CN1141341A - D-山梨醇脱氢酶 - Google Patents

D-山梨醇脱氢酶 Download PDF

Info

Publication number
CN1141341A
CN1141341A CN96102533A CN96102533A CN1141341A CN 1141341 A CN1141341 A CN 1141341A CN 96102533 A CN96102533 A CN 96102533A CN 96102533 A CN96102533 A CN 96102533A CN 1141341 A CN1141341 A CN 1141341A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gluconobacter
glucose oxidation
oxidation bacteria
weak glucose
cerinus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN96102533A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1136310C (zh
Inventor
星野达雄
尾岛节子
杉泽辉秀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
D Sm I P Assets Limited
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN1141341A publication Critical patent/CN1141341A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1136310C publication Critical patent/CN1136310C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/823—Acetobacter

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

纯化形式的D-山梨醇脱氢酶，其催化D-山梨醇向D-山梨糖的氧化，其分子结构包括分子量为79,000±5,000的同源亚单位，对多元醇有底物特异性并且最适pH为6.0-7.0。所说的D-山梨醇脱氢酶可通过下列步骤生产：培养在细胞中能产生D-甘露醇脱氢酶的属于葡糖杆菌或醋杆菌的微生物或其突变菌株；从细胞中分离该酶，如破碎细胞并从破碎后的细胞的无细胞提取物中分离。如此分离的D-山梨醇脱氢酶可用于催化D-山梨醇向D-山梨糖的转化，后者是生产维生素C的重要中间体。

Description

D-山梨醇脱氢酶
本发明涉及一种新的D-山梨醇脱氢酶、生产该酶的方法、以及用该酶生产酮糖特别是L-山梨糖的方法。
如上面所提到的，本发明提供的这种新的D-山梨醇脱氢酶(此后称之为SLDH)催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化。L-山梨糖是生产维生素C的重要中间体。
催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化的酶是已知的。J.T.Cummins，T.E.King和V.H.Cheldelin(J.Biol.Clem.，224，323-329，1957)曾报道过弱氧化醋杆菌(即弱氧化葡糖杆菌)的无细胞提取物含有三种参与D-山梨醇氧化途径的酶。已经纯化其中两种催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化的酶。其中一种是由T.Sugisawa，T.Hoshino和A.Fujiwara从生黑葡糖杆菌IFO3293的可溶性部分分离出的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(此后称之为NADP)依懒性L-山梨糖还原酶(Agric.Biol.Chem.，55，2043-2049，1991)，另一种是由E.Shginagawa，K.Matsushita，O.Adachi和M.Ame yama从弱氧化葡糖杆菌的变种aIFO3254分离出的膜结合型的D-山梨醇脱氢酶(Agric.Biol.Chem.，46，135-14l，1982)。
但本发明提供的SLDH在酶的亚单位的结构、分子量、底物特异性和最适pH方面明显区别于上述两种酶。MADP-依懒性L-山梨糖还原酶的分子量是60,000，但由本发明提供的SLDH的分子量是由分子量为79,000±5,000的同源亚单位组成的，并且不需要NADP催化该反应。在另一方面，由E.Shinagawa等人分离的膜结合型D-山梨醇脱氢酶是由分子量为63,000、51,000和17,000的三种亚单位组成的，并且特异性氧化D-山梨醇，还以与D-山梨醇的反应速率的5％氧化D-甘露糖醇，但不氧化D-阿糖醇或赤藓醇。另外，他们指出该酶的最适pH为4.5，在pH5.0时酶活性是稳定的，而在pH7.0时92％的活性丧失。但是，本发明的SLDH不仅氧化D-山梨醇和D-甘露糖醇，而且还氧化D-阿糖醇和赤藓醇，其最适pH为6.0，即使在pH8.0时活性也是稳定的。
本发明的一个目的是提供这种新的纯化形式的酶SLDH，该酶作用于D-山梨醇生成L-山梨糖(即催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化)，并具有下述物化性质：a)分子结构：
由分子量为79,000±5,000的同源亚单位组成。b)底物特异性：作用于多元醇c)最适pH：6.0-7.0。
本发明的另一个目的是提供一种生产这种新的酶SLDH的方法，该方法是培养能在细胞中产生SLDH的方法，该方法是培养能在细胞中产生SLDH的属于葡糖杆菌或醋杆菌属的微生物、或其突变菌株，破碎细胞，从被破碎的细胞的无细胞提取物中分离和纯化该酶，优选从微生物的膜部分分离和纯化该酶。本发明还有一个目的是提供用所述酶SLDH制备L-山梨糖的方法。
按照下文的实施例制备的新SLDH的纯化样品的物化性质如下：1)酶活性
本发明的新的SLDH按照下列反应式在电子受体的存在下催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化：D-山梨醇＋电子受体→L-山梨糖＋还原型电子受体。
该酶不用氧作为电子受体。通过用氧作为可能的电子受体该酶不具备将D-山梨醇转化成L-山梨糖的催化活性证明了这一点。另外，通过溶解的氧探针进行检测表明未在反应混合物中检测到氧的消耗。但是，任何能作为电子受体的常用化合物均可与本发明的酶结合使用。
可用2，6-二氯靛酚(此后称之为DCIP)，吩嗪硫酸甲酯(此后称之为PMS)，铁氰化物或细胞色素C作为电子受体。
按下述方法进行酶的分析。用于测定D-山梨醇脱氢酶活性的基础反应混合物包括50mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，0.25mMDCIP和0.325mM PMS，测试前临时配制。光路为1-cm的比色池中含有0.4ml基础反应混合物、0.1ml的0.4M D-山梨醇和酶溶液，总体积为0.51ml。对比池中含有除底物外的所有成分。于25℃加入D-山梨醇开始反应，于600nm通过DCIP的初始还原速率测定酶的活性。一个酶单位定义为每分钟催化/微摩尔DCIP还原的酶量。在pH6.0时DCIP的消光系数为10.8mM-1。2)底物特异性
用如上面1)中所述的同样的酶分析法测定酶的底物特异性，但用各种底物溶液(100mM)代替D-山梨醇。测定结果示于表1。在测试物中，D-山梨醇、D-阿糖醇、赤藓醇和甘油被高度氧化，并且在D-山梨醇反应速率的49.9和66.6％下D-甘露糖醇和D-阿东糖醇也被氧化。表1.纯化的D-山梨醇脱氢酶的底物特异性
底物     相对活性a)(％)
D-山梨醇D-甘露糖醇D-阿糖醇内消旋赤藓醇D-阿东糖醇甘油D-葡萄糖D-果糖L-山梨糖D-木糖醇甲醇乙醇蔗糖     10049.917517266.61170000000
a)用从底物D-山梨醇获得的反应速率的百分比表示相对活性。3)最适pH
用如上面1)中所述的同样的酶分析法测定SLDH的反应速率与pH间的相互关系，但用不同的pH和缓冲液。结果示于表2。酶显示出最适pH值为6.0-7.0，并且在pH6.0时活性最高。
             表2.SLDH活性的最适pH
pH值     相对活性(％)a)缓冲液(0.1M)
    McIlvain     磷酸钾 Tris-HCl
    4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0      ---22.282.248.940.033.331.1--       ----100.073.357.851.1---      ------60.031.111.100
a)用在pH6.0的磷酸钾缓冲液中的活性的百分数表示数据。4)pH稳定性
将酶于4℃在各种pH的缓冲液中放置16小时，然后用如上面1)中所述的酶分析法测定残余活性。测定结果示于表3。在pH7.0-9.0之间保持了60％以上的活性。
                  表3.SLDH活性的pH稳定性
pH值     相对活性(％)a)缓中液(0.1M)
McIlvain    磷酸钾     Tris-HCl
    4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0 0000050.060.0100.0--      ----010.060.070.0---      ------75.080.080.095.085.0
a)用在pH8.0的McIlvain缓冲液中的活性的百分数表示数据。5)热稳定性
在0.01M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中将酶于各种温度下保温5分钟来测试热稳定性。用如上面1)中所述的酶分析法测定残余活性，然后将处理后的酶立即在冰水中冷却。结果示于表4。在高至35℃时酶稳定，但在40、50和60℃保温后其活性分别丧失约20.70和90％。
     表4.SLDH活性的温度稳定性
    温度(℃)     相对活性a)(％)
    020253035405060     10010010610610682.429.411.8
a)用在20℃下的活性的百分数表示数据。6)最适温度
用如上面1)中所述的同样的分析法在20-60℃的温度下测定酶活性。结果示于表5。在20-40℃酶显示出最适温度，并于30℃时活性最高。在45和50℃下观察其活性分别降低60和70％，在60℃测定无活性。
     表5.SLDH活性的最适温度
    温度(℃)     相对活性a)(％)
    20283035374045505560     82.183.210091.777.074.839.928.94.5
a)用在30℃下的活性的百分数表示数据。7)金属离子和抑制剂的作用
通过用如上面1)中所述的同样的分析法测定活性来检验金属离子和抑制剂对SLDH活性的影响。向基础反应混合物中加入酶溶液后搅拌加入各种金属溶液，并加入D-山梨醇开始反应。如表6中所示，通过加入0.9l和1.79mM Co2+使活性增加了8-17％。但在加入0.9lmM Cu2+和Fe3+的情况下则受到强烈抑制，而加入Zn2+则受到44-68％的抑制。考查了各种抑制剂对活性的影响。如表7所示，盐酸喹宁和一碘代乙酸盐的抑制作用分别为25％和75％。
      表6.各种金属对D-山梨醇脱氢酶活性的影响
金属     相对活性(％)
    浓度(mM)0.91  1.79
 Ca(NO3)2·4H2OCaCl2CoCl2·6H2OCuSO4Cu(NO3)2·3H2OCuCl2·2H2OFe2(SO4)3·xH2OMgCl2·6H2OMnCl2·4H2OMnSO4·4～6H2ONa2MoO4·2H2OTiClZnCl2ZnSO4·7H2ONiSO4·6H2O     96    9696    96117   1080     00     00     00     088    9280    8888    8868    9696    8856    3244    4088    108
相对活性以在无表中所示的金属化合物的情况下获得的反应速率的百分数表示。
  表7.抑制剂对D-山梨醇脱氢酶活性的影响
抑制剂     相对活性(％)
    浓度(mM)0.96                       1.89
EDTA喹宁-HClN-乙基马来酰亚胺NaN3一碘乙酸盐氟代乙酸钠氟化钠Na2HAsO4·7H2O     96.779.2116.791.775.0104.2100116.7     10075.0100112.525.0108.3100120.0
相对活性以在无表中所示的任何抑制剂的情况下获得的反应速率的百分数表示。8)底物浓度对反应速率的影响
测定D-山梨醇的浓度从0.5至80mM变化时的氧化反应速度，从而测出D-山梨醇的Km值。以DCIP作为反应的电子受体计算的表观未氏常数为18mM。9)分子量
用体积排阻凝胶柱在280nm通过HPLC测定天然SLDH的分子量，流速为每分钟1.0ml。纯化的SLDH是由在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下分子量为79,000±5,000的同源亚单位组成的。10)纯化步骤
与已知的纯化方法相结合进行SLDH的纯化，例如离子交换色谱、液相色谱、吸附色谱、凝胶-过滤色谱、凝胶-电泳、盐析和透析。
可通过培养适宜的微生物、破碎细胞并从被破碎细胞的无细胞提取物中优选从微生物的膜部分中分离和纯化该酶来制备本发明提供的SLDH。
用于本发明的微生物是属于葡糖杆菌和醋杆菌属的微生物。所说微生物的突变菌株或变种也可用于本发明。
最优选用于本发明的菌株的例子是白色葡糖杆菌IFO3250、白色葡糖杆菌IFO3251、白色葡糖杆菌IFO3253、Capsulatus葡糖杆菌IFO3462、Cerinus葡糖杆菌IFO3263、Cerinus葡糖杆菌IFO3264、Cerinus葡糖杆菌IFO3265、Cerinus葡糖杆菌IFO3267、Cerinus葡糖杆菌IFO3270、dioxyacetonicus葡糖杆菌IFO327l、dioxyacetonicus葡糖杆菌IFO3274、gluconicus葡糖杆菌、IFO3171、gluconicus葡糖杆菌IFO3285、gluconicus葡糖杆菌IFO3286、工业葡糖杆菌IFO3260、生黑葡糖杆菌IFO3292、生黑葡糖杆菌IFO3293、生黑葡糖杆菌IFO3294、nonoxygluconicus葡糖杆菌IFO3276、氧化葡糖杆菌IFO3189、氧化葡糖杆菌sphaericus亚种IFO12467、roseus葡糖杆菌IFO3990、rubiginosus葡糖杆菌IFO3244、弱氧化葡糖杆菌IFO3130、弱氧化葡糖杆菌IFO3172、弱氧化葡糖杆菌IFO3254、弱氧化葡糖杆菌IFO3255、弱氧化葡糖杆菌IFO3256、弱氧化葡糖杆菌IFO3257、弱氧化葡糖杆菌IFO3258、弱氧化葡糖杆菌IFO3289、弱氧化葡糖杆菌IFO3290、弱氧化葡糖杆菌IFO3291、醋化醋杆菌醋亚种IFO3281、醋化醋杆菌奥尔兰亚种IFO3259、醋化醋杆菌木质亚种IFO3288、醋化醋杆菌木质亚种IFO13772、以及液化醋杆菌IFO12388。可用于本发明方法的这些微生物包括保存在可发放给任何需求者的公开保藏单位(培养物保藏中心)，例如日本大阪发酵研究所(Institute of Fermentation Osaka，Japa)(IFO)。其中，优选的微生物弱氧化葡糖杆菌IFO3255已于1995年2月13日按布达佩斯条约保存在德国Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germany)。给予的保藏号为DSM9715。
微生物可在通气条件下于补充了适宜营养物质的水介质中进行培养。培养可在pH3.5-8.0，优选5.0-7.5下进行。培养时间根据所用微生物和营养介质而改变，优选约6至100小时。进行培养的优选温度范围是约20℃至约40℃，更优选约25℃至约35℃。
通常要求培养基中含有这样的营养物质如：可固化的碳源；如甘油、D-甘露糖醇、D-山梨醇、赤藓醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，优选D-山梨醇、D-甘露糖醇或甘油；可消化的氮源如有机物质，例如胨、酵母萃、面包酵母和玉米浆，以及无机物质，如硫酸铵、氯化铵、和硝酸钾；维生素；以及微量元素。
下面简述培养后从微生物分离和纯化SLDH的实施方案。(1)通过离心或过滤从液体培养肉汤中收集细胞。(2)用水、生理盐水或具有适宜pH的缓冲液洗涤收集的细胞。(3)将洗涤后的细胞悬浮于缓冲液中并用匀浆器、超声发生器、弗式压碎器或用溶菌酶处理等方式破碎细胞得到破碎细胞的溶液。(4)从破碎细胞的无细胞提取物，优选从微生物的膜部分分离和纯化SLDH。
由本发明提供的SLDH可用作从D-山梨醇生产L-山梨糖的催化剂。该反应应当在如磷酸缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等溶剂中，在电子受体如DCIP、PMS、铁氰化物、细胞色素C等的存在下，在pH值为约5.5至约8.0，优选从6.0至7.0下进行。进行该反应优选的温度范围是从20℃至约50℃，更优选从20℃至40℃。当pH和温度分别设置为约6.5-7.5和30℃时，反应通常给出特别好的结果。基于其它反应条件，如酶的量、D-山梨醇、电子受体、pH、温度或通气速度，D-山梨醇在约2至24小时之内，优选在约12小时内全部转化为L-山梨糖。溶剂中D-山梨醇的浓度根据其它反应条件而变化，但通常适宜从约10至约300g/L，最优选从约10至约200g/L。
除此之外，所培养的细胞还可用于从多元醇生产酮糖，尤其是从D-山梨醇生产L-山梨糖。通过与离心和浓缩这样的常规方法相结合，分离从溶剂中的D-山梨醇生产的L-山梨糖。但是，含未经过分离步骤的L-山梨糖的溶剂也可用作用赖希斯坦法工业化生产维生素C的原料。
在反应中，酶也可以与适宜载体的固定化状态使用。可使用本技术领域通常已知的固定化酶的任何方法。例如，酶可以直接结合于含官能基团的膜、颗粒或其它形式的树脂上，其也可以通过含双官能团的桥连化合物，例如戊二醛，结合到树脂上。
下列实施例说明了本发明。实施例1D-山梨醇脱氢酶的制备(1)弱氧化葡糖杆菌IFO3255的培养
由大阪发酵研究所(IFO)提供弱氧化葡糖杆菌IFO3255(DSM9715)，并用于整个研究过程中。培养基在1升去离水中含有20g D-山梨醇、3g醇母萃、3g牛肉膏、3g玉米浆、10g多聚蛋白胨、1g脲、1g KH2PO4、0.2g MgSO4·7H2O、以及1g CaCO3。在加入CaCO3前用氢氧化钠调节至pH7.0。摇瓶培养是在旋转振荡下通气进行一天，或在30℃于30升发酵罐中进行21.5小时，以500转/分钟搅拌和以15升/分钟通气。将发酵液于400xg离心10分钟除去碳酸钙，然后于10,000xg使细胞沉淀。将细胞饼用生理盐水洗涤一次。从而，从20升培养物中获得了完整的细胞(净重200g)。将细胞于-20℃冷冻备用。(2)膜部分的制备
将细胞(净重100g)悬浮于200ml 50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中并在1400kg/cm2的压力下通过弗氏压力细胞压碎器。离心除去完整的细胞，将上清液(无细胞提取物)于80,000xg离心1小时，该沉淀被认为是膜部分(净重2.28g)。(3)溶解
从弱氧化葡糖杆菌IFO3255(DSM9715)的膜部分分离SLDH。首先用E.Shinagawa，K.Matsushita，O.Adachi和M.Ameyama报道的方法(Agric，Biol.chem.，46，135-141，1982)溶解SLDH。通过用含有1％Triton X-100、0.1MKCl、0.1M D-山梨醇和约10mg/ml膜蛋白的0.01M醋酸钠缓冲液(pH5.0)于5℃处理2小时来进行溶解。但未从膜部分回收到SLDH活性，并且在上述条件下在溶解的上清液和残余膜部分中均丧失了全部活性。
因此，研究了溶解条件如pH值、缓冲液浓度、洗涤剂和KCl对SLDH活性的影响。如图8所示，当将膜部分于5℃于含1％Triton X-100和0.04M D-山梨醇的0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中混合2小时，74％的SLDH活性从膜部分回收到溶解的上清液中。酶不与正辛基-β-D-吡喃葡糖苷混溶，并且加入0.1M KCl则活性丧失。
           表8.膜结合型D-山梨醇脱氢酶的溶解
用于溶解的反应混合物     溶解后D-山梨醇脱氢酶的相对活性(％)
    在溶解的上清液中 在残留的膜中
(1)溶解前的膜部分     -     100
(2)在含有0.1MKC1和0.1M D-山梨醇的0.01M醋酸钠缓冲液(pH5.0)中的溶解。与0.5％Triton X-1001.0％Triton X-1000.2％正辛基-β-吡喃葡糖苷0.3％正辛基-β-吡喃葡糖苷 0068 0000
(3)在含有1％Triton X-100而无KCl的各种浓度的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的溶解。0.01M缓冲液＋0.04M D-山梨醇0.05M缓冲液＋0.04M D-山梨醇0.1M缓冲液＋0.04M D-山梨醇0.05M缓冲液而无   D-山梨醇 237438.565.5 2.563.55
(4)在含有0.04M D-山梨醇的0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的溶解。与0.5％正辛基-β-吡喃葡糖苷 2 119
为了从弱氧化葡糖杆菌IFO3255(DSM9715)的膜部分得到用于分离步骤{实施例1-(4)}的SLDH活性部分，将冷冻膜融化并悬浮于缓冲液(pH7.O)中，得到约10mg/ml蛋白，然后加入1％Triton X-100和0.1M D-山梨醇。将悬浮液于180转/分钟振荡2小时，然后于80,000xg离心60分钟除去沉淀。在溶解的上清液(200ml)中回收到SLDH活性。(4)二乙氨乙基(此后称之为DEAE)-纤维素柱层析
用含0.0SM D-山梨醇和0.1％Triton X-100的缓冲液(pH7.0)平衡并洗涤DEAE-纤维素柱(2.5×30cm)，将从实施例1-(3)获得的溶解的上清液(200ml)加到柱上。用在同样缓冲液中的0.1M NaCl进行酶的洗脱。收集具有酶活性的部分。(5)DEAE-Sepharose柱层析
将从上述步骤收集的酶部分(125ml)对两批含0.05M D-山梨醇和0.1％Triton X-100的1升缓冲液透析，上样于用同种缓冲液平衡并洗涤过的DEAE-Sepharose柱(1.5×50cm)，用NaCl(0-0.2M)线性梯度洗脱。在NaCl浓度范围在0.16-0.18M洗脱了主要酶活性。(6)羟基磷灰石柱层析
将从上述步骤收集的酶部分(40ml)对两批含0.05M D-山梨醇和0.1％Triton X-100的500ml缓冲液透析。将一部分酶(5ml)上样于平衡的羟基磷灰石柱(2.5×20cm)。在洗涤柱的过程中洗脱酶活性。重复同样的制备，然后收集具有酶活性的部分。将活性部分对缓冲液透析后总体积为52ml。然后将该部分超滤浓缩至10ml(PM10，Amicon)。(7)Sephacryl HR300柱层析
用含0.05M NaCl，0.05M D-山梨醇和0.1％Triton X-100的缓冲液(pH7.0)平衡Sephacryl HR300柱(1×120cm)，将从上述步骤获得的一部分酶组分(2ml)上柱并展开。重复该分级分离步骤并合并活性部分。收集对缓冲液(13ml)透析的活性部分并于-80℃保存。
酶的纯化步骤总结示于表9中。
      表9.从弱氧化葡糖杆菌IFO3255(DSM9715)纯化膜结合型D-山梨醇脱氢酶
    步骤     体积(ml) 总活性(单位)     总蛋白(mg)     比活性(单位/mg蛋白)     回收(％)
无细胞提取物膜部分溶解的部分DEAE-纤维素(DE52)DEAE-Sepharose(CL6B)羟基磷灰石(BlO-GELHTP)Sephacryl S300     320100200125405213     9,9396,8942,8781.812924.0415.4173.5     9,0242,2801,48025056.513.463.83     1.103.021.947.2516.430.945.3     10069.429.018.29.294.181.75
(8)分离出的酶的纯化
用纯化后比活性为45.43单位/mg蛋白(0.2mg/ml)的酶进行下面的分析。
用体积排阻凝胶柱(TSK凝胶G3000 SWXL柱，7.8×300mm)以含0.3M NaCl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡柱子，通过HPLC(检测，254μm；流速，1ml/分钟)测定天然D-山梨醇脱氢酶的分子量。使用的分子量标准品为氰钴铵(1.35K)、肌红蛋白(17K)、卵清蛋白(44K)、r-球蛋白(158K)和甲状腺球蛋白。纯化的酶显示出一个单独的峰且测定的分子量约为800,000±50,000。
在十二烷基硫酸钠(SDS)的存在下，显示出一条单独的带的酶分子量约为79,000±5,000。从这些结果看出，纯化的SLDH含有10个同源亚单位。(9)反应产物的鉴定
为了鉴定从每种物质转化的产物，将分别含有0.04M D-山梨醇、D-甘露糖醇、D-阿糖醇、赤藓醇、D-阿东糖醇和甘油、以及8mM PMS的反应混合物与2.0单位的纯化酶于0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中在30℃保温4小时。用HPLC和薄层色谱法分析反应产物。分别从D-山梨醇、D-甘露糖醇、D-阿糖醇、赤藓醇、D-阿东糖醇和甘油生成了L-山梨糖、D-果糖、D-木酮糖、赤藓糖、D-核酮糖和二羟基丙酮。实施例2由纯化的SLDH生产L-山梨糖
将含有0.2ml纯化的SLDH(0.04mg蛋白)、0.04ml 0.2MPMS、0.1ml 0.4M D-山梨醇、0.4ml 0.5M磷酸钾缓冲液(pH7.0)和0.3ml水的反应混合物(总体积1.04ml)于30℃缓缓搅拌保温。结果，以约1.3mg/小时的速率形成L-山梨糖。实施例3膜结合型D-山梨醇脱氢酶的分布
用本发明提供的抗SLDH的抗体通过免疫印迹分析检测膜结合型D-山梨醇脱氢酶在各种醋酸菌中的分布。将各种醋酸菌的细胞匀浆液用SDS处理，将各种含3-5μg蛋白的溶液20μl加到SDS聚丙烯酰胺凝胶上，然后进行电泳。将凝胶中展开的蛋白条带电泳转移到硝化纤维素膜上并与抗体反应。用Bio-Rad的羊抗一兔免疫印迹试剂盒处理硝化纤维素膜，观察哪种微生物在分子量(MW)为79,000±1,000的位置上显示出阳性条带。如表10所示，测试的所有葡糖杆菌菌株和醋化醋杆菌奥尔兰亚种IFO3259、醋化醋杆菌木质亚种IFO3288和木质醋化醋杆菌IFO13772均显示出阳性条带。醋化醋杆菌醋亚种IFO3281和液化醋杆菌IFO12388的细胞匀浆液在MW79,000±1,000的位置上显示出微弱的阳性条带。
   表10.用SLDH的抗体进行免疫印迹分析
菌株                                   免疫印迹分析
白色葡糖杆菌     IFO 3250                 +白色葡糖杆菌IFO3251                       +白色葡糖杆菌IFO3253                       +G.capsulatus IFO3462                      +G.cerinus IFO263                          +G.cerinus IFO3264                         +G cerinus IFO3265                         +G.cerinus IFO3267                         +G.cerinus IFO3270                         +G.dioxyacetonicus IFO3271             +G dioxyacetonicus IFO3274             +G.gluconicus IFO3171                  +G.g1uconicus IFO3285                  +G.gluconicus IFO3286                  +工业葡糖杆菌IFO3260                     +生黑葡糖杆菌IFO3292                     +生黑葡糖杆菌IFO3293                     +生黑葡糖杆菌IFO3294                     +G.nonoxygluconicus IFO3276            +氧化葡糖杆菌IFO3189                       +G.oxydans subsp.sphaericus IFO 12467  +G roseus IFO3990                      +G.rubiginosus IFO3244                 +弱氧化葡糖杆菌IFO3130                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3172                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3254                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3255(DSM9715)            +弱氧化葡糖杆菌IFO3256                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3257                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3258                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3289                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3290                     +弱氧化葡糖杆菌IFO3291                     +醋化醋杆菌醋亚利       IFO3281         略显阳性醋化醋杆菌奥尔兰亚种IFO3259               +醋化醋杆菌木质亚种IFO3288                 +醋化醋杆菌木质亚种IFO13772                +液化醋杆菌    IFO2388                  略显阳性
+：在MW79,000±1,000的位置上明显检出交叉条带。

Claims (10)

1.催化D-山梨醇向L-山梨糖的氧化并具有下列物化性质的纯化形式的D-山梨醇脱氢酶：
a)分子结构：
由分子量为79,000±5,000的同源亚单位组成。
b)底物特异性：作用于多元醇。
c)最适pH：6.0-7.0
2.根据权利要求1的D-山梨醇脱氢酶，其具有下列物化性质：
a)分子结构：
由分子量为79,000±5,000的同源亚单位组成。
b)底物特异性：作用于多元醇。
c)最适pH：6.0-7.0
d)pH稳定性：7.0-9.0
e)最适温度：约20-40℃
f)抑制作用：被Cu2+和Fe3+抑制
3.根据权利要求1或2的D-山梨醇脱氢酶，其是从属于葡糖杆菌或醋杆菌的微生物、或其突变菌株产生的。
4.根据权利要求3的D-山梨醇脱氢酶，其中的微生物是选自：白色葡糖杆菌IFO3250、白色葡糖杆菌IFO3251、白色葡糖杆菌IFO3253、cupsulatus葡糖杆菌IFO3462、Cerinus葡糖杆菌IFO3263、Cerinus葡糖杆菌IFO3264、Cerinus葡糖杆菌IFO3265、Cerinus葡糖杆菌IFO3267、Cerinus葡糖杆菌IFO3270、dioxyacetonicus葡糖杆菌IFO3271、dioxyacetonicus葡糖杆菌IFO3274、gluconicus葡糖杆菌IFO3171、gluconicus葡糖杆菌IFO3285、gluconicus葡糖杆菌IFO3286、工业葡糖杆菌IFO3260、生黑葡糖杆菌IFO3292、生黑葡糖杆菌IFO3293、生黑葡糖杆菌IFO3294、nonoxygluconicus葡糖杆菌IFO3276、氧化葡糖杆菌IFO3189、氧化葡糖杆菌sphaericus亚种IFO1246、roseus葡糖杆菌IFO3990、rubiginosus葡糖杆菌IFO3244、弱氧化葡糖杆菌IFO3130、弱氧化葡糖杆菌IFO3172、弱氧化葡糖杆菌IFO3254、弱氧化葡糖杆菌IFO3255、弱氧化葡糖杆菌IFO3256、弱氧化葡糖杆菌IFO3257、弱氧化葡糖杆菌IFO3258、弱氧化葡糖杆菌IFO3289、弱氧化葡糖杆菌IFO3290、弱氧化葡糖杆菌IFO3291、醋化醋杆菌醋亚种IFO3281、醋化醋杆菌奥尔兰亚种IFO3259、醋化醋杆菌木质亚种IFO3288、醋化醋杆菌木质亚种IFO13772、以及液化醋杆菌IFO12388。
5.生产权利要求1、2、3和4中任意一项中所定义的D-山梨醇脱氢酶的方法，该方法包括培养能在细胞中产生所说D-山梨醇脱氢酶的属于葡糖杆菌或醋杆菌属的微生物或其突变菌株，并从细胞中分离所说的D-山梨醇脱氢酶。
6.根据权利要求5的方法，其中的微生物是选自白色葡糖杆菌IFO3250、白色葡糖杆菌IFO3251、白色葡糖杆菌IFO3253、capsulatus葡糖杆菌IFO3462、Cerinus葡糖杆菌IFO3263、Cerinus葡糖杆菌IFO3264、Cerinus葡糖杆菌IFO3265、Cerinus葡糖杆菌IFO3267、Cerinus葡糖杆菌IFO3270、dioxyacetonicus葡糖杆菌IFO3271、dioxyacetonicus葡糖杆菌IFO3274、gluconicus葡糖杆菌IFO3171、gluconicus葡糖杆菌IFO3285、gluconicus葡糖杆菌IFO 3286、工业葡糖杆菌IFO3260、生黑葡糖杆菌IFO3292、生黑葡糖杆菌IFO3293、生黑葡糖杆菌IFO3294、nonoxygluconicus葡糖杆菌IFO3276、氧化葡糖杆菌IFO3189、氧化葡糖杆菌sphaericus亚种IFO1246、roseus葡糖杆菌IFO3990、rubiginosus葡糖杆菌IFO3244、弱氧化葡糖杆菌IFO3130、弱氧化葡糖杆菌IFO3172、弱氧化葡糖杆菌IFO3254、弱氧化葡糖杆菌IFO3255、弱氧化葡糖杆菌IFO3256、弱氧化葡糖杆菌IFO3257、弱氧化葡糖杆菌IFO3258、弱氧化葡糖杆菌IFO3289、弱氧化葡糖杆菌IFO3290、弱氧化葡糖杆菌IFO3291、醋化醋杆菌醋亚种IFO3281、醋化醋杆菌奥尔兰亚种IFO3259、醋化醋杆菌木质亚种IFO3288、醋化醋杆菌木质亚种IFO13772、以及液化醋杆菌IFO12388。
7.根据权利要求5或6的方法，其包括培养微生物并破碎细胞，然后从破碎细胞的无细胞提取物中分离和纯化D-山梨醇脱氢酶。
8.根据权利要求5至7中任一项的方法，其包括在pH3.5至8.0，优选5.O至7.5，于通气条件下在加有适宜营养物质的液体培养基中进行微生物培养，温度范围为从约20℃至约40℃，优选从约25℃至约35℃。
9.从D-山梨醇生产L-山梨糖的方法，其包括在如权利要求1、2、3和4中任意一项所定义的D-山梨醇脱氢酶和电子受体的存在下，在液体培养基中，于通气条件下氧化D-山梨醇。
10.根据权利要求9的从D-山梨醇生产L-山梨糖的方法，其中进行氧化的条件是pH值从约5.5至约8.0，优选从6.0至7.0，温度范围从约20至约50℃，优选从20℃至40℃。
CNB961025336A 1995-02-27 1996-02-26 D－山梨醇脱氢酶 Expired - Fee Related CN1136310C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95102748 1995-02-27
EP95102748.1 1995-02-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1141341A true CN1141341A (zh) 1997-01-29
CN1136310C CN1136310C (zh) 2004-01-28

Family

ID=8219019

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB961025336A Expired - Fee Related CN1136310C (zh) 1995-02-27 1996-02-26 D－山梨醇脱氢酶

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5747301A (zh)
EP (1) EP0728840B1 (zh)
JP (1) JP3874032B2 (zh)
CN (1) CN1136310C (zh)
AT (1) ATE360685T1 (zh)
DE (1) DE69637038T2 (zh)
ES (1) ES2284162T3 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105154457A (zh) * 2015-09-21 2015-12-16 南京工业大学 一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用
CN106434581A (zh) * 2016-09-18 2017-02-22 南京工业大学 一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2239802A1 (en) * 1997-08-21 1999-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag D-sorbitol dehydrogenase gene
EP0955358B1 (en) * 1998-03-13 2007-09-12 DSM IP Assets B.V. Genetically engineered L-sorbose reductase-deficient mutants
DE69937086T2 (de) * 1998-03-13 2008-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Genetisch veränderte, L-Sorbose Reduktase defiziente Mutanten
DE19907115A1 (de) * 1999-02-19 2000-08-24 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose
WO2000055329A1 (fr) * 1999-03-17 2000-09-21 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Sorbitol deshydrogenase, gene codant pour celle-ci et leur utilisation
US6204040B1 (en) 1999-04-22 2001-03-20 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Gluconobacter suboxydans sorbitol dehydrogenase, genes and methods of use thereof
DE19963126A1 (de) * 1999-12-24 2001-07-12 Suedzucker Ag Verfahren zur Herstellung von 6-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-sorbit
EP1743943A4 (en) 2004-03-17 2012-01-18 Ajinomoto Kk PROCESS FOR PREPARING L-FUCULOSE AND METHOD FOR PRODUCING L-FUCOSE
ES2324128A1 (es) * 2005-09-29 2009-07-30 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Metodo para el diagnostico de carcinoma hepatocelular mediante el empleo de marcadores moleculares.
KR20140046691A (ko) * 2012-10-10 2014-04-21 주식회사 종근당바이오 6-하이드록시에틸 아미노-l-소르보스로의 생물전환 수율이 우수한 신규 글루코노박터 속 ｃｋｄｂｍ ０９０１ 균주
KR101479133B1 (ko) * 2013-04-17 2015-01-05 건국대학교 산학협력단 신규 ｄ－솔비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－소르보스의 생산방법
CN104357507B (zh) * 2014-10-21 2017-08-22 帝斯曼江山制药（江苏）有限公司 一种高浓度l‑山梨糖发酵生产工艺
FR3031983A1 (fr) * 2015-01-23 2016-07-29 Ifp Energies Now Procede de transformation selective de polyols biosources en cetoses

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3311027A1 (de) * 1983-03-25 1984-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Nad(p)-unabhaengige glycerindehydrogenase, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung von glycerin und triglyceriden

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105154457A (zh) * 2015-09-21 2015-12-16 南京工业大学 一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用
CN105154457B (zh) * 2015-09-21 2018-10-12 南京工业大学 一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用
CN106434581A (zh) * 2016-09-18 2017-02-22 南京工业大学 一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
DE69637038D1 (de) 2007-06-06
ATE360685T1 (de) 2007-05-15
JP3874032B2 (ja) 2007-01-31
CN1136310C (zh) 2004-01-28
EP0728840A3 (en) 2001-12-19
EP0728840B1 (en) 2007-04-25
JPH08242850A (ja) 1996-09-24
US5747301A (en) 1998-05-05
DE69637038T2 (de) 2007-12-27
EP0728840A2 (en) 1996-08-28
ES2284162T3 (es) 2007-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1136310C (zh) D－山梨醇脱氢酶
Toyama et al. Three distinct quinoprotein alcohol dehydrogenases are expressed when Pseudomonas putida is grown on different alcohols
EP0606621B1 (en) Alcohol/aldehyde dehydrogenase
Moonmangmee et al. Isolation and characterization of thermotolerant Gluconobacter strains catalyzing oxidative fermentation at higher temperatures
Sugisawa et al. Isolation and characterization of membrane-bound L-sorbose dehydrogenase from Gluconobacter melanogenus UV10
US4916069A (en) Enzyme and process for producing the same
EP0477788B1 (en) Glucose dehydrogenase and method for its production
US6242233B1 (en) Aldehyde dehydrogenase
EP0142169B1 (en) 2,5-diketo-d-gluconic acid reductase
Adachi et al. Crystallization and properties of NADPH-dependent L-sorbose reductase from Gluconobacter melanogenus IFO 3294
US4698306A (en) Process for producing peroxidase
JP3086301B2 (ja) Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素
US5068190A (en) N-acetylhexosamine-dehydrogenase, process for producing same, method for the quantitative analysis of N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine using same and kit for use in the quantitative analysis
JP4511655B2 (ja) ソルビトール脱水素酵素、それを産生する微生物およびその製造方法
EP0248401B1 (de) Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung
US5776742A (en) Aldehyde dehydrogenase enzyme
CA1261289A (en) Peroxidase and a process of its preparation
JP2726826B2 (ja) 酵素およびその製造方法
JPH1118762A (ja) １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法
JPH1118760A (ja) １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素を産生する細菌株及びその大量増殖方法
JP2768473B2 (ja) Ｎａｄｈオキシダーゼの製造法
JPS63230082A (ja) アルコ−ルデヒドロゲナ−ゼ
JPH0568542A (ja) アルコール脱水素酵素およびその製造法
JPS6322185A (ja) 酵素およびその製法
GB2303136A (en) Pentaerythritol tetranitrate reductase enzyme

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: DSM IP ASSET CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: FUEL HA FUMAN-LALUOQI LTD.

Effective date: 20040308

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20040308

Address after: Holland Heerlen

Patentee after: D Sm I P Assets Limited

Address before: Basel

Patentee before: F. Hoffmann-La Roche AG

C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20040128

Termination date: 20100226