las células fueron colocadas después de esto nuevamente durante 2 min sobre hielo, se les añadieron en cada caso 0,5 ml de un medio LB calentado previamente y las tandas se incubaron durante 60 min a 37 �C mediando ligero sacudimiento. De cada tanda se sembraron en placas 100 -300 μl sobre un medio LB, que contenía ampicilina, y se incubaron

45 durante una noche a 37 �C. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico según el siguiente protocolo: para el aislamiento rápido del ADN plasm�dico sirvió una modificación de las etapas del estuche 'Qiagen-Mini-Kit' sin ninguna purificación en la columna (de Qiagen, Hilden), según Birnboim y Doly (Birnboim, H. C., J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA (Un rápido procedimiento de extracción en condiciones alcalinas para el escrutinio de un ADN plasm�dico recombinante). Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523). Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con ApaI/XhoI) y a continuación se secuenciaron los clones positivos (Agowa GmbH, Berlin). Este pl�smido fue designado como pKSadc y se emple� para las siguientes etapas de clonaci�n. El gen de la tioesterasa II teIIsrf se amplificó mediante una PCR del pl�smido pTEIIsrf con los cebadores TeIISalfw

55 (CAA TTG TCG ACG GAT AAC AAT TTC ACA CAG A) y TeIIXhorev (CTA TCA ACT CGA GTC CAA GCT CAG CTA ATT AA). En este caso, los cebadores proporcionaron la introducción de un sitio de corte con SalI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con XhoI junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la polimerasa Synergy (de GeneCraft GmbH, L�dinghausen) según los datos del fabricante en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

95 �C

2 min 1

95 �C

30 s 30

60 �C

40 s 30

72 �C

1 min 30

72 �C

5 min 1

Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 850 pb. éste se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, según los datos del fabricante) y a continuación, al igual que el pl�smido pKSadc, se cort� con las endonucleasas de restricción SalI y XhoI (831 pb) y el vector se desfosforil� adicionalmente (con una Shrimp alkaline phosphatase SAP (fosfatasa alcalina de gamba), de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, según los datos del fabricante). A esto le siguió la ligación del vector y el fragmento tratado de esta manera mediando utilización del Rapid Ligation Kit según los datos del fabricante (de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot). En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. De cada tanda se sembraron en placas 100 -300 μl sobre un medio LB, que contenía ampicilina, y se incub� durante una noche a 37 �C. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con XhoI/SalI), y a continuación se secuenciaron los clones positivos (Agowa GmbH, Berlin). Este pl�smido fue designado como pKSadcte y fue empleado para las siguientes etapas de clonaci�n.

El gen de la tiolasa thlA, inclusive el promotor de la tiolasa, se amplificó mediante una PCR del ADN gen�mico procedente de C. acetobutylicum.

Aislamiento del ADN cromos�mico procedente de C. acetobutylicum: El aislamiento del ADN cromos�mico procedente de C. acetobutylicum se efectu� principalmente de acuerdo con Bertram (Bertram, J. 1989. Entwicklung eines Systems zum DNA-Transfer und zur Transposon-Mutagenese f�r Clostridium acetobutylicum (Desarrollo de un sistema para la transferencia de ADN y para la mutag�nesis con transposones para Clostridium acetobutylicum). Tesis doctoral, Universidad de G�ttingen). Para esto, se cultivaron las células en condiciones anaerobias en un medio 2x YTG y se cosecharon en el caso de una DO600 de aproximadamente 1,2. Las células se sedimentaron mediante centrifugaci�n (5 min, 5.000 x g, 4 �C). El sedimento celular se lav� tres veces con 10 ml de tampón 1x TAE (suplementado con 10 % [p/v] de sacarosa) y se almacen� a -20 �C. El ADN obtenido a partir de 90 ml de una suspensión de células tratada de esta manera se obtuvo como sigue:

1.

Suspensión del sedimento en 3,8 ml de 1x TAE con sacarosa

2.

Adici�n de 1 ml de una solución de lisozima-ARNasa

3.

Incubaci�n: durante 30 min, a 37 �C

4.

Adici�n de 500 μl de EDTA 0,5 M (de pH 8,0), 40 μl de Tris-HCl (de pH 8,0), 30 μl de SDS (al 10 % [p/v])

5.

Incubaci�n: durante 10 min, a 37 �C

6.

Adici�n de 200 μl de una solución de proteinasa K

7.

Incubaci�n: durante 2 h, a 37 �C

8.

Adici�n de 1,4 ml de perclorato de Na 5 M

9.

Adici�n de 7,3 ml de una mezcla de cloroformo y alcohol isoam�lico (24:1 [v/v] sobre hielo

10.

Centrifugaci�n: durante 10 min, 5.000 x g, a 4 �C

11.

Retirada de la fase acuosa superior

12.

Repetici�n en dos veces de las etapas 9. -11.

13.

Precipitaci�n del ADN desde la fase acuosa mediante adición de 1 volumen de isopropanol

14.

Incubaci�n: durante 5 min, a la TA

15.

Centrifugaci�n: durante 20 min, 16.000 x g, a 4 �C

16.

Desecaci�n del sedimento a la TA durante como máximo 2 h

17.

Suspensi�n del sedimento en 2 ml de un tampón TE

18.

Adici�n de 200 μl de una solución de proteinasa K

19.

Incubaci�n: durante una noche, a 37 �C

20.

Aumento del volumen hasta 4 ml con agua destilada

21.

Adici�n de 600 μl de acetato de Na 3 M (de pH 5,2)

22.

Extracci�n repetida tres veces con una mezcla de cloroformo y alcohol isoam�lico (véanse las etapas 9. -11.)

23.

Precipitaci�n del ADN mediante adición de 1 volumen de isopropanol

24.

Incubaci�n: durante 5 min, a la TA

25.

Centrifugaci�n: durante 20 min, 16.000 x g, a 4 �C

26.

Lavado repetido dos veces del sedimento con etanol al 96 % (v/v) (pur�simo, enfriado con hielo)

27.

Desecaci�n del sedimento a la TA durante como máximo 2 h

28.

Suspensi�n del sedimento en 200 μl de TE

Los cebadores empleados para la PCR PthlAXmafw (CAT GAT TTC CCG GGG GTT AGC ATA TG) y PthlASalrev (CAG AGT TAT TTT TAA GTC GAC TTT CTA GCA C) proporcionaron la introducción de un sitio de corte con XmaI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con SalI junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la Taq-Mastermix (de Qiagen Hilden) según los datos del fabricante en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

95 �C

2 min 1

95 �C

30 s 30

60 �C

40 s 30

72 �C

1,5 min 30

72 �C

5 min 1

Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 1.400 pb. éste se subclon� primeramente en el vector pJET (de Fermentas, St. Leon-Rot) según los datos del fabricante (pJet_PthlA). A continuación, el fragmento de thlA procedente se recort� de nuevo desde este pl�smido con las endonucleasas de restricción XhoI y 10 Cfr9I (1.397 pb) y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). El pl�smido pKSadcte se trat� asimismo con XhoI y Cfr9I y se desfosforil� adicionalmente (con la Shrimp alkaline phosphatase SAP, de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, según los datos del fabricante). A esto le siguió la ligación del vector tratado de esta manera y del fragmento mediando utilización del estuche Rapid Ligation Kit según los datos del fabricante (de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot). En cada caso 10 μl

15 de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células de la cepa E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con SalI/Cfrl9I) y a continuación se secuenciaron los clones positivos (Agowa GmbH, Berlin).

20 Este pl�smido con la SEQ ID No. 8 fue designado como pKSatt y se emple� para la transformación ulterior en el seno de diferentes cepas de E. coli, que fueron investigadas a continuación en cuanto a la formación de acetona.

Clonaci�n de los genes adc, teIIsrf, thlA en el pl�smido pSK: Para la clonaci�n de los tres genes en el vector pSK se recort� primeramente el fragmento adc-teIIsrf ya presente en el pKS mediante corte por restricción con ApaI y SalI 25 (1.625 pb) y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante) y se ligó en el vector pSK asimismo cortado y desfosforilado (SAP, de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, según los datos del fabricante). Para esto, se utilizó el estuche Quick Ligation Kit (de New England Biolabs GmbH, Francfort a. M.) correspondientemente a los datos del fabricante. Para la comprobación de los clones obtenidos, éstos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN

30 plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con ApaI/SalI). El pl�smido as� obtenido se design� como pSKadcte y se utilizó ulteriormente para la subsiguiente etapa de clonaci�n.

El gen de la tiolasa thlA se amplificó mediante una PCR del pl�smido pDrive_thl (SEQ ID Nr. 21) con los cebadores ThlAXmafw (GTC GAC CCG GGT CAA AAT TTA GGA G) y ThlASalrev (GCT TGT CGA ATT CAG ATC AGA G). En

35 este caso, los cebadores proporcionaron la incorporación de un sitio de corte con XmaI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con SalI junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la Taq-Mastermix (de Qiagen, Hilden) según los datos del fabricante en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

95 �C

2 min 1

95 �C

30 s 30

60 �C

1 min 30

72 �C

1,5 min 30

72 �C

10 min 1

40 Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 1.250 pb. éste se subclon� primeramente en el vector pJET (de Fermentas, St. Leon-Rot) según los datos del fabricante (pJet_thlA). A continuación, el fragmento de thlA procedente se recort� de nuevo desde este pl�smido con las endonucleasas de restricción XhoI y Cfr9I

(1.243 pb) y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). El pl�smido pSKadcte se trat� asimismo con XhoI y Cfr9I y se desfosforil� adicionalmente 45 (con la Shrimp alkaline phosphatase SAP, de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, según los datos del fabricante). A esto le siguió la ligación del vector tratado de esta manera y del fragmento mediando utilización del estuche Rapid Ligation Kit (de New England Biolabs GmbH, Francfort a. M.) correspondientemente a los datos del fabricante. En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células de la cepa E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido

50 LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con SalI/Cfrl9I) y a continuación se secuenciaron los clones positivos (Agowa GmbH, Berlin).

Este pl�smido con la SEQ ID No. 7 fue designado como pSKatt y se emple� para la transformación ulterior en el seno de diferentes cepas de E. coli, que fueron investigadas a continuación en cuanto a la formación de acetona.

Sobre la base de la construcción artificial pUC18 con la SEQ ID No. 14 (pUCadc_ctfA/B_thIA; véase la Fig. 10), en la que los genes clostridianos adc, ctfA/B y thlA se presentaban ya clonados, se pudo producir por una parte una variante adicional en el vector pUC19, mediante el recurso de que este casete de genes es expresado bajo el control del promotor de lac. Además de esto, a continuación se pudieron recortar específicamente los genes ctfA/B y, después de la introducción de los sitios de corte apropiados en los fragmentos, en lugar de esto se insertaron los genes teIIsrf o respectivamente ybgC (Fig. 9). En la construcción artificial pUC18 se elimin� además el fragmento de thlA original y se reemplazó por un fragmento de thlA, que contenía de manera adicional, "conectada previamente", la secuencia del promotor de thl. La Fig. 10 muestra esquemáticamente la producción de las construcciones artificiales pUC19; en la parte superior se muestra la representación esquemática del modo de proceder en el caso de la clonaci�n del casete de genes adc/ctfAB/thlA en el pl�smido pUC19, y en parte inferior la representación esquemática del modo de proceder en el caso de la clonaci�n de teIIsrf o respectivamente de ybgC partiendo del pl�smido pUC19act.

Las clonaciones en detalle:

Construcci�n del pl�smido pUC19act El fundamento de éste fue el pl�smido pUCadc_ctfA/B_thIA con la SEQ ID No. 14 que representa los genes clostridianos de la acetoacetato descarboxilasa (adc), de la CoA transferasa (ctfA/B) y de la tiolasa (thlA), clonados en el vector pUC18. Los genes se han clonado aquí en la orientación opuesta al gen lacZ. Para que los genes puedan ser transcritos bajo el control del promotor de lac, el fragmento adc_ctfA/B_thIA (de 3.311 pb) se recort� de nuevo con las endonucleasas de restricción SalI y EcoRI y se ligó (con el estuche Rapid Ligation Kit según los datos del fabricante; de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) en el vector pUC19, que había sido cortado con las mismas enzimas. En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células de la cepa E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con SalI/EcoRI). Este pl�smido con la SEQ ID No. 12 fue designado como pUC19act y se emple� para la transformación ulterior en el seno de diferentes cepas de E. coli, que fueron investigadas a continuación en cuanto a la formación de acetona. En este caso, esta construcción artificial, que contiene los genes clostridianos para la formación de acetona, sirvió como una posibilidad de comparación para las construcciones artificiales restantes.

Construcci�n del pl�smido pUC18att El fundamento de éste fue el pl�smido pUCadc_ctfA/B_thIA con la SEQ ID No. 14, que representa los genes clostridianos de la acetoacetato descarboxilasa (adc), de la CoA transferasa (ctfA/B) y de la tiolasa (thlA), clonados en el vector pUC18. El gen de la tioesterasa II teIIsrf se amplificó mediante una PCR del pl�smido pTEIIsrf con los cebadores TeIIpUCBamfw (CAA TTG GGA TCC GAT AAC AAT TTC ACA CAG) y TeIIpUCAccrev (GAG ATC TGG TAC CCG GTT AAA TGA TCG GA). En este caso, los cebadores proporcionaron la introducción de un sitio de corte con BamHI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con Acc65I junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la polimerasa Sinergy (de sinergia) (de GeneCraft GmbH, L�dinghausen) según los datos del fabricante en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

95 �C

2 min 1

95 �C

30 s 30

61 �C

30 s 30

72 �C

1 min 30

72 �C

5 min 1

Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 800 pb. éste se subclon� primeramente en el vector pJET (de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) según los datos del fabricante (pJet_teIIpUC). A continuación, el fragmento de teIIsrf se recort� de nuevo desde este pl�smido con las endonucleasas de restricción BamHI y Acc65I (776 pb) y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). El vector pUCadc_ctfA/B_thlA fue tratado asimismo con las enzimas de restricción BamHI y Acc65I, de modo tal que se cayó el fragmento ctfA/B (de 1.331 pb). La tanda se separ� en un gel de agarosa y la banda con el vector remanente (4.633 pb) se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). A esto le siguió la ligación del vector y del fragmento mediando utilización del estuche Rapid Ligation Kit según los datos del fabricante (de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot). En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células de la cepa E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con BamHI/Acc65I). El pl�smido resultante pUC18att_sub se utilizó ulteriormente para la clonaci�n del fragmento de thlA con el promotor de la tiolasa.

El gen de la tiolasa thlA, inclusive el promotor de la tiolasa, se amplificó mediante una PCR del ADN gen�mico procedente de C. acetobutylicum. Los cebadores empleados para la PCR PthlApUCSalfw (CAT GAT TTG TCG ACG GTT AGC ATA TG) y PthlApUCBamrev (CAG AGT TAT TTT TAA GGA TCC TTT CTA GC) proporcionaron la incorporación de un sitio de corte con SalI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con BamHI junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la Taq-Mastermix (de Qiagen, Hilden) según los datos del fabricante mediando adición de MgSO4 2,5 mM y en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

95 �C

2 min 1

95 �C

30 s 30

50 �C

1 min 30

72 �C

1,5 min 30

72 �C

10 min 1

Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 1.400 pb. éste se subclon� primeramente en

10 el vector pJET (de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) según los datos del fabricante (pJet_PthIpUC). A continuación, el fragmento de thlA de este pl�smido se recort� de nuevo con las endonucleasas de restricción SalHI y BamHI

(1.397 pb) y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). A partir del pl�smido construido previamente pUC18att_sub, el fragmento de la tiolasa (sin el promotor, de 1.217 pb) se recort� con SalI y BamHI, el vector remanente (de 4.192 pb) se eluy� en un gel y el 15 fragmento de la tiolasa inclusive el promotor (de 1.397 pb) se introdujo por ligación (con el estuche Rapid Ligation Kit según los datos del fabricante; de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot). En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células de la cepa E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con SalI/BamHI) y se

20 secuenciaron (Agowa GmbH, Berlin). Este pl�smido se design� como pUC18att (SEQ ID No. 10) y se emple� para la transformación ulterior en el seno de diferentes cepas de E. coli, que fueron investigadas a continuación en cuanto a la formación de acetona.

Construcci�n del pl�smido pUC19att

25 El fundamento de éste fue el pl�smido pUC19act, que comprende los genes clostridianos de la acetoacetato descarboxilasa (adc), de la CoA transferasa (ctfA/B) y de la tiolasa (thlA), clonados en el vector pUC19. El fragmento de teIIsrf se recort� con las enzimas de restricción BamHI y Acc65I desde el pJEt_teIIpUC (776 pb) y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). El vector pUC19act se cort� con las mismas enzimas, de modo tal que se cayó el fragmento de ctfA/B.

30 Después de la separación en agarosa, la banda remanente con el vector (4.633 pb) se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). A esto le siguió la ligación del fragmento de vector y del fragmento de teIIpUC. Para esto, se utilizó el estuche Quick Ligation Kit (de New England Biolabs GmbH, Francfort a. M.) correspondientemente a los datos del fabricante. La transformación se efectu� tal como se ha descrito más arriba. Para la comprobación de los clones obtenidos, éstos

35 se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con BamHI/Acc65I). El pl�smido as� obtenido se design� como pUC19att (SEQ ID No. 9) y se emple� para la transformación ulterior en el seno de diferentes cepas de E. coli, que fueron investigadas seguidamente en cuanto a la formación de acetona.

40 Construcción del pl�smido pUC19ayt El fundamento de éste lo form� el pl�smido pUC19att. El gen ybgc para la acil-CoA tioesterasa YbgC procedente de Haemophilus influenzae se amplificó mediante una PCR del ADN gen�mico con los cebadores ybgcpUCBamfw (CTC TAG AAG GAT CCT GTT TAA CTT TAA G) e ybgcpUCAccrev (ATT GGG TAC CTC ATT GCA TAC TCC G) . En este caso, los cebadores proporcionaron la

45 incorporación de un sitio de corte con BamHI junto al extremo 5' o respectivamente de un sitio de corte con Acc65I junto al extremo 3' del fragmento amplificado. Se emple� la Taq-Mastermix (de Qiagen, Hilden) según los datos del fabricante en las siguientes condiciones:

Temperatura

Tiempo Ciclos

94 �C

2 min 1

94 �C

30 s 30

57 �C

1 min 30

72 �C

1 min 30

72 �C

10 min 1

50 Se obtuvo un fragmento con el tamaño esperado de aproximadamente 490 pb. éste se subclon� primeramente en el vector pJET (de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) según los datos del fabricante (pJet_ybgcpUC). A continuación, el fragmento de ybgc se recort� de nuevo desde este pl�smido con las endonucleasas de restricción BamHI y Acc65I (465 pb) y se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). El vector pUC19att fue tratado asimismo con las enzimas de restricción BamHI y Acc65I, de modo tal que se cayó el fragmento de teIIsrf (de 468 pb). La tanda se separ� en un gel de agarosa y la banda con el vector remanente (de

5 4.633 pb) se eluy� en un gel (con el estuche Gel extraction Kit; de peqlab Biotechnologie GmbH Erlangen, según los datos del fabricante). A esto le siguió la ligación del vector y del fragmento mediando utilización del estuche Rapid Ligation Kit según los datos del fabricante (de Fermentas GmbH, St. Leon-Rot). En cada caso 10 μl de la tanda de ligación se emplearon para la transformación de 100 μl de células de la cepa E. coli XL1-B competentes en presencia de CaCl2. Los clones obtenidos se cultivaron a continuación en un medio líquido LB, que contenía

10 ampicilina, y se aisl� el ADN plasm�dico. Los pl�smidos aislados se comprobaron mediante un análisis por restricción (con BamHI/Acc65I) y se secuenciaron (Agowa GmbH, Berlin). El pl�smido resultante se design� como pUC19ayt (SEQ ID No. 11) y se emple� para la transformación ulterior en el seno de diferentes cepas de E. coli, que fueron investigadas a continuación en cuanto a la formación de acetona.

15 En la Tabla 1 se ha reunido una recopilación acerca de las construcciones artificiales de pl�smidos presentes.

Tabla 1: Construcciones artificiales de pl�smidos

Pl�smido Tamaño en pb Inserto Promotor pSKatt 5.771 teIIsrf (adc, thlA) Lac pKSatt 5.925 teIIsrf (adc, thlA) Thl pUC19att 5.409 teIIsrf (adc, thlA) Lac pUC18att 5.589 teIIsrf (adc, thlA) Thl pUC19ayt 5.101 ybgc (adc, thlA) Lac pUC19act 5.964 ctfA/B (adc, thlA) Lac

20 Ejemplo 5: Formación de acetona en E.coli Todas las variantes obtenidas de pl�smidos (véase la Tabla 1) fueron investigadas en la cepa de clonaci�n de E. coli HB101 en cuanto a la formación de acetona. Los análisis se efectuaron a la escala de 5 ml en un medio LB que contenía ampicilina (100 μg/ml), después de una inoculación, a partir de unos correspondientes cultivos previos y de una incubaci�n a 37 �C y 200 rpm. La densidad óptica (600 nm) se vigil� por fotometría, y en el caso de un valor de

25 aproximadamente 0,5-0,6 se indujo la expresión de los genes clonados mediante adición de IPTG 1 mM (isopropil-βD-tiogalactopiran�sido), y después de 3-4 h se a�adi� glucosa (20 g/l). En el caso de las variantes bajo el control del promotor de la tiolasa no se efectu� ninguna inducción, puesto que se partió del hecho de que se efectúa una expresión constitutiva. En determinados momentos, a lo largo de un período de tiempo de aproximadamente 48 h se extrajeron muestras, y, mediante una cromatograf�a de gases, se determinaron las concentraciones de acetona y de

30 acetato en el material sobrenadante del medio exento de células. Facultativamente, se realizaron unas adiciones adicionales de glucosa en diferentes cantidades (en el intervalo de 10-40 g/l) o bien 4 h después de la inducción o también al mismo tiempo que la inducción.

En E. coli HB101 se pudieron detectar con todas las variantes de pl�smidos unas significativas producciones de

35 acetona. En la Figura 11, se muestran a modo de ejemplo las curvas de crecimiento con las cantidades formadas de acetona y acetato para unas variantes individuales. En la Tabla 2 se muestra una recopilación de los resultados con las concentraciones máximas de acetona. La Fig. 11 representa en cada caso la densidad óptica (a 600 nm), as� como las concentraciones de acetona y acetato (en mM) en unos momentos escogidos. La flecha negra indica en cada caso el momento de la adición de

40 IPTG (1 mM), la flecha verde indica la adición de la glucosa (20 g/l).

Tab. 2: Recopilación de las concentraciones máximas de acetona de las variantes individuales de pl�smidos en cultivos de 5 ml

Pl�smido Inserto Promotor Concentración máxima de acetona, cepa, medio

pSKatt teIIsrf (adc, thlA) lac 34 mM (2,0 g/l, HB101, LBAmp) pKSatt teIIsrf (adc, thlA) thl 36 mM (2,1 g/l, HB101, LBAmp) pUC19att teIIsrf (adc, thlA) lac 30 mM (1,7 g/l, HB101, LBAmp) pUC18att teIIsrf (adc, thlA) thl 35 mM (2,0 g/l, HB101, LBAmp) pUC19ayt ybgc (adc, thlA) lac 60 mM (3,5 g/l, HB101, LBAmp) pUC19act ctfA/B (adc, thlA) lac 46 mM (2,7 g/l, HB101, LBAmp)

45 Ejemplo 6: Comparación de la ruta metabólica de la acetona con un gen ybgC clonado procedente de H. influenzae con la ruta metabólica de la acetona, que se compone exclusivamente de genes clostridianos En un subsiguiente experimento se intent� entonces reproducir los resultados obtenidos también en unos cultivos de 100 ml (en LBAmp) con las variantes pUC19ayt y pUC19act como testigos (a 37 �C, 200 rpm). Los cultivos principales

50 fueron inoculados con 1 ml de un correspondiente cultivo previo y fueron inducidos en el caso de una DO600nm de 0,5 con IPTG 1 mM. Desviándose de los ensayos realizados hasta ahora, se repitió la adición de glucosa (20 g/l ) 18 h después de la primera adición. Adicionalmente, de manera paralela a los momentos individuales de las tomas individuales de muestras se efectu� la determinación del contenido de glucosa del cultivo, con el fin de determinar el consumo de glucosa. La determinación de la glucosa se llev� a cabo mediante un ensayo óptico-enzim�tico según Bergmeyer (1970), en cuyo caso por medio de las enzimas hexocinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, mediando adición de ATP y NADP+, se efectúa en dos etapas una reacción de la glucosa para dar 6-fosfogluconato y NADPH (Bergmeyer, H. U. (jefe de edición): Methods of Enzymatic Analysis (Métodos del análisis enzim�tico), 2a edición, editorial Verlag Chemie, Weinheim -Deerfield Beach -Basilea 1970). La cantidad de NADPH formada en este caso es proporcional a la cantidad presente de glucosa y puede ser determinada fotom�tricamente a una longitud de onda de 340 nm a través de la modificación de la extinción. Los resultados a este respecto se han representado en las Figuras 12 A y 12 B. Se puede reconocer, que la glucosa en el cultivo A (E. coli HB101 pUC19ayt) ya había sido consumida completamente en el momento de la segunda adición.

No obstante, la aplicación renovada de glucosa no dio lugar ni al esperado aumento adicional de la cantidad de acetona ni fue consumida aquélla, puesto que, evidentemente no se pudo comprobar ninguna disminución. Se ha de partir del hecho de que en ese momento otros factores limitaban ya el crecimiento, puesto que se no tuvo lugar tampoco ninguna aumento adicional de la densidad óptica. Se formaron como máximo 67 mM (3,9 g/l) de acetona. Algo similar sucedió en el caso del cultivo B con el pl�smido testigo pUC19act, que se llev� a cabo en iguales condiciones. La glucosa no había sido consumida todavía totalmente en el momento de la segunda adición, y en este caso, la adición renovada de glucosa tampoco tuvo ningún efecto en conexión con un aumento de la cantidad formada de acetona. La cantidad máxima de acetona estaba situada en 20 mM (1,2 g/l). De esta manera, la variante con el gen ybgC clonado procedente de H. influenzae produjo en estas condiciones tres veces la cantidad de acetona que produjo el cultivo testigo con los genes exclusivamente clostridianos.

La Fig. 12 representa en cada caso la densidad óptica (a 600 nm), las concentraciones de acetona y acetato (mM) y el contenido de glucosa (g/l) en los momentos escogidos. La flecha negra indica el momento de la adición de IPTG (1 mM), las flechas verdes la adición de glucosa (20 g/l); parte superior: E. coli HB101 pUC19ayt, parte inferior:

E. coli HB101 pUC19act (testigo)

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Evonik Degussa GmbH

5 <120> Obtención de acetona por fermentación a partir de materias primas renovables mediante una nueva ruta metabólica

<130> 200700792 10 <160> 21

<170> PatentIn version 3.4

<210>

1 15 <211> 246

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

<210> 2

<211> 741

<212> ADN

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 2

<210>

3 10 <211> 650

<212> PRT

<213> Sinorhizobium meliloti

<210> 4

<211> 1953

<212> ADN

<213> Sinorhizobium meliloti

<400> 4

<210> 5

<211> 136

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 5

<210>

6 10 <211> 411

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<210> 7

<211> 5765

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 8

<211> 5919

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 9

<211> 5409

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 10

<211> 5589

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 11

<211> 5098

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 12

<211> 5964

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 13

<211> 4151

<212>

DNA 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 14

<211> 5964

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 15

<211> 7849

<212>

ADN 5 <213> Artificial

10 <400> 7

10 <400> 8

10 <400> 9

10 <400> 10

10 <400> 11

10 <400> 12

10 <400> 13

10 <400> 14

<220>

<223> Pl�smido

10 <400> 15

<210> 16

<211> 392

<212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 16

<210> 17

<211> 1179

<212> ADN

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 17

<210> 18 10 <211> 244

<212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum

<210> 19

<211> 735

<212> ADN

<213> Clostridium acetobutylicum

<400> 19

<210> 20

<211> 4616

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Pl�smido

<210> 21

<211> 5098

<212>

ADN 5 <213> Artificial

10 <400> 20

<220>

<223> Pl�smido

10 <400> 21

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la preparación de acetona partiendo de la acetil-Coenzima A, que comprende las etapas de:

   A. una reacción enzim�tica de acetil-CoA para dar acetoacetil-CoA catalizada por una β-cetotiolasa

   B. una reacción enzim�tica de acetoacetil-CoA para dar acetoacetato y CoA catalizada por una acetoacetato-CoA hidrolasa, una acil-CoA-tioesterasa, una acil-CoA sintetasa o una acil-CoA-tiocinasa

   C. una descarboxilaci�n de acetoacetato para dar acetona y CO2, catalizada por una acetoacetato descarboxilasa

   caracterizado por que en la etapa B de procedimiento, la coenzima A no es transferida a una molécula aceptora, y la reacción enzim�tica en la etapa B de procedimiento es catalizada por un polip�ptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 1, 3 � 5.

2. 2.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la reacción enzim�tica en la etapa A de procedimiento es catalizada por un polip�ptido con una actividad de cetotiolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 16.

3. 3.

   Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la reacción enzim�tica en la etapa C de procedimiento es catalizada por un polip�ptido con una actividad de acetoacetato descarboxilasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica por lo menos en un 90 % a la secuencia de amino�cidos SEQ ID No. 18.

4. 4.

   Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado por que la reacción en la etapa C de procedimiento se efectúa espontáneamente.

5. 5.

   Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado por que es llevado a cabo por medio de un microorganismo.

6. 6.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que el microorganismo contiene por lo menos: a un ácido nucleico que codifica proteicamente por lo menos un polip�ptido de acuerdo con la reivindicación 2

   y

   b un ácido nucleico que codifica proteicamente el polip�ptido con una actividad de acetoacetato-CoA hidrolasa y con una secuencia de amino�cidos, que es idéntica en por lo menos un 90 % a la SEQ ID No. 1, 3 � 5, y

   c un ácido nucleico que codifica proteicamente por lo menos un polip�ptido de acuerdo con la reivindicación 3 siendo utilizados los ácidos nucleicos a, b y c para asegurar la expresión del polip�ptido en el microorganismo.

7. 7.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que el ácido nucleico a se escoge entre: aa una secuencia de ADN descrita por la secuencia 17 o por su cadena complementaria, bb unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

   descritas dentro de aa cc unas secuencias de ADN, que sin la degradación del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN definidas en aa y bb.

8. 8.

   Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizado por que el ácido nucleico c se escoge entre: dd una secuencia de ADN descrita por la secuencia 19 o por su cadena complementaria, ee unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

   descritas dentro de dd ff unas secuencias de ADN, que sin la degradación del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN descritas dentro de dd y ee.

9. 9.

   Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 8, caracterizado por que el ácido nucleico b se escoge entre: gg una secuencia de ADN descrita por la secuencia 2 o por su cadena complementaria, hh unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

   descritas dentro de gg unas secuencias de ADN, que sin la degradación del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN descritas dentro de gg y hh.

10. 10.

    Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 8, caracterizado por que el ácido nucleico b se escoge entre: jj una secuencia de ADN descrita por la secuencia 4 o por su cadena complementaria, kk unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

    descritas dentro de jj ll unas secuencias de ADN, que sin la degradación del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN descritas dentro de jj y kk.

11. 11.

    Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 8, caracterizado por que el ácido nucleico b se escoge entre: mm una secuencia de ADN descrita por la secuencia 6 o por su cadena complementaria, nn unas secuencias de ADN, que se hibridan en condiciones rigurosas para dar las secuencias de ADN

    descritas dentro de mm oo unas secuencias de ADN, que sin la degradación del código genético se hibridar�an para dar las secuencias de ADN descritas dentro de mm y nn.

12. 12.

    Procedimiento de acuerdo con por lo menos una de las reivindicaciones 6 hasta 11, estando situados los ácidos nucleicos a, b y c en una cadena de nucleótidos, y ésta se escoge entre el conjunto formado por:

    el pl�smido pSKatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 7, el pl�smido pKSatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 8, el pl�smido pUC19att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 9, el pl�smido pUC18att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No.10,

    y el pl�smido pUC19ayt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 11.
13. 13. ácido nucleico escogido entre el conjunto formado por: el pl�smido pSKatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 7, el pl�smido pKSatt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 8, el pl�smido pUC19att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 9, el pl�smido pUC18att, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No.10,

    y el pl�smido pUC19ayt, con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID No. 11.

    Figura 1

    Figura 9

    Figura 11