ES2587561T3 - Procedimiento para la preparación de terpeno-nitrilos a partir de terpeno-oximas usando una aldoxima deshidratasa - Google Patents
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/002—Nitriles (-CN)
Abstract
Procedimiento biocatalítico para la preparación de nitrilos en el que se hace reaccionar a) una oxima, seleccionada entre citraloxima, neraloxima, geranialoxima, citronelaloxima y análogos parcial o completamente hidrogenados de las mismas, encontrándose el compuesto en forma estereoisoméricamente pura o como mezcla de estereoisómeros, en presencia de una aldoxima alifática deshidratasa (E.C. 4.99.1.5) o una fenilacetaldoxima deshidratasa (PAOx) (EC 4.99.1.7) para dar nitrilo, encontrándose el nitrilo en forma estereoisoméricamente pura o como mezcla de estereoisómeros y b) dado el caso el producto de reacción se purifica adicionalmente a continuación.
Description
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(continuación)
Resto originario Ejemplos de la sustitución
His Asn ; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg ; Gln ; Glu
Met Leu ; Ile
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
Val Ile; Leu
Los “equivalentes funcionales” en el sentido mencionado anteriormente son también “precursores” de los polipéptidos descritos así como “derivados funcionales” y “sales” de los polipéptidos.
Los “precursores” son a este respecto precursores naturales o sintéticos de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.
Por la expresión “sales” se entiende tanto sales de grupos carboxilo como sales de adición de ácido de grupos amino de las moléculas de proteína de acuerdo con la invención. Las sales de grupos carboxilo pueden prepararse de manera en sí conocida y comprenden sales inorgánicas, tales como por ejemplo sales de sodio, de calcio, de amonio, de hierro y de cinc, así como sales con bases orgánicas, tal como por ejemplo aminas, tales como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina y similares. Las sales de adición de ácido, tales como por ejemplo sales con ácidos minerales, tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico y sales con ácidos orgánicos, tal como ácidos acético y ácido oxálico son igualmente objeto de la invención.
Los “derivados funcionales” de polipéptidos de acuerdo con la invención pueden prepararse en grupos laterales de aminoácidos funcionales o en sus extremos N-terminal o C-terminal igualmente con ayuda de técnicas conocidas. Los derivados de este tipo comprenden por ejemplo ésteres alifáticos de grupos ácido carboxílico, amidas de grupos ácido carboxílico, que pueden obtenerse mediante reacción con amoníaco o con una amina primaria o secundaria; derivados de N-acilo de grupos amino libres, preparados mediante reacción con grupos acilo; o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres, preparados mediante reacción con grupos acilo.
Los “equivalentes funcionales” comprenden naturalmente también polipéptidos que son accesibles por otros organismos, así como variantes que se producen de manera natural. Por ejemplo pueden determinarse mediante comparación de secuencias zonas de regiones de secuencia homólogas y en cumplimiento con las especificaciones concretas de la invención pueden determinarse enzimas equivalentes.
Los “equivalentes funcionales” comprenden igualmente fragmentos, preferentemente dominios individuales o motivos de secuencia, de los polipéptidos de acuerdo con la invención, que presentan por ejemplo la función biológica deseada.
Los “equivalentes funcionales” son además proteínas de fusión, que presentan una de las secuencias de polipéptido mencionadas anteriormente o equivalentes funcionales derivados de la misma y al menos otra secuencia heteróloga, funcionalmente distinta de la misma en enlace funcional N-o C-terminal (es decir sin alteración funcional esencial recíproca de las partes de proteína de fusión). Ejemplos no limitativos de secuencias heterólogas de este tipo son por ejemplo péptidos señal, anclaje de histidina o enzimas.
Los “equivalentes funcionales” comprendidos conjuntamente de acuerdo con la invención son homólogos a las proteínas divulgadas de manera concreta. Éstos tienen al menos el 60 %, preferentemente al menos el 75 % en particular al menos el 85 %, tal como por ejemplo el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %, de homología (o identidad) con respecto a una de las secuencias de aminoácidos divulgadas de manera concreta, calculada según el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Una homología o identidad porcentual de un polipéptido homólogo de acuerdo con la invención significa en particular identidad porcentual de los restos de aminoácido con respecto a la longitud total de una de las secuencias de aminoácidos descritas de manera concreta en el presente documento.
Los valores de identidad porcentuales pueden determinarse también por medio de alineamiento BLAST, algoritmo blastp (BLAST proteína-proteína), o mediante uso de los ajustes de Clustal indicados a continuación.
En el caso de una posible glicosilación de proteínas comprenden los “equivalentes funcionales” de acuerdo con la invención proteínas del tipo designadas anteriormente en forma desglicosilada o glicosilada así como formas modificadas que pueden obtenerse mediante modificación del patrón de glicosilación.
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with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, de acuerdo con la dirección de internet: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# y con los siguientes parámetros:
Penalización por apertura de huecos de ADN 15.0 penalización por extensión de huecos de ADN 6.66 matriz de ADN identidad penalización por apertura de huecos de proteína 10.0 penalización por extensión de huecos de proteína 0.2 matriz de proteína Gonnet Proteína/ADN ENDGAP -1 Proteína/ADN GAPDIST 4
Todas las secuencias de ácido nucleico (secuencias de ARN y ADN de cadena sencilla y doble, tal como por ejemplo ADNc y ARNm) mencionadas en el presente documento pueden prepararse de manera en sí conocida mediante síntesis química a partir de los módulos de nucleótidos, tal como por ejemplo mediante condensación de fragmentos de módulos de ácido nucleico individuales, solapantes, complementarios de la doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede realizarse por ejemplo, de manera conocida, según el procedimiento de fosfoamidita (Voet, Voet, 2ª edición, Wiley Press New York, páginas 898-897). La adición de oligonucleótidos sintéticos y el relleno de huecos con ayuda del fragmento Klenow de la ADN-polimerasa y reacciones de ligamiento así como procedimientos de clonación generales se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Se divulgan también secuencias de ácido nucleico (secuencias de ARN y ADN de cadena sencilla y doble, tal como por ejemplo ADNc y ARNm), que codifican para uno de los polipéptidos mencionados anteriormente y sus equivalentes funcionales, que son accesibles por ejemplo usando análogos de nucleótidos sintéticos.
Se divulgan tanto moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican para polipéptidos o proteínas o fragmentos biológicamente activos de los mismos, como también fragmentos de ácido nucleico que pueden usarse por ejemplo para su uso como sondas de hibridación o cebadores para la identificación o amplificación de ácidos nucleicos codificantes divulgados en cuestión.
Las moléculas de ácido nucleico pueden contener además secuencias no traducidas por el extremo en 3’ y/o en 5’ de la región génica codificante.
Se divulgan además las moléculas de ácido nucleico, o un fragmento de las mismas, complementarias a las secuencias de nucleótidos descritas de manera concreta.
Las secuencias de nucleótidos posibilitan la generación de sondas y cebadores que pueden usarse para la identificación y/o clonación de secuencias homólogas en otros tipos de célula y organismos. Tales sondas o cebadores comprenden habitualmente una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones “rigurosas” (véase a continuación) con al menos aproximadamente 12, preferentemente al menos aproximadamente 25, tal como por ejemplo aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de una secuencia de ácido nucleico divulgada en cuestión o de una correspondiente cadena antisentido.
Una molécula de ácido nucleico “aislada” se separa de otras moléculas de ácido nucleico, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico y puede estar además esencialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, cuando ésta se prepara mediante técnicas recombinantes, o puede estar libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando ésta se sintetiza químicamente.
Una molécula de ácido nucleico divulgada en cuestión puede aislarse por medio de técnicas convencionales de biología molecular y la información de secuencia facilitada. Por ejemplo puede aislarse ADNc de un banco de ADNc adecuado, usándose una de las secuencias completas divulgadas de manera concreta o un fragmento de la misma como sonda de hibridación y técnicas de hibridación convencionales (tal como se describe por ejemplo en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además puede aislarse una molécula de ácido nucleico, que comprende una de las secuencias divulgadas o un fragmento de la misma, mediante reacción en cadena de la polimerasa, usándose los cebadores de oligonucleótidos que se crearon basándose en esta secuencia. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector adecuado y puede caracterizarse mediante análisis de secuencia de ADN. Los oligonucleótidos pueden prepararse además mediante procedimientos de síntesis convencionales, por ejemplo con un aparato de síntesis de ADN automático.
Las secuencias de ácido nucleico divulgadas en cuestión o derivados de las mismas, los homólogos o partes de estas secuencias, pueden aislarse por ejemplo con procedimientos de hibridación habituales o la técnica de PCR de otras bacterias, por ejemplo por medio de bancos genómicos o de ADNc. Estas secuencias de ADN hibridan en condiciones estándares con las secuencias divulgadas en cuestión.
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Por “hibridar” se entiende la capacidad de un polinucleótido u oligonucleótido de unirse a una secuencia casi complementaria en condiciones estándares, mientras que en estas condiciones no tienen lugar uniones inespecíficas entre componentes no complementarios. Para ello pueden ser complementarias las secuencias en un 90-100 %. La propiedad de secuencias complementarias de poder unirse específicamente una con otra, se aprovecha por ejemplo en la técnica de inmunotransferencia de tipo Northern o de tipo Southern o en caso de unión de cebadores en PCR o RT-PCR.
Para la hibridación se usan ventajosamente oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas. Pueden usarse sin embargo también fragmentos más largos de los ácidos nucleicos divulgados en cuestión o las secuencias completas para la hibridación. Dependiendo del ácido nucleico usado (oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa) o dependiendo de qué tipo de ácido nucleico ADN o ARN se use para la hibridación, varían estas condiciones estándares. Así se encuentran por ejemplo las temperaturas de fusión para híbridos de ADN:ADN aproximadamente 10 ºC más bajas que la misma longitud de híbridos de ADN:ARN.
Por condiciones estándares ha de entenderse por ejemplo dependiendo del ácido nucleico temperaturas entre 42 y 58 ºC en una solución acuosa de tampón con una concentración entre 0,1 y 5 x SSC (1 X SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de formamida al 50 % tal como por ejemplo 42 ºC en 5 x SSC, formamida al 50 %. Ventajosamente se encuentran las condiciones de hibridación para híbridos de ADN:ADN en 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20 ºC y 45 ºC, preferentemente entre aproximadamente 30 ºC y 45 ºC. Para híbridos de ADN:ARN se encuentran las condiciones de hibridación ventajosamente en 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30 ºC y 55 ºC, preferentemente entre aproximadamente 45 ºC y 55 ºC. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son valores de temperatura de fusión calculados a modo de ejemplo para un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido en G + C del 50 % en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN están descritas en libros de texto pertinentes de genética, tal como por ejemplo Sambrook et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse según fórmulas conocidas por el experto por ejemplo dependiendo de la longitud de los ácidos nucleicos, del tipo de los híbridos o el contenido en G + C. el experto puede sacar información adicional con respecto a la hibridación de los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
La “hibridación” puede realizarse en particular en condiciones rigurosas. Tales condiciones de hibridación están descritas por ejemplo en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., en: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
Por condiciones de hibridación “rigurosas” se entiende en particular: la incubación a 42 ºC durante la noche en una solución que está compuesta del 50 % de formamida, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de tri-sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano y 20 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, cortado, seguido de una etapa de lavado del filtro con 0,1x SSC a 65 ºC.
Se divulgan también derivados de las secuencias de ácido nucleico que pueden derivarse o divulgadas de manera concreta.
Así pueden derivarse otras secuencias de ácido nucleico divulgadas en cuestión, que codifican para aldoximadeshidratasa, por ejemplo de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 y diferenciarse de las mismas mediante adición, sustitución, inserción o deleción de nucleótidos individuales o varios nucleótidos, sin embargo pueden codificar además para polipéptidos con el perfil de propiedades deseado.
Están comprendidas también aquellas secuencias de ácido nucleico que comprenden las denominadas mutaciones silenciosas o están modificadas de manera correspondiente al uso de codones de un organismo originario o huésped especial, en comparación con una secuencia mencionada de manera concreta, tal como por ejemplo SEQ ID NO: 3, que está optimizada partiendo de SEQ ID NO: 2 con respecto al uso de codones de E. coli, al igual que las variantes de la misma que se producen de manera natural, tal como por ejemplo variantes de empalme o variantes de alelo.
Se divulgan igualmente mediante secuencias que pueden obtenerse mediante sustituciones de nucleótidos conservadoras (es decir el respectivo aminoácido se sustituye por un aminoácido de igual carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).
Se divulgan también las moléculas derivadas mediante polimorfismo de secuencias de los ácidos nucleicos divulgados de manera concreta. Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación natural. Estas variaciones naturales provocan habitualmente una varianza del 1 al 5 % en la secuencia de nucleótidos de un gen.
Por derivados de las secuencias de ácido nucleico divulgadas, que codifican para aldoxima-deshidratasa, derivadas de la secuencia SEQ ID NO: 3 o de una de las secuencias codificantes con respecto a SEQ ID NO: 1, ha de
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entenderse por ejemplo variantes de alelo que presentan al menos un 60 % de homología en el plano de aminoácidos derivados, preferentemente al menos un 80 % de homología, de manera muy especialmente preferente al menos un 90 % de homología por toda la región de secuencia (con respecto a la homología en el plano de aminoácidos se remite a las realizaciones mencionadas anteriormente con respecto a los polipéptidos). Por zonas parciales de las secuencias pueden encontrarse las homologías ventajosamente más altas.
Adicionalmente ha de entenderse por derivados también homólogos de las secuencias de ácido nucleico divulgadas, por ejemplo homólogos fúngicos o bacterianos, secuencias acortadas, ARN o ADN de cadena sencilla de la secuencia de ADN codificante y no codificante.
Además ha de entenderse por derivados por ejemplo fusiones con promotores. Los promotores, que están conectados previamente a las secuencias de nucleótidos indicadas, pueden estar modificados mediante al menos un intercambio de nucleótidos, al menos una inserción, inversión y/o deleción, sin que se vea alterada sin embargo la funcionalidad o actividad de los promotores. Además puede elevarse la actividad de los promotores mediante modificación de su secuencia o pueden intercambiarse completamente los promotores por promotores más eficaces también de organismos de otra especie.
2.2 Generación de mutantes funcionales
El experto conoce además procedimientos para la generación de mutantes funcionales de las enzimas.
Dependiendo de la técnica usada puede introducir el experto mutaciones completamente casuales o también más dirigidas en genes o también regiones de ácido nucleico no codificantes (que son importantes por ejemplo para la regulación de la expresión) y a continuación puede crear bancos de genes. Los procedimientos de biología molecular necesarios para ello los conoce el experto y están descritos por ejemplo en Sambrook y Russell, Molecular Cloning. 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001.
Los procedimientos para la modificación de genes y por consiguiente para la modificación de las proteínas codificadas por éstos son familiares desde hace tiempo para el experto, tal como por ejemplo
-la mutagénesis específica del sitio, en la que se intercambian de manera dirigida nucleótidos individuales o varios
nucleótidos de un gen (Trower MK (ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), -la mutagénesis por saturación, en la que en cualquier sitio discrecional de un gen puede intercambiarse o
añadirse un codón para un aminoácido discrecional (Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids
Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcárel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S
(1995) Mol Biotechnoi 3:1), -la reacción en cadena de la polimerasa susceptible a errores (error-prone PCR), en la que se mutan secuencias
de nucleótidos mediante ADN-polimerasas que actúan de manera errónea (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic
Acids Res 18:3739), -el procedimiento SeSaM (Sequence Saturation Method, procedimiento de saturación de secuencias), en el que
se impiden intercambios preferentes mediante la polimerasa (Schenk et al., Biospektrum, vol. 3, 2006, 277-279), -el pasaje de genes en cepas mutadoras, en los que por ejemplo debido a los mecanismos de reparación de ADN
defectuosos se produce una elevada tasa de mutación de secuencias de nucleótidos (Greener A, Callahan M,
Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. En: Trower MK (ed.)
In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey) o -la transposición de ADN, en la que una combinación de genes muy relacionados se forma y se digiere y los
residuos se usan como moldes para una reacción en cadena de la polimerasa, en la que se generan mediante
separación repetida de las cadenas y nueva aproximación por último genes de mosaico de longitud completa
(Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747).
Usando la denominada evolución dirigida (“directed evolution”; descrita entre otros en Reetz MT y Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, en: Demain AL, Davies JE (ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology) puede generar el experto mutantes funcionales también de manera dirigida y también a gran escala. A este respecto se generan en una primera etapa en primer lugar bancos de genes de las respectivas proteínas, pudiéndose usar por ejemplo los procedimientos indicados anteriormente. Los bancos de genes se expresan de manera adecuada, por ejemplo mediante bacterias o mediante sistemas de presentación en fagos.
Los respectivos genes de organismos huéspedes, que expresan mutantes funcionales con propiedades que corresponden en gran parte a las propiedades deseadas, pueden someterse a otra ronda de mutación. Las etapas de la mutación y de la selección o del muestreo pueden repetirse de manera iterativa hasta que los mutantes funcionales existentes presenten las propiedades deseadas en medida suficiente. Mediante este modo de funcionamiento iterativo puede realizarse gradualmente un número limitado de mutaciones, tal como por ejemplo 1, 2, 3, 4 ó 5 mutaciones y puede valorarse con respecto su influencia sobre la respectiva propiedad de enzima y seleccionarse. El mutante seleccionado puede someterse entonces de igual manera a otra etapa de mutación. Debido a ello puede reducirse significativamente el número de los mutantes individuales que van a someterse a
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estudio.
Los resultados proporcionan también información importante con respecto la estructura y la secuencia de las respectivas enzimas, que es necesaria para generar de manera dirigida otras enzimas con propiedades modificadas deseadas. En particular pueden definirse los denominados “hot spots”, es decir fragmentos de secuencia que son potencialmente adecuados para modificar una propiedad de enzima a través de la introducción de mutaciones dirigidas.
Igualmente puede deducirse la información con respecto a las posiciones de secuencias de aminoácidos de en qué región pueden realizarse mutaciones que debían tener probablemente poca influencia sobre la actividad enzimática y pueden designarse como posibles “mutaciones silenciosas”.
2.3 Constructos
Se divulgan además constructos de expresión, en particular recombinantes, que contienen bajo el control genético de secuencias de ácido nucleico reguladoras una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido; así como vectores, en particular recombinantes, que comprenden al menos uno de estos constructos de expresión.
Por una “unidad de expresión” se entiende un ácido nucleico con actividad de expresión que comprende un promotor, tal como se define en el presente documento y tras el enlace funcional con un ácido nucleico que va a expresarse o un gen regula la expresión, o sea la transcripción y la traducción de este ácido nucleico o de este gen. Se habla por tanto también en este contexto de una “secuencia de ácido nucleico reguladora”. De manera adicional al promotor pueden estar contenidos otros elementos reguladores, tales como por ejemplo potenciadores.
Por un “casete de expresión” o “constructo de expresión” se entiende una unidad de expresión que está enlazada funcionalmente con el ácido nucleico que va a expresarse o el gen que va a expresarse. A diferencia de una unidad de expresión, un casete de expresión comprende por consiguiente no sólo secuencias de ácido nucleico que regulan la transcripción y la traducción, sino también las secuencias de ácido nucleico que deben expresarse como proteína como consecuencia de la transcripción y traducción.
Los términos “expresión” o “sobreexpresión” describen en el contexto de la invención la producción o el aumento de la actividad intracelular de una o varias enzimas en un microorganismo, que se codifican mediante el correspondiente ADN. Para ello puede introducirse por ejemplo un gen en un organismo, puede sustituirse un gen existente por otro gen, puede elevarse el número de copias del gen o de los genes, puede usarse un promotor fuerte
o puede usarse un gen que codifica para una correspondiente enzima con una alta actividad y pueden combinarse eventualmente estas medidas.
Preferentemente comprenden tales constructos en el sentido de 5’ de la respectiva secuencia codificante un promotor y en el sentido de 3’ una secuencia terminadora así como eventualmente otros elementos reguladores habituales, y concretamente en cada caso de manera enlazada operativamente con la secuencia codificante.
Por un “promotor”, un “ácido nucleico con actividad promotor” o una “secuencia promotor” se entiende un ácido nucleico que, en enlace funcional con un ácido nucleico que va a transcribirse, regula la transcripción de este ácido nucleico.
Por un enlace “funcional” u “operativo” se entiende en este contexto por ejemplo la disposición secuencial de uno de los ácidos nucleicos con actividad promotor y una secuencia de ácido nucleico que va a transcribirse y eventualmente otros elementos reguladores, tales como por ejemplo secuencias de ácido nucleico, que garantizan la transcripción de ácidos nucleicos, así como por ejemplo un terminador; de manera que cada uno de los elementos reguladores puede cumplir su función en la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Para ello no es forzosamente necesario un enlace directo en el sentido químico. Las secuencias control genéticas, tal como por ejemplo secuencias de potenciador, pueden ejercer su función también desde posiciones más alejadas o incluso desde otras moléculas de ADN en la secuencia diana. Se prefieren disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico que va a transcribirse se posiciona detrás (es decir en el extremo de 3’) de la secuencia promotor, de modo que ambas secuencias están unidas entre sí de manera covalente. A este respecto, la distancia entre la secuencia promotor y la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse de manera transgénica puede ser más baja de 200 pares de bases o puede ser inferior a 100 pares de bases o inferior a 50 pares de bases.
Además de los promotores y el terminador pueden mencionarse como ejemplos de otros elementos reguladores secuencias de selección como diana, potenciador, señales de poliadenilación, marcadores seleccionables, señales de amplificación, orígenes de replicación y similares. Secuencias reguladoras adecuadas están descritas por ejemplo en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Los constructos de ácido nucleico divulgados en cuestión comprenden en particular una secuencia codificante para un mutante de aldoxima-deshidratasa, en particular una SEQ ID NO: 3 derivada de la secuencia de ácido nucleico que codifica para una PAOx de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y adaptada al uso de codones de E. coli o derivados y homólogos de la misma, así como las secuencias de ácido nucleico que pueden derivarse de la misma, que se
dos en la siguiente tabla 2:
Tabla 2:
- SEQ ID NO:
- número de acceso descripción n.º EC organismo
- 6
- F0QD95_ACIAP fenilacetaldoximadeshidratasa 4.99.1.7 Acidovorax avenae-cepa ATCC 19860 DSM 7227 JCM 20985 NCPPB 1011
- 7
- YP_003097901 fenilacetaldoximadeshidratasa 4.99.1.7 Actinosynnema mirum DSM 43827
- 8
- YP_001240697 supuesta fenilacetaldoximadeshidratasa 4.99.1.7 Bradyrhizobium sp. BTAi1
- 9
- ZP_02891657 fenilacetaldoximadeshidratasa 4.99.1.7 Burkholderia ambifaria IOP4010
- 10
- YP_001816246 fenilacetaldoximadeshidratasa [Burkholderia ambifaria MC40-6]. 4.99.1.7 Burkholderia ambifaria MC406
- 11
- YP_001776877 fenilacetaldoximadeshidratasa [Burkholderia cenocepacia MC0-3]. 4.99.1.7 Burkholderia cenocepacia MC0-3
- 12
- YP_004119277 fenilacetaldoximadeshidratasa [Pantoea sp. At9b]. 4.99.1.7 Pantoea sp. At-9b
- 13
- ZP_07774756 fenilacetaldoximadeshidratasa [Pseudomonas fluorescens WH6]. 4.99.1.7 Pseudomonas fluorescens WH6
- 14
- ZP_07774757 fenilacetaldoximadeshidratasa [Pseudomonas fluorescens WH6]. 4.99.1.7 Pseudomonas fluorescens WH6
- 15
- YP_001268042 fenilacetaldoximadeshidratasa [Pseudomonas putida F1]. 4.99.1.7 Pseudomonas putida F1
- 16
- E4RFH2_PSEPB fenilacetaldoxima_ deshidratasa 4.99.1.7 Pseudomonas putida cepa BIRD-1
- 17
- YP_001758607 fenilacetaldoximadeshidratasa [Shewanella woodyi ATCC 51908]. 4.99.1.7 Shewanella woodyi ATCC 51908
- 18
- YP_001261493 fenilacetaldoximadeshidratasa [Sphingomonas wittichii RW1]. 4.99.1.7 Sphingomonas wittichii RW1
- 19
- YP_004155682 fenilacetaldoximadeshidratasa [Variovorax paradoxus EPS]. 4.99.1.7 Variovorax paradoxus EPS
- 20
- YP_002942593 fenilacetaldoximadeshidratasa [Variovorax paradoxus S110]. 4.99.1.7 Variovorax paradoxus S110
- 21
- YP_002944432 fenilacetaldoximadeshidratasa [Variovorax paradoxus S110]. 4.99.1.7 Variovorax paradoxus S110
- 22
- YP_001416464 fenilacetaldoximadeshidratasa [Xanthobacter autotrophicus Py2]. 4.99.1.7 Xanthobacter autotrophicus Py2
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mediante muestreo de representantes de sobreexpresión. Como alternativa puede provocarse una sobreexpresión mediante amplificación de ingeniería genética de la expresión de un gen que se produce de manera natural en los microorganismos o plantas, que expresa una aldoxima-deshidratasa, por ejemplo mediante uso de promotores más fuertes para el aumento de la transcripción.
De acuerdo con una forma de realización especial se realiza una reacción de la oxima en presencia de un microorganismo, siendo el microorganismo una cepa bacteriana que expresa funcionalmente la aldoximadeshidratasa, preferentemente PAOx. La cepa bacteriana puede seleccionarse por ejemplo entre Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis o Zymomonas mobilis. De acuerdo con formas de realización especiales es la cepa bacteriana una cepa de E. coli. El microorganismo es en particular un microorganismo recombinante, en el que se ha introducido un gen heterólogo de la oxima-deshidratasa, en particular un gen para PAOx.
En un perfeccionamiento especial, el microorganismo porta a este respecto un constructo de expresión, que presenta una secuencia de ácido nucleico que codifica para la aldoxima-deshidratasa. La secuencia de ácido nucleico puede estar adaptada a este respecto parcial o completamente al uso de codones del microorganismo. Una adaptación completa existe cuando todos los codones de todos los aminoácidos están modificados de modo que se realice una traducción óptima en el microorganismo previsto, siempre que no existiera en todo caso ya un codón óptimo. Puede basarse en una adaptación parcial cuando no son óptimos los codones de todo los aminoácidos, sino sólo aminoácidos seleccionados, o cuando no están optimizados todos los codones existentes dentro de la secuencia de ácido nucleico en cada caso de un aminoácido.
De acuerdo con otra forma de realización preferente del procedimiento de acuerdo con la invención expresa el microorganismo al menos una chaperona que favorece la expresión funcional de la aldoxima-deshidratasa, que puede ser en particular PAOx. La expresión funcional puede favorecerse en particular debido a que la chaperona favorece el correcto plegamiento de la oxima-deshidratasa expresada, en particular durante la o a continuación de la traducción. Mediante la expresión de chaperonas puede aumentar ventajosamente la proporción de aldoximadeshidratasa funcional en el microorganismo y la conversión de oxima en nitrilo.
En el contexto del procedimiento de acuerdo con la invención puede preverse en particular que el microorganismo exprese una o varias chaperonas, que se seleccionan entre GroEL y GroES. El experto conoce otras chaperonas que se dividen en cinco grandes familias, concretamente la familia Hsp100/Clp, la familia Hsp90, la familia Hsp70 (con por ejemplo DnaK, DNAJ, Hsc62, Hsc56, y GrpE como representantes en E. coli), la familia Hsp60/GroEL (con la ya mencionada GroEL) y la familia de las proteínas de choque térmico pequeñas (Hsp20). Las chaperonas pueden seleccionarse igualmente de estas familias de proteínas. Igualmente pueden formarse combinaciones, por ejemplo del complejo Dank/DnaJ/GrpE, del complejo GroEL/ES y factor desencadenante, tal como se describen por ejemplo en O’Donnell y Lis, MIT 7.88 Research Paper, 2006. La o las chaperonas pueden expresarse de manera endógena en el microorganismo usado, o pueden expresarse parcial o totalmente mediante secuencias de ácido nucleico introducidas adicionalmente en el microorganismo. Estas secuencias de ácido nucleico pueden introducirse en el genoma del microorganismo, por ejemplo en un cromosoma bacteriano o de manera extracromosómica pueden encontrarse en constructos de expresión. Si se realiza una expresión de una aldoxima-deshidratasa por un constructo de expresión extracromosómico, por ejemplo ya que un gen heterólogo de la oxima-deshidratasa debe expresarse en un microorganismo o ya que la expresión de un gen cromosómico debe complementarse mediante la expresión adicional de un gen extracromosómico de la aldoxima-deshidratasa, entonces pueden encontrarse el gen de aldoxima-deshidratasa y el gen de chaperona en un constructo de expresión común o en constructos de expresión separados.
Una forma de realización preferente del procedimiento de acuerdo con la invención comprende al menos las siguientes etapas a), b) y d):
a) aislar un microorganismo que produce una enzima con actividad aldoxima-deshidratasa a partir de una fuente natural o prepararlo de manera recombinante, b) reproducir este microorganismo, c) aislar eventualmente del microorganismo la enzima con actividad aldoxima-deshidratasa o preparar una fracción de proteína que contiene esta enzima y d) transferir el microorganismo de acuerdo con la etapa b) o la enzima de acuerdo con la etapa c) a un medio que contiene la oxima.
En el procedimiento de acuerdo con la invención se lleva a contacto y/o se incuba el sustrato, tal como por ejemplo citronelaloxima, con la enzima que tiene la actividad de la aldoxima-deshidratasa en un medio de modo que se realice una conversión del sustrato, tal como por ejemplo de citronelaloxima, en citronalalnitrilo, en presencia de la enzima. Preferentemente, en el caso del medio se trata de un medio de reacción acuoso.
El valor de pH del medio de reacción acuoso, en el que se realiza preferentemente el procedimiento de acuerdo con la invención, se mantiene a este respecto ventajosamente entre pH 4 y 12, preferentemente entre pH 4,5 y 9, de manera especialmente preferente entre pH 5 y 8.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En el caso de los medios de reacción acuosos se trata preferentemente de soluciones tamponadas, que presentan por regla general un valor de pH de preferentemente de 5 a 8. Como tampón puede usarse un tampón citrato, fosfato, TRIS (tris(hidroximetil)-aminometano) o MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico). Además puede contener el medio de reacción aún otros aditivos, tal como por ejemplo detergentes (por ejemplo taurodesoxicolato), FMN, iones tales como iones metálicos (por ejemplo Fe2+ y Sn2+) o aniones tales como SO32-, así como azida sódica. Ciertas composiciones detalladas de mezclas de reacción adecuadas pueden encontrarse también en las siguientes fuentes bibliográficas: Kato, Y. et al., Biochemistry (2000), 39, 800-809 y Xie, S.-X. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001), 65(12), 2666-2672.
El sustrato, tal como por ejemplo citronelaloxima, se usa preferentemente en una concentración de 2 -200 mM, de manera especialmente preferente de 5 -25 mM en la reacción enzimática y puede alimentarse de manera continua o discontinua. La reacción puede realizarse sin embargo también con aldoxima pura (por ejemplo citronelaloxima) en presencia del organismo huésped que expresa sólo la enzima, tal como que expresa la PAOx (por ejemplo E. coli), tal como se describe en el ejemplo 2.
La conversión enzimática de oxima en nitrilo se realiza por regla general a una temperatura de reacción por debajo de la temperatura de desactivación de la enzima usada y por encima de -10 ºC. Preferentemente se realiza el procedimiento de acuerdo con la invención a una temperatura entre 0 ºC y 95 ºC, de manera especialmente preferente a una temperatura entre 15 ºC y 60 ºC, en particular entre 20 ºC y 40 ºC, por ejemplo a aproximadamente de 25 ºCa 30 ºC.
Se prefiere especialmente un procedimiento de acuerdo con la invención, en el que la reacción de oxima para dar nitrilo se realiza a una temperatura en el intervalo de 20 ºC a 40 ºC y/o a un valor de pH en el intervalo de 4 a 10, preferentemente a pH 8.
Además de estos sistemas acuosos monofásicos se usan en otra variante de la invención también sistemas bifásicos. A este respecto además de una fase acuosa se usan como segunda fase medios de reacción orgánicos, no miscibles con agua. Debido a ello se acumula los productos de reacción en la fase orgánica. Tras la reacción puede separarse el producto, tal como por ejemplo citralnitrilo, neralnitrilo, geranialnitrilo o citronelalnitrilo, en la fase orgánica fácilmente de la fase acuosa que contiene el biocatalizador.
Se prefiere un procedimiento de acuerdo con la invención, caracterizado porque la preparación de los nitrilos citralnitrilo, neralnitrilo, geranialnitrilo o citronelalnitrilo, se realiza en sistemas acuosos monofásicos o en sistemas bifásicos.
El producto de reacción, tal como por ejemplo citralnitrilo, neralnitrilo, geranialnitrilo o citronelalnitrilo, puede extraerse con disolventes orgánicos y eventualmente puede destilarse para la purificación.
Los disolventes orgánicos adecuados son por ejemplo hidrocarburos alifáticos, preferentemente con 5 a 8 átomos de carbono, tales como pentano, ciclopentano, hexano, ciclohexano, heptano, octano o ciclooctano, hidrocarburos alifáticos halogenados, preferentemente con uno o dos átomos de carbono, tal como diclorometano, cloroformo, tetracloruro de carbono, dicloroetano o tetracloroetano, hidrocarburos aromáticos, tales como benceno, tolueno, los xilenos, clorobenceno o diclorobenceno, éteres o alcoholes alifáticos acíclicos y cíclicos, preferentemente con 4 a 8 átomos de carbono, tal como etanol, isopropanol, dietiléter, metil-terc-butiléter, etil-terc-butiléter, dipropiléter, diisopropiléter, dibutiléter, tetrahidrofurano o ésteres tales como acetato de etilo o acetato de n-butilo o cetonas tales como metilisobutilcetona o dioxano o mezclas de los mismos. De manera especialmente preferente se usan el heptano, metil-terc-butiléter, diisopropiléter, tetrahidrofurano, acetato de etilo.
Las aldoxima-deshidratasas usadas de acuerdo con la invención pueden usarse en el procedimiento de acuerdo con la invención como enzima libre o inmovilizada, tal como se ha descrito ya anteriormente.
Para el procedimiento de acuerdo con la invención pueden usarse células en reposo o en crecimiento, libres o inmovilizadas, que contienen ácidos nucleicos que codifican para la aldoxima-deshidratasa, constructos de ácido nucleico o vectores. Pueden usarse también células solubilizadas, tal como lisados de células u homogeneizados de células. Por células solubilizadas ha de entenderse por ejemplo células que se han vuelto permeables por medio de un tratamiento por ejemplo con disolventes, o células que se rompieron por medio de un tratamiento enzimático, por medio de un tratamiento mecánico (por ejemplo prensa francesa o ultrasonidos) o por medio de otro procedimiento. Los extractos brutos así obtenidos son adecuados ventajosamente para el procedimiento de acuerdo con la invención. Pueden usarse también enzimas purificadas o parcialmente purificadas para el procedimiento.
Si se usan para el procedimiento de acuerdo con la invención organismos o enzimas libres, entonces se separan éstos antes de la extracción de manera conveniente, por ejemplo a través de una filtración o centrifugación.
El procedimiento de acuerdo con la invención puede hacerse funcionar de manera discontinua, semi-continua o continua.
deshidratasa (PAOx). La mezcla de reacción se incubó con agitación a 30 ºC. Las muestras de la mezcla de reacción (0,1 ml) se tomaron tras 18 h y 90 h y se mezclaron con 0,5 ml de n-heptano. La fase orgánica se analizó a través de cromatografía de gases (CG). El análisis de CG se realizó en un Agilent 6890 N (columna: Optima 5 Accent, Macherey & Nagel; velocidad de flujo: 1 ml/min a 13,5 PSI, temperatura de inyección 280 ºC; temperatura de 5 detección 320 ºC; detector: FID; tiempo de retención de citronelaloxima: 7,816 min & 8,018 min; tiempo de retención de citronelilnitrilo: 6,765 min). Tras 90 h se había convertido la R/S-E/Z citronelaloxima racémica cuantitativamente en el correspondiente nitrilo. La reacción realizada a este respecto se muestra en la figura 1. Los correspondientes cromatogramas de gases se muestran antes, durante y tras la conversión en la figura 2A, figura 2B y figura 2C. En la tabla 5 se muestra un desarrollo temporal aproximado de la reacción, en la que se indica la proporción porcentual de
10 las superficies pico de los cromatogramas de gases.
Tabla 5
- Tiempo [h]
- Citronelaloxima Citronelalnitrilo
- 0
- 100,00 0,00
- 18
- 50,03 49,97
- 90
- 0,03 99,97
Tabla 6 -indicaciones de secuencia:
- SEQ ID NO
- Fuente Especie Observación
- 1
- Bacillus s. OxB-1 AS PAOx
- 2
- Bacillus s. OxB-1 NS PAOx ADN de tipo natural para SEQ ID NO: 1
- 3
- sintética NS PAOx SEQ ID NO: 1 optimizada con respecto a codones para E. coli
- 4
- Arthrobacter aurescens TC1 AS Aldoxima alifáticadeshidratasa
- 5
- Acinetobacter sp. cepa ADP1 AS Aldoxima alifáticadeshidratasa
- 6
- Acidovorax avenae (ATCC 19860) AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 7
- Actinosynnema mirum (DSM 43827) AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 8
- Bradyrhizobium sp. BTAi1 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 9
- Burkholderia ambifaria IOP40-10 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 10
- Burkholderia ambifaria MC40-6 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 11
- Burkholderia cenocepacia MC0-3 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 12
- Pantoea sp. At-9b AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 13
- Pseudomonas fluorescens WH6 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 14
- Pseudomonas fluorescens WH6 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 15
- Pseudomonas putida F1 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 16
- Pseudomonas putida cepa BIRD-1 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
(continuación)
- SEQ ID NO
- Fuente Especie Observación
- 17
- Shewanella woodyi ATCC 51908 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 18
- Sphingomonas wittichii RW1 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 19
- Variovorax paradoxus EPS AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 20
- Variovorax paradoxus S110 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 21
- Variovorax paradoxus S110 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 22
- Xanthobacter autotrophicus Py2 AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 23
- Gibberella zeae AS fenilacetaldoximadeshidratasa
- 24
- Pseudomonas chlororaphis AS Aldoxima alifáticadeshidratasa
- 25
- Pseudomonas sp. K-9 AS Aldoxima alifáticadeshidratasa
- 26
- Rhodococcus erythropolis AS Aldoxima alifáticadeshidratasa
- 27
- Rhodococcus globerulus AS Aldoxima alifáticadeshidratasa
- 28
- Arabidopsis thaliana AS Indolacetaldoximadeshidratasa
- NS: ácido nucleico; AS: aminoácido
Sigue una lista de secuencias útiles de acuerdo con la tabla 6, que pueden usarse (con excepción de SEQ ID NO: 28) directamente para un procedimiento de acuerdo con la invención o sirven como secuencias de partida, eventualmente también en forma de secuencias de ácido nucleico codificantes, para la generación de equivalentes funcionales que pueden usarse entonces en un procedimiento de acuerdo con la invención. Los números de acceso remiten a bancos de datos conocidos en la técnica, por ejemplo NCBI (National Center for Biotechnology Information), GeneBank, o SwissProt.
SEQ ID NO: 1; números de acceso: BAA90461; P82604 (UniProtKB/Swiss-Prot)
Claims (1)
-
imagen1
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