KR20010111574A - 소르비톨 데하이드로게나제, 그를 코딩하는 유전자 및그의 용도 - Google Patents

소르비톨 데하이드로게나제, 그를 코딩하는 유전자 및그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 D-소르비톨 데하이드로게나제(SLDH)를 코딩하는 유전자, 이 유전자를 발현하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 SLDH를 제조하는 방법 및 상기 배양물을 사용하여 L-소르보스 및 2-케토-L-굴론산(2KLGA)를 제조하는 방법을 제공한다. 2KLGA는 L-아스코르브산 제조에 있어 중요한 중간체이다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 방법에 의해 수득된 2KLGA로부터 L-아스코르브산을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

소르비톨 데하이드로게나제, 그를 코딩하는 유전자 및 그의 용도{Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof}
L-소르보스는 Reichstein 방법에 의해 L-아스코르브산(비타민 C)을 합성하는데 있어 중요한 중간체이다(참조: 도 1). D-소르비톨이 화학적으로 산화되는 경우, 약 절반의 생성물이 D-소르보스로 되는 반면, D-소르비톨을 SLDH 활성을 갖는 미생물과 접촉시키는 경우에는 L-에난티오머만이 약 95%의 수율로 수득된다. 따라서, D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키기 위해 발효 방법이 통상적으로 사용된다.
한편, 2KLGA는 L-소르보스를 화학적으로 산화시킴으로써 공업적으로 합성된다. L-소르보스 데하이드로게나제(SDH) 및 L-소르보손 데하이드로게나제(SNDH)에 의한 2-단계 효소 산화반응에 의해 L-소르보스를 2KLGA로 전환시키는 미생물이 공지되어 있으나, 이러한 방법에 의해서는 2KLGA의 생산량이 낮다.
발효 방법에 의해 종전보다 더 효율적으로 2KLGA를 제조하는 방법으로서, SLDH 유전자를 분리한 후, 이 유전자를 SDH 또는 SNDH 활성을 갖는 미생물에 도입하여 D-소르비톨로부터 2KLGA를 합성할 수 있는 재조합 미생물을 수득하고, 이 미생물을 D-소르비톨과 접촉시킴을 특징으로 하는 방법이 언급되었다.
여러 타입의 SLDH가 분리되었다[참조:Agric. Biol. Chem., 46(1), 135-141 (1982);Biokhimiia, 43(6), 1067-1078 (1978);J. Biol. Chem., 224, 323 (1957);J. Biol. Chem., 226, 301 (1957);J. Bacteriol., 71, 737 (1956)]. 본 발명자들은 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)에 속하는 균주로부터 막-결합 형태로서 두개의 크고 작은 서브유니트로 구성되고 사이토크롬 c-형 폴리펩타이드와 결합하여 작용하는 SLDH를 코팅하는 유전자를 이미 분리하였다(국제 특허 공개공보 제 WO99/20763 호). 그러나, 상이한 타입의 SLDH 유전자를 클로닝하는 것에 대한 보고는 없었다.
따라서, 본 발명의 목적은 2KLGA의 발효 생산에 유용한 신규한 SLDH 유전자를 제공하고, 상기 유전자로 형질전환된 숙주 미생물, 특히 상기 유전자를 이미 SDH 및 SNDH 활성을 갖는 숙주에 도입하여 수득한 형질전환체, 또는 상기 유전자를 SDH 유전자 및 SNDH 유전자와 함께 도입하여 수득한 형질전환체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 사용하여 D-소르비톨로부터 L-소르보스 또는 2KLGA를 제조하는 방법 및 이러한 방법으로 수득한 2KLGA로부터 L-아스코르브산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 그밖의 다른 목적은 상기 SLDH 유전자로 형질전환된 숙주 미생물을 배양하여 재조합 SLDH를 제조하는 방법 및 이 SLDH를 사용한 효소 방법에 의해 L-소르보스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 신규한 소르비톨 데하이드로게나제(본 발명에서, 소르비톨 데하이드로게나제는 D-소르비톨을 산화에 의해 L-소르보스로 전환시키는 반응을 촉매할 수 있는 효소를 의미하며; 이후 SLDH로 언급된다), 그를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 사용하여 유전자 조작에 의해 L-소르보스 및 2-케토-L-굴론산(이후 2KLGA로 언급된다)을 제조하는 방법 및 상기 제조와 관련한 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 언급된 방법에 의해 수득한 2KLGA를 사용하여 L-아스코르브산 또는 그의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 L-아스코르브산을 합성하는 반응 도식을 나타낸다(여기에서 R은 알킬 그룹이다).
도 2는 플라스미드 pUCP19-B7SX2 및 pUCP19-HC의 DNA 삽입부의 제한 효소지도, 및 pUCP19-HC의 DNA 삽입부의 서열화 전략(sequencing strategy)을 나타낸다.
도 3은 플라스미드 pUCP19-SLDH의 유전자 지도를 나타낸다.
도 4는 발현 벡터 pSDH-tufB1-Eco-d9U의 유전자 지도를 나타낸다.
도 5는 발현 벡터 pBBR(Km)-SDH·SNDH의 유전자 지도를 나타낸다.
도 6은 발현 벡터 pBBR(Tc)-SDH·SNDH의 유전자 지도를 나타낸다.
도 7은 발현 벡터 pUCP19-SDH·SNDH의 유전자 지도를 나타낸다.
본 발명의 SLDH는 분자량이 약 54 kDa이고, D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 반응을 촉매하며, 조효소로서 NADP+또는 NAD+를 필요로하는 특징을 갖는 단백질이다. 이 효소는 소르비톨 이외에도 만니톨 및 아라비톨을 특이적으로 산화시키지만, 자일리톨, 리비톨, 이노시톨 및 글리세롤에는 작용하지 않는다.
본 발명의 SLDH는 상기 언급된 특성을 나타내는 한, 유래에 특별한 제한은없다. 이것은 천연적으로 존재하는 미생물, 자연 또는 인공 돌연변이체, 또는 이종(즉, 외래) SLDH 유전자를 도입하여 수득한 형질전환체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 아세트산 박테리아, 특히 글루코노박터 속, 더욱 바람직하게는 글루코노박터 옥시단스, 특히 글루코노박터 옥시단스 G624 균주(FERM BP-4415; 국제 특허 공개공보 제 WO95/23220) 유래의 SLDH가 예시된다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 SLDH는 그의 분자 진화에 있어서 글루코노박터 옥시단스 G624 균주로부터 유래된 SLDH가 기원된 것과 동일한 유전자로부터 기원된 SLDH이다. 본 원에 사용된 "그의 분자 진화에 있어서 ... 동일한 유전자로부터 유래된" 이라는 것은 DNA 서열, 생리학적 역할 등을 분석한 결과, 그의 분자 진화에 있어서 글루코노박터 옥시단스 G624 균주로부터 유래된 SLDH가 진화된 것과 동일한 유전자로부터 진화되었다고 합리적으로 판단된 SLDH를 의미하는 것으로, 그의 DNA 서열은 고도의 상동성을 나타낸다. 이들 SLDH는 글루코노박터 옥시단스 G624 균주로부터 유래된 SLDH와 DNA 서열에 있어서 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는다. 이후 상세히 설명되는 바와 같이, 이들 유전자는 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 DNA 서열을 기초로 하여, 적합한 프라이머를 사용하여 PCR 법에 따라, 또는 적합한 프로브를 사용하여 혼성화법에 따라 클로닝될 수 있다,
더욱 바람직한 양태에서, 본 발명의 SLDH는 서열 목록 SEQ ID NO:1에 표시된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 SLDH 활성이 손상받지 않는 한, 결실, 치환, 삽입, 부가 또는 변형된 1 내지 수개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.
본 발명의 SLDH는 (1) 출발물질로서 효소를 생산하는 세포 또는 조직의 배양물로부터 분리 및 정제하는 것을 특징으로 하는 방법, (2) 화학적으로 합성하는 방법, (3) SLDH를 발현하도록 유전자 재조합 기술에 의해 조작된 세포로부터 정제하는 것을 특징으로 하는 방법 등에 의해 적절히 수득할 수 있다.
천연 SLDH 생산 세포로부터 SLDH를 분리 및 정제하는 것은 예를 들어 하기 단계를 포함한다. 세포를 적합한 액체 배지에서 배양하고, 수득한 배양물로부터 SLDH 활성을 갖는 분획을 분리 및 회수한다. 예를 들어, 효소가 세포질에 편재해 있는 경우(본 발명의 SLDH는 NAD(P)+의존성이며, 세포질중에 편재화가 예측된다), 배양물을 원심분리 및/또는 여과하여 세포를 회수한 후, 세포를 초음파, 라이소자임(lysozyme) 처리, 삼투압 쇼크 등에 의해 파괴시키고, 약 10,000 내지 40,000 rpm으로 원심분리하여 상등액(가용성 분획)을 회수한다. 효소 단백질의 분리 및 정제를 위해 통상적으로 사용되는 분리 기술을 적절히 조합함으로써 수득한 가용성 분획으로부터 목적하는 SLDH를 정제할 수 있다. 이러한 분리 기술로는 예를 들어 염석, 용매 침전법 등과 같은 용해도 차를 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔 투과, 비-변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), SDS-PAGE 등과 같은 분자량 차를 이용한 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피 등과 같은 전하를 이용한 방법, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 특이적 친화성을 이용한 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등과 같은 소수성을 이용한 방법, 및 등전점 전기영동 등과 같은 등전점 차를 이용한 방법이 포함된다.
화학적인 합성에 의해 본 발명의 SLDH를 제조하는 방법은 예를 들어 서열 목록 SEQ ID NO:1에 표시된 아미노산 서열에 기초하여 각 서열의 전부 또는 일부를 펩타이드 합성기를 이용하여 합성하고, 수득한 폴리펩타이드를 적합한 재생 (renaturation) 조건하에서 재생시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 양태인 글루코노박터 옥시단스 G624로부터 유래된 SLDH는 비-생리학적 조건에서 매우 불안정한 효소이며, 상기 언급된 방법에 의해 정제하는 동안 불활성화될 수 있다. 이러한 효소는 히스티딘 태크법(histidine tag method), GST법 등에 따라 특정 기질에 대해 친화성을 갖는 부가/변형된 서열을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 신속히 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 SLDH를 수득하기 위한 특히 바람직한 방법은 이후 상세히 기술되는 바와 같이, 해당 효소를 갖는 세포 DNA로부터 효소를 코딩하는 DNA를 클로닝한 다음, 유전자 조작에 의해 금속 이온 킬레이트에 흡착할 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 상기 DNA에 부가하는 공정을 포함한다.
효소 유전자는 일반적으로 하기 방법으로 클로닝할 수 있다. 목적하는 효소를 이 효소를 생산하는 세포 또는 조직으로부터 상기 언급된 방법에 의해 완전히 또는 부분적으로 정제하고, N 말단 아미노산 서열을 Edman 방법으로 결정한다. 효소를 서열-특이적 프로테아제로 부분 분해시킨 다음, 수득한 올리고펩타이드의 아미노산 서열을 Edman 법으로 결정한다. 결정된 아미노산 서열에 상응하는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 이를 프라이머 또는 프로브로 사용하여, 효소를 생산할 수 있는 세포 또는 조직으로부터 제조된 RNA 또는 DNA로부터 상기 효소를 코딩하는 DNA를 PCR 법 또는 콜로니(또는 플라크) 혼성화 법에 의해클로닝한다.
또한, 완전 또는 부분 정제된 효소의 전체 또는 일부를 항원으로 사용하여 통상적인 방법에 의해 효소에 대한 항체를 제조하고, 효소를 생산할 수 있는 세포 또는 조직으로부터 제조된 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 효소를 코딩하는 DNA를 면역스크리닝에 의해 클로닝할 수 있다.
그러나, 정제가 어렵고 불안정한 효소, 예를 들어 글루코노박터 옥시단스 G624로부터 유래된 상기 언급된 SLDH의 경우에는, 그의 효소 활성을 마커로 사용하여, 게놈 DNA 라이브러리로부터 효소의 유전자를 그의 프로모터 서열을 함유하는 단편으로 스크리닝할 수 있다. SLDH는 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키기 때문에, 생성된 L-소르보스를 검출하여 SLDH 활성을 갖는 클론을 선택할 수 있다. 이 방법의 적용은 종종 기술적 어려움이 뒤따른다.
구체적으로, SLDH 활성을 갖는 세포 또는 조직으로부터 통상적인 방법에 의해 염색체 DNA를 분리하고, 적합한 제한 효소로 부분 분해시킨 후, 바람직하게는 염색체 DNA에 다수의 제한 부위를 갖는 제한 효소로 분해시킨 후, 수득한 단편을 적합한 클로닝 벡터에 삽입한다. 클로닝 벡터로서, 플라스미드 벡터, 파지 베턱 등이 예시된다. 큰 DNA 삽입물을 수용하고 콜로니로서 회수할 수 있기 때문에, 코스미드(cosmid) 벡터 및 차로미드(charomid) 벡터가 바람직하다. 파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용되는 경우, 시험관내 패키징(in vitro packaging)을 추가로 적용하여 게놈 DNA 라이브러리를 수득한다.
코스미드 라이브러리를 사용하는 경우, 적합한 지시 박테리아, 바람직하게는높은 형질전환능을 갖는 대장균 컴피턴트(competent) 세포를 상기 수득한 패키징 용액으로 감염시킨 후, 고체 배지상에 플레이팅하여 배양한다. 생성된 각각의 콜로니를 D-소르비톨을 함유하는 액체 배지에 개별적으로 접종시켜 배양한다. 배양 종료후, 배양 상등액을 회수하고, 예를 들어 케토헥소스에 의한 색 식별 반응, 예를 들어 레소신-염산 반응(참조: Cohen,J. Biol. Chem., 201, 71, 1953), 레소신-제2철염-염산 반응(참조:Kulka, Biochem. J., 63, 542, 1956) 등을 이용하여 SLDH 활성을 갖는 후보 클론을 선택한다.
예를 들어 HPLC 등에 의해 배양 상등액에서 소르보스를 검출하여 수득한 클론으로부터 SLDH 활성(D-소르비톨을 L-소르보스로 전환)의 존재여부를 확인한다.
코스미드 클론의 DNA 삽입물은 상당히 크기 때문에(35 내지 45 kb), 플라스미드로의 서브클로닝을 용이하게 하기 위하여 삽입 DNA의 비-SLDH 유전자 영역 부분을 제거하여 축소시키는 것이 바람직하다. DNA 삽입물을 축소시키기 위해, 예를 들어 차로미드 벡터 등으로의 서브클로닝이 사용된다. 차로미드 벡터는 다양한 길이의 스페이서(spacer) DNA를 갖기 때문에, 코스미드 벡터보다 작은 다양한 길이를 갖는 DNA가 클로닝될 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들어, 약 10 내지 20 kb DNA 삽입물을 허용할 수 있는 차로미드 벡터가 바람직하게 사용된다. SLDH 활성을 갖는 차로미드 클론이 상기 언급된 방법에 따라 선택될 수 있다.
플라스미드 벡터로 서브클로닝하는 것은 예를 들어 상기 언급된 바와 같이 수득한 복수개의 차코미드 클론을 제한효소 지도작성(mapping)에 적용하고, SLDH 유전자에 제한 부위를 갖지 않는 것으로 확인된 제한 효소를 사용하여 DNA 삽입물을 축소시킨 다음, 제한 효소 처리된 플라스미드 벡터와 결찰시킴으로써 수행될 수 있다.
또한, 상기 언급된 전략과는 별개로, PCR 법을 사용하여 본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA를 직접 클로닝할 수 있다. 즉, 효소 활성을 갖는 세포 또는 조직으로부터 유래된 게놈 DNA 또는 cDNA(또는 mRNA)를 템플레이트로 사용하고, 증폭 단편이 적합하게는 SLDH의 코딩 영역을 커버하는 한쌍의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 통상적인 방법에 따라 PCR을 수행하여 SLDH의 코딩 영역을 함유하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 이 방법은 공지 서열을 갖는 SLDH와 분자 진화에서 동일한 기원을 갖는 SLDH 유전자를 클로닝하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 글루코노박터 옥시단스 G624 균주로부터 유래된 SLDH와 분자 진화에 있어서 동일한 기원을 갖는 것으로 예상되는 박테리아로부터 유래된 SLDH 유전자를 클로닝하는 경우, 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 DNA 서열에 기초하여, 서열로부터 염기 번호 537-1991의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편과 고도의 상동성을 갖는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있는 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머를 작제하고, PCR 법을 수행한다. 목적하는 SLDH와 고도의 상동성을 갖는 SLDH의 DNA 서열이 미지인 경우, 예를 들어 5' 상류 영역에서 비교적 잘 보존된 일부 서열을 센스 프라이머로, 3' 하류 영역에서 비교적 잘 보존된 일부 상보(complementary) 스트랜드 서열을 안티센스 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하여 SLDH 유전자를 클로닝한다. SLDH의 상류 및 하류 서열이 미지인 경우, 일부 미스매치(mismatch)를 함유하는 템플레이트 DNA 및 사용되는 프라이머가 여전히 결합될 수 있도록 하기 위해 어닐링온도를 좀더 낮게 설정할 필요가 있다. 따라서, PCR 생성물은 목적 SLDH 유전자를 함유하는 단편과 비-특이적 증폭 단편의 혼합물일 수 있다. 이 경우, 수득한 증폭 단편을 적합한 클로닝 벡터(예를 들어, TA 클로닝을 위한 플라스미드 벡터 등)에 클로닝시킬 수 있다. 목적하는 증폭 단편이 프로모터 영역을 함유하지 않는 경우, 수득한 증폭 단편을 발현 벡터에 클로닝시켜 대장균과 같은 컴피턴트 세포를 형질전환시키고, SLDH 활성을 갖는 형질전환체를 상기 언급된 방법에 의해 스크리닝한다.
공지된 서열을 갖는 SLDH와 분자 진화에 있어 동일한 기원을 갖는 SLDH 유전자를 클로닝하는데 있어 상이한 전략으로서, 서던(Southern) 방법 등과 같은 혼성화 방법으로 직접 클로닝시킬 수 있는데, 이때 SLDH 활성을 갖는 세포 또는 조직으로부터 유래된 게놈 DNA 또는 cDNA(또는 mRNA)가 템플레이트로서 사용되고 공지된 DNA 서열의 전체 또는 일부가 프로브로서 사용된다. 혼성화 조건은 DNA의 기원에 따라 엄격성을 적절히 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 조건은 클로닝되는 미생물과의 밀접도 등에 기초하여 변화될 수 있으며, 예를 들어 염기 서열중 약 60% 이상의 상동성을 갖는 서열만이 혼성을 형성하거나, 염기 서열중 약 80% 이상의 상동성을 갖는 서열만이 혼성을 형성하는 것이다.
상기 언급된 방법으로 수득된 DNA 삽입물의 염기 서열은 공지된 서열화 기술, 예를 들어 Maxam-Gilbert 방법, 디데옥시 터미네이션(dideoxy termination) 방법 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA는 바람직하게는 서열 목록 SEQ ID NO:1에 표시된 아미노산 서열, 또는 상기 언급된 아미노산 서열에서 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 코딩한다(단, 돌연변이된 아미노산 서열로 구성된 단백질은 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 반응을 촉매할 수 있다). 더욱 바람직하게는, 본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA는 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 537-1991을 갖는 염기 서열로 실질적으로 구성된 DNA이다. 본 원에서 사용된 "실질적으로 구성된 DNA"는 특정 염기 서열로 구성된 DNA 및 엄격한 조건하에서 상기 특정 염기 서열로 구성된 DNA에 혼성화될 수 있는 염기 서열로 구성된 DNA로서, 상기 특정 염기 서열로 구성된 DNA에 의해 코딩된 단백질과 유사한 물리화학적 성질을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 의미한다. 본 원에서 "엄격한 조건(stringent condition)"은 염기 서열에서 약 60% 이상의 상동상을 갖는 DNA를 혼성화시킬 수 있는 조건을 의미한다. 엄격성은 혼성화 반응의 온도, 염 농도 등 및 세척을 적절히 변화시켜 조절할 수 있다.
본 발명의 또 다른 DNA는 또한 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 537-1991을 갖는 염기 서열 및 그의 부분 DNA에 혼성화될 수 있고 SLDH 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있는 염기 서열로 구성된 유전자를 포함한다. 따라서, 상기 유전자에 의해 코딩된 것으로 SLDH 활성을 갖는 단백질, 특히 글루코노박터 속으로부터 유래된 단백질이 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명의 DNA는 상기 언급된 게놈 DNA로부터 수득된 DNA, 또는 mRNA로부터 수득된 cDNA, 또는 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 537-1991을 갖는 염기 서열에 기초하여 화학적으로 합성된 DNA일 수 있다.
상기 언급된 인덱스로서 SLDH 활성을 갖는 게놈 DNA로부터 수득한 SLDH를 코딩하는 DNA는 5' 상류 영역에 프로모터 유전자 서열을 함유한다. 이 프로모터 유전자는 바람직하게는 적어도 하나의 미생물에 프로모터 활성을 갖는 DNA로서 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 1-536을 갖는 염기 서열, 또는 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 부가 또는 변형된 상기 염기 서열을 갖는다. 본 원에서 "미생물"로서는 바람직하게 박테리아(예를 들어 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스, 글루코노박터, 슈도글루코노박터, 아세토박터 등) 및 방선균과 같은 원핵생물 및 효모 등과 같은 특정의 진핵생물이 예시된다.
본 발명은 본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포의 각종 숙주 세포에서 복제/보존하거나 자율증식할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 플라스미드 벡터, 파지 벡터 등을 포함한다. 재조합 벡터는 당 분야에서 입수가능한 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 SLDH를 코딩하는 DNA를 적합한 제한 효소 부위를 사용하여 삽입시킴으로써 편리하게 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 재조합 벡터는 SLDH를 코딩하는 DNA가 특정 숙주 세포내에서 작용하는 프로모터의 조절하에 배치된 발현 벡터이다. 사용가능한 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포와 같은 각종 숙주 세포내에서 작용하는 프로모터 영역을 함유하고, 그의 하류에 배치된 유전자의 전사, 및 상기 유전자의 전사 종결 신호, 즉, 터미네이터(terminator) 영역를 조절할 수 있는 것이면 특별한 제한은 없으며, 이때 프로모터 영역 및 터미네이터 영역은 적어도 하나의 제한 효소 인식 부위, 바람직하게는 독특한 제한 부위를 함유하는 서열을 통해 결찰된다. 형질전환체의 선택을 위해 선택 마커 유전자를 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 바람직하다면, 이 발현 벡터는 각각 프로모터 영역의 하류 및 터미네이터 영역의 상류에 개시 코돈 및 중지 코돈을 함유할 수 있다.
박테리아가 숙주 세포로 사용되는 경우, 발현 벡터는 일반적으로 상기 언급된 프로모터 영역 및 터미네이터 영역 이외에 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있는 복제 단위를 함유할 필요가 있다. 프로모터 영역은 프로모터, 오퍼레이터 및 Shine-Dalgarno(SD) 서열을 포함한다. 예를 들어, 숙주가 대장균인 경우, 프로모터 영역으로서는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, lpp 프로모터, tac 프로모터 등이 예시되며, 숙주가 바실러스 서브틸리스인 경우, 프로모터 영역은 SP01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 포함한다. 터미네이터 영역으로서, 일반적으로 사용되는 천연 또는 합성 터미네이터가 사용될 수 있다. 선택 마커 유전자로서, 테트라사이클린, 암피실린, 카나마이신 등과 같은 각종 약제 내성 유전자가 사용될 수 있다. 개시 코돈으로서 ATG가 일반적으로 사용된다. 일부의 경우, GTG가 또한 사용될 수 있다. 중지 코돈으로서, 통상적인 TGA, TAA 및 TAG가 사용될 수 있다.
본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA는 효소를 생산하는 세포 또는 조직으로부터 유래된 게놈 DNA로부터 제조되고, 고유 프로모터 및 터미네이터 영역을 함유하는 형태로 수득되며, 본 발명의 발현 벡터는 형질전환되는 숙주 세포에서 복제/보존또는 자율 증식할 수 있는 공지된 클로닝 벡터의 적합한 부위에 DNA를 삽입하여 제조할 수 있다. 숙주가 박테리아인 경우 사용가능한 클로닝 벡터로는 대장균으로부터 유래된 pBR 벡터, pUC 벡터 등, 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 pUB110, pTP5 및 pC194 등이 예시된다.
본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터가 재조합 SLDH의 제조를 위해 사용되는 경우, 특히 SLDH가 매우 불안정하고 전형적인 정제법이 정제시 효소의 불활성화를 야기할 수 있는 경우, 하기와 같이 변형된 SLDH 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 변형된 SLDH 코딩 서열은 원래의 SLDH 아미노산 서열의 말단에 특정의 아미노산 서열이 부가되어 있는 SLDH를 발현시키기 위해서, SLDH의 정제를 촉진할 수 있는 특정의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열이 SLDH 코딩 서열의 말단에 부가되어 있는 서열을 포함한다. SLDH의 정제를 촉진할 수 있는 특정 아미노산 서열로는 금속 이온 킬레이트에 흡착될 수 있는 아미노산 서열, 바람직하게는 히스티딘, 라이신, 아르기닌 등과 같은 염기성 아미노산으로 구성된 서열, 더욱 바람직하게는 히스티딘으로 구성된 서열이 예시된다. 이러한 서열은 SLDH의 아미노 또는 카복실의 말단에 부가될 수 있으며, 카복실 말단에 부가되는 것이 바람직하다. 이렇게 변형된 SLDH 코딩 서열은 부가된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열이 고유 SLDH 코딩 서열의 말단 서열과 일치하는 염기 서열에 부가되어 있는 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 이를 프라이머의 하나로서 사용하고 SLDH DNA를 템플레이트로서 사용하여, PCR을 수행함으로써 작제될 수 있다. 생성된 재조합 SLDH는 이후 상세히 설명되는 바와 같이, 부가된 아미노산 서열을 흡착할 수 있는 금속 이온 킬레이트를 고정시키는 담체를 사용하여 신속히 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터가 2KLGA를 제조하는데 사용되는 경우, DNA 이외에 숙주 세포에서 발현을 허용하는 형태로 SDH 및/또는 SNDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터가 사용될 수 있다. SLDH를 코딩하는 DNA, SDH를 코딩하는 DNA 및 SNDH를 코딩하는 DNA는 상이한 프로모터의 조절하에 놓여질 수 있거나, 이중 2 이상은 동일한 프로모터의 조절하에 나란히 놓여질 수 있다.
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 제조할 수 있다. 숙주 세포는 사용되는 재조합 벡터에 적용될 수 있고 형질전환 될 수 있으면 특별히 제한되지 않으며, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 각종 세포, 예를 들어 천연 세포 또는 인공 제조된 돌연변이 세포 또는 재조합 세포가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 박테리아, 특히 대장균(예를 들어 DH5, HB101 등), 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 박테리아 속(예를 들어 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence등), 글루코노박터 속 박테리아(예를 들어 글루코노박터 옥시단스 등), 슈도글루코노박터 속 박테리아, 아세토박터 속 박테리아 등이 사용된다.
재조합 벡터는 종래 공지된 방법으로 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 숙주가 대장균, 바실러스 서브틸리스 등과 같은 박테리아인 경우, Cohen 등의 방법[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)], 프로토플라스트(protoplast) 법[참조:Mol. Gen. Genet., 168: 11(1979)], 컴피턴트법[참조:J. Mol. Biol., 56: 209 (1971)], 일렉트로포레이션(electroporation)법 등이 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 형질전환체는 본 발명의 SLDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현합 벡터로 형질전환된 숙주 세포이다. 형질전환체가 D-소르비톨로부터 2KLGA를 제조할 목적으로 제조된 경우, 숙주 세포는 L-소르보스를 2KLGA로 전환시킬 능력을 가져할 필요가 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 SDH 및 SNDH 활성을 제공한다. 이러한 천연 세포는 예를 들어 글루코노박터 속, 아세토박터 속, 슈도글루코노박터 속 등에 속하는 박테리아, 구체적으로, 글루코노박터 옥시단스 T-100 균주(FERM BP-4415; 국제 특허 공개공보 제 WO95/23220) 등이다. 인공적으로 제조된 세포는 예를 들어 상기 언급된 천연 박테리아로부터 분리된 SDH 및 SNDH를 코딩하는 DNA를 기능적으로 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 세포, 바람직하게는 대장균, 슈도모나스 속 박테리아, 글루코노박터 속 박테리아, 슈도글루코노박터 속 박테리아, 아세토박터 속 박테리아 등이다. 구체적으로, 대장균 JM109-pUC19SD5(국제 특허 공개공보 제 WO94/20609), 글루코노박터 옥시단스 NB6939-pSDH-tufB1, 글루코노박터 옥시단스 NB6939-pSDH-trp6, 글루코노박터 옥시단스 NB6939-pSDH-PL1, 글루코노박터 옥시단스 NB6939-pSDH-tac8(모두 국제 특허 공개공보 제 WO95/23220으로부터) 등이 예시된다.
본 발명의 형질전환체는 또한 상기 언급된 SLDH를 코딩하는 DNA 이외에, 숙주 세포에서 발현을 허용하는 형태로 SDH를 코딩하는 DNA 및/또는 SNDH를 코딩하는DNA를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 수득할 수 있다. 발현 벡터가 SDH를 코딩하는 DNA 및 SNDH를 코딩하는 DNA중 하나가 결여된 경우, 숙주 세포는 상기 DNA를 함유하는 상이한 발현 벡터와 함께 코트랜스펙션(co-transformed)될 수 있다.
본 발명의 재조합 SLDH는 상기 언급된 SLDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하고, 수득한 배양물로부터 SLDH를 수확함으로써 제조할 수 있다.
사용되는 영양 배지는 탄소 공급원으로서 글루코스 및 프럭토스와 같은 사카라이드, 글리세롤, 바람직하게는 L-소르보스 및 D-소르비톨을 함유한다. 영양 배지는 또한 무기 또는 유기 질소 공급원(예를 들어 황산암모늄, 염화암모늄, 카제인의 가수분해물, 효모 추출물, 폴리펩톤, 박토트립톤, 육즙 등)을 함유할 수 있다. 필요하다면, 다른 영양 공급원[예를 들어 무기염(예: 이인산나트륨, 이인산칼륨, 인산수소칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 염화칼슘), 비타민(비타민 B1), 항생제(예: 암피실린, 카나마이신) 등]이 배지에 첨가될 수 있다. 바람직하게, 배지는 성분으로서 D-소르비톨, 효모 추출물, CaCO3및 글리세롤을 함유한다. 배지의 당(D-소르비톨) 농도는 일반적으로 1 내지 50%, 바람직하게는 2 내지 40%이다.
형질전환체를 일반적으로 18 내지 40 ℃, 바람직하게는 20 내지 35 ℃, pH 5.5 내지 8.5, 바람직하게는 pH 6 내지 8에서 5 내지 150 시간동안 배양한다.
SLDH 활성을 갖는 분획에 따라 전형적으로 사용되는 각종 분리 기술을 적절히 조합하여 SLDH를 정제할 수 있다. 본 발명의 SLDH는 NAD(P)+의존성이기 때문에, 아마도 형질전환체의 가용 분획에 심하게 편재될 것이다. 이 경우, 배양 종료후, 배양물을 여과 또는 원심분리하여 세포를 회수한 후, 초음파, 라이소자임 처리 또는 삼투압 쇼크 등에 의해 파괴시켜 세포 추출물을 수득하여 사용한다.
재조합 SLDH가 특정의 아미노산 서열이 말단에 부가된 상기 언급된 형태로 제조되는 경우, 특정 아미노산 서열을 흡착할 수 있는 금속 이온 킬레이트를 고정시킨 담체를 사용하여 크로마토그래피(고정 금속 친화성 크로마토그래피; IMAC)를 포함한 처리에 의해 신속하고 용이하게 분리 및 정제할 수 있다. 사용되는 금속 이온 킬레이트 흡착제는 전이 금속(예를 들어 코발트, 구리, 니켈 및 철과 같은 2가 이온, 철, 알루미늄 등과 같은 3가 이온, 바람직하게는 코발트의 2가 이온)을 함유하는 용액을 리간드, 예를 들어 이미노디아세테이트 그룹, 니트릴로트리아세테이트 그룹, 트리스(카복시메틸)에틸렌디아민 그룹 등을 부착시켜 리간드와 결합하는 매트릭스와 접촉시켜 제조할 수 있다. 킬레이트 흡착체의 매트릭스 부분은 전형적인 불용성 담체라면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 L-소르보스 제조방법에 따라, SLDH를 코딩하는 상기 언급된 DNA를 함유하는 발현 벡터를 갖는 형질전환체를 적합한 배지중에서 배양하고, D-소르비톨을 수득한 배양물과 접촉시키거나, 또는 SLDH 활성이 형질전환체의 세포내 분획에 존재할 경우에는 그의 세포 추출물과 접촉시켜 L-소르보스를 제조한다. D-소르비톨을 배양물과 접촉시키는 방법은 D-소르비톨을 함유하는 배지에서 형질전환체를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 언급된 방법에 의해 수득된 L-소르보스를 사용한 2KLGA의 제조방법을 제공한다. 즉, L-소르보스를 2KLGA로 전환시킬 수 있는 숙주 세포, 바람직하게는 SDH를 코딩하는 DNA 또는 SNDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양하고, 상기 언급된 방법으로 수득한 L-소르보스를 수득한 배양물과 접촉시키거나, 또는 SDH 및 SLDH 활성이 숙주 세포의 세포내 분획에 존재할 경우에는 그의 세포 추출물과 접촉시켜 2KLGA를 제조한다. L-소르보스를 배양물과 접촉시키는 방법은 L-소르보스를 함유하는 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 2KLGA의 상이한 제조방법에 따라, 상기 언급된 SLDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 것으로, L-소르보스를 2KLGA로 전환시킬 수 있는 숙주 세포를 적합한 배지중에서 배양한 후, D-소르비톨을 수득한 배양물과 접촉시키거나, 또는 SLDH, SDH 및 SNDH 활성이 숙주 세포의 세포내 분획에 존재할 경우에는 그의 세포 추출물과 접촉시켜 2KLGA를 제조한다. D-소르비톨을 배양물과 접촉시키는 방법은 D-소르비톨을 함유하는 배지에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 L-소르보스 제조방법 및 2KLGA 제조방법에 사용되는 배지 및 배양 조건은 상기 언급된 SLDH 제조방법에 사용된 것과 동일하거나 부분적으로 상이할 수 있다.
D-소르비톨 또는 L-소르보스를 세포 추출물과 접촉시키는 경우, 배양 완료후 배양물을 원심분리 또는 여과하여 세포를 회수한 후, 아세테이트 완충액과 같은 적당한 완충액에 현탁시키고, 초음파 등에 의해 세포를 파괴시킨 다음, 원심분리 처리하여 세포 추출물로서 사용될 수 있는 상등액을 수득한다.
제조된 L-소르보스 또는 2KLGA는 일반적으로 사용되는 정제방법(예를 들어, 투석, 겔 투과, 적합한 흡착체상에서의 칼럼 크로마토그래피, 고성능 크로마토그래피 등)에 의해 반응 혼합물(형질전환체가 D-소르비톨 또는 L-소르보스를 함유하는 배지중에서 배양되는 경우에는 배양 상등액)로부터 정제할 수 있다.
정제된 2KLGA를 종래 공지된 방법으로 L-아스코르브산 또는 그의 염(예를 들알칼리 금속 또는 알칼리 토금속과의 염)으로 전환시킬 수 있다. 이 방법은 특별히 제한이 없으며, 염산과 같은 강산을 첨가하여 2KLGA를 가열하는 것을 포함하는 방법이 예시된다.
본 발명은 이후 실시예로 상세히 설명된다. 이들 실시예는 단지 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 한정하려는 것은 아니다.
실시예 : SLDH의 클로닝
(1) 염색체 DNA의 제조
글루코노박터 옥시단스 G624 균주(FERM BP-4415; 국제 특허 공개공보 제 WO95/23220)의 단일 콜로니를 2.5% 만니톨, 0.3% 폴리펩톤 및 0.5% 효모 추출물을 함유하는 배지(pH 6.0)중에, 37 ℃에서 48 시간동안 배양하였다. 원심분리(6,000 rpm, 10 분)에 의해 세포를 수집하고, 멸균수(1 ㎖)에 현탁시켰다. 현탁액을 STE 완충액[1 ㎖, 20% 수크로스 - 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0) - 1 mM EDTA]으로 희석하고, 라이소자임(2 ㎎)을 첨가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 30 분동안 방치시켰다. 여기에 사코실 용액[2.5 ㎖, 1% 라우로일사코실레이트 100 mM EDTA (pH 8.5)] 및 프로테이나제 K[최종 농도 100 ㎍/㎖]를 첨가하고, 혼합물을 50 ℃에서 2 시간동안 방치시켰다. 여기에 염화세슘(5.5 g) 및 5 ㎎/㎖ 에티듐 브로마이드(0.3 ㎖)를 첨가하고, 혼합물을 20 ℃에서 16 시간동안 50,000 rpm으로 초원심분리하였다. 염색체 DNA를 함유하는 부분을 분리하여 TE 완충액[30 ㎖, 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0) - 1 mM EDTA]에 용해시킨 후, 1 mM EDTA 5 ℓ로 2회 투석하였다. 투석액을 이소부탄올로 4회, 페놀로 2회, 클로로포름으로 3회 세척하고, 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 이것을 TE 완충액(10 ㎖)에 용해시켜 180 ㎍/㎖ 염색체 DNA 용액을 수득하였다.
(2) 코스미드 라이브러리의 제조
대장균 DH1/pcos6EMBL(ATCC 37571; Sumitomo Pharm International Co. Ltd.를 통해 ATCC로 부터 구입)을 50 ㎍/㎖ 카나마이신-함유 LB 배지[3 ㎖, 1% 폴리펩톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨(pH 7.4)]중에, 37 ℃에서 16 시간동안 배양하고, 이것의 0.5 ㎖를 500 ㎖ 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크에서 50 ㎍/㎖ 카나마이신-함유 LB 배지(50 ㎖)에 접종하였다. 배지를 37 ℃에서 8 시간동안 배양하고, 세포를 원심분리(6,000 rpm, 10 분)하여 수확하였다. 코스미드 pcos6EMBL을 QIAGEN 플라스미드 Midi Kit(QIAGEN)로 정제하였다. pcos6EMBL(25 ㎍)을 37 ℃에서 2 시간동안 50U BamHI로 분해하고, 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 이것을 37 ℃에서 1 시간동안 3U 송아지 장-유도된 알칼리성 포스파타제 (CIAP)로 탈포스포릴화시키고, 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 별도로, 상기 언급된 (1)에서 수득한 글루코노박터 옥시단스 G624 균주의 염색체 DNA(100 ㎍)를 37 ℃에서 1 분동안 5U Sau3AI로 부분 분해시키고, 에탄올 침전에 의해 정제하였다. pcos6EMBL의 BamHI 분해물(약 3 ㎍) 및 부분 분해물(약 1.5 ㎍)을 4 ℃에서 16 시간동안 3U T4 DNA 리가제로 결찰시켰다. 그의 일부분(3 ㎕)을 GIGAPACK II Gold Packaging Extract(STRATAGENE)를 사용하여 시험관내에서 패키징하였다. 이 패키징 용액을 SM 완충액[50 mM 트리스-HCl(pH 7.5) - 10 mM NaCl - 8mM MgSO4- 0.1% 젤라틴]으로 50-배 희석하여 그의 25 ㎕를 지시 박테리아(대장균 XL1-Blue MRA) 25 ㎕에 감염시키고, 50 ㎍/㎖ 카나마이신-함유 LB 플레이트상에 심은 후, 37 ℃에서 밤새 방치시켰다. 약 400 콜로니를 수득하였는데, 이는 약 40,000 콜로니의 코스미드 라이브러리가 수득되었음을 의미한다.
(3) SLDH 활성을 갖는 클론의 스크리닝
5% 소르비톨 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 0.9-배 희석된 LB 배지가 웰당 150 ㎕씩 들어있는 환저 96 웰 플레이트(Nalge)에서 368 코스미드 클론을 30 ℃에서 3 일동안 온화하게 진탕하면서 배양하였다. 원심분리(2,000 rpm, 10 분)후, 0.5 ㎎/㎖ 레소신-에탄올 용액(30 ㎕) 및 0.216 ㎎/㎖ 황산철(III) 암모늄-염산 용액(30 ㎕)을 배양물 상등액(20 ㎕)에 첨가하여 혼합물을 80 ℃에서 1 시간동안 가열하였다. 유사하게 반응시킨 배지 단독을 대조군으로 사용하고, 대조군 보다 더 짙은 갈색을 나타내는 1A4, 1A5, 4A9의 3 콜로니를 소르보스(프럭토스)의 전환 능력이 있는 클론으로서 선택하였다. 그의 배양 상등액을 HPLC[칼럼:Polyspher OA KC(E. Merck), 7.8×300 mm; 온도: 실온; 이동상: 0.01N H2SO4; 유량: 0.4 ㎖/분; 검출: RI]로 분석하고, 각 클론에 대해 소르보스를 검출하였다. 이에 따라, 이들 3 클론은 SLDH 활성을 갖는 것으로 판단된다. 이들 코스미드 클론의 삽입부 길이는 모두 약 40 kb이었다.
(4) 차로미드 벡터의 서브클로닝(삽입물의 축소)
SLDH 활성을 갖는 코스미드 클론 1A4(300 ng)를 37 ℃에서 1 시간동안 20 mU Sau3AI로 부분 분해시켰다. 차로미드 9-28(1 ㎍, Nippon Gene)을 37 ℃에서 1 시간동안 4U BamHI로 분해시켰다. 이들 두 용액을 혼합하여 에탄올 침전에 의해 정제하고, 2-배 희석 TE 완충액(5 ㎕)에 용해시킨 다음, 4 ℃에서 16 시간동안 1U T4 DNA 리가제로 결찰시켰다. 그의 1 ㎕를 GIGAPACK II XL Packaging Extract (STRATAGENE)를 사용하여 시험관내에서 패키징하였다. 이 패키징 용액(75 ㎕) 및 SM 완충액(75 ㎕)을 혼합하여 지시 박테리아(대장균 DH-1) 150 ㎕를 감염시키는데 사용하고, 50 ㎍/㎖ 암피실린-함유 LB 플레이트상에 심은 후, 37 ℃에서 하루동안 인큐베이션하였다. 출현된 콜로니중 95 콜로니를 5% 소르비톨 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 0.9-배 희석된 LB 배지가 웰당 150 ㎕씩 들어있는 환저 96 웰 플레이트(Nalge)에서 30 ℃에서 3 일동안 온화하게 진탕하면서 배양하였다. 원심분리 (2,000 rpm, 10 분)후, 0.5 ㎎/㎖ 레소신-에탄올 용액(30 ㎕) 및 0.216 ㎎/㎖ 황산철(III) 암모늄-염산 용액(30 ㎕)을 배양물 상등액(20 ㎕)에 첨가하여 혼합물을 80 ℃에서 1 시간동안 가열하였다. 유사하게 반응시킨 배지 단독을 대조군으로 사용하고, 대조군 보다 더 짙은 갈색을 나타내는 G1, C2, A4, B7, H10, B12의 6콜로니를 소르보스의 전환 능력이 있는 클론으로서 선택하였다. 이들 차로미드 클론의 삽입부 길이는 모두 약 15 kb이었다.
(5) SLDH 유전자의 플라스미드 벡터로의 서브클로닝
지금까지 수득한 클론의 제한 효소지도로부터, SLDH 유전자는 SacI 부위 또는 XbaI 부위를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 차로미드 B7 1 ㎍을 SacI 10U 및 XbaI 10U로 분해시켜 약 6 kb(B7SX3) 및 약 9 kb(B7SX2) SacI-XbaI 단편을 제조하였다. 이들 두 단편을 각각 대장균-슈도모나스 셔틀(shuttle) 벡터 pUCP19[pRO1614로부터 유래된 1.8 kb PstI 단편을 pUC19의 NarI 부위에 삽입하고 대장균 DH5 αF'(ATCC 87110)으로부터 정제하였다]와 결찰시키고, 일렉트로포레이션법에 의해 슈도모나스(이 균주는 이후 Pseudomonas sp. F-1으로 명명되었으며 이후 상기 명으로 언급된다)로 형질전환시켜 Ps./pUCP10-B7SX3 및 Ps./pUCP19-B7SX2를 수득하였다. 컴피턴트 세포 제조 및 형질전환 조건은 대장균에 대한 것과 같다. 이들 두 클론을 소르비톨을 함유하는 배지에서 배양하였다. 그 결과, Ps./pUCP19-B7SX2에서 소르보스 전환능이 관찰되었다. 따라서, Ps./pUCP19-B7SX2를 5% 소르비톨, 1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% 염화나트륨 및 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 배지(pH 7.4)중에, 30 ℃에서 4 일동안 배양하여 소르보스 2.4 ㎎/㎖를 수득하였다(전환 효율: 5%). 이 소르보스를 HPLC에 의해 분리하고, 표준 생성물과 체류 시간이 일치함을 확인하였다. HPLC를 상기 언급된 (3)과 동일한 조건하에서 수행하였다. GC/MS[칼럼: DB-5(J&W Scientific), 0.32 mm×30 m(필름 0.25 μm); 온도: 주입 = 230 ℃, 칼럼 = 100 ℃(5 분) → 10 ℃/분으로 10 분동안가열 →200 ℃(5 분) → 30 ℃/분으로 1 분동안 가열 → 230 ℃(4 분), 검출 = 230 ℃; 유량: 압력 조절 20 kPa(He)]을 사용하여 표준 생성물과 질량 패턴이 일치하는 것을 확인하였다.
(6) SLDH 유전자의 염기 서열 결정
SLDH 활성을 발현하는 슈도모나스, Ps./pUCP19-B7SX2의 형질전환체의 플라스미드 pUCP19-B7SX2의 삽입부의 제한 효소 지도는 도 2에 도시된 것으로 추정된다. pUCP19-B7SX2 1 ㎍을 37 ℃에서 1 시간동안 Hind III 10U로 분해시켜 약 4 kb Hind III-Hind III 단편을 수득하였다. 이 Hind III-Hind III 단편을 벡터 pUCP19와 결찰시키고, 플라스미드 pUCP19-HC를 작제하였다. 슈도모나스를 이 플라스미드로 형질전환시켜 Ps./pUCP19-HC를 수득하였다. 이 형질전환체를 소르비톨을 함유하는 배지에서 배양하였다. 그 결과, SLDH 활성의 발현이 확인되었다. 따라서, 이 Hind III-Hind III 단편은 완전한 길이의 SLDH 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이것의 약 4 kb Hind III-Hind III 단편의 염기 서열을 결정하였다. 첫째, pUCP19-HC의 삽입부를 약 1.1 kb SphI-SphI 단편(S1), 약 0.8 kb EcoRI-SphI 단편(ES) 및 약 1.3 kb EcoRI- EcoRI 단편(E1)(참조 도 2)으로 나누고, 각각을 pUC18로 서브클로닝하여 pUC18-S1, pUC18-ES 및 pUC18-E1을 수득하였다.
플라스미드 pUC19-HC, pUC18-S1, pUC18-ES 및 pUC18-E1을 템플레이트로서 사용하고 M13 서열화 프라이머인 유니버설(universal) 프라이머 및 역 프라이머(New England Labs.)를 사용하여 제 1 서열화를 수행하였다. 샘플을 BigDye Terminator Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems)로 형광 표지시키고, ABIPRISM 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems)로 분석하였다. 하기 11 종류의 프라이머가 합성되었으며, pUCP19-HC를 템플레이트로 사용하여 서열화를 수행한 후 약 4 kb Hind III-Hind III 단편의 염기 서열을 결정하였다(서열 목록 SEQ ID NO:2).
SLDH 유전자 서열화 프라이머
염기 서열을 분석한 결과, 1455 bp ORF가 확인되었다(염기 번호 537-1991). 따라서, SLDH는 485의 아미노산으로 구성되고, 분자량이 약 54 kDa인 것으로 추정된다. 상동성 조사결과, 슈도모나스 플루오로센스의 만니톨 데하이드로게나제와 42% 상동성을 나타내었다.
실시예 2 : 재조합 SLDH의 제조
(1) 히스티딘-tag(태그)를 갖는 SLDH(이후 His-태그된 SLDH로 언급)를 발현하는 플라스미드의 작제
재조합 단백질을 정제하는데 있어, 6×히스티딘을 사용한 태그 시스템은 매우 간단한 방법이다. 즉, 6 개의 히스티딘 태그를 갖는 단백질을 발현시키고, 금속(예를 들어 코발트, 니켈) 및 히스티딘 잔기의 상호작용을 이용하여 단백질을 IMAC로 분리하였다. 6×His를 SLDH의 C 말단측에 삽입시키기 위하여, 하기 두쌍의 프라이머를 각각 사용하였으며, pUCP19-HC(5 ng)를 템플레이트로서 사용하여, PCR을 pfu DNA 폴리머라제(2.5U)로 수행하였다(94 ℃, 30 초→55 ℃ 2 분→72 ℃, 2 분, 25 사이클). 프라이머(각 20 pmol)를 4 분동안 99 ℃로 가열하고, 사용전에 급냉시켰다.
PCR 1
프라이머 1(센스) [SLDH 코딩 서열에서 NheI 부위(하선부) 근처 서열과 일치하는 서열]
CGGATTGCTAGCGATGGC(서열 목록 SEQ ID NO:14)
프라이머 2(안티센스) [SLDH 코딩 서열의 3' 말단과 일치하는 서열, 6×His(H), 중지 코돈(*) 및 BamHI 부위(하선부) 함유]
ATCGAGGATCCTCA ATGATGATGATGATGATG GGCCGGGATGGCGGC
* H H H H H H
(서열 목록 SEQ ID NO:15)
PCR 2
프라이머 3(센스) [BamHI 부위(하선부) 및 SLDH 유전자의 중지 코돈 직후 서열과 일치하는 서열]
ATCGAGGATCCATTCGGCTTTTAGGGTAGC (서열 목록 SEQ ID NO:16)
프라이머 4(안티센스) [SLDH 유전자의 3' 비-코딩 영역에서 BglII 부위 근처의 서열과 일치하는 서열 및 SacI 부위(하선부) 함유]
TAGCTGAGCTCATGGGACAGATCTGAGC (서열 목록 SEQ ID NO:17)
PCR 1에서 특이적으로 증폭된 약 360 bp 단편을 NheI 및 BamHI로 분해하고, PCR 2에서 특이적으로 증폭된 약 100 bp 단편을 BamHI 및 SacI로 분해하였다. 별도로, pUCP19-HC를 Ba1II 및 PstI로 분해하여 수득한 약 2 kb 단편을 pUCP19의 BamHI-PstI 단편에 삽입하여 플라스미드 pUCP-SLDH를 수득하고(참조: 도 3), 삽입물의 BglII 부위의 하류를 제거하였다. 이것을 NheI 및 SacI로 분해하고, 수득한 약 6.2 kb 단편을 상기 언급된 두 PCR 증폭 단편과 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pUCP19-SLDH-His를 작제하였다. 슈도모나스를 이 플라스미드로 형질전환시켜 Ps./pUCP19-SLDH-His를 수득하였다.
(2) His-태그된 SLDH의 정제
형질전환체 Ps./pUCP19-SLDH-His의 동결보존 저장물 한 루프를 15 ㎖의 원심분리관(Corning)에서 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 배지(2 ㎖)에 접종하고, 30 ℃에서 16 시간동안 배양하였다. 그의 1.5 ㎖를 500 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르비톨 및 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 배지(50 ㎖)에 접종하고, 25 ℃에서 3 일동안 배양하였다. 원심분리(6,000 rpm, 4 ℃에서 5 분동안)하여 세포를 수확하고, 100 mM NaCl-함유 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 10 ㎖에 현탁시켰다. 현탁액을 초음파 호모지나이저(Tomy UD-201)로 5 분동안(50% 간격) 처리하고, 원심분리(15,000 rpm, 4 ℃에서 10 분동안)한 후, 상등액을 회수하여 세포를 함유하지 않는는 추출물을 수득하였다. TARON 수지(2 ㎖, CLONTECH)를 15 ㎖의 원심분리관 (Corning)에 도입하고, 100 mM NaCl-함유 20 mM 트리스-HCl(pH 8.0) 10 ㎖로 2회 세척하여 평형화시켰다. 상기 언급된 세포를 함유하지 않는 추출물(5 ㎖)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20 분동안 진탕하여 His-태그된 SLDH를 흡착시킨 다음, 100 mM NaCl-함유 20 mM 트리스-HCl(10 ㎖, pH 8.0)로 10 분간 3 회 세척하였다. 각각 10 mM, 30 mM, 50 mM 및 100 mM 이미다졸을 함유하는 100 mM NaCl-함유 20 mM 트리스-HCl 완충액(2 ㎖, pH 8.0)을 순차적으로 첨가하고, 실온에서 2 시간동안 진탕하여 His-태그된 SLDH를 용출시켰다. 그 결과, 30 mM-50mM 이미다졸 분획에서 SLDH 활성이 용출되었다. 이 분획을 SDS-PAGE 분석기에 적용하여 거의 단일 밴드를 검출하였다.
(3) N 말단 아미노산 서열 분석
상기 언급된 (2)에서 정제된 His-태그된 SLDH를 12.5%의 겔 농도를 갖는 멀티겔(Daiichi Pure Chemicals)을 사용하여 40 mA 전류로 1 시간동안 전기영동시키고, Horiz-Blot(Atto)를 사용하여 PVDF 막(Immobilon PSQ; Millipore) 상에 전사시켰다. 막을 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250으로 염색한 후, 약 55 kDa SLDH인 것으로 여겨지는 밴드를 한쌍의 가위로 절단했다. 이 PVDF 막을 단백질 시퀀서G100A(Hewlett-Packard) 및 PTH 분석기 1090(Hewlett-Packard)을 사용하여 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, SLDH의 ORF로부터 예상되는 N 말단 아미노산 서열과 일치하는 서열(MITRETLKSL; 서열 목록 SEQ ID NO: 18)을 얻었다.
(4) SLDH 활성의 확인
적용되는 세포를 함유하지 않는 추출물이 10 ㎖ 씩이고, His-태그된 SLDH 흡착후 수지를 6 회 세척하고, His-태그된 SLDH를 50 Mm 이미다졸 및 100 Mm NaCl-함유 20 Mm 트리스-HCl(5 ㎖, pH 8.0)로 용출시키는 것을 제외하고 상기 언급된 (2)와 동일한 방법으로 His-태그된 SLDH를 정제하였다. 수득한 His-태그된 SLDH를 소르비톨과 반응시키고, 생성물을 분석하였다. 반응 용액(2 ㎖)의 조성은 10 mM(1.82 ㎎/㎖) 소르비톨, 0.1 M 글리신/NaOH 완충액(pH 10.1), 5 mM NADP+및 His-태그된 SLDH 0.2 ㎖(41.1 ㎍ 단백질)이고, 반응을 25 ℃에서 24 시간동안 수행하였다. 그 결과, 소르보스 1.12 ㎎/㎖가 생성되었다(소르비톨은 0.70 ㎎/㎖ 남아 있었으며; 전환 효율은 62% 이다). 따라서, 코발트 타입 IMAC에 의해 정제된 His-태그된 SLDH는 소르비톨을 산화시키고 소르보스를 생성하는 소르비톨 데하이드로게나제인 것으로 확인되었다.
실시예 3 : SLDH의 특정화
(1) 조효소 의존성 및 활성 pH 범위
50 mM NAD+(또는 NADP+) 0/1 ㎖, 500 mM 완충액 0.2 ㎖, 실시예 2(4)에 따라제조된 His-태그된 SLDH 용액(2.1 ㎍ 단백질) 10 ㎕ 및 증류수(0.29 ㎖)를 함유하는 용액에 500 mM 소르비톨(0.4 ㎖)을 첨가하여 반응을 개시(25 ℃)시킨 후, NADH(또는 NADPH)의 증가를 분광광도계(UV-2200; Shimadzu)를 사용하여 340 nm에서의 흡광도를 인덱스로 하여 측정하였다. pH 10.1 및 pH 9.0을 갖는 반응 용액의 경우 글리신/NaOH 완충액이 사용되었고, pH 8.0 및 pH 7.0을 갖는 반응 용액의 경우 인산칼륨 완충액이 사용되었다. 효소 활성(1 단위)은 분당 1 μmol의 NADH(또는 NADPH)를 생성하는 양으로 정의된다. NAD(P)H의 분자 흡광계수는 6.3 mM-1㎝-1이었다. 단백질 양을 소 혈청 알부민(BSA)을 표준으로 사용하여 Lowry 법으로 측정하였다. 그 결과, SLDH는 NAD+및 NADP+둘 다를 조효소로 사용하였으며, NADP+가 더 높은 특이성을 나타내었다. 이 효소의 활성은 알칼리성 pH에서 더 높았다(표 1 참조).
표 1
조효소 pH 활성 (U/㎎ 단백질)
NADP+ 10.1 130.2
9.0 30.0
8.0 22.9
7.0 4.2
NAD+ 10.1 8.1
9.0 3.4
8.0 1.2
7.0 0.1
(2) 기질 특이성
반응 용액이 소르비톨 대신 각종 기질을 함유하고, 완충액이 글리신/NaOH 완충액(pH 10.1)이며, 조효소로서 NADP+를 사용하는 것을 제외하고 상기 언급된 (1)과 동일한 방법으로 SLDH 활성을 측정하였다. 그 결과, 이 효소는 소르비톨 이외에 만니톨 및 아라비톨을 기질로서 사용하였으나, 자일리톨, 리비톨, 이노시톨 또는 글리세롤에 대해서는 작용하지 않았다(표 2 참조).
표 2
기질 활성 (U/㎎ 단백질)
소르비톨 130.2
만니톨 85.7
아라비톨 88.1
자일리톨 0
리비톨 0
이노시톨 0
글리세롤 0
(3) 미카엘리스(Michaelis) 상수
소르비톨을 기질로 사용하여 상기 언급된 (2)에 따라 SLDH 활성을 측정하였다. 그 결과, 소르비톨에 대한 Km 값은 132 mM(25 ℃) 이었다.
실시예 4 : SNDH/SDH 발현 벡터를 갖는 슈도모나스 형질전환체의 제조 및 이 형질전환체에 의한 2KLGA 생산성 조사
Louisiana State University, Medical Center의 Kovach 박사에 의해 공급되는 광영 숙주 플라스미드[Gene, 166, 175 (1995)]인 pBBR 플라스미드 중에서, pBBR1MCS-2(카나마이신 내성) 및 pBBR1MCS-3(테트라사이클린 내성)을 벡터로 사용하여 슈도모나스 속 균주에 SNDH/SDH 유전자를 도입하고, 수득된 형질전환체에 의한 L-소르보스로부터 2KLGA의 발효 생산성을 조사하였다.
(1) SNDH/SDH 발현 광영 숙주 플라스미드 제조
tufB를 프로모터로 사용하여 SNDH/SDH 유전자를 함유하는 플라스미드 pSDH-tufB1-Eco-d9U(도 4 참조)(5 ㎍)를 37 ℃에서 1 시간동안 EcoRI(50U, Boehringer-Mannheim)로 분해하고, 0.8% 아가로스겔상에서 전기영동시킨 다음, SNDH/SDH 유전자를 함유하는 3.7 kb EcoRI/EcoRI 단편을 분리하였다. 이 단편을 pBBR1MCS-2의 EcoRI 부위에 삽입하였다. β-갈락토시다제 유전자로서 동일 방향으로 삽입된 플라스미드를 pBBR(Km)-SDH·SNDH로 취하였다(도 5 참조).
tufB를 프로모터로 사용하여 SNDH/SDH 유전자를 함유하는 플라스미드 pSDH-tufB1(10 ㎍, 작제 방법은 유럽 특허 공개 EP 0758679 A1에 개시되어 있다)를 37 ℃에서 1 시간동안 EcoRI(50U, Boehringer-Mannheim)로 분해하고, Klenow 단편 (Nippon Gene)을 사용하여 실온에서 30 분동안 처리하여 말단을 평활화시켰다. T4 DNA 리가제(TOYOBO)를 사용하여, 말단에 PstI 링커(GCTGCAGC, TOYOBO)를 결찰시키고, 37 ℃에서 1 시간동안 PstI(50U, Boehringer-Mannheim)로 분해시켰다. 이 분해물을 0.8% 아가로스겔로 전기영동시키고, SNDH/SDH 유전자를 함유하는 3.7 kb PstI/PstI 단편을 분리하였다. 이 단편을 pBBR1MCS-3의 PstI 부위에 삽입하였다. β-갈락토시다제 유전자로서 동일 방향으로 삽입된 플라스미드를 pBBR(Tc)-SDH· SNDH로 취하였다(도 6 참조).
(2) 슈도모나스의 컴피턴트 세포의 제조
슈도모나스 sp.F-1의 글리세롤 동결보존 저장물을 16.5×165 ㎜ 시험관에서1% 박토트립톤(Difco), 0.5% 효모 추출물(Difco) 및 1% 염화나트륨을 함유하는 L 배지(3 ㎖, pH 7.4)에 접종하고, 30 ℃에서 밤새 배양하였다. 배양액 전량을 500 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 L 배지(50 ㎖)에 접종하고, 25 ℃에서 6 시간동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 세포를 수확하고, 세포를 차거운 10 % 글리세롤 수용액(30 ㎖)으로 2 회 세척하였다. 세척 세포를 소량의 차거운 10 % 글리세롤 수용액에 현탁시키고, 60 ㎕ 씩 배분한 후, 액체 질소로 순간 동결시켰다.
(3) 슈도모나스의 형질전환
액체 질소에 동결보존한 슈도모나스 sp.F-1의 컴피턴트 세포를 빙수에서 해동시키고, 상기 언급된 (1)에서 작제된 SNDH/SDH 발현 광역 숙주 플라스미드 용액, pBBR(Km)-SDH·SNDH 및 pBBR(Tc)-SDH·SNDH를 각각 1 ㎕(약 1 ㎍) 씩 첨가한 다음, 4 ℃에서 30 분동안 방치시켰다. 이것을 전극간 거리가 0.1 ㎝인 큐벳에서 Gene Pulser 유전자 도입 장치(Bio-Rad)를 200 Ω, 1.8 kV, 25 μF의 조건하에 사용하여 형질전환시키고, 0.4% 글루코스를 함유하는 L 배지에 현탁시킨 후, 30 ℃에서 1 시간동안 진탕하였다. 이것을 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 L 아가 플레이트 및 20 ㎍/㎖ 테트라사이클린을 함유하는 L 아가 플레이트상에 심고 30 ℃에서 이틀동안 배양하여 형질전환체 Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH 및 Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH를 수득하였다.
(4) 형질전환체에 의해 소르보스로부터 2KLGA의 발효 제조
상기 언급된 (3)에서 수득한 형질전환체 Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH 및 Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH의 단일 콜로니를 각각 16.5×165 ㎜ 시험관에서 L 배지 5㎖에 접종하고, 30 ℃에서 이틀동안 배양하였다. 배양액(0.5 ㎖)을 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르보스, 0.1% 글루코스, 0.9% 박토트립톤(Difco), 0.45% 효모 추출물(Difco), 0.9% 염화나트륨 및 2% 탄산칼슘을 함유하는 2KLGA 생산용 배지(10 ㎖, pH 7.4)에 접종하고, 30 ℃에서 5 일동안 배양하였다. 배양액을 원심분리에 분리하고, 배양 상등액중의 소르보스, 소르보손, 2KLGA 및 L-이돈산을 정량적으로 측정하였다. 소르보스, 소르보손, 2KLGA 및 L-이돈산을 각각 하기 조건에서 HPLC에 의해 정량적으로 측정하였다.
[소르보스]
칼럼: Polyspher OA KC(7.8 ㎜ 내경 ×300 ㎜; Cica-MERCK)
이동상: 0.01N H2SO4
칼럼 온도: 실온
유량: 0.4 ㎖/분
검출: 차동 굴절계
[소르보손(후-칼럼 표지법)]
칼럼: Polyspher OA KC(7.8 ㎜ 내경 ×300 ㎜; Cica-MERCK)
이동상(표지화제): 0.04M 벤즈아미딘 하이드로클로라이드
0.25M 아황산칼륨
2 mM 붕산/0.1N 수산화칼륨
유량: 0.3 ㎖/분
검출: 형광 검출기(여기 파장: 315 nm, 검출 파장: 405 nm)
[2KLGA 및 L-이돈산]
칼럼: Capcell pak NH2(4.6 ㎜ 내경 ×250 ㎜; Shiseido)
이동상: 30% 아세토니트릴, 20 mM 인산칼슘(pH 3.0)
유량: 1.2 ㎖/분
검출: UV-210 nm
상기 결과, Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH에 의한 소르보스로부터 2KLGA로의 전환 효율은 약 18%이었고, L-이돈산으로의 전환 효율과 조합시 약 37%이었다. Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH에 의한 소르보스로부터 2KLGA로의 전환 효율은 약 26%이었고, L-이돈산으로의 전환 효율과 조합시 약 47%이었다(표 3 참조).
표 3
형질전환체에 의한 배양 결과(㎎/㎖)
형질전환체 소르보스 소르보손 2KLGA L-이돈산
Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH 12.5(25.0) 0.3(0.6) 8.9(17.8) 9.6(19.6)
Ps./pBBR(Tc)-SDH·SNDH 15.6(31.2) 0.15(0.3) 13(26.0) 10.3(20.6)
괄호안의 수치는 전환 효율(초기 소르보스 농도에 대한 생성물 %)이다.
비교를 위해, 비-형질전환체 슈도모나스 sp.F-1에 의한 2KLGA 및 L-이돈산의 생산을 또한 조사하였다. 슈도모나스 sp.F-1의 글리세롤 동결보존된 세포를 16.5×165 ㎜ 시험관에서 L 배지 5 ㎖에 접종하고, 30 ℃에서 하루동안 배양하였다. 배양액(1 ㎖)을 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르보스, 0.9% 박토트립톤(Difco), 0.45% 효모 추출물(Difco) 및 0.9% 염화나트륨을 함유하는 배지(10 ㎖, pH 7.4)에 접종하고, 30 ℃에서 3 일동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하고, 배양 상등액중의 소르보스, 소르보손, 2KLGA 및 L-이돈산을 상기와 유사하게 정량적으로 측정하였다. 그 결과, 소르보스가 소비되었으나(5.7 ㎎/㎖), 소르보손, 2KLGA 및 L-이돈산은 검출되지 않았다.
상기 결과로부터, 2KLGA 및 L-이돈산 비-생성 슈도모나스 sp.F-1에 SNDH/SDH 유전자를 도입시킴으로써 소르보스로부터 2KLGA 및 L-이돈산을 고도로 생산하는 형질전환체를 수득할 수 있다.
실시예 5 : SNDH/SDH 발현 벡터를 함유하는 슈도모나스 형질전환체의 제조 및 이 형질전환체에 의한 2KLGA 생산성 조사 - (2)
실시예 4와 동일한 방법으로, 슈도모나스 속에 속하는 상이한 균주[슈도모나스 IFO3309 균주; Institute for Fermentation, Osaka(17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka)에 의해 공급]를 숙주로 사용하여 형질전환체를 제조하고, SNDH/SDH 유전자를 도입한 후, 이 형질전환체의 2KLGA 및 L-이돈산의 생산성을 조사하였다.
(1) 슈도모나스 IFO3309 균주에 SNDH/SDH 유전자 도입
슈도모나스 IFO3309 균주의 글리세롤 동결보존된 세포를 실시예 4(2)와 동일한 방법으로 처리하여 컴피턴트 세포의 동결보존 세포를 제조하였다. 컴피턴트 세포를 액체 질소에 동결보존하고, 빙수에서 해동시킨 후, SNDH/SDH 발현 광역 숙주 플라스미드인 Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH 1 ㎕(약 1 ㎍) 용액을 첨가하고, 혼합물을 4 ℃에서 30 분동안 방치시켰다. 이것을 실시예 4(3)과 동일한 조건하에서 Gene Pulser 유전자 도입 장치(Bio-Rad)를 사용하여 형질전환시켜 형질전환체 Ps.IFO3309/pBBR(Km)-SDH·SNDH를 수득하였다.
(2) 형질전환체에 의한 2KLGA의 발효 제조
상기 (1)에서 수득한 Ps.IFO3309/pBBR(Km)-SDH·SNDH 한 루프를 16.5×165 ㎜ 시험관에서 2% 소르비톨 및 0.5% 효모 추출물(Difco)을 함유하는 배지(5 ㎖, pH 7.0)에 접종하고, 28 ℃에서 하루동안 배양하였다. 배양액(1 ㎖)을 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르비톨, 0.5% 효모 추출물(Difco), 0.2% 폴리펩톤(Wako Pure Chemical Industries), 0.1% K2HPO4, 0.5% MgSO4·7H2O 및 2% CaCO3를 함유하는 배지(10 ㎖, pH 7.0)에 접종하고, 28 ℃에서 7 일동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하고, 실시예 4(4)와 동일한 방법으로, 배양 상등액중의 소르비톨, 소르보스, 소르보손, 2KLGA 및 L-이돈산을 정량적으로 측정하였다. 비교를 위해, 비-형질전환체인 슈도모나스 IFO3309 균주를 동일한 조건하에서 배양하고, 배양 상등액중의 소르비톨, 소르보스, 소르보손, 2KLGA 및 L-이돈산을 정량적으로 측정하였다.
그 결과, 비-형질전환체에 의해 소르비톨이 소비되어(0.4 ㎎/㎖), 소르보스가 생산되었으나(3.9 ㎎/㎖), 소르보손, 2KLGA 및 L-이돈산은 검출되지 않았다. 한편, 형질전환체에 Ps.IFO3309/pBBR(Km)-SDH·SNDH에 의해 2KLGA(1.2 ㎎/㎖) 및 L-이돈산(0.5 ㎎/㎖)이 제조되었다(표 4 참조). 바꾸어 말하면, 이 숙주에 SNDH/SDH를 도입시킴으로써 슈도모나스 IFO3309가 2KLGA 또는 L-이돈산을 생산할 수 없는 조건하에서도 소르비톨로부터 2KLGA 및 L-이돈산을 제조할 능력이 부여됨을 확인할 수 있었다.
표 4
형질전환체에 의한 배양 결과(㎎/㎖)
형질전환체 소르보스 소르보손 2KLGA L-이돈산
Ps./pBBR(Km)-SDH·SNDH 0.41 1.8 1.2 0.5
실시예 6 : SLDH 발현 벡터 및 SNDH/SDH 발현 벡터가 도입된 슈도모나스 형질전환체에 의한 2KLGA의 생산
(1) SLDH 발현 벡터 및 SNDH/SDH 발현 벡터를 갖는 슈도모나스 형질전환체의 제조
상기 언급한 바와 같이, 글루코노박터 옥시단스 T-100(FERM BP-4188; 유럽 특허 공개공보 제 EP 0758679 A1)으로부터 유래된 SNDH/SDH 유전자를 pBBR1MCS-2에 혼입시켜 발현 벡터 pBBR(Km)-SDH·SNDH(도 5 참조)를 작제하였다. pBBR(Km)-SDH·SNDH를 일렉트로포레이션법에 의해 실시예 1(5)에서 수득한 재조합 슈도모나스 Ps./pUCP19-B7SX2에 도입시켜 Ps./pUCP19-B7SX2+pBBR(Km)-SDH·SNDH를 수득하였다.
(2) 슈도모나스 형질전환체에 의한 2KLGA의 제조
Ps./pUCP19-B7SX2+pBBR(Km)-SDH·SNDH를 5% 소르비톨, 1% 박토트립톤 (Difco), 0.5% 효모 추출물(Difco), 1% 염화나트륨, 50 ㎍/㎖ 암피실린, 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 2% 경질(light) 탄산칼슘을 함유하는 배지(pH 7.4)중에, 30 ℃에서 4 일동안 배양하여 1.1 ㎎/㎖의 2KLGA 및 1.7 ㎎/㎖의 이돈산을 수득하였다. 2KLGA를 HPLC에 의해 분리하고, 체류 시간이 표준 생성물과 일치함을 확인하였다.GC/MS를 사용하여 질량 패턴이 표준 생성물과 일치함을 확인하였다. HPLC 및 GC/MS는 실시예 1(3) 및 (5)와 동일한 조건하에서 수행하였다.
실시예 7 : 각종 슈도모나스 형질전환체의 제조
(1) Ps./pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH
슈도모나스 sp.F-1을 실시예 2(1)에서 작제한 pUCP19-SLDH로 형질전환시켜 Ps./pUCP19-SLDH를 수득하였다. 이 재조합 슈도모나스에 pBBR(Km)-SDH·SNDH를 추가로 도입하여 Ps./pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH를 수득하였다.
(2) Ps./pUCP19-SLDH-tufB+pBBR(Km)-SDH·SNDH
SLDH 유전자의 개시 코돈의 상류에 SspI 부위를 도입시키기 위하여, pfU DNA 폴리머라제(2.5U)를 사용하여 하기 프라이머의 존재하에서 pUCP19-SLDH(5 ㎍)를 템플레이트로 사용하여 PCR을 수행하였다(94 ℃, 30 초→55 ℃, 2 분→72 ℃, 2 분, 25 사이클).
센스 프라이머[SspI 부위(하선부) 및 SLDH 코딩 서열의 5' 말단과 동일한 서열 함유]
TAGGAATATTTCTCATGATTACGCGCGAAACCC(서열 목록 SEQ ID NO: 19)
안티센스 프라이머[SLDH 코딩 서열에서 EagI 부위의 하류 서열과 동일한 서열]
GATGCTTCAGCACGGC(서열 목록 SEQ ID NO: 20)
PCR에 의해 특이적으로 증폭된 약 360 bp 단편을 SspI 및 EagI로 분해하였다. pUCP19-SLDH를 PstI 및 EagI로 분해하여 약 5.7 kb 단편을 수득하였다. 이들 두 단편 및 tufB 프로모터를 함유하는 PstI-SspI 단편(서열 목록 SEQ ID NO: 21)을 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pUCP19-SLDH-tufB를 작제하였다. 슈도모나스를 이 플라스미드로 형질전환시켜 Ps./pUCP19-SLDH-tufB를 수득하였다. 추가로, SNDH/SDH 활성을 발현할 수 있는 pBBR(Km)-SDH·SNDH를 도입하여 Ps./pUCP19-SLDH-tufB+pBBR(Km)-SDH·SNDH를 수득하였다.
(3) Ps./pUCP19-3DH
pUCP19-SLDH-tufB(5 ㎍)를 37 ℃에서 1 시간동안 40U KpnI 및 40U PstI로 분해하여 1.6 kb 단편을 수득하였다. pUCP19-SDH·SNDH(글루코노박터 옥시단스 T-100으로부터 유래된 SNDH/SDH를 pUCP19에 도입하여 수득한 발현 벡터; 도 7 참조)(1 ㎍)를 37 ℃에서 1 시간동안 10U KpnI 및 10U PstI로 분해하여 8.2 kb 단편을 수득하였다. 이들 두 단편을 T4 DNA 리가제로 결찰시켜 pUCP19-3DH를 작제하였다. 슈도모나스를 이 플라스미드로 형질전환시켜 Ps./pUCP19-3DH를 수득하였다.
실시예 8 : 2KLGA의 생산성 검토
재조합 슈도모나스에 의한 2KLGA의 생산이 확인되었기 때문에, 실시예 6 및 7에서 수득한 4 개의 형질전환체를 사용하여 다양한 조성물 갖는 배지에서 2KLGA의 생산성을 조사하였다.
[배양 1]
Ps./pUCP19-B7SX2+pBBR(Km)-SDH·SNDH의 동결보존 저장물 한 루프를 15 ㎖ 튜브(Falcon)에서 1% 박토트립톤(Difco), 0.5% 효모 추출물(Difco), 1% NaCl, 50 ㎍/㎖ 암피실린 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 배지(2 ㎖, pH 7.4)에 접종하고, 30 ℃에서 24 시간동안 예비배양하였다. 예비-배양액(0.5 ㎖)을 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르비톨, 5% 효모 추출물(Difco), 0.15% MgSO4·7H2O, 50 ㎍/㎖ 암피실린, 50 ㎍/㎖ 카나마이신 및 4% 탄산칼슘을 함유하는 주 배양배지(10 ㎖, pH 7.0)에 접종하고, 30 ℃에서 3 일동안 배양하였다.
[배양 2]
주 배양배지에서 5% 효모 추출물을 5% 카사미노산으로 대체시킨 것을 제외하고 [배양 1]과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
[배양 3]
주 배양배지에 1% 글리세롤을 추가로 첨가하는 것을 제외하고 [배양 1]과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
[배양 4]
Ps./pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH를 생산 박테리아로 사용하고 주 배양배지에 5% 글리세롤을 추가로 첨가하는 것을 제외하고 [배양 1]과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
[배양 5]
Ps./pUCP19-SLDH-tufB+pBBR(Km)-SDH·SNDH를 생산 박테리아로 사용하고 주 배양배지에 5% 글리세롤을 추가로 첨가하는 것을 제외하고 [배양 1]과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
[배양 6]
Ps./pUCP19-3DH를 생산 박테리아로 사용하고 예비-배양 배지 및 주 배양배지로부터 카나마이신을 제거하며 주 배양배지에 5% 글리세롤을 추가로 첨가하는 것을 제외하고 [배양 1]과 동일한 방법으로 세포를 배양하였다.
각 배양에 있어서 소르비톨, 소르보스, 소르보손 및 2KLGA를 정량적으로 측정하였다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 배지에 글리세롤을 첨가함으로써 2KLGA로의 전환 효율이 향상되는 경향이 관찰되었다.
[배양 7]
주 배양배지의 효모 추출물 농도를 2%로 설정하고, 주 배양배지에 5% 글리세롤을 추가로 첨가하는 것을 제외하고 [배양 1]과 동일한 방법으로 세포를 7 일동안 배양하였다. 1, 3, 5 및 7 일 배양에서 소르비톨, 소르보스, 소르보손 및 2KLGA를 정량적으로 측정하였다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
표 5
배양 소르비톨 소르보스 소르보손 2KLGA 이돈산
1 44.1 6.3 0.1 3.7 1.6
2 44.8 3.1 0 4.8 2.2
3 26.7 5.1 0 10.9 8.4
4 26.6 0 0 9.0 ND
5 26.6 0 0 10.7 ND
6 30.7 5.2 0 7.5 ND
7 일 소르비톨 소르보스 소르보손 2KLGA 이돈산
1 41.1 0 0 4.2 ND
3 25.6 0 0 10.6 ND
5 14.2 0 0 16.3 ND
7 7.6 0 0 18.4 15.5
(단위: ㎎/㎖)
ND: 정량되지 않음
실시예 9 : SLDH 발현 벡터 및/또는 SNDH/SDH 발현 벡터가 도입된 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 형질전환체에 의한 소르보스 또는 2KLGA의 발효 생산
하기 시험에서, 슈도모나스 푸티다 IFO3738 균주의 컴피턴트 세포의 제조 및 형질전환은 상기 언급된 슈도모나스 sp.F-1에 대한 것과 동일하다. 슈도모나스 푸티다 IFO3738은 암피실린 내성이기 때문에, 암피실린 내성이 선택 마커로서 사용되는 경우, 세포를 일렉트로포레이션후 500 ㎍/㎖ 암피실린(통상의 10-배량)을 함유하는 L 아가 플레이트상에 심고, 30 ℃에서 하루동안 배양하여 형질전환체 선택용으로서 거대 콜로니를 골라내었다.
(1) SLDH 발현 벡터가 도입된 형질전환체에 의한, 소르비톨로부터 소르보스의 발효 생산
SLDH 유전자(pUCP19-SLDH)를 슈도모나스 푸티다 IFO3738 균주에 도입하였다. 수득한 형질전환체 슈도모나스 푸티다 IFO3738/pUCP19-SLDH의 단일 콜로니를 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르비톨, 0.9% 박토트립톤(Difco), 0.45% 효모 추출물(Difco), 0.9% 염화나트륨 및 500 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 소르보스 생산용 배지(10 ㎖, pH 7.4)에 접종하고, 30 ℃에서 3 일동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하고, 배양 상등액중의 소르비톨 및 소르보스를 정량적으로 측정하였다. 그 결과, 34.6 ㎎/㎖의 소르비톨이 잔존하였고, 7.4 ㎎/㎖의 소르보스가 생성되었다.
(2) SNDH/SDH 발현 벡터가 도입된 형질전환체에 의한, 소르보스로부터 2KLGA의 발효 생산
SNDH/SDH 유전자(pBBR(Km)-SDH·SNDH)를 슈도모나스 푸티다 IFO3738에 도입하였다. 수득한 형질전환체 슈도모나스 푸티다 IFO3738/pBBR(Km)-SDH·SNDH의 단일 콜로니를 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르보스, 0.9% 박토트립톤(Difco), 0.45% 효모 추출물(Difco), 0.9% 염화나트륨, 2% 탄산칼슘 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 2KLGA 생산용 배지(10 ㎖, pH 7.4)에 접종하고, 30 ℃에서 7 일동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하고, 배양 상등액중의 소르보스, 2KLGA 및 이돈산을 정량적으로 측정하였다. 그 결과, 34.3 ㎎/㎖의 소르보스가 잔존하였고, 13.9 ㎎/㎖의 2KLGA 및 3.5 ㎎/㎖의 이돈산이 생성되었다.
(3) SLDH 발현 벡터 및 SNDH/SDH 발현 벡터가 도입된 형질전환체에 의한, 소르비톨부터 2KLGA의 발효 생산
SLDH 및 SNDH/SDH 유전자(pUCP19-SLDH 및 pBBR(Km)-SDH·SNDH)를 슈도모나스 푸티다 IFO3738 균주에 도입하였다. 수득한 형질전환체 슈도모나스 푸티다 IFO3738/pUCP19-SLDH+pBBR(Km)-SDH·SNDH의 단일 콜로니를 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 5% 소르비톨, 0.9% 박토트립톤(Difco), 0.45% 효모 추출물(Difco), 0.9% 염화나트륨, 2% 탄산칼슘, 500 ㎍/㎖ 암피실린 및 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 2KLGA 생산용 배지(10 ㎖, pH 7.4)에 접종하고, 30 ℃에서 7 일동안 배양하였다. 배양액을 원심분리하고, 배양 상등액중의 소르비톨, 소르보스, 2KLGA 및 이돈산을정량적으로 측정하였다. 그 결과, 35.6 ㎎/㎖의 소르비톨이 잔존하였고, 13.2 ㎎/㎖의 2KLGA 및 6.2 ㎎/㎖의 이돈산이 생성되었다. 소르보스는 검출되지 않았다.
서열 목록의 프리 텍스트
SEQ ID NO: 3: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 4: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 5: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 6: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 7: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 8: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 9: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 10: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 11: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 12: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 13: pUCP19-HC의 삽입 DNA를 서열화하기 위한 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 14: His-태그된 SLDH 및 프로모터를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 센스 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 15: His-태그된 SLDH 및 프로모터를 코딩하는 DNA 서열을 증폭시키기 위한 안티센스 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 16: SLDH 유전자의 3' 비-코딩 영역의 DNA 서열을 증폭시키기 위한 센스 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 17: SLDH 유전자의 3' 비-코딩 영역의 DNA 서열을 증폭시키기 위한 안티센스 프라이머로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 18: SLDH의 N-말단 아미노산 서열.
SEQ ID NO: 19: SLDH 코딩 서열의 5' 상류 영역에 SspI 제한 부위를 도입시키기 위한 PCR 프라이머(센스)로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
SEQ ID NO: 20: SLDH 코딩 서열의 5' 상류 영역에 SspI 제한 부위를 도입시키기 위한 PCR 프라이머(안티센스)로서 작용하도록 설계된 올리고뉴클레오타이드.
본 출원은 일본에서 출원된 특허 출원 제 72810/1999 및 224679/1999를 기초로 하며, 이들의 내용은 본 원에 참고로 포함된다.
특허 및 특허 출원을 포함한 본 원에 인용된 모든 문헌은 그의 전체 내용이 본 원에 참고로 인용된다.
본 발명자들은 상기 언급된 목적을 달성하기 위하여 집중적인 연구를 수행하고 상기 효소 활성을 갖는 글루코노박터 속에 속하는 균주의 염색체 DNA 라이브러리로부터 SLDH의 코딩 영역을 함유하는 DNA를 코딩하는데 성공하였다. 서열화 결과, 이 DNA는 본 발명자들에 의해 이전에 분리되었던 SLDH 유전자와 완전히 상이한 신규한 SLDH 유전자를 함유하는 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 DNA를 함유하는 발현 벡터로 슈도모나스(Pseudomonas)를 형질전환시키고 이 재조합 슈도모나스의 배양물로부터 재조합 SLDH를 정제하는데 성공하였다. 본 발명자들은 또한 상기 DNA를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 슈도모나스를 SDH 유전자 및 SNDH 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키고, 이 형질전환체의 배양물을 사용하여 D-소르비톨을 2KLGA로 효과적으로 전환시킴에 따라 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 하기 (1) 내지 (22)를 제공한다:
(1) 하기 물리화학적 성질을 갖는 SLDH:
(a) 작용: D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 반응을 촉매한다,
(b) 분자량: 약 54 kDa,
(c) 조효소: NAD(P)+의존성,
(d) 기질 특이성: 소르비톨, 만니톨 및 아라비톨을 특이적으로 산화시키지만, 자일리톨, 리비톨, 이노시톨 및 글리세롤에는 작용하지 않는다.
(2) 글루코노박터 옥시단스 G624 균주 유래의 상기 언급된 (1)의 SLDH.
(3) 그의 분자 진화에 있어서 상기 언급된 (2)의 SLDH가 기원된 것과 동일한 유전자로부터 기원된 SLDH.
(4) 글루코노박터 속에 속하는 박테리아 유래의 상기 언급된 (3)의 SLDH.
(5) 하기 단백질 (a) 또는 (b)인 SLDH:
(a) 서열 목록 SEQ ID NO:1에 표시된 아미노산 서열로 구성된 단백질,
(b) 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 부가 또는 변형된 것을 제외하고 상기 (a)와 동일한 아미노산 서열로 구성되었으며 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 반응을 촉매하는 단백질.
(6) 상기 언급된 (1) 내지 (5)중 어느 하나의 SLDH를 코딩하는 DNA.
(7) 하기 (a) 또는 (b)인 상기 언급된 (6)의 DNA:
(a) 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 537-1991의 염기 서열을 갖는 DNA,
(b) 엄격한(stringent) 조건하에서 상기 언급된 (a)의 염기 서열에 혼성화할 수 있는 DNA.
(8) 글루코노박터 속에 속하는 박테리아 유래의 상기 언급된 (6) 또는 (7)의DNA.
(9) 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 537-1991의 염기 서열을 갖는 DNA 및 그의 부분 DNA에 혼성화할 수 있는 DNA로서 SLDH 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자.
(10) 상기 언급된 (9)의 유전자에 의해 코딩되고 SLDH 활성을 갖는, 글루코노박터 속 유래의 단백질.
(11) 하기 (a) 또는 (b)의 DNA 를 포함하는 프로모터(promoter) 유전자:
(a) 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 1-536의 염기 서열을 갖는 DNA,
(b) 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환, 삽입, 부가 또는 변형되고, 적어도 하나의 미생물에서 프로모터 활성을 나타내는, 상기 언급된 (a)의 염기 서열을 갖는 DNA.
(12) 상기 언급된 (6) 내지 (9)중 어느 하나의 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
(13) 상기 언급된 (6) 내지 (9)중 어느 하나의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
(14) SDH를 코딩하는 DNA 및/또는 SNDH를 코딩하는 DNA를 추가로 포함하는 상기 언급된 (13)의 발현 벡터.
(15) 상기 언급된 (13) 또는 (14)의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 수득한 형질전환체.
(16) 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 글루코노박터 (Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 및 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속으로 구성된 그룹중에서 선택된 속에 속하는 상기 언급된 (15)의 형질전환체.
(17) D-소르비톨을 2-KLGA로 전환시킬 수 있는 상기 언급된 (15) 또는 (16)의 형질전환체.
(18) 상기 언급된 (13)의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배지에서 배양하고, 수득한 배양물로부터 상기 언급된 (1) 내지 (5)중 어느 하나의 SLDH 또는 (10)의 단백질을 수확함을 특징으로 하여 SLDH 활성을 갖는 단백질을 제조하는 방법.
(19) 상기 언급된 (13)의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배지에서 배양한 후, D-소르비톨을 수득한 배양물 또는 그의 처리 산물과 접촉시킴을 특징으로 하여 L-소르보스를 제조하는 방법.
(20) SDH를 코딩하는 DNA 및 SNDH를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배지에서 배양한 후, 상기 언급된 (19)의 방법에 따라 수득한 L-소르보스를 수득한 배양물 또는 그의 처리 산물과 접촉시킴을 특징으로 하여 2-KLGA를 제조하는 방법.
(21) 상기 언급된 (17)의 형질전환체를 배지에서 배양한 후, D-소르비톨을 수득한 배양물 또는 그의 처리 산물과 접촉시킴을 특징으로 하여 2-KLGA를 제조하는 방법.
(22) 상기 언급된 (20) 또는 (21)의 방법에 의해 수득한 2-KLGA를 L-아스코르브산 또는 그의 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로 전환시킴을 특징으로하여 L-아스코르브산 또는 그의 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염을 제조하는 방법.
본 발명의 SLDH 유전자를 발현하는 재조합 세포는 L-소르보스 및 2KLGA의 발효 방법에 유용한 수단일 수 있다. 따라서, 본 발명은 L-아스코르브산을 간편하게 대규모로 제조하는데 대단히 유용하다.

Claims (22)

  1. 하기 물리화학적 성질을 갖는 소르비톨 데하이드로게나제:
    (a) 작용: D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 반응을 촉매함,
    (b) 분자량: 약 54 kDa,
    (c) 조효소: NAD(P)+의존성,
    (d) 기질 특이성: 소르비톨, 만니톨 및 아라비톨을 특이적으로 산화시키지만, 자일리톨, 리비톨, 이노시톨 또는 글리세롤에는 작용하지 않음.
  2. 제 1 항에 있어서, 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans) G624 균주 유래의 소르비톨 데하이드로게나제.
  3. 분자 진화에 있어서 제 2항의 소르비톨 데하이드로게나제가 기원된 것과 동일한 유전자로부터 기원된 소르비톨 데하이드로게나제.
  4. 제 3 항에 있어서, 글루코노박터 속에 속하는 박테리아 유래의 소르비톨 데하이드로게나제.
  5. 하기 단백질 (a) 또는 (b)인 소르비톨 데하이드로게나제:
    (a) 서열 목록 SEQ ID NO:1에 표시된 아미노산 서열로 구성된 단백질,
    (b) 1 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 부가 또는 변형된 것을 제외하고 상기 (a)와 동일한 아미노산 서열로 구성되어 있으며 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환시키는 반응을 촉매하는 단백질.
  6. 제 1 항 내지 5 항중 어느 하나의 소르비톨 데하이드로게나제를 코딩하는 DNA.
  7. 제 6 항에 있어서, 하기 (a) 또는 (b)인 DNA:
    (a) 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 537-1991의 염기 서열을 갖는 DNA,
    (b) 엄격한(stringent) 조건하에서 상기 언급된 (a)의 염기 서열에 혼성화할 수 있는 DNA.
  8. 제 6 항 또는 7 항에 있어서, 글루코노박터 속에 속하는 박테리아 유래의 DNA.
  9. 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 537-1991의 염기 서열을 갖는 DNA 및 그의 부분 DNA에 혼성화할 수 있는 DNA로서 소르비톨 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자.
  10. 제 9 항의 유전자에 의해 코딩되고 소르비톨 데하이드로게나제 활성을 갖는, 글루코노박터 속 유래의 단백질.
  11. 하기 (a) 또는 (b)의 DNA를 포함하는 프로모터(promoter) 유전자:
    (a) 서열 목록 SEQ ID NO:2에 표시된 염기 서열중 염기 번호 1-536의 염기 서열을 갖는 DNA,
    (b) 1 내지 수개의 염기가 결실, 치환, 삽입, 부가 또는 변형되고, 적어도 한 종류의 미생물에서 프로모터 활성을 나타내는, 상기 언급된 (a)의 염기 서열을 갖는 DNA.
  12. 제 6 항 내지 9 항중 어느 하나의 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제 6 항 내지 9 항중 어느 하나의 DNA를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제 13 항에 있어서, 소르보스 데하이드로게나제를 코딩하는 DNA 및/또는 소르보손 데하이드로게나제를 코딩하는 DNA를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  15. 제 13 항 또는 14 항의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 수득한 형질전환체.
  16. 제 15 항에 있어서, 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속 및 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter) 속으로 구성된 그룹중에서 선택된 속에 속하는 형질전환체.
  17. 제 15 항 또는 16 항에 있어서, D-소르비톨을 2-케토-L-굴론산으로 전환시킬 수 있는 형질전환체.
  18. 제 13 항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배지에서 배양하고, 수득한 배양물로부터 제 1 항 내지 5 항중 어느 하나의 소르비톨 데하이드로게나제 또는 제 10 항의 단백질을 수확함을 특징으로 하여 소르비톨 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 제조하는 방법.
  19. 제 13 항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배지에서 배양한 후, D-소르비톨을 상기 수득한 배양물 또는 그의 처리 산물과 접촉시킴을 특징으로 하여 L-소르보스를 제조하는 방법.
  20. 소르보스 데하이드로게나제를 코딩하는 DNA 및 소르보손 데하이드로게나제를 코딩하는 DNA를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배지에서 배양한 후, 제 19 항의 방법에 따라 수득한 L-소르보스를 상기 수득한 배양물 또는 그의처리 산물과 접촉시킴을 특징으로 하여 2-케토-L-굴론산을 제조하는 방법.
  21. 제 17 항의 형질전환체를 배지에서 배양한 후, D-소르비톨을 상기 수득한 배양물 또는 그의 처리 산물과 접촉시킴을 특징으로 하여 2-케토-L-굴론산을 제조하는 방법.
  22. 제 20 항 또는 21 항의 방법에 의해 수득한 2-케토-L-굴론산을 L-아스코르브산 또는 그의 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로 전환시킴을 특징으로 하여 L-아스코르브산 또는 그의 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염을 제조하는 방법.
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