KR101521045B1 - 유기산을 생산하기 위한 재조합 미생물유기체 - Google Patents

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Abstract

유기산을 생산하기 위한 효소 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소를 공동발현시키는 재조합 미생물유기체가 생성된다.

Description

유기산을 생산하기 위한 재조합 미생물유기체{RECOMBINANT MICROORGANISMS FOR PRODUCING ORGANIC ACIDS}
미국 정부 지원에 대한 언급
본 발명의 양태는 DE-FC36-02GO12001 하에 미국 정부의 지원으로 만들어졌다.
관련된 출원에 대한 상호참조 및 참조로서 전자적으로 제출된 매체의 포함
본 출원은 2012년 10월 2일 출원된 미국 가특허 출원 제61/708,998호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원의 개시내용은 그것의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 출원은 개시내용의 별개의 부분으로서, 컴퓨터-판독가능한 형태의 서열목록(파일명: 40000A_SeqListing.txt, 2013년 10월 2일에 작성됨, 20,065 바이트)을 포함하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 증가된 양의 유기산을 생산하기 위해 유전자조작된 미생물유기체 및 이의 사용방법에 관한 것이다.
유기산은 중합체, 식품, 약제 및 화장료와 같은 산업적 적용 범위에서 석유 화학적으로 유래된 단량체를 대체하기 위한 가능성을 가진다. 생물계 유기산의 사용은 화석연료에 대한 의존을 감소시킬 수 있으며, 감소된 이산화탄소 생성의 면에서 환경에 유리할 수 있다.
유기산을 생산하기 위한 재조합 미생물유기체가 개시된다. 개시된 재조합 미생물유기체는 효소 글루코스-6-포스페이트-1-탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소를 발현시키는데, 이는 증가된 유기산 생산을 초래한다.
다음의 넘버링된 단락은 각각 본 발명의 하나 이상의 대표적인 변형을 간결하게 정의한다:
1. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소 효소를 발현시키는 재조합 미생물유기체.
2. 단락 1에 있어서, 재조합 유기체는 숙신산 생산 미생물유기체인 것인 재조합 미생물유기체.
3. 단락 1에 있어서, 악티노바실러스 숙시노겐스(Actinobacillus succinogenes)의 16S 리보좀 RNA 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 갖는 16S 리보솜 RNA 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물유기체.
4. 단락 1에 있어서, 악티노바실러스 숙시노겐스, 비스가드 탁손(Bisgaard Taxon) 6 및 비스가드 탁손 10인 것인 재조합 미생물유기체.
5. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 이종성 혹은 과발현된 폴리뉴클레오타이드 또는 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 이종성 혹은 과발현된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 재조합 미생물유기체.
6. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소는 악티노바실러스 숙시노겐스 효소인 것인 재조합 미생물유기체.
7. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소는 악티노바실러스 숙시노겐스 효소인 것인 재조합 미생물유기체.
8. 단락 1 내지 단락 6 중 어느 한 단락에 있어서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소는 이콜라이(E. coli) 효소인 것인 재조합 미생물유기체.
9. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소는 이콜라이 효소인 것인 재조합 미생물유기체.
10. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 40% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물유기체.
11. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 말레이트 탈수소효소는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 60% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 미생물유기체.
12. 단락 1 내지 단락 11 중 어느 한 단락에 있어서, 미생물유기체는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소 효소를 단독으로 발현시키는 미생물유기체와 비교하여 증가된 양의 유기산(예를 들어, 숙신산)을 생산하는 것인 재조합 미생물유기체.
13. 단락 1 내지 단락 12 중 어느 한 단락에 있어서, 미생물유기체는 약 50g/ℓ 내지 150g/ℓ의 농도에서 숙신산을 생산할 수 있는 것인 재조합 미생물유기체.
14. 유기산 생산 방법으로서, 단락 1 내지 단락 13 중 어느 한 단락의 재조합 미생물유기체를 발효 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
15. 유기산 생산에 바람직한 조건 하에서 탄소 공급원과 함께 재조합 미생물유기체를 배양시키는 단계를 포함하는 유기산 생산 방법으로서, 재조합 미생물유기체는 적어도 하나의 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소 효소를 발현시키는 유기산 생산 방법.
16. 단락 15에 있어서, 재조합 미생물유기체는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소와 말레이트 탈수소효소 효소를 둘 다 발현시키는 것인 방법.
17. 유기산 생산에 바람직한 조건 하에서 탄소 공급원과 함께 단락 1 내지 단락 13 중 어느 한 단락의 재조합 미생물유기체를 배양시키는 단계를 포함하는 유기산 생산 방법.
18. 단락 15 내지 단락 17 중 어느 하나에 있어서, 유기산은 숙신산 또는 프로피온산인 것인 방법.
19. 단락 18에 있어서, 유기산은 숙신산인 것인 방법.
20. 단락 15 내지 단락 19 중 어느 하나에 있어서, 탄소 공급원은 글루코스 또는 솔비톨인 것인 방법.
도 1은 pL88 벡터의 개략도를 도시한 도면;
도 2는 pISTONS1의 개략도를 도시한 도면;
도 3은 p830.60의 개략도를 도시한 도면;
도 4는 p856.78의 개략도를 도시한 도면;
도 5는 이콜라이("질의(query)") 및 악티노바실러스 숙시노겐스("대상(sbjt)")로부터의 Zwf 효소의 아미노산 서열 간의 서열 비교를 도시한 도면;
도 6은 이콜라이("질의") 및 악티노바실러스 숙시노겐스("대상")로부터의 Mdh 효소의 아미노산 서열 간의 서열 비교를 도시한 도면;
도 7은 아스페르길러스 플라부스(Aspergillus flavus)("질의") 및 악티노바실러스 숙시노겐스("대상")로부터의 Mdh 효소의 아미노산 서열 간의 서열 비교를 도시한 도면;
도 8은 p830.60에서 악티노바실러스 숙시노겐스 zwf 핵산 서열을 도시한 도면;
도 9는 pISTONS1에서 악티노바실러스 숙시노겐스 mdh 핵산 서열을 도시한 도면.
다음의 상세한 설명에서, 실시형태들이 당업자가 이들의 실행을 가능하게 하도록 충분히 상세하게 기재되며, 다른 실시형태가 이용될 수 있고, 화학적 및 절차적 변화가 본 대상의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서 다음의 상세한 설명은 제한의 의미로 취해져서는 안 되며, 실시형태의 범주는 첨부하는 특허청구범위에 의해서만 정해진다.
용어 "미생물유기체"는 박테리아, 진균 또는 효모와 같은 단세포 유기체를 지칭한다.
용어 "재조합 미생물유기체"는 그것이 유래된 자연적으로 생기거나 또는 출발하는 미생물유기체와 비교하여 변성되거나, 변형되거나 또는 상이한 유전자형 또는 표현형을 나타내도록(예를 들어 유전적 변형이 미생물유기체의 암호 핵산 서열에 영향을 미칠 때), 변경되거나, 변형되거나 또는 유전자조작된(예를 들어, 유전적으로 유전자조작된) 미생물유기체를 지칭한다.
유전적 조작은 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 변성시키거나 또는 변형시키는 것(예를 들어, 강한 프로모터, 유동성 프로모터 또는 다중 프로모터를 사용함으로써); 특정 유전자에 인접한 핵산 서열, 예컨대 프로모터 활성, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결자에 대해 중요한 조절 서열을 포함하는 프로모터 영역 내 서열을 변성시키는 것; 특정 유전자의 복제 수를 증가시키는 것; 특정 유전자 산물의 전사 또는 번역에 연루된 단백질(예를 들어, 조절 단백질, 억제자, 인핸서, 전사 활성자 등)을 증가시키는 것; 또는 특정 유전자의 발현을 증가시키는 임의의 통상적인 수단을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "유기산"은 적어도 하나의 카복실기를 포함하는 산을 포함한다. 선택적으로 유기산은 C1-C10 유기산이며, 또한 선택적으로 유기산은 2개의 카복실레이트 기를 포함한다. 예를 들어, "유기산"은 숙신산 또는 프로피온산을 포함한다. 유기산의 다른 예는, 락트산, 말산, 시트르산, 옥살산 및 타르타르산을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 유기산은 또한 유기산 음이온 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, "숙신산"은 "숙시네이트"로서 지칭될 수 있으며, "프로피온산"은 "프로피오네이트"로서 지칭될 수 있다.
"이종성"은 발현이 요망되는 특정 세포 또는 유기체에 대해 유래되지 않거나 또는 천연이 아닌 임의의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
"과발현"은 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포에서 보통 발현되는 것보다 더 높은 수준으로 산물(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 RNA)을 생산하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지칭한다. 과발현된 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 숙주 세포에 대해 천연인 폴리뉴클레오타이드이며, 이의 산물은 숙주 세포에서 보통 발견되는 것보다 더 큰 양으로 만들어진다. 과발현은, 예를 들어 그리고 제한 없이, 폴리뉴클레오타이드의 천연 프로모터보다는 상이한 프로모터에 대해 폴리뉴클레오타이드를 조작가능하게 연결하거나 또는 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오타이드의 추가적인 복제물을 도입함으로써 달성된다.
유기체로부터 "유래된" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 유기체로부터의 기준 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서 동일한 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 포함하거나 또는 선택적으로 이하에 추가로 기재되는 바와 같은 천연 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 대한 하나 이상의 변형을 함유하고, 선택적으로는 천연 효소와 비교하여, 양호하지 않다면, 유사한 활성을 나타낸다(예를 들어, 천연 효소 활성의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100% 또는 적어도 110% 수준). 유기체로부터 "유래된" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 특정 숙주 유기체로부터 물리적으로 제거된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이지만, 이들로 제한되지 않는 것으로 인식될 것이다.
또한 본 발명에서, 종말점의 수치적 범위의 인용은 해당 범위 내에 포함된 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다). 더 나아가, 범위의 개시내용은 더 넓은 범위 내에 포함된 모든 하위범위의 개시내용을 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1 내지 4, 1.5 내지 4.5, 4 내지 5 등을 개시한다).
본 발명은 발효를 통해 유기산을 생산하기 위한 개선된 물질 및 방법을 제공한다. 발효 성능은 3가지 변수: 역가, 생산성 및 수율에 의해 포착된다. 역가는 발효의 마지막에 발효 브로스에서 산물(예를 들어, 유기산, 예컨대 숙신산)의 농도를 구체화한다. 생산성 또는 생산율은 산물의 역가에 도달되는 시간을 나타낸다. 수율은 공급 원료(예를 들어, 글루코스와 같은 당)의 질량 당 산물 질량의 몫이다. 모두 3가지 변수는 발효 생산 과정(process)의 경제학에 영향을 미친다. 고역가는 산물 회수를 용이하게 하며; 더 적은 물이 증발되거나 또는 제거되어야 하고, 더 적은 에너지를 필요로 하는데, 이는 과정의 작업 비용을 낮춘다. 생산성은 역가와 관련되는데, 그것에 시간 차원을 더한다. 고생산성은 빠른 발효 과정을 암시하며, 발효 용기 크기를 감소시키는데, 과정이 더 자주 실행될 수 있기 때문이다. 생산성은 발효 생산 과정의 자본 경비에 주로 영향을 미친다. 수율은 과정의 작업 비용에 영향을 미치며 - 수율이 높아지면, 산물을 얻기 위해 더 적은 원료 또는 공급원료가 필요로 된다.
역가, 생산성 및 수율은 서로 엮이며, 서로 영향을 미친다. 단시간에 고역가를 달성하는 발효는 고생산성을 초래할 것이며, 반대의 경우도 마찬가지일 것이다. 발효 산물의 축적 또는 더 높은 역가는 생산을 지연시킬 수 있다. 수율은 생산성과 반비례하며, 즉, 공급원료는 세포 및 구성 바이오매스를 곱한 유기체의 성장을 지지할 뿐만 아니라 공급원료를 요망되는 산물로 대사하는 발효에서 사용된다. 일반적으로, 더 많은 세포는 더 많은 산물을 생산할 것이며, 더 빠르게 생산할 것인데, 이는 더 높은 생산성을 초래하지만, 더 낮은 수율을 초래할 것이다. 따라서, 발효 최적화는 대부분의 경제적 과정을 달성하기 위해 모두 3개의 변수의 균형을 맞춰야 한다. 궁극적 목표는 모두 3개의 변수에 대해 높은 값을 갖는 과정을 달성하는 것이다.
현저하게는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 펜토스 포스페이트 경로(또는 엔트너-듀도로프 경로(Entner-Doudoroff pathway))에서 효소의 동시 생산 및 재조합 미생물(예를 들어, 악티노바실러스 숙시노겐스)의 트라이-카복실산 사이클은 더 고수율의 숙신산을 촉진하는 것으로 발견되었는데, 이는 발효 과정의 경제적 실행 가능성을 결정하는데 중요한 인자이다. 이에 대해서, 본 발명은, 미생물유기체에서 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소의 생산이 신호 효소만을 발현시키는 미생물유기체에 의해 달성된 생산 수준과 비교하여 증가된 유기산 생산을 야기한다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 근거를 둔다. 펜토스 포스페이트 주기(또는 엔트너-듀도로프 경로)는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(예를 들어, 글루코스-6-포스페이트-1-탈수소효소, 이는 또한 중간발효소(Zwischenferment enzyme) 또는 Zwf로 지칭됨); 6-포스포글루코노락토나제; 6-포스포글루코네이트 탈수소효소(또한 Gnd로 불림); 리보스-5-포스페이트 아이소머라제 A 및 B; 리불로스 포스페이트 3-에피머라제; 트랜스케토라제 I 및 II; 트랜스알돌라제 A 및 B; 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제(Edd); 및 2-케토-3-데옥시포스포글루코네이트 알돌라제(Eda)를 포함하는 몇몇 효소를 이용한다. 숙신산의 혐기성 생산에서 사용되는 트라이-카보사이클릭산 주기는, 예를 들어 효소 포스포엔올피루페이트-카복시키나제, 말레이트 탈수소효소, 푸마라제 및 푸마레이트-환원효소를 사용한다.
일 양태에서, 본 발명은 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(예를 들어, Zwf)와 말레이트 탈수소효소(예를 들어, Mdh)를 생산하는 재조합 미생물유기체를 제공하므로, 다양한 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 미변형 모 미생물유기체에 비해 향상된 유기산(예를 들어, 숙신산 또는 프로피온산) 생산을 나타낸다. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(EC 1.1.1.49) 및 말레이트 탈수소효소(EC 1.1.1.37)의 활성은 당업계에서 잘 이해된다. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소는, 예를 들어 반응 D-글루코스-6-포스페이트 + NADP+ => 6-포스포-D-글루코노-1,5-락톤 + NADPH를 촉매한다. 말레이트 탈수소효소는 이하에 제한되는 것은 아니지만 NADH 또는 NADPH와 같은 보조인자의 사용을 통해 물질을 환원시켜, 옥살로-아세테이트를 말레이트로, 또는 옥살로아세트산을 말산으로 전환시킨다.
글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소는 매우 다양한 유기체에서 발견된다. 효소 중 하나 또는 둘 다는 재조합 미생물유기체에 대해 천연일 수 있지만, 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 다수의 복제물은 숙주 세포 내로 도입되어 효소의 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 비-재조합 미생물유기체 또는 출발 미생물유기체에 존재하는 수준에 대해 상승된 수준에서 천연 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소 및/또는 천연 말레이트 탈수소효소를 발현시킨다(예를 들어, 효소를 "과발현시킨다"). 대안적으로, 효소 중 하나 또는 둘 다는 재조합 미생물유기체에 대해 천연이 아니다. 다양한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 숙신산 또는 말산을 자연적으로 생산하는 유기체로부터 유래된다. 본 발명의 실시형태에 의존하여, 폴리뉴클레오타이드는 자연적 공급원, 예컨대 박테리아, 조류, 진균, 식물 또는 동물로부터 단리되며; 반합성 경로 생산되거나(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열은 특정 숙주 세포, 예컨대 이콜라이에서 발현을 위해 코돈 최적화됨); 또는 데노보 합성된다.
말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mdh 유전자)는, 예를 들어 악티노바실러스 숙시노겐스(예를 들어, NC_009655) 또는 이콜라이(EG10576 (EcoCyc))로부터, 또는 효소 활성을 갖는 것으로 나타난 다른 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 유사하게는, 다양한 실시형태에서, 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이콜라이(예를 들어, EG11221(EcoCyc); 등록번호: ECK1853) 또는 악티노바실러스 숙시노겐스(예를 들어, 젠뱅크(GenBank) 등록번호 ABR73607.1 GI:150839636)로부터 유래된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드는 특정 미생물유기체에서 발현을 용이하게 하도록 코돈 최적화된다. 일부 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 Zwf 효소를 암호화하는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 Mdh 효소를 암호화하는 서열번호 3을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또한 서열번호 1 또는 서열번호 3에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%(또는 앞서 언급한 백분율 중 어떤 범위)인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 본 명세서에서 고려된다.
일부 실시형태에서, 변이체 폴리뉴클레오타이드는 Zwf 또는 Mdh 효소의 하나 이상의 생화학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. 변이체 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어 zwf 또는 mdh 유전자의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 악티노바실러스 숙시노겐스, 이콜라이, 바스피아(Basfia)(예를 들어, 바스피아 숙시닉프로듀센스(Basfia succinicproducens)), 맨하이미(Mannheimia)(예를 들어, 맨하이미 숙시니시프로듀센스(Mannheimia succiniciproducens)), 사카로마이세스(Saccharomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus) 또는 이들의 변이체에 의해 발현된 zwf 또는 mdh 유전자를 발현시킬 수 있다.
본 발명자는 단일 발효 과정에서 Zwf와 Mdh 효소는 둘 다 숙신산 또는 프로피온산과 같은 유기산을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 일부 실시형태에서, 단일 재조합 유기체는 Zwf와 Mdh를 공동발현시키는데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, zwf 및 mdh를 암호화하는 유전자는 상이한 유기체에서 발현되지만, 단일 발효 과정에서 이들 효소 둘 다의 조합된 발현은 유기산 생산에 사용된다. 본 발명은 Mdh 효소의 하나 이상의 생화학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 선택적으로 Zwf 효소의 하나 이상의 생화학적 활성, 예컨대 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 활성 및/또는 NADP 환원효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 조합하여 포함하는 재조합 미생물유기체(예를 들어, 이에 의해 형질전환된 미생물유기체)를 고려한다. 예를 들어, 적합한 Zwf 또는 Mdh 효소는 이콜라이 Zwf 또는 Mdh 효소 또는 이들의 변이체이다. 달리 말하자면, 다양한 실시형태에서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및/또는 말레이트 탈수소효소는 이콜라이 또는 악티노바실러스 숙시노겐스 효소이다.
대표적인 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소 아미노산 서열은, 악티노바실러스 숙시노겐스 Zwf 아미노산 서열인 서열번호 2에서 제공된다. 재조합 미생물유기체는 Zwf 효소의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2)에 대해 적어도 약 40% 서열 동일성 및 더 바람직하게는 Zwf 효소의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 2)에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 변이체 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 다양한 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드는 기준 서열에 대해 하나 이상의 보존적 돌연변이, 즉 기능적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 포함한다. 달리 말하자면, 보존적 치환은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 것을 수반한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되었고, 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 알기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스팔트산 및 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신 및 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판) 및 베타-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린 및 아이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 히스티딘)을 포함한다.
대표적인 말레이트 탈수소효소 아미노산 서열은 악티노바실러스 숙시노겐스 Mdh 아미노산 서열인 서열번호 4에서 제공된다. 재조합 미생물유기체는 Mdh 효소의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 4)에 대해 적어도 약 50% 또는 적어도 약 60% 및 더 바람직하게는 Mdh 효소의 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 4)에 대해 적어도 약 70% 또는 80% 또는 90% 서열 동일성을 갖는 변이체 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.
아미노산 서열 내의 실질적인 변이는 재조합 미생물유기체의 효소에 대해 허용된다. 이콜라이 및 악티노바실러스 숙시노겐스로부터의 Zwf 효소의 아미노산 서열은, 예를 들어 44% 동일성을 공유하며, 둘 다 본 발명의 내용에 적합한 효소이다. 도 5를 참조한다. 유사하게는, 이콜라이 및 악티노바실러스 숙시노겐스로부터의 Mdh 효소의 아미노산 서열은 69% 동일성을 공유하며, 둘 다 본 발명의 내용에 적합한 효소이다. 도 6을 참조한다. Mdh 효소는 일반적으로 상이한 유기체에서 잘 보존된다. 사상균인 아스페르길러스 플라부스로부터의 Mdh 효소의 아미노산 서열은 악티노바실러스 숙시노겐스로부터 Mdh 효소 서열에 대해 약 50% 동일성을 증명하며, 옥살로-아세테이트에서 말레이트로 전환되는 능력을 보유한다. 도 7을 참조한다.
바람직하게는, 변이체 폴리펩타이드는 Zwf 또는 Mdh 효소의 하나 이상의 생화학적 활성, 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소 활성을 가진다. 변이체 폴리펩타이드는 Zwf 또는 Mdh 효소의 단편을 포함할 수 있다. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 활성 및 말레이트 탈수소효소 활성의 평가 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 매사추세츠주에 소재한 압캠(Abcam) 및 미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 상업적으로 입수가능하다. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 활성을 결정하기 위한 대표적인 분석은 문헌[Rowley and Wolf, J. Bacteriology, 173, 968-977 (1991) 및 Wolf et al., J. Bacteriology, 139, 1093-1096 (1979)]에 기재된다. 해당 반응에 대한 예시적 조건은 다음과 같다: 50mM 트리스-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl2, 1mM NADP, 1mM 글루코스-6-포스페이트를 함유하는 반응 혼합물 및 세포 추출물을 제조하고, 340㎚에서 흡광도 증가가 측정된다. 다양한 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소는 서열번호 2의 폴리펩타이드의 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 활성의 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소는 100% 초과의 서열번호 2의 폴리펩타이드의 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 활성(예를 들어, 110% 이상, 120% 이상 또는 130% 이상의 활성)을 나타낼 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 재조합 미생물유기체에 의해 생산된 말레이트 탈수소효소는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%의 서열번호 4의 폴리펩타이드의 말레이트 탈수소효소 활성을 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 말레이트 탈수소효소는 100% 초과의 서열번호 4의 폴리펩타이드의 말레이트 탈수소효소 활성(예를 들어, 110% 이상, 120% 이상 또는 130% 이상의 활성)을 나타낼 수 있다. 말레이트 탈수소효소 활성을 결정하기 위한 대표적인 분석은 문헌[Samuelov, J. Bacteriology, 57, 3013 (1991)]에 기재된다. 반응을 위한 예시적인 조건은 다음과 같다: 100mM 트리스-HCl, pH 8.1, 5mM 옥살로아세테이트, 0.3mM NADH, 2mM DTT를 함유하는 반응 혼합물, 및 세포 추출물이 제조되고; NADH의 산화를 나타내는 340㎚에서 감소된 흡광도가 측정된다.
재조합 미생물유기체는, 예를 들어 박테리아 세포 및 다른 원핵 세포 및 효모 세포와 같은 임의의 적합한 미생물유기체로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 미생물유기체는 상업적 생산에 적합한 수준으로 유기산을 생산할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 미생물유기체를 제조하기 위한 적합한 미생물유기체는 숙신산 생산 미생물유기체를 포함한다. 대표적인 미생물유기체는 파스퇴렐라(Pasteurellaceae) 패밀리의 유기체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 파스퇴렐라 패밀리 구성원의 예는 악티노바실러스 숙시노겐스를 포함하는 악티노바실러스 속, 비스가드 탁손 6(등록번호 15568 하에 스웨덴에 소재한 유니버시티 오브 예테보리, 균주보관기관(Culture Collection, University of Goteborg: CCUG)에 기탁됨), 비스가드 탁손 10(CCUG 등록번호 15572 하에 기탁됨), 맨하이미아 숙시니시프로듀센스, 바스피아 숙시닉프로듀센스, 이콜라이, 아나에로바이오스피릴룸 숙시니시프로듀센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 루미노박터 아밀로필루스(Ruminobacter amylophilus), 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스(Succinivibrio dextrinosolvens), 프레보텔라 루미니콜라(Prevotella ruminicola), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 및 코리네포름(coryneform) 박테리아(예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아겐스(Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 플라븀(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토페르멘투인(Brevibacterium lactofermentuin), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum))의 구성원; 락토바실러스 속의 구성원; 효소(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 사카로마이세스 속의 구성원; 및 이들의 어떤 서브세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 균주는 16S rRNA가 악티노바실러스 숙시노겐스의 16S rRNA에 대해 적어도 약 90% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 약 95% 서열 동일성)을 갖는 미생물유기체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 재조합 균주는 악티노바실러스 숙시노겐스, 비스가드 탁손 6 또는 비스가드 탁손 10의 균주로부터 유래될 수 있다.
재조합 미생물유기체는 zwf 유전자, mdh 유전자 또는 둘 다를 발현시킬 수 있다. zwf 또는 mdh 유전자는 재조합 미생물유기체에 대해 천연일 수 있다. 다른 실시형태에서, zwf 또는 mdh 유전자는 이종성일 수 있다(즉, 재조합 미생물유기체가 유래된 미생물유기체에 대해 천연이 아니다). 일부 실시형태에서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, zwf 또는 mdh 유전자)는 재조합 미생물유기체에서 발현을 위해 최적화된다. 예를 들어, zwf 또는 mdh 유전자는 비재조합 미생물유기체에 대해 유전자 과발현을 용이하게 하는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 미생물유기체(예를 들어, 재조합 미생물유기체가 유래된 미생물유기체에 대해 천연임)에 대해 내인성일 수 있거나 또는 미생물유기체에 대해 이종성일 수 있다. 일부 실시형태에서, zwf 및 mdh 유전자는 악티노바실러스 숙시노겐스로부터 유래되며, 또한 악티노바실러스 숙시노겐스로부터 그것의 각각의 zwf 및 mdh 프로모터에 의해 조절된다.
글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, zwf 또는 mdh 유전자)는 선택적으로 변형되어 대응되는 mRNA의 번역을 용이하게 한다. 예를 들어, zwf 또는 mdh 유전자는 내인성 또는 천연 유전자에 존재하지 않는 코돈을 포함하도록 변형될 수 있다. 이들 비내인성 코돈은 재조합 미생물유기체에서 코돈 사용 빈도를 반영하도록 선택될 수 있다. 코돈 사용 표는 다수의 미생물유기체를 위해 개발되었고, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, zwf 또는 mdh 유전자)는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 미국특허 제8,119,377호에 제공된 바와 같이 악티노바실러스 숙시노겐스를 위한 코돈 사용을 반영하도록 변형될 수 있다.
재조합 미생물유기체는 고수준의 숙신산 또는 프로피온산과 같은 하나 이상의 유기산을 생산하는 균주로부터 유래될 수 있거나, 또는 재조합 미생물유기체는 비재조합 미생물유기체에 대해 높거나 또는 향상된 수준의 숙신산 또는 프로피온산과 같은 하나 이상의 유기산을 생산하도록 선택되거나 또는 유전자조작될 수 있다.
선택적으로, 재조합 미생물유기체는 원치않는 부산물의 상대적으로 높은 수준에 저항하도록 또는 원치않는 부산물의 상대적으로 낮은 수준을 생산하기 위해 선택되거나 또는 유전자조작된다(또는 둘 다). 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 세포 내로 도입(예를 들어, 형질전환) 후, 재조합 미생물유기체의 집단은 상대적으로 높은 아세테이트 수준에 저항성인 균주 또는 상대적으로 낮은 아세테이트 수준을 생산하는 균주를 선택하기 위해 모노플루오로아세트산나트륨의 존재에서 선택적으로 성장된다. 바람직하지 않은 부산물은, 포르메이트(또는 포름산), 아세테이트(또는 아세트산) 및/또는 피루베이트(또는 피루브산), 락테이트, 1.3-프로판다이올 및 에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 낮은 아세테이트 수준을 생산하는 균주를 선택하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 특히 미생물 균주 선택의 논의에 대해 본 명세서에 참조로서 포함된, 미국특허 제5,521,075호 및 미국특허 제5,573,931호를 참조한다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 아세테이트 수준을 생산하는 미생물유기체의 균주는 독성 아세테이트 유도체의 존재에서, 예컨대 모노플루오로아세트산나트륨의 1.0 내지 약 8.0g/ℓ의 농도에서 미생물유기체를 성장시킴으로써 선택될 수 있다. 선택된 균주는 글루코스 발효에서 상대적으로 낮은 아세테이트 수준(예를 들어, 약 10g/ℓ 미만, 약 7g/ℓ 미만, 약 5g/ℓ 미만 또는 약 2.0g/ℓ 미만), 포르메이트(예를 들어, 약 2.0g/ℓ 미만) 및/또는 피루베이트(예를 들어, 약 3.0g/ℓ 미만)를 생산할 수 있다. 재조합 미생물유기체 또는 유도체를 생산하기 위한 하나의 적합한 모노플루오로아세테이트 저항성 균주는 ATCC 등록 번호 55618 하에 기탁된 악티노바실러스 숙시노겐스의 균주이다. 또한 모노플루오로아세테이트에 저항성인 미생물 균주를 제조하기 위한 적합한 방법을 기재하는 미국특허 제5,573,931호를 참조한다. 다른 적합한 모노플루오로아세테이트 저항성 균주는 FZ45 및 FZ53를 포함하며, 이는 또한 미국특허 제5,573,931호에 기재된다.
글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(또는 Zwf 또는 Mdh 효소의 하나 이상의 생화학적 활성을 지니는 폴리펩타이드)는 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 얻어질 수 있다(예를 들어, 적합한 프라이머에 의한 PCR 증폭 및 적합한 DNA 벡터로 클로닝). 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 활성을 암호화하는 적합한 zwf 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열이 개시되었다(예를 들어, 젠뱅크(GenBank) 참조). 예를 들어, 악티노바실러스 숙시노겐스 zwf 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열은 미국특허 제8,119,377호에서 공개되었으며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 또한 미국 에너지국 산하 공동 유전체 연구소(Joint Genome Institute, Department of Energy) 웹사이트, NCBI 등록번호 NC_009655를 참조한다. 이콜라이 zwf 유전자는 젠뱅크(GenBank)에 기탁된다(예를 들어, 젠뱅크(GenBank) 등록 번호 NC 000913 및 젠뱅크(GenBank) 등록 번호 M55005 하에). zwf 유전자 또는 이의 변이체는 적절한 프라이머를 지니는 미생물유기체의 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다.
mdh 서열은, 예를 들어 악티노바실러스 숙시노겐스, 젠뱅크(GenBank) NC_009655, 또는 이콜라이 EG10576(EcoCyc)로부터 얻을 수 있다.
DNA 벡터는 재조합 미생물유기체에서 폴리뉴클레오타이드(들)를 발현시키기 위한 임의의 적합한 벡터일 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드, 인공 염색체(예를 들어, 박테리아 인공 염색체) 및/또는 변형된 박테리오파지(예를 들어, 파지미드(phagemid))를 포함한다. 벡터는 후성적(epigenetic) 구성요소로서 존재하도록 설계될 수 있고/있거나 벡터는 미생물유기체의 게놈과 재조합되도록 설계될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 핵산 서열(즉, Zwf 또는 Mdh 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 전형적으로 포함한다. 프로모터는 재조합 미생물유기체가 유래된 미생물유기체에 대해 내인성이거나 또는 천연일 수 있거나 또는 미생물유기체에 대해 이종성(예를 들어, 재조합 미생물 유기체 이외의 공급원으로부터 유래됨)일 수 있다. 더 나아가, 프로모터는 선택된 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소 암호 서열(즉, zwf 또는 mdh 유전자)에 대해 천연인 프로모터일 수 있거나 또는 선택된 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소(예를 들어, 비-zwf 또는 mdh 유전자 프로모터)에 대해 천연 프로모터 이외의 프로모터일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 악티노바실러스 숙시노겐스 균주이고, 악티노바실러스 숙시노겐스 zwf 또는 mdh 프로모터가 사용된다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 본 명세서에 참조로서 포함되는 미국특허 제8,119,377호에 개시된 바와 같이 뉴클레오타이드 1 내지 258 또는 이의 변이체를 포함하는 젠뱅크(GenBank) 등록번호 AY308832 하에 기탁된 악티노바실러스 숙시노겐스 포스포엔올피루베이트(PckA) 카복시키나제 프로모터일 수 있다. 원하는 미생물유기체에서 원하는 서열의 발현을 지시할 수 있는 임의의 적합한 프로모터(예를 들어, 유도성, 구성적, 강한 등)가 사용될 수 있다. 프로모터는 당업계에 공지된 클로닝 방법을 사용하여 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, zwf 또는 mdh 유전자)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 프로모터 및 암호 서열(예를 들어 zwf 및 mdh 유전자)은 양립가능한 제한 효소 인식 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 증폭된 프로모터 및 암호 서열은 그 다음에 효소로 분해되고, 적합한 다중 클로닝 부위를 포함하는 적절한 벡터로 클로닝된다.
추가로, 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 벡터는 선별가능한 마커를 포함하거나 또는 암호화할 수 있다. 선별가능한 마커는 하나 이상의 항생제에 대해 내성을 부여할 수 있다. 예를 들어, 선별가능한 마커는 암피실린 저항성, 스트렙토마이신 저항성, 카나마이신 저항성, 테트라사이클린 저항성, 클로람페니콜 저항성, 설폰아마이드 저항성 또는 이들 마커의 조합을 위한 유전자를 포함할 수 있다. 전형적으로, 선별가능한 마커는 마커의 발현을 용이하게 하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 선별가능한 마커를 포함하는 플라스미드 및 다른 클로닝 벡터는 당업계에 공지되어 있다.
임의의 적합한 숙주 세포가 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 벡터를 저장하거나 또는 전파하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 선택적으로 DNA 분자 상의 암호 서열을 발현시킨다. 적합한 숙주 세포는 또한 상업적 생산을 위해 발효 과정의 유기산, 예컨대 숙신산 또는 프로피온산을 적합한 농도에서(예를 들어, 적어도 약 20g/ℓ, 더 적합하게는 적어도 약 50g/ℓ 및 더 적합하게는 적어도 약 100g/ℓ) 생산할 수 있는 세포(즉, 생산하는 세포)를 유도할 수 있다.
본 발명의 내용에서, 유기산을 생산하기 위한 방법은 전형적으로 재조합 미생물유기체를 지니는 영양 배지를 발효시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발효 배지 내 재조합 미생물유기체는 zwf 및 mdh 유전자를 발현시킨다. 예를 들어, 방법은 zwf 및 mdh 유전자(예를 들어, 천연 악티노바실러스 숙시노겐스 zwf 또는 mdh 유전자)를 발현시키는 재조합 악티노바실러스 숙시노겐스를 지니는 영양 배지를 발효시키는 단계를 포함할 수 있다. 유전자 및 유기체의 다른 조합은 유기산을 생산하기 위한 발효 배지로 사용될 수 있다는 것이 생각될 수 있다. 예를 들어, 이종성 zwf 유전자 및 내인성 mdh 유전자는 둘 다 적합한 유기체 또는 임의의 다른 적합한 조합에서 이종성 프로모터로부터 발현될 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 바람직한 유기산 생산 조건 하에서 탄소 공급원과 함께 본 명세서에 기재된 재조합 미생물유기체를 배양시키는 단계를 포함하는 유기산의 생산 방법을 제공한다. 재조합 미생물유기체는, 예를 들어, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 이종성 혹은 과발현된 폴리뉴클레오타이드 및 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 이종성 혹은 과발현된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 원하는 유기산의 생산을 가능하게 하는 효소를 생산한다. 발효에서 생산되는 유기산은, 예를 들어 숙신산 또는 프로피온산, 또는 본 명세서에서 논의된 임의의 다른 유기산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 대해 하나의 적합한 재조합 미생물유기체는 ATCC 등록번호 PTA-6255 하에 기탁된 이콜라이 zwf 유전자를 발현시키는 악티노바실러스 숙시노겐스의 재조합 균주이다. 이 유기체는 mdh 유전자를 발현시키는 다른 재조합 유기체와 조합되어 둘 다 유기산을 생산하는 영양 배지의 발효에서 성장될 수 있다. 대안적으로, ATCC 등록 번호 PTA-6255 하에 기탁된 균주는 mdh를 과발현시키거나 또는 이종성 Mdh를 생산하도록 변형된다. 방법은 또한 숙신산을 생산하기 위해 zwf 또는 mdh 또는 유전자 둘 다(예를 들어, 이콜라이로부터와 같이 이종성 zwf 또는 mdh 유전자)를 발현시키는 비스가드 탁손 6 또는 비스가드 탁손 10의 재조합 균주를 지니는 영양 배지를 발효시키는 단계를 포함할 수 있다.
영양 배지는 발효가능한 탄소 공급원을 포함한다. 발효가능한 탄소 공급원은 발효가능한 바이오매스에 의해 제공될 수 있다. 발효가능한 바이오매스는 하기를 포함하는 다양한 작물 및/또는 공급원료로부터 유래될 수 있다: 당료 작물(예를 들어, 당, 비트, 단수수, 사탕수수, 사료용 비트); 전분 작물(예를 들어, 곡물, 예컨대 옥수수, 밀, 수수, 보리 및 덩이줄기, 예컨대 감자 및 고구마); 셀룰로스 작물(예를 들어, 옥수수 대, 옥수수 섬유질, 밀짚 및 사료, 예컨대 수단 그라스(Sudan grass) 사료 및 수수). 바이오매스는 발효가능한 탄소 공급원(예를 들어, 당)의 방출을 용이하게 하도록 처리될 수 있다. 예를 들어, 바이오매스는 효소, 예컨대 셀룰라제 및/또는 자일라나제로 처리하여 단당(simple sugar)을 방출하기 위해 처리될 수 있고/있거나 열, 증기 또는 산으로 처리하여 분해를 용이하게 할 수 있다. 발효가능한 탄소 공급원은 단당 및 당 알코올, 예컨대 글루코스, 말토스, 만노스, 만니톨, 솔비톨, 갈락토스, 자일로스, 자일리톨, 아라비노스, 아라비톨 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비정제된, 최소로 처리되거나 또는 조질의 탄소 공급원은 유기산 생산을 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 탄소 공급원은 미국 가특허 출원 제61/708998호로서 당해 출원이 우선권을 주장하는 동일 날짜에 출원된 미국 특허출원 제60/709,036호(발명의 명칭: Integrated Systems & Methods for Organic Acid Productions)에 기재된 조질의 폴리올을 포함할 수 있으며, 이 출원은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다. 조질의 폴리올은, 예를 들어 다르게 최소 처리를 실시한, 예를 들어 발효 또는 수소처리를 통해 생산된, 폴리올을 포함한다. 예를 들어, 조질의 폴리올은 고체를 제거하기 위해 여과 단계에 실시되지 않는다. 이와 같이, 조질의 폴리올은 정제된 폴리올보다 덜 순수하다.
본 발명의 방법은 당(예를 들어, 글루코스 또는 솔비톨)과 같은 유입 탄소 공급원에 비해 상대적으로 고수율의 숙신산을 초래한다. 예를 들어, 방법은 선택적으로 탄소 공급원(예를 들어, 글루코스) 유입물(g)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%(또는 앞서 언급한 백분율 중 어떤 범위)의 숙신산 수율(들), 또는 탄소 공급원(예를 들어, 글루코스) 유입물(g)에 대해 적어도 56% (예를 들어, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 또는 앞서 언급한 백분율 중 어떤 범위)의 프로피온산 수율(g)을 가진다. 일부 실시형태에서, 수율은 %숙신산 또는 프로피온산 수율(㏖)/탄소 공급원(예를 들어, 글루코스) 유입물(㏖)로서 계산될 수 있다. 이와 같이, 방법은 탄소 공급원(예를 들어, 글루코스) 유입물(㏖)에 대해 적어도 약 154%의 숙신산 또는 프로피온산 수율(㏖)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 해당 방법은 탄소 공급원(예를 들어, 글루코스) 유입물(㏖)에 대해 적어도 약 130% 또는 적어도 약 170%의 숙신산 또는 프로피온산 수율(㏖)을 가질 수 있다.
해당 방법은 상대적으로 높은 숙신산 농도를 초래할 수 있다(예를 들어, 발효에서 비-재조합 미생물유기체를 사용하는 방법에 비해). 예를 들어, 발효는 적어도 약 50g/ℓ 숙신산(예를 들어, 적어도 약 60g/ℓ, 적어도 약 70g/ℓ 또는 적어도 약 80g/ℓ)의 농도에 도달할 수 있다. 바람직하게는, 발효는 적어도 약 90g/ℓ 숙신산의 농도(예를 들어, 적어도 약 100g/ℓ 숙신산, 적어도 약 110g/ℓ 숙신산, 또는 적어도 약 120g/ℓ 숙신산) 또는 더 바람직하게는, 적어도 약 130g/ℓ 숙신산의 농도 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 140g/ℓ의 농도에 도달할 수 있다. 일부 실시형태에서, 발효는 바람직하지 않은 부산물, 예컨대 아세테이트, 포르메이트, 피루베이트 및 이들의 혼합물의 실질적인 수준을 생산하지 않는다(예를 들어, 약 11.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 10.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 9.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 8.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 7.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 6.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 5.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 4.0g/ℓ 이하의 아세테이트, 약 3.0g/ℓ 이하, 또는 약 2.0g/ℓ 이하의 아세테이트(예를 들어, 1.5g/ℓ 이하 또는 1.0g/ℓ 이하); 약 2.0g/ℓ 이하의 포르메이트(예를 들어, 1.5g/ℓ 이하 또는 1.0g/ℓ 이하); 및/또는 약 3.0g/ℓ 이하의 피루베이트(예를 들어, 2.5g/ℓ 이하 또는 2.0g/ℓ 이하 또는 1.5g/ℓ 이하 또는 1.0g/ℓ 이하)).
본 명세서에 기재된 방법은 선택적으로 상대적으로 높은 생산률을 초래한다. 다양한 실시형태에서, 해당 방법은 적어도 약 1.0g/ℓ-h, 적어도 약 1.5g/ℓ-h, 적어도 약 2.0g/ℓ-h, 적어도 약 2.5g/ℓ-h, 적어도 약 3.0g/ℓ-h, 적어도 약 3.5g/ℓ-h 또는 적어도 약 4.0g/ℓ-h의 생산성을 달성한다.
일 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 이종성 zwf 및 mdh 유전자를 발현시키는 악티노바실러스 숙시노겐스이다. 이종성 zwf 및 mdh 유전자는 악티노바실러스 숙시노겐스에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. 이종성 zwf 및 mdh 유전자는 이콜라이에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, 재조합 유기체는 Mdh를 과생산하기 위해 선택적으로 변형된 ATCC 등록번호 PTA-6255(미국 버지니아주 매너서스에 소재한 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)) 하에 기탁된 악티노바실러스 숙시노겐스이다. 대안의 재조합 미생물유기체는 모(미변형) 악티노바실러스 숙시노겐스 균주에 비해 증가된 수준의 Zwf 및 Mdh를 생산하는 균주인 ATCC 등록 번호 PTA-120462 하에 기탁된 악티노바실러스 숙시노겐스 균주이다. 재조합 균주는 약 50g/ℓ 내지 약 150g/ℓ의 농도에서 숙신산 또는 프로피온산을 생산할 수 있다(예를 들어, 적합한 탄소 공급원을 이용하는 발효 시스템에서). 재조합 균주는 적어도 약 1g/ℓ의 모노플루오로아세트산나트륨의 수준에 대해 저항성일 수 있다.
다른 실시형태에서, 재조합 균주는 종성 zwf 또는 mdh 유전자에 작동가능하게 연결된 악티노바실러스 숙시노겐스에 대한 전사 프로모터(예를 들어, Zwf 암호 서열에 연결된 악티노바실러스 숙시노겐스 프로모터 및 Mdh 암호 서열에 연결된 악티노바실러스 숙시노겐스 프로모터)를 포함하는 DNA 분자(즉, 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 악티노바실러스 숙시노겐스이다. 전사 프로모터는 악티노바실러스 숙시노겐스 포스포엔올피루베이트(PckA) 카복시키나제 프로모터 또는 이의 변이체를 포함할 수 있으며, 이의 서열은 미국특허 제8,119,377호에 개시된다. 이종성 zwf 유전자는 이콜라이 중간발효소 또는 이의 변이체를 암호화할 수 있다. 이종성 mdh 유전자는 이콜라이 Mdh 효소 또는 이의 변이체를 암호화할 수 있다. 선택적으로 zwf 유전자 및/또는 mdh 유전자는 악티노바실러스 숙시노겐스에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. DNA 분자는 후성적일 수 있다(예를 들어, 플라스미드 상에 존재함). DNA 분자는 선별가능한 마커(예를 들어, 카나마이신 저항성, 암피실린 저항성, 스트렙토마이신 저항성, 설폰아마이드 저항성, 테트라사이클린 저항성, 클로람페니콜 저항성 또는 이들의 조합)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, DNA 분자(폴리뉴클레오타이드)는 이종성 zwf 프로모터에 작동가능하게 연결된 미생물유기체를 생산하는 숙신산에 대한 전사 프로모터를 포함한다. 전사 프로모터는 zwf 프로모터를 포함할 수 있다. DNA 분자는 플라스미드 내에 존재할 수 있다. DNA 분자는 숙주 세포에 존재할 수 있다(예를 들어, 약 50g/ℓ 내지 약 150g/ℓ의 농도에서 숙신산 또는 프로피온산을 생산하는 숙주 세포).
일 실시형태에서, 숙신산을 생산하기 위한 방법이 제공된다. 해당 방법은 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 생산하는 이종성 zwf 유전자를 발현시키는 재조합 미생물유기체를, 선택적으로 말레이트 탈수소효소를 생산하는 이종성 mdh 유전자를 발현시키는 제2의 재조합 미생물유기체와 조합하여 영양 배지를 발효시키는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 이종성 mdh 유전자 및 이종성 zwf 유전자를 발현시킨다. 재조합 미생물유기체는 악티노바실러스 숙시노겐스의 재조합 균주를 포함할 수 있다(예를 들어, ATCC 등록 번호 PTA-6255 하에 기탁된 악티노바실러스 숙시노겐스 재조합 균주). 재조합 미생물유기체는 비스가드 탁손 6, 비스가드 탁손 10 등의 재조합 균주를 포함할 수 있다. 이종성 zwf 유전자는 이콜라이 zwf 유전자를 포함할 수 있다. 이종성 mdh 유전자는 이콜라이 mdh 유전자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 재조합 균주는 적어도 약 1g/ℓ의 모노플루오로아세트산나트륨의 수준에 대해 저항성이다. 선택적으로 재조합 균주는 약 50g/ℓ 내지 약 150g/ℓ의 농도에서 숙신산 또는 프로피온산을 생산할 수 있다. 영양 배지는 발효가능한 당(예를 들어, 글루코스)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 해당 방법은 글루코스(g)에 대해 적어도 약 100%의 숙신산 수율(g)을 초래한다.
다른 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 미생물유기체를 생산하는 숙신산의 재조합 균주이다. 재조합 미생물유기체는 이종성 zwf 유전자(즉, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 이종성 폴리뉴클레오타이드)를 포함한다(예를 들어 이에 의해 형질전환되었다). 이종성 zwf 유전자는 미생물유기체에서 발현을 위해 최적화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 zwf 유전자는 이콜라이 Zwf 효소를 암호화할 수 있다.
다른 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 Zwf 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 포스포엔올피루베이트(PckA) 카복시키나제에 대한 전사 프로모터를 포함하는 DNA 분자(폴리뉴클레오타이드)에 의해 형질전환된 미생물유기체를 생산하는 숙신산의 재조합 균주이다. 재조합 미생물유기체는 Mdh 효소 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된 포스포엔올피루페이트(PckA) 카복시키나제에 대한 전사 프로모터를 포함하는 DNA 분자(폴리뉴클레오타이드)에 의해 선택적으로 형질전환되었다. 전사 프로모터는 악티노바실러스 숙시노겐스 포스포엔올피루페이트(PckA) 카복시키나제 프로모터를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 후성적인 DNA 분자에 의해 형질전환된 재조합 균주이다. DNA 분자는 플라스미드 상에 존재할 수 있다.
다른 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 약 50g/ℓ 내지 약 150g/ℓ의 농도에서 숙신산 또는 프로피온산을 생산할 수 있는 재조합 균주이다.
재조합 균주는 적어도 약 1g/ℓ의 모노플루오로아세트산나트륨의 수준에 대해 저항성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 균주는 ATCC 등록 번호 PTA-6255 하에 기탁된 재조합 악티노바실러스 숙시노겐스를 사용하여 생산되거나, 또는 재조합 균주는 ATCC 등록 번호 PTA-120462 하에 기탁된 악티노바실러스 숙시노겐스이다.
다른 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 재조합 미생물유기체를 지니는 영양 배지를 발효시키는 단계를 포함하는 방법에서 숙신산 또는 프로피온산을 생산하기 위해 사용된다. 영양 배지는 전형적으로 글루코스 또는 솔비톨과 같은 발효가능한 당을 포함한다. 해당 방법은 글루코스(g)에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100%의 숙신산 수율(g)을 초래할 수 있다. 해당 방법은 글루코스(g)에 대해 적어도 약 62% 내지 약 72%의 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%(또는 이들 백분율 내의 어떤 범위)의 프로피온산을 초래할 수 있다.
유기산을 생산하기 위한 방법은 탄소 공급원(예를 들어, 조질의 솔비톨)을 함유하는 적합한 발효 브로스에서 적합한 미생물유기체를 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 발효 브로스는 또한 질소 공급원, 무기 염, 비타민 또는 성장 촉진 인자 등을 함유한다. 일부 실시형태에서, 염, 암모늄 공급원 및 다른 영양 배지 필요조건은 옥수수 침지액(corn steep liquor: CSL), 옥수수 습식밀링의 부산물로부터 얻어질 수 있다. 염에 대해, 나트륨 공급원은, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2CO3, NaHCO3, NaCl 및 유기산으로부터의 Na(예를 들어 글루탐산모노나트륨, 아세트산나트륨)를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 나트륨 농도는 약 1200㎎/ℓ 내지 약 6800㎎/ℓ의 범위에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 나트륨 농도는 약 3000㎎/ℓ 내지 약 3500㎎/ℓ이다. 본 발명은 나트륨 염으로 제한되지 않으며; 다른 염이 본 발명의 부분으로서 고려된다.
발효는 임의의 적합한 발효기에서 탄소 공급원과 발효 브로스를 합하는 단계 및 적합한 미생물유기체로 접종하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 발효는 미생물유기체의 성장 및 적합한 유기산의 생산에 좋은 조건 하에서 호기성으로 또는 혐기성으로 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 발효 온도는 적어도 약 25℃, 및 약 50℃ 미만의 온도 내에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 온도는 약 30℃ 내지 약 39℃(예를 들어, 약 38℃)이다. 일부 실시형태에서, 온도는 약 30℃ 내지 약 37℃이다.
발효 브로스는 또한 베타인 또는 부가염 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 베타인은 베타인-HCl, 베타인 유리 염기 등이다.
다른 실시형태에서, 베타인은 베타인을 함유하는 공급 산물의 성분으로서 존재할 수 있다. 대표적인 베타인 또는 베타인을 함유하는 적어도 하나의 공급 산물은 베타인, 아미노산 발효 부산물 가용성 물질, 베타인을 함유하는 당밀, 응축 세퍼레이터 부산물, 응축 당밀 가용성 물질, 발효 찌꺼기 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함한다. 베타인을 함유하는 공급 산물의 다른 예는 응축되고, 추출된 글루탐산 발효 산물, 발효 생산 리신으로부터의 아미노산 발효 부산물 가용성 물질 또는 발효 생산 트립토판으로부터의 아미노산 발효 부산물 가용성 물질을 포함한다. 베타인 농도는 약 0.05g/ℓ 내지 약 2g/ℓ의 범위에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 사용되는 베타인 농도는 0.2g/ℓ 내지 0.5g/ℓ일 수 있다.
일 실시형태에서, 발효의 시작시 발효 브로스의 pH는 약 pH 6 내지 7의 범위 또는 약 pH 7 내지 약 pH 8.0(예를 들어, 약 pH 8.0)의 범위 내에 있다. 발효 pH는 염기의 첨가에 의해 제어될 수 있으며, 예를 들어 발효가 진행됨에 따라 pH는 약 pH 5 내지 약 pH 7, 또는 약 pH 6 내지 약 pH 7(예를 들어, 약 pH 6.6), 또는 약 pH 4.5 내지 약 6, 또는 약 5 내지 약 5.5를 달성하도록 제어될 수 있다. 마그네슘 염기는 본 발명의 내용에서 pH를 제어하는데 적합하다. 일 실시형태에서, MgCO3은 대략 약 pH 6.0 내지 약 pH 7.0(예를 들어, 약 pH 6.4 내지 약 pH 6.8), 바람직하게는 약 pH 6.6의 pH를 선택적으로 달성하기 위해 CO2 분위기에서 pH를 제어하도록 제공된다. Mg(OH)2가 또한 적절하다. 해당 방법은 특정 pH 제어제에 의존하지 않지만, NH4OH, NaOH, 기체 NH3, Na3PO4, 또는 이들의 탄산염 형태가 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1
미생물유기체 균주 및 플라스미드
악티노바실러스 숙시노겐스 균주 FZ45 및 FZ53은 모노플루오로아세트산나트륨에 저항성인 악티노바실러스 숙시노겐스 130Z의 안정한 박테리아 변이체이다. 문헌[Guettler et al., INT'L J. SYST. BACT. (1999) 49:207-216]; 및 미국특허 제5,573,931호를 참조한다. 이콜라이-악티노바실러스 숙시노겐스 셔틀 벡터 pLS88(ATCC 등록번호 86980으로서 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)에 기탁됨)을 캐나다 유니버시티 오브 매니토바(University of Manitoba)의 레슬리 슬래니 박사로부터 얻었다. 플라스미드 pLS88을 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi)로부터 단리시킨 바와 같이 기재하고, 설폰아마이드, 스트렙토마이신 및 카나마이신에 대한 저항성을 부여할 수 있다.
유전자 조작:
재조합 DNA 조작은 일반적으로 당업계에 기재된 방법을 따랐다. 플라스미드 DNA를 알칼리 용균법에 의해 제조하였다. 1.5㎖ 배양물로부터 추출한 다중복제 플라스미드에 대한 전형적인 재현탁 용적은 50㎕였다. 더 큰 DNA 제제를 퀴아젠 플라스미드 정제 미디 및 맥시 키트(Qiagen Plasmid Purification Midi and Maxi)로 제조업자의 설명서에 따라 사용하였다. 제한 엔도뉴클레아제, 분자량 표준 및 사전염색한 마커를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입하였고, 대략 5배 효소 과량을 사용한 것을 제외하고 제조업자에 의해 추천된 바와 같이 분해를 수행하였다. DNA를 브롬화 에티듐의 존재에서 트리스-아세테이트-아가로스 겔 상에서 분석하였다. DNA를 아가로스 겔로부터 추출하였고, 제조업자의 설명서에 따라 퀴아젠(Qiagen) 젤 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 제한효소 분해와 조합하여 새우 또는 송아지 알칼리 포스파타제(로슈(Roche))를 사용하여 DNA를 탈인산화시켰다. 포스파타제를 70℃에서 15분 동안 열 활성화시키거나 또는 퀴아젠(Qiagen) 정제 컬럼을 통과시켰다. 20㎕ 반응용적 및 1㎕의 T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 중에서 1시간 동안 25℃에서 벡터 DNA에 3 내지 5배 과량의 몰의 삽입물을 사용하여 결찰을 수행하였다. 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입한 "라이브러리 효율 컴피턴트 세포(competent cell)"를 제조업자의 설명서에 따라 사용함으로써 이콜라이 형질전환을 수행하였다.
적절한 항생제를 함유하는 표준 LB 플레이트 상에서 결찰 혼합물을 사용하는 형질전환을 희석 없이 플레이팅시켰다. 가이드라인으로서 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 매뉴얼을 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 프라이머 설계는 공개된 서열을 기반으로 하며(미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 데이터베이스에서 제공되는 바와 같음), 인비트로젠 라이프 사이언스(Invitrogen Life Sciences)로부터 얻었다. 프라이머는 유전자조작된 제한 효소 인식 부위를 포함하였다. 벡터 NTI 프로그램을 사용하여 다이머 및 헤어핀 형성 및 용융 온도에 대해 프라이머를 분석하였다. 모든 프라이머는 미시간 주립 거대분자 구조 시설(Michigan State Macromolecular Structure Facility)로부터 주문하였다. 에펜도르프 구배 마스터 사이클러(Eppendorf Gradient Master Cycler)에서 또는 퍼킨 엘머 써모사이클러(Perkin Elmer Thermocycler)에서 PCR 증폭을 수행하였다. 각 프라이머 쌍에 대해 벡터 NTI 프로그램을 사용하여 출발 어닐링 온도를 결정하였다. 증폭된 산물을 분해하는 제한 효소를 인비트로젠(Invitrogen) 또는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 구입하였다.
전기천공법을 위한 악티노바실러스 숙시노겐스 컴피턴스 세포를 글루코스로 보충한 배지인 트립신 대두 브로스(tryptic soy broth: TSB)에서 MgCO3의 존재에서 세포를 성장시킴으로써 제조하였고, 초기 내지 중간 대수기(log-phase)에 채취하였다. 사용하지 않은 탄산염을 저속 원심분리에 의해 제거하였다. 세포를 교반시키고, 멸균수로 2회, 10% v/v 글라이세롤로 2회 세척시켰으며, 0.01x 본래 배양 용적의 10% 글라이세롤에서 재현탁시켰다. 세포를 작은 알리쿼트(aliquot)로 현탁시켰고, 급속 냉동시켰으며, -80℃에서 저장하였다. 0.1㎝ 큐벳 및 400W, 25mF, 1.8kV의 설정을 지니는 바이오래드 진펄서(BioRad GenePulser)를 사용하여, 전기천공법을 위해 40㎖의 제조한 세포를 사용하였다. 전기천공법 후, 1㎖ 실온 TSB 배지를 큐벳에 바로 첨가하였고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 용액을 적절한 항생제를 함유하는 TSB 한천 플레이트 상에서 플레이팅시켰고, 3일 동안 CO2 분위기로 37℃에서 인큐베이션시켰다.
플라스미드 p830.60
악티노바실러스 숙시노겐스 zwf 유전자 및 프로모터를 프라이머 TD299(서열번호 5) 및 TD300(서열번호 6)을 사용하여 악티노바실러스 숙시노겐스 FZ45 게놈 DNA로부터 증폭시켰고, 다중클로닝 부위를 지니는 pLS88의 유도체인 pJR762.47의 BamH1 및 Sal1 부위에 삽입하였으며, pLS88의 EcoRI 및 SphI 부위에 삽입하였고, 도 3에 나타낸다.
p830.60에서 클로닝한 유전자는 1781개의 염기쌍(base pair: bp)이며, 암호 영역은 위치 272에서 시작되고(도 8에서 볼드체 밑줄 atg), 1757에서 중단되며(도 8에서 볼드체 밑줄), 그것의 서열을 서열번호 1로서 제공한다. 프로모터 서열은 출발점에서 시작해서 암호 서열 앞에서 끝난다.
플라스미드 pISTONS1
악티노바실러스 숙시노겐스 Mdh 유전자 및 프로모터를 프라이머 TD223(서열번호 7) 및 TD218(서열번호 8)을 사용하여 악티노바실러스 숙시노겐스 FZ45 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 증폭시킨 DNA를 EcoRI 단편으로서 클로닝시켰고, 도 2에서 나타내는 바와 같이 pLS88의 EcoRI 부위에 삽입하였다. pISTONS1의 mdh 유전자는 1558 bp였고, 암호 영역은 303에서 시작되며(도 9에서 볼드체 밑줄 atg), 1239에서 끝나고(도 9에서 볼드체 밑줄 taa), 서열번호 3에서와 같이 제공되며, 프로모터는 서열의 출발점로부터 나타나며 암호 영역 앞에서 끝난다.
플라스미드 p856.78
악티노바실러스 숙시노겐스 mdh 유전자를 제한효소 EcoRI를 사용하여 pISTONS1로부터 절단하였고, 말단을 클레노브 폴리머라제(Klenow Polymerase)로 채워서 평활 말단을 제조하고, 플라스미드 p830.60과 결찰시켰는데, 이는 제한 엔도뉴클레아제 BamHI와 선형을 이루며, 말단을 클레노브 폴리머라제로 채웠다. 두 유전자를 수미식(head-to-tail) 삽입으로서 배열한다.
실시예 2
Zwf 및 Mdh 효소의 과발현에 의한 솔비톨로부터의 숙신산 생산
악티노바실러스 숙시노겐스 균주(FZ53; FZ53/pLS88; FZ53/p830.60; FZ53/pPISTONS1 및 FZ53/p856.78)를 2ℓ의 배양 배지를 함유하는 발효 용기(뉴 브런즈윅에 소재한 바이오플로(Bioflo) III)에서 배양시켰다. 배양 배지는 120g/ℓ 솔비톨, 30g/ℓ(고체), 옥수수 침지액(CSL)(ADM으로부터의 10 내지 12% 고체), 1.6g/ℓ Mg(OH)2, 0.2㎎/ℓ 바이오틴, 0.5g/ℓ 베타인 HCl, 0.2㎎/ℓ MSG, 6.5mM 인산나트륨, 7g/ℓ Na2CO3, 0.5g/ℓ 효모 추출물(AG900)을 함유하였다.
발효기와 동일한 배지(Mg(OH)2는 생략함)에서 배양시킨 바이알 배양물로부터 6.25% 접종물로 발효기를 접종하였고, 38℃에서 13시간 동안 150 rpm에서 지속적으로 진탕하면서 인큐베이션시켰다.
접종시킨 발효기를 380 rev/분으로 교반하고, 0.025 내지 0.05 vvm CO2의 살포와 함께 38℃에서 인큐베이션시켰다. 발효 배지의 pH를 6M Mg(OH)2의 자동 첨가 또는 120g/ℓ에서 MgCO3의 첨가에 의해 pH 6.8에서 유지시켰다.
탄소 공급원 공급물을 15 g의 추가적인 탄소 공급원이 발효 용기에 첨가되는 동안인 12 내지 22시간에 보충하였다.
당 및 유기산 결정:
샘플을 간격을 두고 발효기로부터 제거하였고, 고체를 10,000×g에서 4분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 분석 전 0.2μM 필터를 통해 상청액을 여과시켰다. 배양 상청액 내 당 및 유기산 농도 및 여과액을 HPLC(애질런트(Agilent) 1200 시리즈)에 의해 결정하였다. 애미넥스(Aminex) HPX-87H(300㎜×7.8㎜) 컬럼(바이오-래드(Bio-Rad))를 1.4㎖/분의 유속으로 0.013 N H2SO4로 이루어진 이동상에 의해 사용하였다. 분석물 피크를 검출하였고, 굴절률 검출기(워터스(Waters) 2414))를 사용하여 정량화하였으며, 피크의 확인을 시그마(Sigma)로부터 구입한 유기산 표준 용액에 대한 기준에 의해 결정하였다. 이하의 표 1은 솔비톨에서 성장시킨 다수의 악티노바실러스 숙시노겐스 형질전환체의 발효 평가를 나타낸다.
발효 성능
균주 지정 작제물 역가(g/ℓ) 생산성(g/ℓ-h) 수율(g 숙신산/g 당) n=
FZ53 벡터 없음 109.23±2.50 2.83 ±0.12 0.99±0.02 3
FZ53 PLS88 빈벡터 107.00±2.01 2.77 ±0.06 0.97±0.01 3
FZ53 p830.60 zwf 113.08 0.85 2.70±0.17 1.03±0.01 3
FZ53 pPISTONS1 mdh 120.53±0.33 2.20±0.14 1.10±0.01 2
FZ53 p856.78 zwf;mdh 120.72±1.98 2.50±0.11 1.12±0.02 6
숙주에 의해 과발현된 유전자를 함유하지 않은 "빈" 벡터(pLS88)를 지니는 악티노바실러스 숙시노겐스의 형질전환은, 솔비톨이 탄소 공급원이었을 때, 숙신산 발효 성능에 유의하게 영향을 미치지 않았다. 단일 유전자로서 zwf 유전자 또는 mdh 유전자(각각 벡터 p830.60 및 pPISTONS1) 중 하나의 과발현은 숙신산 수율을 증가시켰다. Mdh 효소의 과발현에 의해 가장 높은 수율이 얻어졌지만, 이 높은 수율은 생산성의 비용을 증가시켰는데, 이는 Zwf 발현 균주, 즉 미형질전환 모체 및 빈 벡터를 지니는 형질전환체에서보다 이 형질전환체에서 더 낮았다.
zwf 및 mdh 유전자의 공동발현은 또한 고수율을 야기하였지만(mdh 형질전환체에 대해 관찰된 것과 동일함), 또한 증가된 생산성을 뒷받침하였다(zwf 형질전환체와 유의하게 상이하지 않음.
Zwf 및 Mdh 효소의 공동발현은, 솔비톨이 탄소 공급원일 때, 높은 생산성, 수율 및 역가를 지니는 숙신산의 형성을 촉진한다는 것을 증명한다.
실시예 3
Zwf 및 Mdh 효소의 과발현에 의한 글루코스로부터의 숙신산 생산
실시예 1에 기재한 악티노바실러스 숙시노겐스 균주(FZ53; FZ53/pLS88; FZ53/p830.60; FZ53/pISTONS1 및 FZ53/p856.78)를 배양 pH를 유지하기 위해 보틀에 6 g MgCO3로 사전장전한 변화와 함께 실시예 2에 기재한 바와 같은 동일 배지 내 50㎖ 혐기성 바이알에서 배양시켰다. 동일한 씨딩 바이알로부터 바이알을 2.5㎖(5% v/v 접종물)로 접종시켰다. 바이알을 150 rev/분에서 일정하게 진탕하면서 38℃에서 인큐베이션시켰다.
배양물 여과액의 분석을 실시예 2에 기재한 바와 같이 수행하였다. 분석 결과의 예는 다음과 같다(46시간에 계산함): FZ53 pLS88은 역가 80.0g/ℓ, 생산성 1.74g/ℓ-h, 및 수율 0.76 g 숙신산/g 당을 달성하였고; FZ53 p830.60(Zwf)은 역가 100.6g/ℓ, 생산성 2.19g/ℓ-h, 및 수율 0.89 g 숙신산/g 당을 달성하였으며; FZ53 pPISTONS1(Mdh)은 역가 80.2g/ℓ, 생산성 1.87g/ℓ-h, 및 수율 0.77 g 숙신산/g 당을 달성하였고; FZ53 p878.56(Zwf + Mdh)은 역가 110.0g/ℓ, 생산성 2.16g/ℓ-h, 및 수율 0.96 g 숙신산/g 당을 달성하였다. 또한 글루코스 상의 악티노바실러스 숙시노겐스 형질전환체의 발효 평가 결과를 요약하는 표 2를 참조한다.
균주 작제물 개선[%]
n=3 　 역가 생산성 수율
FZ53/pLS88 빈 벡터 100.0 100.0 100.0
FZ53/p830.60 Zwf 110.7 111.2 107.9
FZ53/pISTONS1 Mdh 102.6 102.8 100.0
FZ53/p856.78 Zwf + Mdh 117.5 114.0 122.4
글루코스로부터 숙신산의 생산성과 수율이 증가함에 따라 Zwf의 과발현이 유리하게 되는 것을 확인하였지만, Mdh 단독의 과발현은 어떤 유리한 영향도 나타내지 않았다. 수율이 증가함에 따라 Zwf 및 Mdh의 공동발현은 Zwf 단독의 발현 이상으로 유리함 제공한 반면, 숙신산 생산성을 유의하게 감소시키지 않았다. 추가적인 관찰을 이하에 제공한다.
악티노바실러스 숙시노겐스를 사용한 숙신산 생산은 혐기성 생산 과정이다. 유기체는 자연적 숙신산 생산자이다. 생산은 H2 또는 더 많이 환원된 물질(예를 들어, 솔비톨 또는 만니톨)로 배양물의 보충에 의해 자극되는데, 이는 환원력(NADPH)이 악티노바실러스 숙시노겐스에서 숙신산 생산을 제한하였다는 것을 시사한다. 이를 염두에 두고, Zwf(NADPH를 직접 만들고, 글루코스를 펜토스 포스페이트 경로 또는 엔트너-듀도로프 경로로 전환시키는 효소)를 악티노바실러스 숙시노겐스에서 과발현시켰다. 이 개입은 수율에 대해 숙신산 발효 성능을 증가시켰다. 따라서, 펜토스 포스페이트 경로 또는 엔트너-듀도로프 경로를 통한 당분해 경로로부터 글루코스의 전환(및 세포내 NADPH 풀의 증가)은 숙신산 생산에 유리하였다.
악티노바실러스 숙시노겐스의 생화학적 연구 및 이콜라이를 생산하는 숙신산과 비교는 포스포엔올 피루베이트의 숙신산으로 전환에 연루된 효소(포스포엔올 피루베이트 데카보실라제, 말레이트 탈수소효소, 푸마라제 및 푸마레이트 환원효소)가 악티노바실러스 숙시노겐스에서 고도로 발현되었다는 것을 증명하였으며, 이는 숙신산을 축적하는 악티노바실러스 숙시노겐스의 엄청난 능력 뒤의 메커니즘을 시사한다. 특히, 말레이트 탈수소효소 활성은 악티노바실러스 숙시노겐스에서 매우 높은 것으로 발견되었으며 - 이는 이콜라이에서보다 10배 초과였다(2100n㏖/분/㎎ 단백질, 참고, 160n㏖/분/㎎ 단백질(Van der Werf, Arch. Microbiol., 167, 332-342 (1997)). 따라서, 말레이트 탈수소효소 활성은 악티노바실러스 숙시노겐스에서 숙신산의 생산을 제한하는 것으로 예상되지 않았다. 사실, Mdh만의 과발현은 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 이종성 Mdh를 결여하는 대조군 미생물유기체와 비교하여 역가, 생산성, 또는 수율을 유의하게 개선시키지 못했다. 표 2를 참조한다. 이 관찰은 악티노바실러스 숙시노겐스의 생화학적 연구 후 도출된 결론을 확인하는 것으로 나타났으며, Mdh는 그것의 자연적으로 높은 내인성 활성의 결과로서 악티노바실러스 숙시노겐스 내 숙신산의 생산에서 반응률 제한 단계가 아니었다.
Mdh 과발현 단독에 대한 생화학적 조사 및 표 2에 보고된 데이터를 기반으로, 악티노바실러스 숙시노겐스에서 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(zwf)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 말레이트 탈수소효소(mdh)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 이점이 예상되지 않았다.
그러나, 악티노바실러스 숙시노겐스 균주를 과발현시키는 Zwf의 특성규명동안, HPLC 부산물 프로파일에서 피크는 놀랍게도 Zwf 과발현과 관련되고, 과발현에 의해 증가된 것을 관찰하였다. 피크는 데카복실레이트가 용이하게 이합체화되고, 말레이트로 전환되는 매우 불안정한 화합물인 옥살로아세테이트에 대응되는 것으로 결정되었다. 이는 예상치못하게, Zwf가 악티노바실러스 숙시노겐스에서 과발현될 때, Mdh가 숙신산 생산에서 제한적인 효소가 되며, 이는 그것의 기질(옥살로아세테이트)의 축적을 야기한다는 것을 시사한다. 특정 이론에 구속되지 않고, 부산물로서 옥살로아세테이트의 구성은 탄소 유동을 전환시키는데, 이는 발효의 숙신산 수율을 감소시킨다. 따라서, 생화학적 시험관내 연구와 반대로, Mdh 활성은 악티노바실러스 숙시노겐스에서 높으며, 생체내 효소 활성은 예상치못하게 제한된다는 것을 증명하였다. Zwf와 조합으로 Mdh의 과발현은 제한을 극복하며, 옥살로아세테이트의 축적을 회피하고, 숙신산의 수율을 증가시킨다.
이 예는 Zwf와 Mdh의 공동발현이 글루코스가 탄소 공급원으로서 사용될 때 단일 효소 중 하나의 발현 이상의 이점을 제공한다는 것을 증명한다. Mdh는 앞서 악티노바실러스 숙시노겐스에 의한 숙신산의 생산에서 활성을 제한하지 않는 것으로 나타났다. Mdh의 과발현은 Zwf가 또한 과발현될 때 악티노바실러스 숙시노겐스에 의한 숙신산 생산에서 개선된 성능을 야기한다는 것을 예상치못하게 발견하였다.
본 발명을 추가로 예시하기 위해 일부 추가적인 비제한적 실시형태를 이하에 제공한다.
일 실시형태에서, 재조합 미생물유기체는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소 효소를 발현시킨다. 일부 실시형태에서 단일 효소 또는 효소 둘 다는 유기체에 대해 이종성이다. 다양한 실시형태에서, 이종성 폴리뉴클레오타이드의 발현 또는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및/또는 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 과발현은 모(비변형, 매칭) 미생물유기체에서 관찰된 효소 활성과 비교하여 효소 활성에서 2배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 또는 250배, 또는 500배 초과의 증가를 야기한다.
다양한 양태에서 본 발명의 미생물유기체는 이종성 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않거나 또는 폴리뉴클레오타이드(들)를 과발현시키지 않는 다른 유사한 미생물유기체보다 많은 유기산을 생산한다(또는 유기산을 더 빨리 또는 더 효율적으로 생산한다). 다양한 실시형태에서, 미생물유기체는 동시에 프레임에서 이종성 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않거나 또는 폴리뉴클레오타이드(들)를 과발현시키지 않는 유사한 미생물유기체 이외의 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 15%, 적어도 17%, 적어도 20%, 적어도 25% 또는 적어도 30% 초과의 유기산을 생산한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 미생물유기체는 미변형 (모) 미생물유기체보다 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 15%, 적어도 17%, 적어도 20%, 적어도 25%, 또는 적어도 30% 더 양호한 생산성 수준을 증명한다. 대안적으로 또는 추가로, 미생물유기체는 미변형 (모) 미생물유기체와 비교하여 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 15%, 적어도 17%, 적어도 20%, 적어도 25% 또는 적어도 30%의 수율 증가를 증명한다.
다른 실시형태에서, 효소는 둘 다 악티노바실러스 숙시노겐스로부터 발현된다. 또 다른 실시형태에서, 효소는 둘 다 이콜라이로부터 발현된다. 또 다른 실시형태에서, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소는 이콜라이로부터 암호화되고, 말레이트 탈수소효소는 악티노바실러스 숙시노겐스에 의해 암호화된다. 유전자 조합은 반대로 될 수 있다. 다른 실시형태에서, Zwf 및 Mdh를 발현시키는 미생물유기체는 파스퇴렐라 패밀리의 구성원을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 미생물유기체는 악티노바실러스 숙시노겐스와 90% 초과의 rRNA 서열 동일성을 갖는 악티노바실러스 숙시노겐스, 비스가드 탁손 6 및 비스가드 탁손 10 또는 미생물유기체를 포함한다. 이들 유전자를 발현시키는 숙주 세포는 악티노바실러스 숙시노겐스일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 유전자는 별개의 유기체에서 발현될 수 있지만, 유기체는 둘 다 유기산을 생산하는 발효 배지에 포함된다. 일 실시형태에서 유기산은 숙신산 또는 프로피온산이다.
일부 실시형태에서, 조질의 폴리올은 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 미생물유기체를 성장시키는 발효 브로스 또는 배지는 옥수수침지액, 베타인, 나트륨, 마그네슘 이온 및 이들의 조합을 포함한다.
펜토스 포스페이트 경로(또는 엔트너-듀도로프 경로) 및 환원적 트라이-카복실산 사이클에 사용되는 효소 발현의 개시내용은 단일 효소 단독보다 증가된 유기산의 생산을 초래한다.
본 출원은 본 대상 문제의 어떤 적응 또는 변화를 다루도록 의도된다. 예를 들어, zwf 및 mdh를 공동발현시키는 단일 재조합 유기체로서 주로 기재되었지만, zwf 및 mdh를 각각 발현시키는 다수의 유기체가 유기산 생산을 초래하는 단일 발효 과정에 포함될 수 있다는 것이 생각될 수 있다. 본 발명은 재조합 미생물의 표현형 특징을 보유하는 본 명세서에 기재된 미생물유기체의 변이체 또는 자손을 포함한다. 본 명세서에 기재된 미생물유기체의 실질적으로 순수한 단일배양(즉, 원하는 미생물유기체의 적어도 80% 또는 적어도 90%를 포함하는 배양물)이 또한 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE MICHIGAN BIOTECHNOLOGY INSTITUTE Guettler, Michael Jadhav, Sachin Kleff, Susanne Hanchar, Robert <120> RECOMBINANT MICRORGANISMS FOR PRODUCING ORGANIC ACIDS <130> 32236/40000A <150> US-61/708,998 <151> 2012-10-02 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1781 <212> DNA <213> Actinobacillus succinogenes <220> <221> misc_feature <223> Zwf gene <400> 1 gtcgacccgc ctcggcagaa ccggcgaatg ggacaccgcc gccggcgaac tgttactgga 60 agagctgggc ggtaacgcgc tggacgagca ctatcaaccg ctcacctata atcaacggga 120 aacctttgtc aatcctgatt tcgtcatcac tgccgatgcc tcggtaaact ggaaaaacgt 180 ctttcaattt aatttgcctt agctattaga ttttttagcg gaattcaggc attattaacc 240 gactattttc cagataagga ttaggataaa aatgaaagca gaaaataatt gtatcgtgat 300 tttcggcgca tcaggggatc tgacgcaccg taaattaatt cccgcactct ataatcttta 360 caaaatcgga cggttggaag aaaacttctc cgtgctggga gtggcccgca cagaaatgac 420 ggatgacatt ttccgtgaaa aaatgcgaac cgccctgatt acccaagaaa atgccgaagg 480 cgaaacgctg gataaattct gttctcatct gtattaccag gcggtaaaca cctccgattc 540 ggcggattac gtaaagttac tgcctcgttt ggatgaatta cacgacaaat accaaacctg 600 cggcaatacg ctttattatc tatccactcc gccgagcctg tacggcgtta ttccggaatg 660 cctggcggct cacggcttaa atacggaaga attcggctgg aaacggatta tcgtggaaaa 720 accgttcggt tacgatatta aaaccgccaa agcactggat attcagattc accgtttctt 780 cgaggaacac cagatttacc gtatcgacca ttatttgggc aaagaaaccg tgcaaaatct 840 gttggtgctg cgattctcca acggcctgtt cgaaccgctt tggaaccgta acttcatcga 900 ttacgtagaa atcaccggcg cggaagagat cggcgtagaa caacggggcg gctattatga 960 cggttccggt gcaatgcggg atatgttcca aaaccactta ttgcaagtat tggcaatggt 1020 tgccatggaa ccgccggcga ttattaacgc cgattccatg cgtgacgaaa ccgccaaagt 1080 gctctattgt ctgcatccgt tgaccacgga agatctcaaa cacaatctgg tattagggca 1140 atacacggcc tccaccgttg acgataaacc ggtgaagggt tatctggagg aagcgggcgt 1200 gccgtccgat tccggcaccg aaacctacat ggcgttgcgc tgccaaatcg ataactggcg 1260 ctgggccggc gtgccgtttt acgtgcgcac cggtaaacgc ctgccgaccc gggtgacgga 1320 aatcgtcatt catttcaaaa ccacgccgca cccggtattc agccaaaatg cgccggataa 1380 caaattaatc atccgtatcc aaccggacga aggcatttcc atgttcttcg gtttgaaaaa 1440 accgggagcc ggcttcgagg ctaaagaagt atccatggat ttccgttatg cggatatcag 1500 ttcttccgct aatttattaa ccgcctacga acgtttactg cttgacgcca tgaaaggcga 1560 cgccacatta ttcgcccgta ccgacgccgt tcacgcctgc tggaaattcg tgcagccgat 1620 tttggattac aaggaaaacc aaggtcgcgt ttacgaatat gaagccggca cccggggacc 1680 ggtggaagcg gataaactta tcgcccgtga aggacgcgta tggcgcagac cttcgggctc 1740 catgaagaaa aaagcgtaaa ccttacctgg tatgaggatc c 1781 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> Actinobacillus succinogenes <220> <221> MISC_FEATURE <223> Zwf protein <400> 2 Met Lys Ala Glu Asn Asn Cys Ile Val Ile Phe Gly Ala Ser Gly Asp 1 5 10 15 Leu Thr His Arg Lys Leu Ile Pro Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Lys Ile 20 25 30 Gly Arg Leu Glu Glu Asn Phe Ser Val Leu Gly Val Ala Arg Thr Glu 35 40 45 Met Thr Asp Asp Ile Phe Arg Glu Lys Met Arg Thr Ala Leu Ile Thr 50 55 60 Gln Glu Asn Ala Glu Gly Glu Thr Leu Asp Lys Phe Cys Ser His Leu 65 70 75 80 Tyr Tyr Gln Ala Val Asn Thr Ser Asp Ser Ala Asp Tyr Val Lys Leu 85 90 95 Leu Pro Arg Leu Asp Glu Leu His Asp Lys Tyr Gln Thr Cys Gly Asn 100 105 110 Thr Leu Tyr Tyr Leu Ser Thr Pro Pro Ser Leu Tyr Gly Val Ile Pro 115 120 125 Glu Cys Leu Ala Ala His Gly Leu Asn Thr Glu Glu Phe Gly Trp Lys 130 135 140 Arg Ile Ile Val Glu Lys Pro Phe Gly Tyr Asp Ile Lys Thr Ala Lys 145 150 155 160 Ala Leu Asp Ile Gln Ile His Arg Phe Phe Glu Glu His Gln Ile Tyr 165 170 175 Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Leu Leu Val 180 185 190 Leu Arg Phe Ser Asn Gly Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Arg Asn Phe 195 200 205 Ile Asp Tyr Val Glu Ile Thr Gly Ala Glu Glu Ile Gly Val Glu Gln 210 215 220 Arg Gly Gly Tyr Tyr Asp Gly Ser Gly Ala Met Arg Asp Met Phe Gln 225 230 235 240 Asn His Leu Leu Gln Val Leu Ala Met Val Ala Met Glu Pro Pro Ala 245 250 255 Ile Ile Asn Ala Asp Ser Met Arg Asp Glu Thr Ala Lys Val Leu Tyr 260 265 270 Cys Leu His Pro Leu Thr Thr Glu Asp Leu Lys His Asn Leu Val Leu 275 280 285 Gly Gln Tyr Thr Ala Ser Thr Val Asp Asp Lys Pro Val Lys Gly Tyr 290 295 300 Leu Glu Glu Ala Gly Val Pro Ser Asp Ser Gly Thr Glu Thr Tyr Met 305 310 315 320 Ala Leu Arg Cys Gln Ile Asp Asn Trp Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe 325 330 335 Tyr Val Arg Thr Gly Lys Arg Leu Pro Thr Arg Val Thr Glu Ile Val 340 345 350 Ile His Phe Lys Thr Thr Pro His Pro Val Phe Ser Gln Asn Ala Pro 355 360 365 Asp Asn Lys Leu Ile Ile Arg Ile Gln Pro Asp Glu Gly Ile Ser Met 370 375 380 Phe Phe Gly Leu Lys Lys Pro Gly Ala Gly Phe Glu Ala Lys Glu Val 385 390 395 400 Ser Met Asp Phe Arg Tyr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Ala Asn Leu Leu 405 410 415 Thr Ala Tyr Glu Arg Leu Leu Leu Asp Ala Met Lys Gly Asp Ala Thr 420 425 430 Leu Phe Ala Arg Thr Asp Ala Val His Ala Cys Trp Lys Phe Val Gln 435 440 445 Pro Ile Leu Asp Tyr Lys Glu Asn Gln Gly Arg Val Tyr Glu Tyr Glu 450 455 460 Ala Gly Thr Arg Gly Pro Val Glu Ala Asp Lys Leu Ile Ala Arg Glu 465 470 475 480 Gly Arg Val Trp Arg Arg Pro Ser Gly Ser Met Lys Lys Lys Ala 485 490 495 <210> 3 <211> 1558 <212> DNA <213> Actinobacillus succinogenes <220> <221> misc_feature <223> mdh gene <400> 3 gaattcccga agcgttcctg cgcgagtaac gctttaaaaa cctgtaatag gttatctgtt 60 ttattgtcgg tcataaatag aaatatatca gtttttaagt cgaaatattg cataaattct 120 gcataaaaat tcaaaattaa tcaataaaaa tttaagttta ttgtgatttg agcgttttcg 180 aaaaataaat gataaaaact tgttttagat cgtaaaaata gatgaatatt taattgagtt 240 tcattttttt tcttcgtaaa atctacccag ttcaagttat taatattatc gaggagtatc 300 tcatgaaagt aaccttatta ggcgccagcg gcggtatcgg tcaacctctt tcattgttgt 360 taaaattaca tcttccggca gaaagcgatt taagcttata cgatgttgcg ccggtcaccc 420 ccggtgtggc gaaagacatc agccatattc cgacttcggt tgaagtggaa ggtttcggcg 480 gcgatgatcc gtccgaggca ttaaaagggg cggatatcgt tttaatctgt gcgggtgtgg 540 cgcgtaagcc gggtatgact cgtgcggatt tgtttaatgt taacgccggt attatccaga 600 atttagtgga aaaagttgcg caagtttgcc cgcaggcttg tgtttgcatt atcactaatc 660 cggtgaactc gattattccg attgcggcgg aagtgctgaa aaaagcgggc gtatacgata 720 aacggaaatt attcggtatt actacgctgg ataccatccg ttccgaaaaa tttatcgtgc 780 aagcgaaaaa tattgaaatc aaccgtaacg atatttcagt tatcggcgga cattcaggtg 840 tgacgatttt acctttgttg tcacaaattc cgcatgtgga atttaccgag caggaattaa 900 aagatttaac tcaccgcatc caaaatgccg gcaccgaagt ggtagaagct aaagccggtg 960 cgggttccgc tacactttcc atggcgtatg cggcaatgcg ttttgtggtt tccatggctc 1020 gcgcattaaa cggcgaagtg attacggaat gcgcctatat tgaaggcgac ggtaaattcg 1080 cccgtttctt tgcacaaccg gttcgtttgg gtaaaaacgg cgtagaagaa attctgccgt 1140 taggtacatt aagcgcattt gagcaacaag cgcttgaagc gatgttaccg accttgcaaa 1200 ctgacattga taacggtgtg aaatttgtta ccggcgaata attcaccaaa ataatttaac 1260 aaaaccgatt aaaggattag gtttttatgc aaacctaatc ctttttgttt ggtatcaatc 1320 agttaaaatc cgccgtttga ttaatgggaa gctatataag attttagtat tttatataga 1380 taaaaatagc gtggaagaaa taaagtaatc ctccacgcgt cttctcaaaa tgtataaaaa 1440 gtgcggtcaa aaattaatcg attttttatt catcctcgtt tcttggcggt ttaatcgcca 1500 gtaaattaca ttttaactta ctgataacat gttcggcggt gttgcctaac aggaattc 1558 <210> 4 <211> 312 <212> PRT <213> Actinobacillus succinogenes <220> <221> MISC_FEATURE <223> mdh protein <400> 4 Met Lys Val Thr Leu Leu Gly Ala Ser Gly Gly Ile Gly Gln Pro Leu 1 5 10 15 Ser Leu Leu Leu Lys Leu His Leu Pro Ala Glu Ser Asp Leu Ser Leu 20 25 30 Tyr Asp Val Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Lys Asp Ile Ser His 35 40 45 Ile Pro Thr Ser Val Glu Val Glu Gly Phe Gly Gly Asp Asp Pro Ser 50 55 60 Glu Ala Leu Lys Gly Ala Asp Ile Val Leu Ile Cys Ala Gly Val Ala 65 70 75 80 Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Ala Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly 85 90 95 Ile Ile Gln Asn Leu Val Glu Lys Val Ala Gln Val Cys Pro Gln Ala 100 105 110 Cys Val Cys Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Ser Ile Ile Pro Ile Ala 115 120 125 Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Arg Lys Leu Phe 130 135 140 Gly Ile Thr Thr Leu Asp Thr Ile Arg Ser Glu Lys Phe Ile Val Gln 145 150 155 160 Ala Lys Asn Ile Glu Ile Asn Arg Asn Asp Ile Ser Val Ile Gly Gly 165 170 175 His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Ile Pro His Val 180 185 190 Glu Phe Thr Glu Gln Glu Leu Lys Asp Leu Thr His Arg Ile Gln Asn 195 200 205 Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Ala Gly Ser Ala Thr 210 215 220 Leu Ser Met Ala Tyr Ala Ala Met Arg Phe Val Val Ser Met Ala Arg 225 230 235 240 Ala Leu Asn Gly Glu Val Ile Thr Glu Cys Ala Tyr Ile Glu Gly Asp 245 250 255 Gly Lys Phe Ala Arg Phe Phe Ala Gln Pro Val Arg Leu Gly Lys Asn 260 265 270 Gly Val Glu Glu Ile Leu Pro Leu Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu Gln 275 280 285 Gln Ala Leu Glu Ala Met Leu Pro Thr Leu Gln Thr Asp Ile Asp Asn 290 295 300 Gly Val Lys Phe Val Thr Gly Glu 305 310 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequences <220> <223> Artificial Zwf primer <400> 5 aaaggatcct cataccaggt aaggtttac 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequences <220> <223> Artificial Zwf primer <400> 6 aaagtcgacc cgcctcggca gaaccggcg 29 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequences <220> <223> Artificial Mdh primer <400> 7 ccgaattccc gaagcgttcc tgcgcgag 28 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequences <220> <223> Artificial Mdh primer <400> 8 aagaattcct gttaggcaac accgccg 27 <210> 9 <211> 491 <212> PRT <213> Escherichia coli <300> <308> UniProtKB/Swiss-Prot / P0AC53.1 <309> 2013-09-18 <313> (1)..(491) <400> 9 Met Ala Val Thr Gln Thr Ala Gln Ala Cys Asp Leu Val Ile Phe Gly 1 5 10 15 Ala Lys Gly Asp Leu Ala Arg Arg Lys Leu Leu Pro Ser Leu Tyr Gln 20 25 30 Leu Glu Lys Ala Gly Gln Leu Asn Pro Asp Thr Arg Ile Ile Gly Val 35 40 45 Gly Arg Ala Asp Trp Asp Lys Ala Ala Tyr Thr Lys Val Val Arg Glu 50 55 60 Ala Leu Glu Thr Phe Met Lys Glu Thr Ile Asp Glu Gly Leu Trp Asp 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ala Arg Leu Asp Phe Cys Asn Leu Asp Val Asn Asp Thr 85 90 95 Ala Ala Phe Ser Arg Leu Gly Ala Met Leu Asp Gln Lys Asn Arg Ile 100 105 110 Thr Ile Asn Tyr Phe Ala Met Pro Pro Ser Thr Phe Gly Ala Ile Cys 115 120 125 Lys Gly Leu Gly Glu Ala Lys Leu Asn Ala Lys Pro Ala Arg Val Val 130 135 140 Met Glu Lys Pro Leu Gly Thr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn 145 150 155 160 Asp Gln Val Gly Glu Tyr Phe Glu Glu Cys Gln Val Tyr Arg Ile Asp 165 170 175 His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Leu Asn Leu Leu Ala Leu Arg Phe 180 185 190 Ala Asn Ser Leu Phe Val Asn Asn Trp Asp Asn Arg Thr Ile Asp His 195 200 205 Val Glu Ile Thr Val Ala Glu Glu Val Gly Ile Glu Gly Arg Trp Gly 210 215 220 Tyr Phe Asp Lys Ala Gly Gln Met Arg Asp Met Ile Gln Asn His Leu 225 230 235 240 Leu Gln Ile Leu Cys Met Ile Ala Met Ser Pro Pro Ser Asp Leu Ser 245 250 255 Ala Asp Ser Ile Arg Asp Glu Lys Val Lys Val Leu Lys Ser Leu Arg 260 265 270 Arg Ile Asp Arg Ser Asn Val Arg Glu Lys Thr Val Arg Gly Gln Tyr 275 280 285 Thr Ala Gly Phe Ala Gln Gly Lys Lys Val Pro Gly Tyr Leu Glu Glu 290 295 300 Glu Gly Ala Asn Lys Ser Ser Asn Thr Glu Thr Phe Val Ala Ile Arg 305 310 315 320 Val Asp Ile Asp Asn Trp Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg 325 330 335 Thr Gly Lys Arg Leu Pro Thr Lys Cys Ser Glu Val Val Val Tyr Phe 340 345 350 Lys Thr Pro Glu Leu Asn Leu Phe Lys Glu Ser Trp Gln Asp Leu Pro 355 360 365 Gln Asn Lys Leu Thr Ile Arg Leu Gln Pro Asp Glu Gly Val Asp Ile 370 375 380 Gln Val Leu Asn Lys Val Pro Gly Leu Asp His Lys His Asn Leu Gln 385 390 395 400 Ile Thr Lys Leu Asp Leu Ser Tyr Ser Glu Thr Phe Asn Gln Thr His 405 410 415 Leu Ala Asp Ala Tyr Glu Arg Leu Leu Leu Glu Thr Met Arg Gly Ile 420 425 430 Gln Ala Leu Phe Val Arg Arg Asp Glu Val Glu Glu Ala Trp Lys Trp 435 440 445 Val Asp Ser Ile Thr Glu Ala Trp Ala Met Asp Asn Asp Ala Pro Lys 450 455 460 Pro Tyr Gln Ala Gly Thr Trp Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Met Ile 465 470 475 480 Thr Arg Asp Gly Arg Ser Trp Asn Glu Phe Glu 485 490 <210> 10 <211> 312 <212> PRT <213> Escherichia coli <300> <308> UniProtKB/Swiss-Prot / P61889.1 <309> 2013-05-29 <313> (1)..(312) <400> 10 Met Lys Val Ala Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ala Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Lys Thr Gln Leu Pro Ser Gly Ser Glu Leu Ser Leu 20 25 30 Tyr Asp Ile Ala Pro Val Thr Pro Gly Val Ala Val Asp Leu Ser His 35 40 45 Ile Pro Thr Ala Val Lys Ile Lys Gly Phe Ser Gly Glu Asp Ala Thr 50 55 60 Pro Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Leu Ile Ser Ala Gly Val Ala 65 70 75 80 Arg Lys Pro Gly Met Asp Arg Ser Asp Leu Phe Asn Val Asn Ala Gly 85 90 95 Ile Val Lys Asn Leu Val Gln Gln Val Ala Lys Thr Cys Pro Lys Ala 100 105 110 Cys Ile Gly Ile Ile Thr Asn Pro Val Asn Thr Thr Val Ala Ile Ala 115 120 125 Ala Glu Val Leu Lys Lys Ala Gly Val Tyr Asp Lys Asn Lys Leu Phe 130 135 140 Gly Val Thr Thr Leu Asp Ile Ile Arg Ser Asn Thr Phe Val Ala Glu 145 150 155 160 Leu Lys Gly Lys Gln Pro Gly Glu Val Glu Val Pro Val Ile Gly Gly 165 170 175 His Ser Gly Val Thr Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gln Val Pro Gly Val 180 185 190 Ser Phe Thr Glu Gln Glu Val Ala Asp Leu Thr Lys Arg Ile Gln Asn 195 200 205 Ala Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Gly Gly Ser Ala Thr 210 215 220 Leu Ser Met Gly Gln Ala Ala Ala Arg Phe Gly Leu Ser Leu Val Arg 225 230 235 240 Ala Leu Gln Gly Glu Gln Gly Val Val Glu Cys Ala Tyr Val Glu Gly 245 250 255 Asp Gly Gln Tyr Ala Arg Phe Phe Ser Gln Pro Leu Leu Leu Gly Lys 260 265 270 Asn Gly Val Glu Glu Arg Lys Ser Ile Gly Thr Leu Ser Ala Phe Glu 275 280 285 Gln Asn Ala Leu Glu Gly Met Leu Asp Thr Leu Lys Lys Asp Ile Ala 290 295 300 Leu Gly Glu Glu Phe Val Asn Lys 305 310

Claims (25)

  1. (i) 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소를 과발현시키거나 또는 (ii) 이종성 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 이종성 말레이트 탈수소효소를 발현시키는 재조합 박테리아로서, 악티노바실러스 숙시노겐스(Actinobacillus succinogenes)의 16S 리보좀 RNA 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 지니는 16S 리보좀 RNA 서열을 포함하는 천연 숙신산 생산 박테리아인 재조합 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 악티노바실러스 숙시노겐스, 비스가드 탁손(Bisgaard Taxon) 6 또는 비스가드 탁손 10인 재조합 박테리아.
  3. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 천연이 아닌 혹은 과발현된 폴리뉴클레오타이드 및 말레이트 탈수소효소를 암호화하는 천연이 아닌 혹은 과발현된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 박테리아로서, 악티노바실러스 숙시노겐스의 16S 리보좀 RNA 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 지니는 16S 리보좀 RNA 서열을 포함하는 천연 숙신산 생산 박테리아인 재조합 박테리아.
  4. 제3항에 있어서, 악티노바실러스 숙시노겐스, 비스가드 탁손 6 또는 비스가드 탁손 10인 재조합 박테리아.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소는 악티노바실러스 숙시노겐스 효소인 재조합 박테리아.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소는 악티노바실러스 숙시노겐스 효소인 재조합 박테리아.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소는 이콜라이(E. coli) 효소인 재조합 박테리아.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소는 이콜라이 효소인 재조합 박테리아.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 박테리아.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말레이트 탈수소효소는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 박테리아.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아는 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 또는 말레이트 탈수소효소 효소를 단독으로 발현시키는 박테리아와 비교하여 개선된 유기산 생산을 나타내는 것인 재조합 박테리아.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아는 50g/ℓ 내지 150g/ℓ의 농도에서 숙신산을 생산할 수 있는 것인 재조합 박테리아.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 박테리아를 발효 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는, 유기산 생산 방법.
  14. 제9항의 재조합 박테리아를 발효 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는, 유기산 생산 방법.
  15. 제10항의 재조합 박테리아를 발효 배지에서 배양시키는 단계를 포함하는, 유기산 생산 방법.
  16. 탄소 공급원과 함께 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 및 말레이트 탈수소효소를 발현시키는 재조합 박테리아를 배양시키는 단계를 포함하되, 상기 효소들은 박테리아에 대해 천연이 아니거나 또는 미변형 모 박테리아에 비해 과발현되는 것인 유기산 생산 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유기산은 숙신산 또는 프로피온산인 유기산 생산 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 탄소 공급원은 글루코스 또는 폴리올인 유기산 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 유기산은 숙신산인 유기산 생산 방법.
  20. 탄소 공급원과 함께 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 상기 재조합 박테리아를 배양시키는 단계를 포함하는, 유기산 생산 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 유기산은 숙신산 또는 프로피온산인 것인 유기산 생산 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 탄소 공급원은 글루코스 또는 폴리올인 유기산 생산 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 유기산은 숙신산인 유기산 생산 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
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