ES2284162T3

ES2284162T3 - D-sorbitol dehidrogenasa.

Info

Publication number: ES2284162T3
Application number: ES96102405T
Authority: ES
Inventors: Tatsuo Hoshino; Setsuko Ojima; Teruhide Sugisawa
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1995-02-27
Filing date: 1996-02-17
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2016-02-17
Also published as: JP3874032B2; JPH08242850A; EP0728840B1; CN1141341A; DE69637038T2; ATE360685T1; EP0728840A2; US5747301A; DE69637038D1; CN1136310C; EP0728840A3

Abstract

LA DESHIDROGENASA DE D-SORBITOL EN SU FORMA PURIFICADA, QUE CATALIZA LA OXIDACION DE D-SORBITOL EN L-SORBOSA, TIENE UNA ESTRUCTURA MOLECULAR QUE CONSISTE EN SUBUNIDADES HOMOLOGAS DE PESO MOLECULAR 79.000 (MAS MENOS) 5.000, UNA ESPECIFICIDAD A UN SUSTRATO PARA LOS POLIOLES Y UN PH OPTIMO DE 6,0 A 7,0. DICHA DESHIDROGENASA DE D-SORBITOL SE PUEDE PRODUCIR SEGUN UN PROCEDIMIENTO QUE CONSISTE EN CULTIVAR UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO GLUCONOBACTER O ACETOBACTER, O UN MUTANTE O VARIANTE DEL MISMO, CAPAZ DE PRODUCIR LA DESHIDROGENASA DE D-SORBITOL EN LAS CELULAS Y AISLARLA DE LAS CELULAS, EJ., ROMPIENDO LAS CELULAS Y SEPARANDO EL EXTRACTO DE CELULAS LIBRES DE LAS CELULAS ROTAS. LA HIDROGENASA DE D-SORBITOL ASI AISLADA ES UTIL PARA CATALIZAR LA OXIDACION DE D-SORBITOL EN L-SORBOSA, SIENDO ESTA ULTIMA UN INTERMEDIO IMPORTANTE PARA LA PRODUCCION DE VITAMINA C.

Description

D-Sorbitol dehidrogenasa.

La presente invención concierne a una nueva D-sorbitol dehidrogenasa, un proceso para producir la misma y un proceso para producir cetosas, especialmente L-sorbosa utilizando dicha enzima.

Como se mencionó anteriormente, la nueva D-sorbitol dehidrogenasa (en lo adelante referida como SLDH) proporcionada por la presente invención cataliza la oxidación de D-sorbitol a L-sorbosa. La L-sorbosa es un intermediario importante para la producción de vitamina C.

Las enzimas que catalizan la oxidación de D-sorbitol a L-sorbosa son conocidas. L.T. Cummins, T.E. King y V.H. Cheldelin (J Biol. Chem., 224, 323-329, 1957) reportaron que el extracto libre de células de Acetobacter suboxydans (syn. Gluconobacter suboxydans) contiene tres enzimas que participan en las rutas de la oxidación del D-sorbitol. Dos de esas enzimas que catalizan la oxidación de D-sorbitol a L-sorbosa han sido purificadas. Una fue aislada como L-sorbosa reductasa dependiente del fosfato dinucleótido de nicotinamida y adenina (en lo adelante referido como NADP) a partir de la fracción soluble de Gluconobacter melanogenus IFO 3293 por T. Sugisawa, T. Hoshino y A. Fujiwara (Agric. Biol Chem., 55, 2043-2049, 1991), y la otra fue aislada como D-sorbitol dehidrogenasa de enlace de membrana a partir de Gluconobacter suboxydans var. \alpha IFO 3254 por E. Shinagawa, K. Matsushita, O. Adachi y M. Ameyama (Agric. Biol. Chem., 46, 135-141, 1982).

Sin embargo, el SLDH proporcionado por la presente invención es claramente distinto de las dos enzimas anteriores en la estructura de sub-unidades de la enzima, el peso molecular, especificidad del sustrato y pH óptimo. El peso molecular de L-sorbosa reductasa dependiente de NADP es 60,000, pero aquel del SLDH proporcionado por la presente invención consiste de sub-unidades homólogas que tienen un peso molecular de 79,000 \pm 5,000, y no requieren NAPD para catalizar la reacción. Por otra parte, la D-sorbitol dehidrogenasa de enlace de membrana aislada por E. Shinagawa y otros, consistió de tres tipos de sub-unidades con peso molecular de 63,000, 51,000 y 17,000 y oxidó específicamente al D-sorbitol y también oxidó al D-manitol al 5% de la velocidad de la reacción con D-sorbitol, pero no oxidó al D-arabitol o eritritol. Además, estas mostraron que el pH óptimo de la enzima era de 4.5, que la actividad de la enzima fue estable a pH 5.0 y que el 92% de la actividad se perdió a pH 7.0. Sin embargo, la SLDH de la presente invención oxida no solamente el D-sorbitol y D-manitol, sino también el D-arabitol y eritritol, el pH óptimo es 6.0, y la actividad es estable incluso a pH 8.0

Es un objeto de la presente invención proporcionar la nueva enzima SLDH en forma purificada la cual es derivada de un microorganismo que pertenece al género Gluconobacter o Acetobacter y el cual actúa sobre el D-sorbitol para producir L-sorbosa (es decir catalizar la oxidación de D-sorbitol a L-sorbosa), y que tiene las siguientes propiedades físico-químicas:

a): Peso molecular de 800,000 \pm 50,000 Da

b): Estructura molecular consistiendo de 10 sub-unidades homólogas que tienen un peso molecular de 79,000 \pm 5,000 Da cada una,

c): Especificidad del sustrato: Activo en polioles,

d): pH óptimo: 6.0-7.0, al cual la enzima oxida el D-sorbitol a L-sorbosa,

e): Una estabilidad de pH en el rango de pH 7.0 a 9.0,

f): Temperatura óptima en el rango de alrededor de 20 a 40ºC;

g): Inhibición por Cu^{2+} y Fe^{3+}

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un proceso para producir la nueva enzima SLDH cultivando un microorganismo que pertenece al género Gluconobacter o Acetobacter, el cual es capaz de producir la SLDH en las células, rompimiento de las células, aislamiento y purificación de la misma a partir del extracto libre de células de las células rotas, preferiblemente a partir de la fracción de la membrana del microorganismo. Aún un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un proceso para producir L-sorbosa utilizando dicha enzima SLDH.

Las propiedades físico-químicas de la muestra purificada de la nueva SLDH preparada de acuerdo a los Ejemplos en lo adelante son como sigue:

1) Actividad de la enzima

La nueva SLDH de la presente invención cataliza la oxidación de D-sorbitol a L-sorbosa en presencia de un aceptor de electrones de acuerdo a la siguiente fórmula de reacción:

D-Sorbitol + Aceptor de electrones \rightarrow L-Sorbosa + Aceptor de electrones reducido

La enzima no utiliza oxígeno como un aceptor de electrones. Esto fue afirmado por la no actividad de catalización de la enzima para convertir D-Sorbitol a L-sorbosa usando oxígeno como un aceptor de electrones posible. Además, no fue detectado consumo de oxígeno en la mezcla de reacción como se detectó mediante una prueba de oxígeno disuelto.

Sin embargo, cualquier compuesto convencional el cual tiene la capacidad de actuar como un aceptor de electrones puede ser utilizado en conjunción con la enzima de esta invención. Como un aceptor de electrones, puede ser usado el 2,6-diclorofenolindofenol (en lo adelante referido como DCIP), la fenazina metosulfato (en lo adelante referido como PMS), la ferricianida o el citocromo c.

El ensayo de la enzima fue realizado como sigue. La mezcla de reacción basal para ensayar la actividad de la D-sorbitol dehidrogenasa consistió de 50 mM de buffer de fosfato de potasio (pH 6.0), 0.25 mM DCIP y 0.325 mM de PMS, el cual fue preparado justamente antes del ensayo. Una cubeta con una trayectoria de luz de 1 cm contenía 0.4 ml de la mezcla de reacción basal, 0.1 ml de de D-sorbitol 0.4 M y solución de la enzima con un volumen total de 0.51 ml. La cubeta de referencia contenía todos los componentes excepto para el sustrato. La reacción fue comenzada a 25ºC con D-sorbitol y la actividad de la enzima fue medida como la velocidad de reducción inicial de DCIP a 600 nm. Una unidad de enzima es definida como la cantidad de la enzima que cataliza la reducción de 1 \mumol de DCIP por minuto. El coeficiente de extinción de DCIP a pH 6.0 fue 10.8 mM^{-1}.

2) Especificidad del sustrato

La especificidad del sustrato de la enzima fue determinado usando el mismo método de ensayo de la enzima como se describió anteriormente en 1) excepto que varias soluciones de sustratos (100 mM) fueron usadas en vez de D-sorbitol. Los resultados de la medición son mostrados en la Tabla 1. Entre las sustancias probadas, el D-sorbitol, D-arabitol, eritritol y el glicerol fueron altamente oxidados, y el D-manitol y D-adonitol fueron también oxidados, a 49.9 y 66.6% de la velocidad de reacción de D-sorbitol.

TABLA 1 Especificidad del sustrato de la D-sorbitol dehidrogenasa purificada

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3) pH óptimo

La correlación entre la velocidad de reacción de la SLDH y el pH fue determinada usando el mismo método de ensayo de la enzima como se describió anteriormente en 1) excepto que varios pH y buffers fueron usados. Los resultados son mostrados en la Tabla 2. La enzima mostró valores de pH óptimos de 6.0-7.0 y mostró la mayor actividad a pH 6.0.

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TABLA 2 pH óptimo para la actividad de la SLDH

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4) Estabilidad de pH

La enzima fue mantenida fija en buffers de varios pH durante 16 horas a 4ºC, y luego la actividad residual fue medida usando el mismo método de ensayo de la enzima como se describió en 1). Los resultados de la medición son mostrados en la Tabla 3. Más del 60% de la actividad se mantuvo a pH entre 7.0 y 9.0.

TABLA 3 Estabilidad de pH para la actividad de la SLDH

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5) Termo-estabilidad

La termo-estabilidad fue medida incubando la enzima durante 5 minutos a varias temperaturas en buffer de fosfato de potasio 0.01 M (pH 7.0). La actividad residual fue medida usando el mismo método de ensayo de la enzima como se describió anteriormente en 1), después de lo cual la enzima tratada fue enfriada inmediatamente en agua helada. Los resultados son mostrados en la Tabla 4. La enzima fue estable hasta 35ºC, y perdió alrededor del 20, 70 y 90% de su actividad después que hubo sido incubada a 40, 50 y 60ºC, respectivamente.

TABLA 4 Estabilidad de temperatura para la actividad de la SLDH

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6) Temperatura óptima

Las actividades de la enzima fueron medidas a temperaturas desde 20 a 60ºC en el mismo método de ensayo como se describió anteriormente en 1). Los resultados son mostrados en la Tabla 5. La enzima mostró una temperatura óptima de 20 a 40ºC y mostró la mayor actividad a 30ºC. El decrecimiento de 60 y 70% en su actividad fue observado a 45 y 50ºC, respectivamente, y no se detectó más actividad a 60ºC.

TABLA 5 Temperatura óptima para la actividad de la SLDH

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7) Efectos de los iones de metal e inhibidores

Los efectos de los iones de metal e inhibidores en la actividad de la SLDH fueron examinados midiendo la actividad usando el mismo método de ensayo como se describió anteriormente en 1). Después de la adición de la solución de enzima a la mezcla de reacción basal cada solución de metal fue agitada y la reacción fue iniciada con la adición de D-sorbitol. Como es mostrado en la Tabla 6, 8 a 17% de la actividad fue estimulada por la adición de 0.91 y 1.79 mM de Co^{2+}. Sin embargo, la adición de 0.91 mM de Cu^{2+} y Fe^{3+} en cada caso fue fuertemente inhibitorio, y la adición de Zn^{2+} fue inhibitorio en 44 a 68%. Los efectos de varios inhibidores sobre la actividad fueron investigados. Como es mostrado en la Tabla 7, el hidrocloruro de quinina y el monoiodoacetato fueron inhibitorios en 25% y 75%, respectivamente.

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TABLA 6 Efectos de varios metales en la actividad de D-sorbitol dehidrogenasa

8

\begin{minipage}[t]{153mm} La actividad relativa es expresada como el porcentaje de la velocidad de reacción obtenida sin compuestos de metal mostrada en la tabla.\end{minipage}

TABLA 7 Efectos de inhibidores sobre la actividad de la D-sorbitol dehidrogenasa

9

\begin{minipage}[t]{153mm} La actividad relativa es expresada como el porcentaje de la velocidad de reacción obtenida sin inhibidores mostrada en la tabla.\end{minipage}

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8) Efectos de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción

La velocidad de la reacción de oxidación sobre la variación de la concentración de D-sorbitol de 0.5 a 80 mM fue medida para determinar el valor Km para el D-sorbitol. La constante de Michaelis aparente fue calculada ser 18 mM con DCIP como un aceptor de electrones para la reacción.

9) Peso molecular

El peso molecular de la SLDH nativa fue determinado usando una columna de gel de exclusión por tamaño a 280 nm y una velocidad de flujo de 1.0 ml por minuto. La SLDH purificada consistió de sub-unidad homóloga con un peso molecular de 79,000 \pm 5,000 en presencia de sodio dodecil sulfato (SDS).

10) Procedimiento de purificación

La purificación de la SLDH es efectuada mediante la combinación de métodos de combinación conocidos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida, cromatografía de adsorción, cromatografía de filtración en gel, electroforesis en gel, precipitación por salado y diálisis.

La SLDH proporcionada por la presente invención puede ser preparada cultivando un microorganismo apropiado, rompiendo las células y aislando y purificando el mismo a partir del extracto libre de célula de las células rotas, preferiblemente a partir de la fracción de la membrana del microorganismo.

Los microorganismos usados para la presente invención son microorganismos que pertenecen al género Gluconobacter y Acetobacter.

Ejemplos de cepas más preferiblemente usadas en la presente invención son Gluconobacter albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus IFO 3251, Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263, Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus IFO 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274, Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286, Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293, Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO 3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467, Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130, Gluconobacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255, Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258, Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291, Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13772 y Acetobacter liquefaciens IFO 12388. Estos microorganismos, los cuales pueden ser empleados en el proceso de la presente invención, incluyen aquellos los cuales están siendo preservados en el depósito público (colección de cultivo) para entregar a cualquiera a solicitud tal como el Instituto de Fermentación de Osaka, Japón (IFO). De estos, un microorganismo preferido y específico, el Gluconobacter suboxydans IFO 3255, ha sido depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania en Febrero 13, 1995 bajo el Tratado de Budapest. El número de depósito asignado es DSM 9715.

Los microorganismos pueden ser cultivados en un medio acuoso suplementado con nutrientes apropiados bajo condiciones aeróbicas. El cultivo puede ser conducido a un pH de 3.5 a 8.0, preferiblemente 5.0 a 7.5. El período de cultivo varía dependiendo del microorganismo y del medio nutriente a ser usado, y es preferiblemente alrededor de 6 a 100 horas. Un rango de temperatura preferida para llevar a cabo el cultivo es de 20ºC a 40ºC, preferiblemente de 25ºC a 35ºC.

Es usualmente requerido que el medio de cultivo contenga nutrientes tales como: fuentes de carbono asimilables, tal como glicerol, D-manitol, D-sorbitol, eritritol, ribitol, xilitol, arabitol, inositol, dulcitol, D-ribosa, D-fructosa, D-glucosa y sucrosa, preferiblemente D-sorbitol, D-manitol o glicerol; fuentes de nitrógeno digerible tal como sustancias orgánicas, por ejemplo, peptona, extracto de levadura, levadura de hornear y licor de maceración del maíz, y sustancias inorgánicas, por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio y nitrito de potasio; vitaminas; y elementos traza.

A continuación, una realización para el aislamiento y purificación de la SLDH a partir de microorganismos después del cultivo es resumidamente descrita.

(1): Las células son cosechadas del caldo de cultivo líquido por centrifugación o filtración.

(2): Las células cosechadas son lavadas con agua solución salina fisiológica o una solución buffer teniendo un pH apropiado.

(3): Las células lavadas son suspendidas en la solución buffer y rotas por medio de un homogenizador, sonicador, prensa Francesa o tratamiento con lisozima y similares para dar una solución de células rotas.

(4): La SLDH es aislada y purificada a partir del extracto libre de células de células rotas, preferiblemente de la fracción de la membrana del microorganismo.

La SLDH proporcionada por la presente invención es útil como un catalizador para la producción de L-sorbosa a partir de D-sorbitol. La reacción debe ser conducida a valores de pH de 5.5 a 8.0, preferiblemente de 6.0 a 7.0, en presencia de un aceptor de electrones, por ejemplo, DCIP, PMS, ferricianida, citocromo c y similares en un solvente tal como buffer fosfato, buffer tris, buffer citrato y similares. Un rango de temperatura preferido para llevar a cabo la reacción es de 20ºC a 50ºC, preferiblemente de 20ºC a 40ºC. Cuando el pH y la temperatura son establecidos en 6.5 a 7.5 y 30ºC, respectivamente, la reacción de manera general da particularmente buenos resultados. Dependiendo de otras condiciones de reacción tal como la cantidad de enzima, D-sorbitol, aceptor de electrones, pH, temperatura o velocidad de aereación, el D-sorbitol es completamente convertido a L-sorbosa dentro de alrededor de 2 a 24 horas, preferiblemente dentro de alrededor de 12 horas. La concentración de D-sorbitol en un solvente varía en dependencia de otras condiciones de reacción, pero en general es convenientemente desde alrededor de 10 a alrededor de 300 g/L, más preferiblemente desde alrededor de 10 a alrededor de 200 g/L.

En adición a lo anterior, las células cultivadas son también útiles para la producción de cetosas a partir de polioles, especialmente para la producción de L-sorbosa a partir del D-sorbitol. La L-sorbosa producida a partir del D-sorbitol en un solvente es aislada mediante una combinación de métodos convencionales como la centrifugación y la concentración. Sin embargo, el solvente que contiene L-sorbosa sin el paso de aislamiento puede ser usado como el material de partida en la producción industrial de vitamina C por el método de Reichstein.

En la reacción, la enzima puede ser también usada en un estado inmovilizado con un portador apropiado. Cualquier medio de inmovilizar una enzima generalmente conocido en el arte puede ser usado. Por ejemplo, la enzima puede ser enlazada directamente a una membrana, gránulos o similares o una resina que tiene grupo(s) funcional(es), o la misma puede ser enlazada a la resina a través de compuestos de enlace que tienen grupo(s) bifuncional(les), por ejemplo, glutaraldehído.

Los siguientes Ejemplos ilustran la presente invención.

Ejemplo 1 Preparación de D-sorbitol dehidrogenasa (1) Cultivo de Gluconobacter suboxydans IFO 3255

El Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715) fue suministrado por el Instituto para la Fermentación, Osaka (IFO), y usado a través de todo este estudio. El medio consistió de 20 g de D-sorbitol, 3 g de extracto de levadura, 3 g de extracto de carne, 3 g de licor de maceración del maíz, 10 g de polipeptona, 1 g de urea, 1g de KH_{2}PO_{4}, 0.2 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, y 1 g de CaCO_{3} en 1 litro de agua des-ionizada. El pH fue ajustado a 7.0 con hidróxido de sodio antes de la adición de CaCO_{3}. El cultivo en un matraz fue llevado a cabo de manera aeróbica con un agitador rotatorio durante un día, o aquel en un fermentador de jarra de 30 litros fue llevado a cabo durante 21.5 horas a 30ºC, 500 rpm para la agitación y 15 L/min para la aereación. El caldo fue centrifugado a 400 x g durante 10 minutos para eliminar el carbonato de calcio, y luego a 10,000 x g para dar forma de pelotitas a las células. La torta de células fue lavada una vez con solución salina fisiológica. Así, las células intactas (200 g de peso húmedo) fueron obtenidas de 20 litros de cultivo. Las células fueron congeladas a -20ºC hasta el uso.

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(2) Preparación de la fracción de la membrana

Las células (100 g de peso húmedo) fueron suspendidas en 200 ml de buffer de fosfato 50 mM (pH 7.0) y pasadas a través de una prensa de células de presión Francesa a 20,000 psi. Después de la centrifugación para eliminar las células intactas, el sobrenadante (extracto libre de células) fue centrifugado a 80,000 x g durante una hora y este precipitado fue designado como la fracción de membrana (2.28 g de peso húmedo).

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(3) Solubilización

La SLDH fue aislada a partir de la fracción de membrana de Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715). Inicialmente, el método reportado por E. Shinagawa, K. Matsushita, O. Adachi y M. Ameyama, (Agric. Biol. Chem., 46, 135-141, 1982), fue usado para solubilizar la SLDH. La solubilización fue llevada a cabo tratando la membrana con buffer de acetato de sodio 0.01 M (pH 5.0) conteniendo 1% de Triton X-100, KCl 0.1 M, D-sorbitol 0.1 M y alrededor de 10 mg/ml de proteína de la membrana durante 2 horas a 5ºC. Sin embargo, la actividad de la SLDH no fue recuperada de la fracción de la membrana y las actividades completas en el sobrenadante solubilizado y la fracción de membrana residual se perdieron bajo las condiciones anteriores.

Por lo tanto, los efectos de las condiciones de solubilización tal como un valor de pH, la concentración del buffer, los detergentes y el KCl en la actividad de la SLDH fueron estudiados. La recuperación de la actividad de la SLDH fue 74% en el sobrenadante solubilizado de la fracción de membrana, cuando la fracción de membrana fue mezclada en buffer de fosfato de potasio 0.05 M (pH 7.0) conteniendo 1% Triton X-100 y D-sorbitol 0.04M durante 2 horas a 5ºC como es mostrado en la Tabla 8. La enzima no fue solubilizada con n-octil-\beta-D-glucopiranosido y la actividad se perdió por la adición de KCl 0.1 M.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Para dar la fracción activa de SLDH para el paso de aislamiento {Ejemplo 1 - (4)} de la fracción de membrana de Gluconobacter suboxydants IFO 3255 (DSM 9715), membranas congeladas fueron disueltas y suspendidas en el buffer (pH 7.0) para dar alrededor de 10 mg/ml de proteína, y luego 1% de Triton X-100 y D-sorbitol 0.1 M fueron adicionados. La suspensión fue agitada a 180 rpm durante 2 horas, y luego centrifugada a 80,000 x g durante 60 minutos para eliminar el precipitado. La actividad de la SLDH fue recuperada en el sobrenadante solubilizado (200 ml).

(4) Cromatografía en columna de dietilaminoetil-celulosa (en lo adelante referido como DEAE)

El sobrenadante solubilizado (200 ml) obtenido en el Ejemplo 1-(3) fue colocado en una columna de DEAE-celulosa (2.5 x 30 cm) equilibrada y lavada con el buffer (pH 7.0) conteniendo D-sorbitol 0.05 M y 0.1% de Triton X-100. La elusión de la enzima fue realizada con NaCl 0.1 M en el mismo buffer. Las fracciones que tienen actividad de la enzima fueron recogidas.

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(5) Cromatografía en columna de DEAE-Sefarosa

Las fracciones de enzimas combinadas (125 ml) del paso previo fueron dializadas en dos lotes frente a un litro de buffer conteniendo D-sorbitol 0.05M y 0.1% de Triton X-100, y colocadas en una columna de DEAE-Sefarosa (1.5 x 50 cm) equilibrada y lavada con el mismo buffer, y la actividad de la SLDH fue eluida con un gradiente lineal de NaCl (0 a 0.2 M). La mayor actividad de la enzima fue eluida a concentraciones de NaCl que oscilan en el rango de 0.16 a 0.18 M.

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(6) Cromatografía en columna de hidroxilapatita

La fracción activa combinada (40 ml) del paso previo fue dializada frente a dos lotes de 500 ml de buffer conteniendo D-sorbitol 0.05 M y 0.1% de Triton X-100. Una parte de la enzima (5 ml) fue puesta en una columna de hidroxilapatita (2.5 x 20 cm) equilibrada. La actividad de la enzima fue eluida durante el lavado de la columna. Después que la misma preparación fue repetida, fueron recogidas fracciones que tienen actividad de la enzima. El volumen total fue de 52 ml después que la fracción activa fue dializada frente al buffer. Luego la fracción fue concentrada a 10 ml por ultrafiltración (PM10, Amicon).

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(7) Cromatografía en columna de Sefacril HR300

Una porción de la fracción de la enzima (2 ml) del paso previo fue puesta en una columna de Sefacril HR300 (1 x 120 cm) equilibrada con el buffer (pH 7.0) conteniendo NaCl 0.05 M, D-sorbitol 0.05 M y 0.1% de Triton X-100 y desarrollada. Este paso de fraccionamiento fue repetido y la fracción activa fue combinada. La fracción activa dializada frente al buffer (13 ml) fue combinada y almacenada a -80ºC.

El resumen de los pasos de purificación de la enzima es mostrado en la Tabla 9.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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(8) Pureza de la enzima aislada

La enzima purificada con una actividad específica de 45.43 unidades por mg de proteína (0.2 mg/ml) fue usada para los análisis siguientes.

El peso molecular de la D-sorbitol dehidrogenasa nativa fue determinado por HPLC (detección, 254 \mum; velocidad de flujo 1 ml/min) usando una columna de gel de exclusión por tamaño (columna SWxL G3000 gel TSK, 7.8 por 300 mm) equilibrada con buffer de fosfato de potasio 0.1 M (pH 7.0) conteniendo NaCl 0.3 M. Cianocobalamina (1.35 K), mioglobina (17 K), ovalbumina (44 K), \gamma-globulina (158 K) y tiroglobulina (670 K) de peso molecular estándares fueron usados. La enzima purificada mostró un pico único y el peso molecular fue determinado en alrededor de 80,000 \pm 50,000.

En presencia del sodio dodecil sulfato (SDS), la enzima mostró una banda única con un peso molecular de alrededor de 79,000 \pm 5,000. A partir de estos resultados, la SLDH purificada consistió de diez sub-unidades homólogas.

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(9) Identificación del producto de reacción

Para identificar el producto convertido de cada sustrato, la mezcla de reacción (1 ml) conteniendo D-sorbitol, D-manitol, D-arabitol, eritritol, D-adonitol y glicerol cada uno de 0.04 M, y 8 mM de PMS fue incubada durante 4 horas a 30ºC en buffer de fosfato de potasio 0.2 M (pH 7.0) con 2.0 unidades de la enzima purificada. El producto de reacción fue analizado por HPLC y cromatografía en capa delgada. Fueron producidas L-sorbosa, D-frutosa, D-xilulosa, eritrulosa, D-ribulosa y dihidroxiacetona a partir de D-sorbitol, D-manitol, D-arabitol, eritritol, D-adonitol y glicerol, respectivamente.

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Ejemplo 2 Producción de L-sorbosa mediante SLDH purificada

Una mezcla de reacción (volumen total 1.04 ml) conteniendo 0.2 ml de SLDH purificada (0.04 mg de proteína), 0.04 ml de PMS 0.2 M, 0.1 ml de D-sorbitol 0.4 M, 0.4 ml de buffer de fosfato de potasio 0.5 M (pH 7.0) y 0.3 ml de agua fue incubada a 30ºC con agitación suave. Como resultado, fue formada L-sorbosa a una velocidad de alrededor de 1.3 mg/hora.

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Ejemplo 3 Distribución de D-sorbitol dehidrogenasa de enlace de membrana

La distribución de la D-sorbitol dehidrogenasa de enlace de membrana en varias bacterias de ácido acético fue inspeccionada por el ensayo de transferencia inmunológica usando el anticuerpo frente a la SLDH proporcionada en la presente invención. Cada homogenizado de células de varias bacterias de ácido acético fue tratado con SDS para poner cada 20 \mul de la solución conteniendo 3 a 5 \mug de proteína en gel de poliacrilamida SDS, y luego fue llevada a cabo la electroforesis. Las bandas de proteínas desarrolladas en el gel fueron electroforéticamente transferidas a la membrana de nitrocelulosa y reaccionadas con el anticuerpo. Luego la membrana de nitrocelulosa fue tratada usando el kit Immuno-Blot Bio-Rad para Conejo Anti-Cabra, y fue investigado cual microorganismo mostró la banda positiva en la posición de peso molecular (PM) 79,000 \pm 1,000. Como es mostrado en la Tabla 10, todas las cepas de Gluconobacter y Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288 y Acetobacter aceti xylinum IFO 13772 mostraron la banda positiva. El homogenizado de célula de Acetobacter aceti subsp. aceti IF0 328l y Acetobacter liquefaciens IFO 12388 mostraron banda débilmente positiva en la posición de PM 79,000 \pm 1,000.

TABLA 10 Análisis por Immunotransferencia usando el anticuerpo de SLDH

12

Claims

1. D-Sorbitol dehidrogenasa en forma purificada la cual es derivada de un microorganismo que pertenece al género Gluconobacter o Acetobacter y la cual cataliza la oxidación de D-sorbitol a L-sorbosa, dicha enzima teniendo las siguientes propiedades físico-químicas:

a): Peso molecular de 800,000 \pm 50,000 Da

c): Especificidad del sustrato: Activo en polioles,

d): pH óptimo al cual la enzima oxida el D- sorbitol a L-sorbosa en el rango de pH 6.0 a 7.0

e): Una estabilidad de pH en el rango de pH 7.0 a 9.0

f): Temperatura óptima en el rango de alrededor de 20 a 40ºC

g): Inhibición por Cu^{2+} y Fe^{3+}.

2. D-Sorbitol dehidrogenasa de acuerdo a la reivindicación 1 donde el microorganismo es seleccionado de un grupo que consiste en Gluconobacter albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus IFO 3251, Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263, Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus IF0 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274, Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286, Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293, Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO 3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467, Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130, Gluconobacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715), Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258, Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291, Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13772 y Acetobacter liquefaciens IFO 12388.

3. Un proceso para producir una D-Sorbitol dehidrogenasa de acuerdo a la reivindicación 1 o 2 el cual comprende cultivar un microorganismo que pertenece al género Gluconobacter o Acetobacter, el cual es capaz de producir dicha D-sorbitol dehidrogenasa en las células, y aislar dicha D-sorbitol dehidrogenasa de las células.

4. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 3 donde el microorganismo es seleccionado de un grupo que consiste de Gluconobacter albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus IFO 3251, Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263, Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus IFO 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274, Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286, Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293, Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO 3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467, Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130, Gluconohacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715), Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258, Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291, Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13772 y Acetobacter liquefaciens IFO 12388.

5. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 3 o 4 el cual comprende cultivar el microorganismo y posteriormente romper las células y aislar y purificar la D-sorbitol dehidrogenasa a partir del extracto libre de células de las células rotas.

6. Un proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 el cual comprende conducir el cultivo del microorganismo en un medio con nutrientes apropiados bajo condiciones aeróbicas a un pH de 3.5 a 8.0 y en un rango de temperatura de 20ºC a 40ºC.

7. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 6 el cual comprende conducir el cultivo del microorganismo a un pH de 5.0 a 7.5 y en un rango de temperatura de 25ºC a 35ºC.

8. Un proceso para producir L-sorbosa a partir de D-sorbitol el cual comprende oxidar el D-sorbitol en presencia de D-sorbitol dehidrogenasa, como se definió en la reivindicación 1 o 2, y de un aceptor de electrones en un medio acuoso bajo condiciones aeróbicas.

9. Un proceso para producir L-sorbosa a partir de D-sorbitol de acuerdo a la reivindicación 8 donde la oxidación es efectuada a valores de pH de 5.5 a 8.0 y en un rango de temperatura de 20ºC a 50ºC.

10. Un proceso de acuerdo a la reivindicación 8 o 9 donde dicha L-sorbosa es posteriormente convertida en vitamina C.