JP4323553B2 - 新規アルドキシム脱水酵素およびその利用方法 - Google Patents
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Description
(1)以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質
(2)以下の(c)または(d)のDNAからなる遺伝子。
(c)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードするシュードモナス属に属する微生物由来のDNA
(3)上記(1)または(2)記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
(4)上記(3)記載のベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
(5)上記(4)記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からアルドキシム脱水酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、アルドキシム脱水酵素の製造方法。
(6)上記(4)記載の形質転換体をアルドキシム化合物に作用させてニトリル化合物を得ることを特徴とする、ニトリル化合物の製造方法。
1.アルドキシム脱水酵素
本発明にかかるタンパク質は、Pseudomonas chlororaphis B23株から単離されたアルドキシム脱水酵素(Aldoxim dehydratase)活性を有する新規タンパク質である。該タンパク質は、アルドキシム化合物を脱水して、対応するニトリル化合物に変換する「アルドキシム脱水酵素活性」を有する。
構造について:
(1)分子量は約76.2kDa、352アミノ酸残基からなる2つの同一サブユニットから構成されるホモダイマーである。
(2)酵素中にヘムを含むヘムタンパクである。
(3)還元条件下でのラマンスペクトルから予測される構造は、還元状態のデオキシミオグロビンや還元状態のホースラディッシュパーオキシダーゼに類似している。
(4)酵素中には、鉄以外の金属として、カルシウムが含まれる。
酵素活性について:
(1)酵素はヘムがフェロフェム(2価鉄)状態にあるとき触媒作用を示す。すなわち、酵素は還元状態で活性である。
(2)酵素活性にはFMNを必要としない(この点で、公知のBacillus属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素と異なる)。
(3)酵素活性は、ヒドロキシルアミン、硝酸銀により強い阻害を受ける。
基質特異性について:
基質としては、脂肪族アルドキシム、特にC1〜C6の脂肪族アルドキシムが好ましく、ブチルアルドキシムが最も好適である。芳香族アルドキシムに対してはほとんど酵素活性を示さない。
本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子は、前記アルドキシム脱水酵素タンパク質をコードする遺伝子である。より詳細には、アルドキシム脱水酵素タンパク質ホモダイマーの各サブユニットをコードする遺伝子である。
本発明の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の遺伝子を連結(挿入)して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本発明のDNAを発現できるのもであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ(Saccharomyces cervisiae)、チゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces. pombe)等の酵母、その他COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf19、Sf21等の昆虫細胞を挙げることができる。
本発明の酵素は、本発明の形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて、決定すればよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質を利用すれば、温和な条件下でアルドキシム化合物を対応するニトリル化合物に変換することができる。すなわち、本発明は、本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質または、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子を含む形質転換体を利用した、ニトリル化合物の製造方法を提供する。
Pseudomonas chlororaphis B23由来のニトリルヒドラターゼ系に関連する遺伝子のコーディング領域はクラスター化しており、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を中心として、その上流域にアミダーゼ遺伝子が、また下流域に約47kDaのニトリルヒドラターゼアクセリータンパク(P47K)、機能未知のOrfEが存在する(図9)。一方、大腸菌においてニトリルヒドラターゼを最大限に発現させるためには推定38kDaのタンパクが必要であることがわかっている(Nishiyama M. et al, (1991) J. Bacteriol. 173, p2465-2472)。そこで、アミダーゼ遺伝子の上流域より、前述のニトリルヒドラターゼ系遺伝子とクラスター化する分子量約38kDaのタンパクをコードするORFを探索した。
Maniatis T. らの方法(Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, N.Y.)に従い、oxdAの大腸菌における発現を試みた。
ニトリルヒドラターゼ遺伝子近傍の配列を含むプラスミドpPCN4を、これを含む大腸菌JM105/pPCN4株(寄託番号FERM BP-2779;特開平3−251184号)より、常法に従って調製した。
実施例1で選択されたoxdAの塩基配列を基に、以下のプライマーを合成し、pPCN4を鋳型としてPCRを行った。
Forward Primer:5'-CATATGGAATCTGCGATCGACACGC-3'(配列番号3)
Reverse Primer:5'-ACGCGTCGACTCAGGTGGGCGCGACAACGGC-3'(配列番号4)
PCR条件:94℃ 30sec、55℃ 30sec、68℃ 30sec を30サイクル
Forward PrimerはNdeI認識配列(下線部)を含み、oxdAの開始コドンから22塩基に対応する。Reverse Primerは、SalI認識配列(下線部)を含み、oxdA の3'末端の配列に相補的な21塩基に対応する。
得られた増幅断片はpUC18ベクターにサブクローニングし、DNA配列をABI Prism 310 genetic analyzer(Applied Biosystems製)を用いて確認した。次いで、このベクターをNdeIとSalIで切断し、pET-24a(+)(Novagen製)のNdeI-SalI領域に挿入し、得られたプラスミドをpET-oxdAと命名した。pET-oxdA中において、oxdAはT7プロモーターの支配下にある。
次いで、pET-oxdAを大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(ストラタジーン社)に導入し、得られた形質転換体を用いて発現実験を行った。形質転換体は50μg/mlカナマイシンと34μg/mlクロラムフェニコールを含む2×YT 培地240ml中37℃で振とう培養した。オーバーナイトで培養後、全培養物を同じ培地48Lに接種し、37℃で2時間振とう培養した。ここにIPTGを最終濃度0.1mMとなるように添加して、T7プロモーターを誘導し、さらに15℃で7日間培養した。
実施例2で得られたoxdA遺伝子産物の精製は、0-4℃で、5mM 2MEを含むリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて行った。まず、遠心(15,000×g、30分)により菌体を集め、1mMのジチオスレイトールを含む100mM緩衝液で2回洗浄し、ソニケーション(Insonator Model 201M:KUBOTA製)により菌体を破壊し、菌体を含まない抽出物を集めた。さらに遠心して残った菌体を取り除き、上清を硫酸アンモニウム(40〜60%)で分画し、10mM緩衝液に透析した。透析後の液は10mM緩衝液で等張化したDEAE-Sephacelカラム(5×25cm:Amersham Pharmacia製)に供し、KCl 0.1-0.4Mの直線グラジエントをかけた10mM緩衝液1.2Lでタンパクを溶出させた。
(1)SDS-PAGE
精製された酵素をSDS-PAGEに供した(図3)。分子量マーカーとしては、フォスフォリラ-ゼb(94kDa)、BSA(67kDa)、卵白アルブミン(43kDa)、炭酸脱水酵素(30kDa)、大豆トリプシンインヒビター(20.1kDa)、αラクトアルブミン(14.4kDa)を用いた。図3に示すように、oxdA遺伝子産物は約38kDaの分子量を示した。
次に、未変性の酵素の分子量をゲルろ過により確認した。精製された酵素は、AKTA Purifier(Amersham Biosciences製)に接続させたSuperose 12 HR10/30カラム(Amersham Biosciences製)にかけ、0.15M KClを含む100mM緩衝液を用いて0.5ml/minの流速で溶出した。溶出液の吸収は280〜422nmで記録し、スタンダード:グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(290kDa)、乳酸デヒドロゲナーゼ(142kDa)、エノラーゼ(67kDa)、アデニレートキナーゼ(32kDa)、およびチトクロームc(12.4kDa)の動きから酵素の分子量を測定した。その結果、未変性の酵素は76.4kDaの分子量を有することが確認された。この結果とSDS-PAGEによる結果から、oxdA遺伝子産物は2つの同一サブユニットから構成されることが示唆された。
反応用混合物として、全量200μl中に20μmolのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1μmolのブチルアルドキシム(東京化成製)、および適当量の酵素を含むものを用いた。反応はブチルアルドキシムを加えて開始させ、30℃、好気的条件下で5分間行った。100μlのIM KOHを加えて反応を止め、上清を遠心(10,000×g、5分)により集めた。反応生成物は、水素炎イオン化検出器とガスクロパック56(80/100%1メッシュ;GL-Science製)を充填したガラスカラム(3.2mm by 2.1m)を装備したガスクロマトグラフィー(GC-14BPF;SHIMAZU製)で解析した。
(1)ヘム染色
精製されたアルドキシム脱水酵素は溶液中で赤茶色をしており、酵素中にヘムの存在が予測されたため、未変性でのポリアクリルアミドゲル電気泳動後の酵素について、Klattらの方法(Klatt P. et al., J. Biol. Chem. 271, p7336-7342)にしたがってヘム染色を実施した。すなわち、泳動後のゲルを3,3'-ジメトキシベンチジン/H2O2およびクーマシーブリリアントブルーで染色した。いずれの染色においても、単一バンドが同じ位置に確認された。さらに、この酵素の吸収スペクトルをShimazu UV-1700 PharmaSpec (SHIMAZU製)を用いて測定したところ、415nmにヘムタンパクに特異的なピークが確認された(図4A)。
ヘムをピリジンヘモクロムに変換することにより、補欠分子の同定とヘムの定量を行った(Falk, J.E., (1964) Porphyrins and Metalloporphyrins, p.240, Elsevier, Amsterdam)。すなわち、酵素にピリジン(最終濃度20%)と少量のNa2S2O4を加え、15分後に生成するピリジンヘモクロムのスペクトルを測定した。図5に示すよう、418.5nm(Soret)、524nm(β-band)、556nm(α-band)の位置にピークが確認された。さらに、HCl-Aceton処理により補欠分子を抽出し、抽出物中のピリジンヘモクロムのスペクトルを測定したところ、得られたスペクトルは酵素中のピリジンヘモクロムのスペクトルと同じであった。
以下の方法により金属分析を行った。全てのガラス器具は2M HClで一晩洗浄し、使用前に蒸留水でよくすすいだ。分析に先立って、酵素は1mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に透析した。0.94mgタンパク/mlを含む酵素試料を高周波プラズマ発光分析装置ICPS-8000(27.120MHz:SHIMAZU製)を用いて分析した。酵素の金属含量は標準溶液から検量線を描くことによって求めた。その結果、ホモダイマーを形成している酵素は1モルあたり1.62モルの鉄を含むことが確認された。この結果から、本発明のアルドキシム脱水酵素は鉄とヘムを1:1の比率で含み、すべての鉄イオンはヘム分子中に存在すると考えられた。なお、測定されたヘム含量はタンパクより少ないが、これは精製工程中で一部のヘムが失われたことを示すものであった。同様の結果はバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素の精製工程についても報告されている。ちなみに、該酵素の精製工程では、最終的に酵素1モルあたり0.35モルのヘムしか検出されなかったことが報告されている(Kato Y. et al., (2000) Biochemistry 39, p800-809)。
表2に示すように、好気的条件下におけるアルドキシム脱水酵素は不活性な状態にあり、酵素の特異的活性は非常に弱いもの(0.758 units/mg)である。この精製された酵素にNa2S2O4を添加すると、415nmのピークが428nmにシフトし(図4A)、同時に酵素の特異的活性は250倍増加する。
以下の実験は、全てNa2S2O4による還元状態下で実施した。
(1)分子量の測定
0.15M KClと10mMのNa2S2O4を含む100mM緩衝液を用いる以外は実施例4と同様にして、Na2S2O4還元後の酵素について、その分子量をゲルろ過により求めた。その結果、酵素の分子量は76.2kDaと測定された。このことから、活性状態(すなわち、還元状態)にある酵素もまたホモダイマーであることが確認された。
Na2S2O4で還元後の酵素について室温でTRS-600/S single monochromator(日本分光製)を用いてラマンスペクトルを測定した。励起にはHe-Cdレーザーからの441.6nm lineを用い、ラマン散乱をレーザー光に対して垂直方向に集めた。分散するラマン散乱はCCD検出機:LN/CCD-1100PBUVAR(Princeton Instruments製)を用いて測定した。
酵素反応におけるアルドキシム消費量とニトリル生成量の関係を測定した。反応は、40μmolのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、2μmolのブチルアルドキシム、2μmolのNa2S2O4、1μg(12.5pmol)の酵素を含む反応混合物中、30℃、嫌気的条件下で行った。その結果、アルドキシム消費量とニトリル生成量は化学量論的関係にあることが確認された。
種々のアルドキシムを基質として酵素の脱水活性を調べた。なお、酵素活性の確認は、実施例5に記載した方法を基に、Na2S2O4(最終濃度5mM)を緩衝液に加え、還元条件下で嫌気的に実施した(標準アッセイ B)。結果を表3に示す。
pH4.0〜11.0の領域における酵素活性を調べた(図7)。その結果、最大の活性はpH5.5で得られ(図7A)、それ以外にはpH9.4で高い酵素活性が得られることが確認された(図7B)。これはバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素ではみられない特性である。さらに、酵素の最適温度は45℃であると確認された。
表4に挙げる種々の化合物について、酵素活性阻害効果を調べた。
ブチルアルドキシムの添加(最終濃度50mM)により、還元状態にある酵素(最終濃度mg/ml)のスペクトルがどのように変化するかを観察した。
配列番号4−人工配列の説明:プライマー
Claims (4)
- 以下の(a)もしくは(b)のタンパク質をコードする遺伝子または(c)もしくは(d)のDNAからなる遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、得られる培養物からアルドキシム脱水酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、アルドキシム脱水酵素の製造方法。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質
(c)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードするシュードモナス属に属する微生物由来のDNA - 以下の(a)もしくは(b)のタンパク質をコードする遺伝子または(c)もしくは(d)のDNAからなる遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体をアルドキシム化合物に作用させてニトリル化合物を得ることを特徴とする、ニトリル化合物の製造方法。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質
(c)配列番号1で表される塩基配列からなるDNA
(d)配列番号1で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードするシュードモナス属に属する微生物由来のDNA - 形質転換体をpH5〜10、温度20〜50℃、および嫌気的還元条件下でアルドキシム化合物に作用させることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- アルドキシム化合物が脂肪族アルドキシム化合物である、請求項2または3記載の方法。
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