ES2703770T3

ES2703770T3 - Preparación biocatalítica de ambroxán

Info

Publication number: ES2703770T3
Application number: ES10724460T
Authority: ES
Inventors: Michael Breuer; Andrea Hörster; Bernhard Hauer
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2010-06-02
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2030-06-02
Also published as: EP3404108A1; CN102449158B; JP2012528578A; JP5735493B2; US8759043B2; US20120135477A1; WO2010139719A3; CN102449158A; EP2438182A2; WO2010139719A2; EP2438182B1; MX2011012757A

Abstract

Procedimiento para la preparación de derivados de ambroxán, preferentemente ambroxán, de fórmula general (2) caracterizado porque se hacen reaccionar derivados de homofarnesol de fórmula general (1) de manera biocatalítica para dar los derivados de ambroxán correspondientes por medio de un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa como enzima,**Fórmula** en donde la actividad del polipéptido es la reacción de homofarnesol para dar ambroxán con sustrato principal homofarnesol, caracterizado porque la enzima es un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: a) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2, 5 o 10; b) molécula de ácido nucleico que comprende al menos un polinucleótido de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1; c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia presenta una identidad de al menos el 60 % con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2, 5 o 10.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación biocatalítica de ambroxán

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación biocatalítica de ambroxán.

Los compuestos con la estructura principal del dodecahidronafto[2,1-b]furano son de gran interés económico como productos químicos aromáticos. En este caso se menciona el Compuesto 2, el (3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9atetrametildodecahidronafto-[2,1-b]-furano) conocido como el estereoisómero levógiro [(-)-2] del ambroxán.

Originalmente obtenido a partir del ámbar del cachalote, actualmente existen principalmente dos rutas que permiten el acceso a ambroxán. Esclareol (3), un ingrediente de la esclárea (Salvia sclarea) sirve a este respecto con frecuencia como material de partida adecuado para material semisintético, debido a que contiene ya información óptica para el compuesto ((-)-2). A este respecto, la degradación oxidativa puede llevarse a cabo con ácido crómico, permanganato, h2o2 u ozono [Stoll et al.; Helv Chim Acta (1950), 33: 1251]. La esclareolida obtenida (4) se convierte mediante una reacción posterior (por ejemplo con LiAIH4 o NaBH4) en el ambrox-1,4-diol (5) [Mookherjee et al.; Perfumer and Flavourist (1990), 15: 27]. La preparación de compuesto (4) a partir de esclareol (3) puede tener lugar también mediante una biotransformación con Hyphozyma roseoniger [documento EP 204009].

Ambrox-1,4-diol (5) puede ciclarse por último con una serie de procedimientos químicos para dar el compuesto ((-)-2). Para el racemato de ambroxán rac-2 se tratado accesos, entre otros, a través de ácido homofarnesílico [documento US 513.270; Lucius et al.; Chem Ber (1960), 93: 2663] y 4-(2,6,6-trimetil-ciclohex-1-enil)-butan-2-ona [Büchi et al.; Helv Chim Acta (1989), 72: 996]. El volumen de mercado de ambroxán en 2002 era en aquel momento en promedio de 20 toneladas al año. Para ello es necesaria una base de partida de aproximadamente 33 toneladas de esclareol al año. Para la producción de una tonelada de ambroxán se necesitan 207 toneladas de distintas sustancias individuales, que a su vez requieren la acumulación de 206 toneladas de desecho. Las sustancias generadas presentan diferentes, pero en conjunto relativamente fuertes efectos sobre el medio ambiente y la salud [Deutsche Bundesstiftung Umwelt]. Por lo tanto, esta síntesis es de muy alto consumo energético y requiere el uso de productos químicos contaminantes.

La síntesis biocatalítica de compuesto ((-)-2) se describe en la bibliografía [Neumann et al.; Biol Chem Hoppe Seyler (1986), 367: 723]. A este respecto, la molécula se obtiene a partir de homofarnesol (Compuesto (1), (3Z,7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11 -trien-1 -ol). Como catalizador se usó la escualeno-hopeno ciclasa (SHC) de Alicyclobacillus acidocaldarius (anteriormente Bacillus acidocaldarius). La enzima cataliza naturalmente la ciclación de escualeno para dar hopano. Como reacción secundaria, esta SHC puede convertir obviamente también el Compuesto (1) para dar ambroxán ((-)-2). El biocatalizador puede prepararse de manera recombinante [Ochs D.et al.; J Bacteriol (1992), 174: 298]. La reacción de ciclación de homofarnesol para dar ambroxán asciende según Neumann et al. no obstante únicamente al 1,2 % (calculado a partir de los picos de CG) y la actividad específica con respecto a la ciclación de homofarnesol se indica 0,02 mU/mg de proteína.

La solicitud de patente JP2009060799 describe la síntesis biocatalítica de (-)-ambroxán a partir de homofarnesol por medio de una SHC, teniendo lugar la reacción en un disolvente a un pH de 5,2-6,6. Los ejemplos experimentales usan la SHC de A. acdidocaldarius.

Por lo tanto era objetivo de la presente invención proporcionar un nuevo procedimiento para la preparación de ambroxán así como derivados del mismo, que ofrezca ventajas con respecto a las síntesis técnicamente costosas del estado de la técnica. Mediante el uso de procedimientos biotécnicos se evitará la generación de sustancias contaminantes y se reducirá drásticamente el consumo de energía. Otro objetivo era reducir los gastos generados adicionalmente por el uso de materias primas fácilmente accesibles así como una disminución del número de reacciones químicas (o etapas). Asimismo se conseguirá una productividad elevada.

Este objetivo se consigue mediante un procedimiento para la preparación de derivados de ambroxán, preferentemente ambroxán, de fórmula general (2) caracterizado porque se hacen reaccionar derivados de homofarnesol de fórmula general (1) de manera biocatalítica para dar los derivados de ambroxán correspondientes por medio de un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa como enzima, en el que la actividad del polipéptido es la reacción de homofarnesol para dar ambroxán con sustrato principal homofarnesol, caracterizado porque la enzima es un polipéptido, que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2, 5 o 10;

b) molécula de ácido nucleico que comprende al menos un polinucleótido de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1;

c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia presenta una identidad de al menos el 60 % con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2, 5 o 10.

Derivados son en particular estereoisómeros, preferentemente enantiómeros pero también diastereómeros del compuesto (2). En una realización de la presente invención, derivados de homofarnesol o ambroxán son Compuestos sustituidos (1) y (2), siendo los sustituyentes inertes con respecto a la reacción biocatalizada. Con ello se expresan en particular compuestos de las fórmulas estructurales representadas a continuación.

En el sentido de la invención, los términos "Compuesto (1), "homofarnesol", "4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trien-1-ol)" y derivados del homofarnesol o los términos "Compuesto (2)", "ambroxán", "dodecahidronafto[2,1-b]furano" y derivados del ambroxán tienen el mismo significado y pueden intercambiarse y sustituirse uno por otro, siempre que no se defina expresamente nada al contrario.

En una variante preferida de la invención, se forma el ambroxán levógiro de fórmula ((-)-2):

Los polipéptidos con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa representan una nueva clase de enzimas. El término "actividad" describe la capacidad de una enzima para convertir un sustrato en un producto. La actividad puede determinarse en una denominada prueba de actividad a través del aumento del producto, la disminución del sustrato (o educto) o a través de una combinación de estos parámetros en función del tiempo.

Las enzimas usadas de acuerdo con la invención tienen una actividad para la reacción de homofarnesol para dar ambroxán.

En el sentido de la invención, el sustrato principal es el compuesto químico que en comparación con todos los demás compuestos, que pueden convertirse por la enzima, presenta en porcentaje en moles la mayor proporción como componente de reacción de la homofarnesol-ambroxán ciclasa.

En el sentido de la invención, el sustrato principal es homofarnesol y por lo tanto la actividad principal y con ello la reacción principal de una homofarnesol-ambroxán ciclasa la reacción con el sustrato principal homofarnesol.

La actividad de la homofarnesol-ambroxán ciclasa se define en una variante de la invención a través del rendimiento en porcentaje en moles. Preferentemente, con la reacción de homofarnesol para dar ambroxán en presencia de una enzima de la nueva clase de homofarnesol-ambroxán ciclasas, se obtiene un rendimiento de ambroxán en porcentaje en moles con respecto a los moles empleados de homofarnesol de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100; de manera especialmente preferente, el rendimiento se encuentra entre 5 y 100, 10 y 100, 20 y 100, 25 y 100, 30 y 100, 35 y 100, en particular entre 40 y 100, 45 y 100, 50 y 100, 60 y 100, 70 y 100 porcentaje en moles.

La actividad de la homofarnesol-ambroxán ciclasa, en otra variante de la invención se define a través de la conversión (cantidad de producto/(cantidad de producto cantidad de educto residual) * 100) en porcentaje en moles. Preferentemente, con la reacción de homofarnesol para dar ambroxán en presencia de una enzima de la nueva clase de homofarnesol-ambroxán ciclasas, se obtiene una conversión de ambroxán en porcentaje en moles de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100; de manera especialmente preferente, la conversión se encuentra entre 5 y 100, 10 y 100, 20 y 100, 25 y 100, 30 y 100, 35 y 100, en particular entre 40 y 100, 45 y 100, 50 y 100, 60 y 100, 70 y 100.

En una realización preferida de la invención, el rendimiento y/o la conversión se determina a lo largo de un periodo de tiempo definido de por ejemplo 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 36 o 48 horas en el que la reacción de homofarnesol para dar ambroxán tiene lugar por medio de las ciclasas usadas de acuerdo con la invención. En otra variante, la reacción se lleva a cabo en condiciones definidas de manera precisa, de por ejemplo 25, 30, 40, 50 o 60 °C. En particular, tiene lugar la determinación del rendimiento y/o de la conversión llevándose a cabo la reacción para la reacción de homofarnesol para dar ambroxán por medio de las ciclasas usadas de acuerdo con la invención a 30 °C durante 16 horas.

En una realización de la invención, para la determinación del rendimiento y/o de la conversión se hace reaccionar una solución 10 mM de homofarnesol (tamponada con citrato) con una solución de ciclasa, encontrándose la enzima como extracto de proteína de membrana de células que expresan homofarnesol-ambroxán ciclasas (aisladas de acuerdo con [Ochs D.et al.; J Bacteriol (1992), 174: 298]) en una concentración de contenido de proteína del 0,08 por ciento en peso.

En otra realización de la presente invención, una homofarnesol-ambroxán ciclasa se caracteriza porque con la reacción de homofarnesol para dar ambroxán en las mismas condiciones muestra una conversión y/o rendimiento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 500, 1000 veces o superior en comparación con la escualeno-hopeno ciclasa (SHC) de Alicydobacillus acidocaldarius (anteriormente Bacillus acidocaldarius). El término condición se refiere en este caso a condiciones de reacción tales como concentración de sustrato, concentración de enzima, periodo de tiempo de reacción y/o temperatura.

En una variante de la presente invención, una homofarnesol-ambroxán ciclasa se caracteriza por cualquiera o varias, en cualquier combinación aleatoria, de las definiciones mencionadas anteriormente.

Asimismo, se divulga un procedimiento para la preparación de ambroxán, en el que

a) se pone en contacto homofarnesol con la homofarnesol-ambroxán ciclasa y/o se incuba, y

b) se aísla ambroxán.

En una realización de la invención, se pone en contacto homofarnesol con la homofarnesol-ambroxán ciclasa en un medio y/o se incuba de modo que tiene lugar una reacción de homofarnesol para dar ambroxán en presencia de la ciclasa. Preferentemente, en el caso del medio se trata de un medio de reacción acuoso. En el caso de los medios de reacción acuosos se trata preferentemente de soluciones tamponadas, que por regla general presentan un valor de pH de preferentemente de 5 a 8. Como tampón puede usarse un tampón de citrato, fosfato, TRIS (tris(hidroximetil)-aminometano), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico). Asimismo el medio de reacción puede contener también aditivos adicionales, tales como por ejemplo detergentes (por ejemplo taurodesoxicolato).

El sustrato (1) se emplea preferentemente en una concentración de 5 - 100 mM, de manera especialmente preferente de 15 - 25 mM en la reacción enzimática y puede seguirse de manera continua o discontinua.

La ciclación enzimática tiene lugar por regla general a una temperatura de reacción por debajo de la temperatura de desactivación de la ciclasa empleada y por encima de -10 °C. De manera especialmente preferente se encuentra en el intervalo de 0 a 100 °C, en particular de 15 a 60 °C y en especial de 20 a 40 °C, por ejemplo a aproximadamente 30 °C.

El producto de reacción ambroxán puede extraerse con disolventes orgánicos, seleccionados del grupo de los mencionados anteriormente, y dado el caso destilarse para la purificación.

Junto a estos sistemas acuosos de una sola fase, en otra variante de la invención se emplean también sistemas de dos fases. A este respecto se usan líquidos iónicos como segunda fase, pero preferentemente medios de reacción orgánicos, no miscibles con agua, como segunda fase. De esta manera los productos de reacción se acumulan en la fase orgánica. Después de la reacción, ambroxán en la fase orgánica puede separarse fácilmente de la fase acuosa, que contiene el biocatalizador.

Por medios de reacción no acuosos se entienden medios de reacción que contienen menos del 1 % en peso, preferentemente menos del 0,5 % en peso de agua, con respecto al peso total del medio de reacción líquido. En particular, la reacción puede llevarse a cabo en un disolvente orgánico.

Disolventes orgánicos adecuados son por ejemplo hidrocarburos alifáticos, preferentemente con 5 a 8 átomos de carbono, tales como pentano, ciclopentano, hexano, ciclohexano, heptano, octano o ciclooctano, hidrocarburos alifáticos halogenados, preferentemente con uno o dos átomos de carbono, tales como diclorometano, cloroformo, tetraclorocarbono, dicloroetano o tetracloroetano, hidrocarburos aromáticos, tales como benceno, tolueno, los xilenos, clorobenceno o diclorobenceno, éteres alifáticos acíclicos y cíclicos o alcoholes, preferentemente con 4 a 8 átomos de carbono, tales como etanol, isopropanol, dietil éter, metil-terc-butil éter, etil-terc-butil éter, dipropil éter, diisopropil éter, dibutil éter, tetrahidrofurano o ésteres tales como acetato de etilo o acetato de n-butilo o cetonas tales como metilisobutil cetona o dioxano o mezclas de los mismos. De manera especialmente preferente se usan los mencionados anteriormente heptano, metil-terc-butil éter, diisopropil éter, tetrahidrofurano, acetato de etilo. En una realización de la presente invención, como material de partida para la síntesis de ambroxán se emplea citral. Esto es una ventaja particular del procedimiento de acuerdo con la invención, dado que citral se encuentra disponible de manera económica en grandes cantidades. Citral se hace reaccionar en una síntesis química clásica para dar homofarnesol.

En una realización de la presente invención, la reacción de citral para dar homofarnesol tiene lugar en las siguientes etapas (por ejemplo: Jo C, (1992), 57, 2794):

El procedimiento de acuerdo con la invención ofrece una ventaja adicional porque la reacción total de homofarnesol para dar ambroxán tiene lugar en sistemas acuosos de una sola fase pero también en sistemas de dos fases.

En el caso de los sistemas de dos fases se emplenan los mencionados anteriormente. Preferentemente se usan los disolventes orgánicos, no miscibles con agua, mencionados anteriormente, como segunda fase. De esta manera los productos de reacción se acumulan en la fase orgánica. Después de la reacción, ambroxán en la fase orgánica puede separarse fácilmente de la fase acuosa, que contiene el biocatalizador.

También en la realización de la invención con citral como material de partida, se pone en contacto homofarnesol con la homofarnesol-ambroxán ciclasa en un medio y/o se incuba de modo que tiene lugar una reacción de homofarnesol para dar ambroxán en presencia de la ciclasa. Preferentemente, en el caso del medio se trata de un medio de reacción acuoso. En el caso de los medios de reacción acuosos se trata preferentemente de soluciones tamponadas, que por regla general presentan un valor de pH de preferentemente de 5 a 8. Como tampón puede usarse un tampón de citrato, fosfato, TRIS (tris(hidroximetil)-aminometano), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico). Asimismo el medio de reacción puede contener también aditivos adicionales, tales como por ejemplo detergentes (taurodesoxicolato, u otros).

En una realización, el producto de reacción ambroxán se extraerá con disolventes orgánicos seleccionados del grupo de los mencionados anteriormente y dado el caso se destilarán para la purificación.

Asimismo, se divulga un procedimiento para la preparación biocatalítica de ambroxán, caracterizado porque la enzima es un polipéptido, que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia presenta una identidad de al menos el 46 % con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

d) molécula de ácido nucleico según (a) a (c), que para un polipéptido funcionalmente equivalente o un fragmento de la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

e) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, que se obtiene amplificándose una molécula de ácido nucleico de un banco de ADNc o de un ADN genómico por medio de los cebadores de acuerdo con la n.° 3 y 4, o sintetizándose químicamente la molécula de ácido nucleico mediante síntesis de novo;

f) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, que en condiciones rigurosas hibrida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (c);

g) molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, que puede aislarse a partir de un banco de ADN con el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (c) o sus fragmentos parciales de al menos 15 nt, preferentemente 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt como sonda en condiciones de hibridación rigurosas; y

h) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, presentando la secuencia del polipéptido una identidad de al menos el 46 % con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

i) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, donde el polipéptido se codifica por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de los descritos en a) a h) y se aisló o puede aislarse por medio de un anticuerpo monoclonal,

j) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, presentando el polipéptido un sitio de unión análogo o similar, tal como un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de los descritos en a) a h). Un sitio de unión análogo o similar en el sentido anterior es un motivo o dominio conservado de la secuencia de aminoácidos con una homología del 80 %, de manera especialmente preferente del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, en particular 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o 100 %, que garantiza la unión del mismo sustrato, en particular homofarnesol.

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico c) presenta una identidad con la SEQ ID NO: 1 de al menos el 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, de manera especialmente preferente del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, en particular 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

Asimismo, un polipéptido funcionalmente equivalente presenta una identidad con la SEQ ID NO: 2 de al menos el 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 55 % 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, de manera especialmente preferente del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, en particular 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

En lugar del término "identidad" puede usarse con el mismo significado también el término "homólogo" u "homología".

La identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o secuencias de polipéptido se calcula mediante comparación con ayuda del programa BESTFIT que se basa en el algoritmo de Smith, T.F. y Waterman, M.S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981)).

Preferentemente, la identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o secuencias de polipéptido se define por la identidad de la secuencia de ácido nucleico/secuencia de polipéptido a lo largo de la longitud de secuencia total en cada caso, tal como se calcula mediante comparación con ayuda del programa GAP que se basa en el algoritmo de Needleman, S.B. y Wunsch, C.D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453)).

Preferentemente, las comparaciones de identidad se llevan a cabo con el ajuste de los siguientes parámetros para aminoácidos:

penalización de creación de huecos: 8; penalización de extensión de huecos: 2

y los siguientes parámetros para ácidos nucleicos:

penalización de creación de huecos: 50; penalización de extensión de huecos: 3.

En una realización, la identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o secuencias de polipéptido se propone mediante comparación con ayuda del programa BLASTP 2.2.20+ con ajustes convencionales tal como en NCBI Blast (Referencia: Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Reference for compositional score matrix adjustment: Altschul et al., (2005), FEBS J. 272:5101-5109.)

Asimismo se divulgan otros homólogos o equivalentes funcionales de la SEQ ID NO: 1, que hibridan con esta secuencia de ácido nucleico en condiciones rigurosas.

Los "equivalentes funcionales" describen en principio en este caso secuencias de ácido nucleico que en condiciones estándar hibridan con una secuencia de ácido nucleico o partes de una secuencia de ácido nucleico y son capaces de provocar la expresión de una proteína con las mismas propiedades que las de la homofarnesol-ambroxán ciclasa en una célula o un organismo.

Para la hibridación se usan ventajosamente oligonucleótidos cortos con una longitud de aproximadamente 10-50 pb, preferentemente 15-40 pb por ejemplo de las regiones conservadas u otras, que pueden determinarse a través de comparaciones con otros genes relacionados de manera conocida por el experto en la materia. Pueden usarse también fragmentos más largos de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención con una longitud de 100-500 pb o las secuencias completas para la hibridación. En función del ácido nucleico/oligonucleótido usado, de la longitud del fragmento o de la secuencia completa o en función de qué tipo de ácido nucleico, es decir, ADN o ARN, se usan para la hibridación, varían las condiciones estándar. De este modo, por ejemplo las temperaturas de fusión para ADN:híbridos de ADN es aproximadamente 10 °C menor que la de ADN:híbridos de ARN de igual longitud.

Por condiciones de hibridación estándar se entienden por ejemplo en función del ácido nucleico temperaturas entre 42 y 58 °C en una solución tampón acuosa con una concentración entre 0,1 y 5 x SSC (1 X SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, pH 7,2) o adicionalmente en presencia del 50 % de formamida tal como por ejemplo 42 °C en 5 x SSC, 50 % de formamida. Ventajosamente, las condiciones de hibridación para ADN:híbridos de ADN son 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 20 °C y 65 °C, preferentemente entre aproximadamente 30 °C y 45 °C. Para ADN:híbridos de ARN, las condiciones de hibridación son ventajosamente 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30 °C y 65 °C, preferentemente entre aproximadamente 45 °C y 55 °C. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son valores de temperatura de fusión calculados a modo de ejemplo para un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido de G C del 50 % en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN se describen en libros de texto especializados de Genética, tales como por ejemplo Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse según fórmulas conocidas por el experto por ejemplo en función de la longitud de los ácidos nucleicos, del tipo de híbridos o del contenido de G C. El experto puede extraer informaciones adicionales para la hibridación de los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds), 1985, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York; Harnes and Higgins (eds), 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Por un equivalente funcional se entienden además también secuencias de ácido nucleico que con una secuencia de ácido nucleico determinada ("secuencia de ácido nucleico original) son homólogas o idénticas hasta un porcentaje definido y que presentan la misma actividad que las secuencias de ácido nucleico originales, asimismo en particular también mutaciones naturales o artificiales de estas secuencias de ácido nucleico.

"Equivalentes funcionales" o análogos de las enzimas divulgadas en concreto son en el contexto de la presente divulgación polipéptidos distintos de los mismos, que tienen además la actividad biológica deseada, tal como por ejemplo actividad principal, especificidad de sustrato. De este modo, por ejemplo por "equivalentes funcionales" se entienden enzimas que catalizan la reacción modelo y que presentan al menos el 20 %, 30 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, de manera especialmente preferente del 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, en particular 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la actividad de una enzima, que comprende una de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11.

Por "equivalentes funcionales" se entienden en particular también mutantes, que en al menos una posición de secuencia de las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente presentan un aminoácido distinto del aminoácido mencionado en concreto pero, a pesar de ello, tienen una de las actividades biológicas mencionadas anteriormente. Los "equivalentes funcionales" abarcan por lo tanto los mutantes que pueden obtenerse mediante una o varias adiciones, sustituciones, deleciones y/o inversiones de aminoácido, pudiendo aparecer las modificaciones mencionadas en cualquier posición de secuencia, siempre que lleven a un mutante con el perfil de propiedades divulgado en este caso. Equivalencia funcional se da en particular también entonces cuando los patrones de reactividad entre mutante y polipéptido no modificado coinciden cualitativamente, es decir, por ejemplo se hacen reaccionar sustratos iguales con diferente velocidad.

Ejemplos de sustituciones de aminoácido adecuadas se desprenden de la siguiente Tabla:

Reto original Ejemplos de sustitución

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln; His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn; Gln

Ile Leu; Val

Leu Ile; Val

Lys Arg; Gln; Glu

Met Leu; Ile

Phe Met; Leu; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp; Phe

Val Ile; Leu

"Equivalentes funcionales" en el sentido anterior son también "precursores" de los polipéptidos descritos así como "derivados funcionales".

"Precursores" son a este respecto etapas previas naturales o sintéticas de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.

"Derivados funcionales" de los polipéptidos puede prepararse asimismo en grupos laterales de aminoácido funcionales o en sus extremos N o C terminales con ayuda de técnicas conocidas. Los derivados de este tipo comprenden por ejemplo ésteres alifáticos de grupos ácido carboxílico, amidas de grupos ácido carboxílico, que pueden obtenerse mediante reacción con amoniaco o con una amina primaria o secundaria; derivados de N-acilo de grupos amino libres, preparados mediante reacción con grupos acilo; o derivados de O-acilo de grupos hidroxi libres, preparados mediante reacción con grupos acilo.

En el caso de una posible glicosilación de proteína, los "equivalentes funcionales" abarcan proteínas del tipo designado anteriormente en forma desglicosilada o glicosilada así como formas diferentes que pueden obtenerse mediante modificación del patrón de glicosilación.

Los "equivalentes funcionales" abarcan naturalmente también polipéptidos a los que puede accederse a partir de otros organismos, así como variantes que existen naturalmente. Por ejemplo, mediante comparación de secuencias puede establecerse zonas de regiones de secuencia homólogas y siguiendo las especificaciones de la invención pueden averiguarse enzimas equivalentes. Los "equivalentes funcionales" abarcan asimismo fragmentos, preferentemente dominios o motivos de secuencia individuales, de los polipéptidos de acuerdo con la invención, que presentan por ejemplo la función biológica deseada.

Los "equivalentes funcionales" son además proteínas de fusión que presentan una de las secuencias de polipéptido mencionadas anteriormente o equivalentes funcionales derivados de las mismas y al menos una secuencia heteróloga adicional, funcionalmente distinta de la misma, en enlace funcional No C terminal (es decir, sin perjuicio funcional esencial mutuo de las partes de proteína de fusión). Ejemplos no limitativos de secuencias heterólogas de este tipo son por ejemplo péptidos señal o enzimas.

Homólogos de las proteínas divulgadas en este caso pueden identificarse mediante selección de bancos combinatorios de mutantes, tales como por ejemplo mutantes de acortamiento. Por ejemplo puede generarse un banco variado de variantes de proteína mediante mutagénesis combinatoria en el plano de ácido nucleico, tal como por ejemplo mediante ligación enzimática de una mezcla de oligonucleóticos sintéticos. Existe una pluralidad de procedimientos que pueden usarse para la preparación de bancos de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica generada puede llevarse a cabo en un sintetizador automático de ADN, y el gen sintético puede ligarse entonces en un vector de expresión adecuado. El uso de un conjunto de genes degenerado permite la provisión de todas las secuencias en una mezcla, que codifican el conjunto deseado de secuencias de proteína potenciales. Procedimientos para la síntesis de oligonucleótidos degenerados son conocidos por el experto en la materia (por ejemplo Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

En el estado de la técnica son conocidas varias técnicas para la selección de productos génicos de bancos combinatorios, que se han producido mediante mutaciones puntuales o acortamiento, y para la selección de bancos de ADNc sobre productos génicos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas puede adaptarse a la selección rápida de los bancos de genes, que se han generado mediante mutagénesis combinatoria de homólogos de acuerdo con la invención. Las técnicas usadas con la mayor frecuencia para la selección de grandes bancos de genes, que están sujetas a un análisis con alto rendimiento, comprenden la clonación del banco de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células adecuadas con el banco de vectores resultante y expresión de los genes recombinantes en condiciones en las que la detección de la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen, cuyo producto se detectó. La Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM) (mutagénesis de conjunto recursiva), una técnica que amplía la frecuencia de mutantes funcionales en los bancos, puede usarse en combinación con las pruebas de selección para identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Se divulgan además secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN mono- y bicatenarios, tales como por ejemplo ADNc y ARNm), que codifican para una enzima con actividad ciclasa de acuerdo con la invención. Se prefieren secuencias de ácido nucleico que codifican por ejemplo para secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 secuencias parciales características de las mismas.

Todas las secuencias de ácido nucleico mencionadas en el presente documento pueden prepararse de manera en sí conocida mediante síntesis química a partir de los elementos constructivos de nucleótido, tales como por ejemplo mediante condensación de fragmentos de elementos constructivos de ácido nucleico complementarios, solapantes, individuales, de la doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede tener lugar por ejemplo, de manera conocida, según el procedimiento de fosfoamidita (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). La adición de oligonucleótidos sintéticos y la compleción de huecos con ayuda del fragmento de la ADN polimerasa y reacciones de ligación así como procedimientos de clonación generales se describen en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Otras configuraciones para llevar a cabo el procedimiento biocatalítico de acuerdo con la invención para la preparación de ambroxán:

El procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza porque la enzima se encuentra en una forma seleccionada del grupo que consiste en:

a) polipéptido libre, dado el caso purificado o parcialmente purificado con la actividad de una homofarnesolambroxán ciclasa;

b) polipéptido inmovilizado con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa;

c) polipéptido aislado a partir de células de acuerdo con a) o b);

d) célula completa, dado el caso células quiescentes o disgregadas, que contiene al menos un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa;

e) lisado celular u homogeneizado celular de las células descritas en d).

En una realización de la invención, las células son microorganismos, preferentemente microorganismos transgénicos que expresan al menos una molécula heteróloga de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa.

Además se divulga por lo tanto también un constructo génico o un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, preferentemente una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11; b) molécula de ácido nucleico que comprende al menos un polinucleótido de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1;

d) molécula de ácido nucleico según (a) a (c), que para un fragmento de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

e) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, que se obtiene amplificándose una molécula de ácido nucleico de un banco de datos de ADNc o de un banco de datos de genoma por medio de los cebadores de acuerdo con las secuencias n.° 3 y 4;

f) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, que en condiciones rigurosas hibrida con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (c); g) molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, que puede aislarse a partir de un banco de ADN con el uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con (a) a (c) o sus fragmentos parciales de al menos 15 nt, preferentemente 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt o 500 nt como sonda en condiciones de hibridación rigurosas; y

h) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, presentando la secuencia del polipéptido una identidad de al menos el 46 % con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

j) molécula de ácido nucleico, que codifica para un polipéptido funcionalmente equivalente con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, presentando el polipéptido un sitio de unión análogo o similar, tal como un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo de los descritos en a) a h). Asimismo, en este caso se divulgan asimismo las células huésped que contienen un constructo génico o un vector tal como se describe anteriormente. Para ello se introducen las secuencias de ácido nucleico usadas de manera ventajosa en un constructo génico transgénico, que pueden garantizar una expresión transgénica de una homofarnesol-ambroxán ciclasa, en un organismo, preferentemente microorganismo.

En los constructos génicos, a este respecto, una molécula de ácido nucleico que codifica para una homofarnesolambroxán-ciclasa se encuentra preferentemente en enlace funcional con al menos un elemento control genético (por ejemplo un promotor y/o terminador), que garantiza una expresión en un organismo, preferentemente microorganismo.

Por un enlace funcional se entiende por ejemplo la disposición secuencial de un promotor con la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse que codifica para una homofarnesol-ambroxán ciclasa (por ejemplo la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO: 1) y dado el caso otro elementos reguladores tales como por ejemplo un terminador, de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función en la expresión transgénica de la secuencia de ácido nucleico. Para ello no es realmente necesario un enlace directo en el sentido químico. La preparación de un enlace funcional como también la preparación del constructo genómico puede realizarse por medio de técnicas de recombinación y clonación usuales, tal como se describen por ejemplo en Maniatis T, Fritsch EF y Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), en Silhavy TJ, Berman ML y Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), en Ausubel FM et al. (1987). Entre ambas secuencias pueden situarse en cambio también otras secuencias que tienen por ejemplo la función de un ligador con determinados sitios de corte de enzima de restricción o de un péptido señal. También la inserción de secuencias puede llevar a la expresión de proteínas de fusión. Preferentemente, el constructo génico, que se compone de un enlace de promotor y secuencia de ácido nucleico que va a expresarse, puede encontrarse integrado en un vector e insertarse mediante por ejemplo transformación en un microorganismo.

Las secuencias de ácido nucleico contenidas en los constructos génicos o vectores pueden estar enlazadas funcionalmente con otras secuencias de control genéticas junto a un promotor. El término de las secuencias control genéticas ha de entenderse en un sentido amplio y quiere decir todas aquellas secuencias que tienen una influencia sobre la conclusión o la función del constructo genómico. Las secuencias control genéticas modifican por ejemplo la transcripción y traducción en organismos procariotas o eucariotas. Preferentemente, los constructos génicos comprenden una secuencia control, así como dado el caso otros elementos reguladores habituales, en concreto en cada caso enlazados funcionalmente con la secuencia de ácido nucleico que va a expresarse de manera transgénica.

Como secuencias control se entienden aquellas que posibilitan una recombinación homóloga o inserción en el genoma de un organismo huésped o permiten la eliminación del genoma. En la recombinación homóloga puede intercambiarse de manera dirigida por ejemplo la secuencia codificante de un gen endógeno determinado por la secuencia que codifica para un ARNbc.

Un constructo génico y los vectores derivados del mismo pueden contener otros elementos funcionales. El término elemento funcional ha de entenderse en un sentido amplio y quiere decir todos aquellos elementos que tienen una influencia sobre la preparación, proliferación o función de los casetes de expresión de acuerdo con la invención, vectores u organismos transgénicos. A modo de ejemplo pero de manera no limitativa pueden mencionarse:

a) Marcadores de selección, que confieren una resistencia contra antibióticos o biocidas tales como por ejemplo kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina, etc.

b) Genes indicadores, que codifican para proteínas fácilmente cuantificables y a través de color propio o actividad enzimática garantizan una evaluación de la eficiencia de transformación o del sitio o instante de expresión. Se prefieren muy especialmente a este respecto proteínas indicadoras (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) tal como la "green fluoroescence protein" (GFP) (proteína fluorescente verde) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5):777-784), la cloranfenicoltransferasa, una luciferasa (Ow et al. (1986) Science 234:856-859), el gen de ecuorina (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268), la beta-galactosidasa, se prefiere muy especialmente la p-glucuronidasa (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907).

c) Orígenes de la replicación, que garantizan una propagación de los casetes de expresión de acuerdo con la invención o vectores en por ejemplo E.coli. A modo de ejemplo se mencionan ORI (origin of DNA replication) (origen de replicación de ADN), el pBR322 ori o el P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Para la selección de células recombinadas de manera homóloga o también transformadas de manera satisfactoria es necesario por regla general introducir adicionalmente un marcador seleccionable que confiera a las células recombinadas de manera satisfactoria una resistencia contra un biocida o un antibiótico. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas con respecto a las no transformadas (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).

La introducción del constructo génico en un organismo puede realizarse de manera ventajosa con el uso de vectores, en los que están contenidos los constructos génicos. Otro objeto de la invención se refiere por lo tanto a dichos vectores transgénicos, que comprenden un constructo génico transgénico para una homofarnesol-ambroxán ciclasa.

Los vectores pueden ser a modo de ejemplo plásmidos, cósmidos, fagos, virus. El constructo génico puede introducirse en el vector (preferentemente un vector de plásmido) a través de un sitio de corte de restricción adecuado. El vector generado se introduce en primer lugar en E.coli. Se seleccionan E.coli correctamente transformadas, se cultivan y se obtiene el vector recombinante con procedimientos conocidos por el experto en la materia. Análisis de restricción y secuenciación pueden servir para comprobar la etapa de clonación. Se prefieren aquellos vectores que permiten una integración estable del casete de expresión en el genoma huésped.

La preparación de un organismo transgénico correspondiente tiene lugar por ejemplo por medio de transformación o transfección por medio de las proteínas o ácidos nucleicos correspondientes. La preparación de un organismo transformado (o de una célula transformada) requiere que el ADN correspondiente (por ejemplo el vector de expresión), ARN o proteína se introduzca en la célula huésped correspondiente. Para este proceso, que se denomina transformación (o transducción o transfección), se encuentra disponible una pluralidad de procedimientos (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185:527-537). De este modo, el ADN o ARN puede introducirse a modo de ejemplo directamente mediante microinyección o mediante bombardeo con micropartículas recubiertas con ADN. También la célula puede permeabilizarse químicamente, por ejemplo con polietilenglicol, de modo que el ADN puede llegar mediante difusión a la célula. El ADN puede realizarse también mediante fusión de protoplastos con otras unidades que contienen ADN tales como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. La electroporación es un procedimiento adecuado adicional para la introducción de ADN, en el que las células se permeabilizan de manera reversible mediante un impulso eléctrico.

Células transformadas de manera estable, es decir, aquellas que contienen el ADN introducido integrado en el ADN de la célula huésped, pueden seleccionarse con respecto a las no transformadas, cuando un marcador seleccionable es un constituyente del ADN introducido. Como marcador puede funcionar a modo de ejemplo cualquier gen que es capaz de conferir una resistencia contra antibióticos (tales como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina, etc.) (véase anteriormente). Las células transformadas, que expresan un gen marcador de este tipo, son capaces de sobrevivir en presencia de concentraciones de un antibiótico correspondiente, que destruyen un tipo natural no transformado. 89:525-533 usa.

"Transgén" o "recombinante" significa con respecto, por ejemplo, a una secuencia de ácido nucleico, un constructo génico o un vector que contiene dicha secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con dicha secuencia de ácido nucleico, constructo génico o vector, todas aquellas construcciones realizadas mediante procedimientos de ingeniería genética, en los que o bien

a) la secuencia de ácido nucleico que codifica para una homofarnesol-ambroxán ciclasa, o

b) una secuencia control genética enlazada funcionalmente con dicha secuencia de ácido nucleico en a), por ejemplo un promotor funcional, o

c) (a) y (b)

no se encuentran en su entorno genético natural o se modificaron mediante procedimientos de ingeniería genética, en los que la modificación a modo de ejemplo puede ser sustituciones, adiciones, deleciones, inversión o inserciones de uno o varios restos de nucleótido. Un entorno genético natural significa el locus cromosómico natural en el organismo de origen o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica se mantiene preferentemente al menos en parte el entorno genético natural de la secuencia de ácido nucleico.

Organismos huésped o de partida preferidos como organismos transgénicos son principalmente microorganismos de acuerdo con la definición mencionada anteriormente. Están incluidos en el contexto de la invención en particular microorganismos, preferentemente aquellas células transgénicas o recombinantes, que se seleccionan de bacterias, cianobacterias, hongos y levaduras. Preferentemente la célula se selecciona de bacterias de los géneros Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Zymomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Burkholderia, Lactobacillus y Lactococcus. De manera especialmente preferente, la célula se selecciona de bacterias de las especies Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor y Zymomonas mobilis.

Como organismo donante, es decir, organismo a partir del cual se aísla una homofarnesol-ambroxán ciclasa, se mencionan Methylococcus capsalatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec., Streptomyces coelicolor, Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas palent, Frankia alni, Bacillus anthracis, Burkholderia ambifaria, en particular Zymomonas mobilis y Bradyrhizobium japonicum.

Los organismos transgénicos, en particular Streptomyces coelicolor o Zymomonas mobilis, que presentan homofarnesol-ambroxán ciclasas endógenas, muestran en una variante de la invención una sobreexpresión de las homofarnesol-ambroxán ciclasas. Sobreexpresión significa cualquier forma de expresión de las homofarnesolambroxán ciclasas que puede encontrarse además de la expresión original del tipo natural.

Asimismo se divulga la preparación de E. coli transgénicas, que expresan el gen que codifica para las homofarnesolambroxán ciclasas, preferentemente SEQ ID NO: 1. Para ello se amplifica con cebadores, por ejemplo Zm-SHC_fw y Zm-SHC_rev (SEQ ID NO: 3 o 3) el gen de la ciclasa, preferentemente de Zymomonas mobilis (SEQ ID NO: 1). Los cebadores se mezclan de manera equimolar. Las PCR con ADN genómico de un organismo donante, preferentemente de Z. mobilis (LU8910 = ATCC31821) se llevan a cabo según instrucciones del fabricante con Pwo-Polymerase (Roche Applied Science) y el siguiente programa de gradiente de temperatura: 95 °C durante 3 min; 30 ciclos con 95 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s, y 72 °C durante 3 min; 72 °C durante 10 min.; 4 °C hasta su uso. El producto de PCR se aísla mediante electroforesis en gel de agarosa (Gel E al 1,2 %, Invitrogen) y cromatografía en columna (Kit GFX, Amersham Pharmacia) y a continuación se secuencia (cebador de secuenciación: Zm-SHC_fw y Zm-SHC_rev). El producto de PCR se digirió con las endonucleasas de restricción, preferentemente NdeI y SamHI, y se liga en un vector cortado de manera correspondiente, preferentemente vector pDHE1650 [documento WO 200132890 A1]. El plásmido así obtenido se transforma en E. coli, preferentemente en la cepa TG10 pAgro4 de E. coli [Takeshita S.et al.; Gene (1987), 61: 63] pHSG575.

Inoculadas a partir de un cultivo previo correspondiente, se cultivan las E. coli, preferentemente se fijan en LBAmp/Spec/Cm (ampicilina 100 pg/l; espectinomicina 100 pg/l; cloranfenicol 20 |jg/l), IPTG 0,1 mM, ramnosa 0,5 g/l en 16 h a 37 °C, y a continuación se centrifugan a 5000*g/10 min y dado el caso se almacenan a 4 °C.

En otra realización, se aísla la ciclasa a partir del organismo donante o a partir del organismo huésped transgénico y dado el caso se purifica.

A partir de las células se prepara un extracto de proteína suspendiéndose el sedimento celular en tampón de disgregación (Tris/HCl 0,2 M, EDTA 0,5 M, pH 8,0), 375 U de benzonasa (por ejemplo Novagen, 25 U/pl), 40 pl de PMSF (100 mM, disuelto en i-PropOH), sacarosa 5,3 g/100 ml y lisozima aproximadamente 3,3 mg/100 ml. La preparación se mezcla y se incuba durante 30 min sobre hielo. A continuación se congela dado el caso la mezcla a -20 °C. Después de la descongelación de la preparación se rellena con agua destilada y se incuba de nuevo durante 30 min sobre hielo. A continuación se disgregan las células 3 veces durante 3 min con ultrasonidos.

Después de la disgregación se separaron por centrifugación los detritos celulares en 60 min a 4 °C y 26900 *g. El sobrenadante se retira y el sedimento se resuspende en tampón de solubilización (Tris/HCl 50 mM, MgC^x6H2O 10 mM, Triton X-100 al 1 %, pH 8,0) y se homogeneíza durante aproximadamente 5 min, por ejemplo con un Potter. A continuación se mantiene la suspensión durante 30 min sobre hielo. El extracto homogeneizado se centrifuga de nuevo durante 1 h a 4 °C y 26900 *g y se retira el sedimento. El extracto puede emplearse para pruebas enzimáticas y puede almacenarse durante varias semanas sin pérdida de actividad a -20 °C. El contenido de proteína se encuentra en el intervalo de 1 mg /ml

Las ciclasas empleadas de acuerdo con la invención pueden usarse como enzima libre o inmovilizada.

Las ciclasas usadas de acuerdo con la invención pueden emplearse de manera libre o inmovilizada. Por una enzima inmovilizada se entiende una enzima que está fijada a un soporte inerte. Materiales de soporte adecuados así como las enzimas inmovilizadas sobre los mismos son conocidos por el documento EP-A-1149849, el documento EP-A-1 069 183 y el documento DE-OS 100193773 así como por las citas bibliográficas citadas en los mismos. A este respecto se hace referencia a la divulgación de estos documentos en su totalidad. A los materiales de soporte adecuados pertenecen por ejemplo arcillas, minerales de arcilla, tales como caolinita, tierras de diatomeas, perlita, dióxido de silicio, óxido de aluminio, carbonato de sodio, carbonato de calcio, polvos de celulosa, materiales de intercambio aniónico, polímeros sintéticos, tales como poliestireno, resinas acrílicas, resinas de fenol-formaldehído, poliuretanos y poliolefinas, tales como polietileno y polipropileno. Los materiales de soporte se emplean para la preparación de las enzimas soportadas habitualmente en una forma particulada, finamente dividida, prefiriéndose formas porosas. El tamaño de partícula del material de soporte asciende habitualmente a no más de 5 mm, en particular no más de 2 mm (curva granulométrica). De manera análoga, en el caso del uso de la ciclasa como catalizador de célula completa, puede seleccionarse una forma libre o inmovilizada. Materiales de soporte son por ejemplo alginato de Ca, y carragenano. Enzimas como también células pueden reticularse también directamente con glutaraldehído (reticulación para dar CLEA). Procedimientos de inmovilización correspondientes y adicionales se describen por ejemplo en J. Lalonde y A. Margolin "Immobilization of Enzymes" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim.

Pueden usarse además células completas, dado el caso células quiescentes o disgregadas, lisado celular o homogeneizado celular.

Para el procedimiento de acuerdo con la invención pueden usarse células en crecimiento, que contienen ácidos nucleicos que codifican para la ciclasa, constructos de ácido nucleico o vectores. También pueden usarse células quiescentes o disgregadas. Por células disgregadas se entienden por ejemplo células que se han hecho permeables a través de un tratamiento con por ejemplo disolventes, o células que se han roto a través de un tratamiento enzimático, a través de un tratamiento mecánico (por ejemplo prensa francesa o ultrasonidos) o a través de otro procedimiento. Los extractos brutos así obtenidos son adecuados de manera ventajosa para el procedimiento de acuerdo con la invención. También pueden usarse para el procedimiento enzimas purificadas o no purificadas. Asimismo son adecuados microorganismos inmovilizados o enzimas que pueden emplearse ventajosamente en la reacción.

El procedimiento de acuerdo con la invención puede hacerse funcionar de manera discontinua, semi-discontinua o continua.

La reacción puede llevarse a cabo tanto en un modo de proceder discontinuo como también en alimentación discontinua.

El producto se purifica a continuación mediante extracción y/o destilación.

Otro objeto de la presente invención es el uso de un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa para la reacción biocatalítica de homofarnesol para dar ambroxán, caracterizado porque el polipéptido se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

c) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido cuya secuencia presenta una identidad de al menos el 60 % con respecto a las secuencias SEQ ID NO: 2, 5 o 10;

Los siguientes Ejemplos ilustrarán la invención, pero sin limitarla. En este sentido se hace referencia a las Figuras adjuntas, a este respecto muestra:

Parte experimental

Ejemplos

Ejemplo 1 Clonación de Zm-SHC y expresión en E. coli

Con los oligonucleótidos Zm-SHC_fW y Zm-SHC_rev puede amplificarse el gen de la ciclasa a partir de Zymomonas mobilis.

Cebador:

N.° de cebador Secuencia (5'->3') Posición

Zm-SHC_fW gcgctgtttcatatg ggtattgaca ^{Cebador N-} _terminal

Zm-SHC_rev gcgcttaccctggatcctcgaaaat ^{Cebador C-} _terminal

Se mezclaron de manera equimolar respectivamente 100 ng de los cebadores Zm-SHC_fw y Zm-SHC_rev. La PCR con ADN genómico de Z. mobilis (ATCC31821) se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante con Pwo-Polymerase (Roche Applied Science) y el siguiente programa de gradiente de temperatura: 95 °C durante 3 min; 30 ciclos con 95 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s, y 72 °C durante 3 min; 72 °C durante 10 min.; 4 °C hasta su uso. El producto de PCR (~2,2 kB) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa (Gel E al 1,2 %, Invitrogen) y cromatografía en columna (Kit GFX, Amersham Pharmacia) y a continuación se secuencia (cebador de secuenciación: Zm-SHC_fw y Zm-SHC_rev). La secuencia obtenida corresponde a la secuencia publicada.

El producto de PCR se digirió con las endonucleasas de restricción NdeI y SamHI y se ligó en vector pDHE19.2 digerido de manera correspondiente. La secuenciación de los plásmidos resultantes dio como resultado la secuencia de ácido nucleico representada en la Seq-ID1.

El plásmido pDHE-Zm-SHC-1 se transformó en la cepa TG10 pAgro4 pHSG575 de E. coli [Takeshita et al., Gene 1987, 61:63-74; Tomoyasu et al., Mol Microbiol 2001, 40:397-413]. Las E. coli recombinantes reciben la denominación E. coli LU15568.

Ejemplo 2a: Provisión de homofarnesol ciclasa recombinante a partir de Z. mobilis (SEQ ID NO: 2)

Inoculada a partir de 2 ml de un cultivo previo correspondiente, E. coli LU 15568 se fijó en 20 ml de LB-Amp/Spec/Cm (ampicilina 100 pg/l; espectinomicina 100 pg/l; cloranfenicol 20 pg/l), IPTG 0,1 mM, ramnosa 0,5 g/l en matraz Erlenmeyer 100 ml (Schikanen) durante 16 h a 37 °C, se centrifugó a 5000*g/10 min y se almacenó a 4 °C. Se preparó extracto de proteína suspendiéndose el sedimento celular en 15 ml de tampón de disgregación (Tris/HCl 0,2 M, EDTA 0,5 M, pH 8,0), 375 U de benzonasa (por ejemplo Novagen, 25 U/pl), 40 pl de PMSF (100 mM, disuelto en i-PropOH), 0,8 g de sacarosa y aproximadamente 0,5 mg de lisozima. La preparación se mezcló y se incubó durante 30 min sobre hielo. A continuación se congeló la mezcla a -20 °C.

Después de la descongelación de la preparación se rellenó con agua destilada hasta aproximadamente 40 ml y se incubó de nuevo durante 30 min sobre hielo.

A continuación se disgregaron las células 3 veces durante 3 min con ultrasonidos (HTU-Soni 130, empresa G. Heinemann, Schwabisch-Hall, amplitud 80 %, 15" de pulso / 15" de pausa).

Después de la disgregación se separaron por centrifugación los detritos celulares en 60 min a 4 °C y 26900 *g. El sobrenadante se retiró y el sedimento se resuspendió en 100 ml de tampón de solubilización (Tris/HCl 50 mM, MgCl2x6H2O 10 mM, Triton X-100 al 1 %, pH 8,0) y se trato en Potter durante aproximadamente 5 min. A continuación se mantuvo la suspensión durante 30 min sobre hielo.

El extracto homogeneizado se centrifugó de nuevo durante 1 h a 4 °C y 26900 *g y se retiró el sedimento. El extracto se empleó para las pruebas enzimáticas y puede almacenarse durante varias semanas sin pérdida de actividad a -20 °C. El contenido de proteína se encuentra en el intervalo de 1 mg /ml.

Ejemplo 2b: Provisión de homofarnesol ciclasa recombinante a partir de Bradyrhizobium japonicum (SEQ ID NO: 5) Se preparó homofarnesol ciclasa a partir de Bradyrhizobium japonicum tal como en el Ejemplo 2a.

Ejemplo 3a: Determinación de actividad de la homofarnesol ciclasa recombinante (SEQ ID NO: 2) a partir de E. coli LU15568

Con la preparación de proteína descrita en el Ejemplo 2a se incubó homofarnesol (1, (3Z,7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trien-1-ol). En detalle se mezclaron entre sí 4 ml de preparación de proteína, 0,5 ml de tampón citrato de Na (citrato de sodio 1 M, pH 4,9), 0,5 ml de solución de homofarnesol (100 mM en tampón citrato de Na 0,1 M, pH 6,5 con 2 % (p/p) de taurodesoxicolato) y se incubó con agitación a 30 °C. Una reacción control se incubó en la misma composición pero a 60 °C.

Después de una incubación de 16 horas se extrajeron las preparaciones con 10 ml de hexano/ n-propanol 3:2 y se concentró la fase orgánica hasta sequedad.

El residuo se recogió en 200 pl diclorometano y se empleó para el análisis de CG o CG/EM.

Con la analítica representada en el Ejemplo 4 pudo establecerse una conversión del 41 % (»20,5 pmol de 2).

En comparación, en reacciones de homofarnesol con la escualeno-hopeno ciclasa conocida de Alicyclobacillus acidocaldarius se consiguió una conversión del 1,2 %.

Ejemplo 3b: Determinación de actividad de la homofarnesol ciclasa recombinante (SEQ ID NO: 5) a partir de E. coli La actividad enzimática del biocatalizador preparados de manera recombinante en E. coli a partir de Bradyrhizobium japonicum corresponde a la de Zm-SHC. Después de una incubación de 3 horas de una solución 20 mM de homofarnesol con homogeneizado celular (cantidad de proteína: 31 mg) a 37 °C se hizo reaccionar un 26,4 % de homofarnesol para dar ambroxán. En las mismas condiciones se consiguió con Zm-SHC recombinante una conversión del 22,4 %.

Ejemplo 4 Analítica

Conversión/Cuantificación

La conversión de homofarnesol (1) en ambroxán (2) puede determinarse con el siguiente sistema de CG:

Columna: Optima 1 de 10 m

Perfil de temperatura:

0': 100 °C

15 °C/min

14,7': 320 °C

34,7' 320 °C

Temperatura de

inyector: ^{320 °C}

TA: homofarnesol aproximadamente 12,5'; ambroxán: aproximadamente 11,4'

Con material auténtico se creó una serie de calibración, por medio de la que se determinó la concentración de muestras desconocidas.

Identificación

La identificación tuvo lugar por medio de CG capilar/EM de los iones positivos tras ionización por choque de electrones (EI) e ionización química (CI) con amoniaco. Aparatos: CG (HP 6890) acoplado con dos MSD (HP 5973) para ionización EI e CI.

Condiciones de CG:

Columna de separación: DB-1

Longitud: 30 m

Diámetro interno: 250 pm

Grosor de película 0,25 pm

Gas portador: He

Flujo: 1,2 ml/min

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la preparación de derivados de ambroxán, preferentemente ambroxán, de fórmula general (2) caracterizado porque se hacen reaccionar derivados de homofarnesol de fórmula general (1) de manera biocatalítica para dar los derivados de ambroxán correspondientes por medio de un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa como enzima,

en donde la actividad del polipéptido es la reacción de homofarnesol para dar ambroxán con sustrato principal homofarnesol, caracterizado porque la enzima es un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las homofarnesol-ambroxán ciclasas presentan una conversión en ambroxán en porcentaje en moles de 10 a 100.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la enzima se encuentra en una forma seleccionada del grupo que consiste en:

c) polipéptido aislado a partir de células de acuerdo con a) o b);

e) lisado celular u homogeneizado celular de las células descritas en d).

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las células son microorganismos, preferentemente microorganismos transgénicos que expresan al menos una molécula heteróloga de ácido nucleico que codifica para un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque para la preparación de ambroxán como material de partida se emplea citral, que se hace reaccionar en varias etapas para dar homofarnesol.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la preparación de ambroxán tiene lugar en sistemas acuosos de una sola fase o en sistemas de dos fases.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la preparación de ambroxán tiene lugar en un modo de proceder discontinuo, de alimentación discontinua o continuo.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción de homofarnesol para dar ambroxán tiene lugar a una temperatura en el intervalo de 0 a 60 °C y/o un valor de pH en el intervalo de 4 a 8.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la reacción de homofarnesol para dar ambroxán tiene lugar a una temperatura en el intervalo de 0 a 45 °C.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la homofarnesol-ambroxán ciclasa se aisló a partir de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste en Zymomonas mobilis, Bradyrhizobium japonicum y Rhodopseudomonas palustris.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la homofarnesol-ambroxán ciclasa se aisló a partir de bacterias transgénicas de las especies Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor y Methylococcus capsalatus, Rhodopseudomonas palustris, Frankia spec., Rhodop-seudomonas palent, Frankia alni, Bacillus anthracis, Burkholderia ambifaria, en particular Zymomonas mobilis y Bradyrhizobium japonicum, que sobreexpresan la homofarnesol-ambroxán ciclasa.

12. Uso de un polipéptido con la actividad de una homofarnesol-ambroxán ciclasa para la reacción biocatalítica de homofarnesol para dar ambroxán, caracterizado porque el polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

a) molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende las SEQ ID NO: 2, 5 o 10;